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DE69226844T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin

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DE69226844T2
DE69226844T2 DE69226844T DE69226844T DE69226844T2 DE 69226844 T2 DE69226844 T2 DE 69226844T2 DE 69226844 T DE69226844 T DE 69226844T DE 69226844 T DE69226844 T DE 69226844T DE 69226844 T2 DE69226844 T2 DE 69226844T2
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escherichia coli
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culture
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Description

    1. Einleitung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin. L-Isoleucin, eine der essentiellen Aminosäuren, spielt eine für die Ernährung wichtige Rolle für Menschen und Tiere und wird für Medikamente wie Aminosäurezubereitungen, Nahrungsmittel und Tierfuttermittel verwendet. Die Nachfrage nach L-Isoleucin hat in den vergangenen Jahren ständig zugenommen.
    • 2. Hintergrund der Erfindung
  • Da vier optische Isomere von Isoleucin bekannt sind, ist es schwierig, L-Isoleucin allein und bei niedrigen Kosten durch Verfahren herzustellen, die die chemische Synthese oder eine Kombination aus chemischer Synthese und enzymatischer Trennung verwenden. Deshalb wird die industrielle Herstellung von L-Isoleucin hauptsächlich durch Fermentation durchgeführt.
  • Unterschiedliche Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin durch Fermentation sind bekannt. Z. B. ist es bekannt, eine L- Isoleucin-Vorstufe wie DL-α-Aminobuttersäure, α- Ketobuttersäure oder Threonin zu einem Fermentationsmedium oder einem mikrobiellen Reaktionssystem hinzuzugeben, um die Vorstufe zu L-Isoleucin zu konvertieren. Dieses Verfahren ist als ein Vorstufenadditionsverfahren bekannt (japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldungen Nrn. 45347/60, 7091/63, 8709/68, 29789/71). Dieses Verfahren ist jedoch zur industriellen Herstellung von L-Isoleucin aufgrund des Bedarfs an teuren Materialien, der niedrigen Ausbeute und der Instabilität der Vorstufen ungeeignet.
  • Andererseits sind als indirekte Fermentationsverfahren bekannt: ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zu Serratia marcescens mit Resistenz gegenüber α-Aminobuttersäure und Isoleucinhydroxamat gehört (J. Bacteriology, Band 110: Seiten 761-763, 1972; Applied and Environmental Microbiology, Band 34: Seiten 647-653, 1977), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Brevibacterium mit Resistenz gegenüber α-Amino-β- hydroxyvaleriansäure und o-Methylthreonin gehört (japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. 93586/74), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Corynebacterium mit Empfindlichkeit gegenüber Fluorbrenztraubensäure gehört (japanische veröffentlichte geprüfte Patentanmeldung Nr. 60236/89). Weiterhin sind bekannt: ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zu Serratia marcescens gehört, der durch eine Kombination aus Mutation und Transduktion verbessert ist (J. General Microbiology, Band 119: Seiten 51-61, 1980), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia oder Brevibacterium gehört, der eine erhöhte Aktivität von Threonindeaminase oder Hydroxyessigsäuresynthase besitzt, Schlüsselenzymen zur Synthese von L-Isoleucin, unter Verwendung rekombinanter DNA- Technik (japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldungen Nrn. 458/90, 42988/90).
  • Diss. Abstr. Int. B34, 6, 1973, offenbart den Isoleucin- und Valin-Metabolismus im E. coli-Stamm K 12, der gegenüber Thiaisoleucin resistent ist. Chem. Abstr. 86, 15, 1977, AN1044Oly beschreibt eine Thiaisoleucin-resistente Mutante von Corynebacterium.
    • 3. Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin zur Verfügung, welches umfaßt:
  • Kultivieren eines Mikroorganismus, der eine Resistenz gegenüber einem Isoleucin-Analogon und Ethionin aufweist und der zur Art Escherichia coli gehört, in einem Nährmedium;
  • Zulassen der Anreicherung von L-Isoleucin in der Kultur; und Gewinnen von L-Isoleucin daraus.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin zur Verfügung, welches umfaßt: Kultivieren eines Mikroorganismus, der eine Resistenz gegenüber Thiaisoleucin und Argininhydroxamat aufweist und der zur Art Escherichia coli gehört, in einem Nährmedium; Zulassen der Anreicherung von L-Isoleucin in der Kultur; und Gewinnen von L-Isoleucin daraus.
    • 4. Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Als in der vorliegenden Erfindung verwendeter Mikroorganismus kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, so lange er zur Art Escherichia coli zugehört und eine Resistenz gegenüber einem Isoleucin-Analogon und einem oder beiden aus Ethionin und Argininhydroxamat aufweist und eine Fähigkeit zur Produktion von L-Isoleucin hat. Ein in der vorliegenden Erfindung verwendetes Isoleucin-Analogon schließt Thiaisoleucin und Isoleuchinhydroxamt ein. Mikroorganismen mit Resistenz gegenüber Argininhydroxamat und Ethionin ebenso wie gegenüber einem Isoleucin-Analogon sind bevorzugt.
  • Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden, geeigneten Mutantenstämme können erhalten werden durch Übertragen der Resistenz gegenüber einem Isoleucin-Analogon wie Thiaisoleucin oder Isoleucinhydroxamat, mit der Resistenz gegenüber Argininhydroxamat und/oder Ethionin auf einen L- Threonin-produzierenden Mikroorganismus der Art Escherichia coli durch eine herkömmliche Mutationstechnik. Alternativ können die Mutantenstämme ebenfalls erhalten werden durch ein umgekehrtes Verfahren, d. h. durch Übertragen der L-Isoleucin- Produktionsfähigkeit, wie der Übertragung des Nährmittelerfordernisses oder der Threonin-metabolischen Antagonistenresistenz, auf Mutantenstämme mit der Isoleucin- Analogon-Resistenz, mit der Argininhydroxamat- und/oder Ethionin-Resistenz, die aus einem wilden Stamm der Art Escherichia coli stammen. Spezielle Beispiel für L-Isoleucinproduzierende Mikroorganismen schließen Escherichia coli H-8271, Escherichia coli H-8272, Escherichia coli H-8273, Escherichia coli H-8285 und Escherichia coli H-8362 ein.
  • Erfindungsgemäß kann die Herstellung von L-Isoleucin bewirkt werden durch Kultivieren des Mikroorganismus in einer herkömmlichen Weise. Als das verwendete Medium kann jedes synthetische oder natürliche Medium verwendet werden, so lange es in angemessener Weise Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und Spuren anderer Nährstoffe enthält, die für den verwendeten Stamm erforderlich sind.
  • Als Kohlenstoffquellen können Kohlehydrate wie Glucose, Fructose, Lactose, Melasse, Cellulosehydrolysat, Rohzuckerhydrolysat, Stärkehydrolysat etc.; und organische Säuren wie Brenztraubensäure, Essigsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Milchsäure etc. verwendet werden. Abhängig von der Assimilationsfähigkeit des zu verwendenden Mikroorganismus können auch Alkohole wie Glycerin, Ethanol etc. verwendet werden.
  • Als Stickstoffquellen können Ammoniak; unterschiedliche anorganische und organische Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat etc.; Amine und andere stickstoffhaltige Verbindungen, Pepton, Fleischextrakt, Maisstärkeeinweichwasser, Caseinhydrolysat, Sojabohnenkuchenhydrolysat, unterschiedliche fermentierte Zellen oder ihre abgedauten Produkte etc. verwendet werden.
  • Als anorganische Verbindungen können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumcarbonat etc. verwendet werden.
  • Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. durch eine eingetauchte Schüttelkultur und eine Belüftungs-Rührkultur. Die Temperatur zur Kultivierung liegt im Bereich von 20 bis 40ºC, bevorzugt 25 bis 38ºC. Der pH des Mediums liegt im Bereich von 5 bis 9 und wird bevorzugt um den Neutralpunkt herum gehalten. Während der Kultivierung wird der pH des Mediums durch Verwendung von Calciumcarbonat, anorganischen und organischen Säuren, Alkalilösung, Ammoniak, pH-Puffer, etc. eingestellt. Gewöhnlich wird L-Isoleucin durch Kultivieren für 2 bis 7 Tage gebildet und in der Kultur angereichert.
  • Nach der Beendigung der Kultivierung werden Ausfällungen wie Zellen etc. aus der Kultur entfernt, und L-Isoleucin kann aus dem Überstand durch eine Kombination aus einer Technik wie der Behandlung mit Ionenaustauscher, Aufkonzentrierung und Aussalzen etc. gewonnen werden.
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezug auf die Beispiele spezifisch beschrieben.
    • Beispiel 1 Gewinnung des Mutanten-Stammes der vorliegenden Erfindung
  • Escherichia coli H-4258 (FERM BP-985; Diaminopimelinsäure- Erfordernis, Methionin-Erfordernis, α-Amino-β- hydroxyvaleriansäure-Erfordernis, Rifampicin-Resistenz) wurde mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (0,2 mg/ml) bei 30ºC für 30 min behandelt, um die Mutation durch ein herkömmliches Verfahren zu bewirken. Die Zellen wurden auf einem Medium ausgebreitet, das 1 g/l Thiaisoleucin in einem Minimalmedium bei pH 7,2 enthielt (0,5% Glucose, 0,2% NH&sub4;Cl, 0,2% KH&sub2;PO&sub4;, 0,01% MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 20 mg/l FeSO&sub4; · 7H&sub2;O, 50 mg/l DL- Methionin, 200 mg/l Diaminopimelinsäure, 2% Agar). Nach Kultivierung bei 30ºC für 2 bis 6 Tage wurden große, auf dem Medium gewachsene Kolonien, Thiaisoleucin-resistente Mutanten, aufgenommen und dem L-Isoleucin-Produktionstest unterzogen. Eine Mutante mit einer höheren L-Isoleucin- Produktivität als die von Escherichia coli H-4258 wurde ausgewählt. Dadurch wurde Escherichia coli H-8271 erhalten.
  • Escherichia coli H-8271 wurde im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, am 29. Oktober 1991 gemäß dem Budapest-Vertrag mit der Anmelde- Nr. FERM BP-3626 hinterlegt.
  • Das gleiche Verfahren wie bei der Gewinnung der Thiaisoleucin-resistenten Mutante wurde wiederholt, außer daß 1,5 g/l Isoleucinhydroxamat anstelle von 1 g/l Thiaisoleucin im Medium enthalten war. Dadurch wurde Escherichia coli H-8272 erhalten.
  • Escherichia coli H-8272 wurde im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, am 29. Oktober 1991 gemäß dem Budapest-Vertrag mit der Anmelde- Nr. FERM BP-3627 hinterlegt.
  • Die Thiaisoleucin-resistente Mutante H-8271 wurde weiterhin einer Mutationsbehandlung in der gleichen Weise wie oben beschrieben unterzogen, und dann wurden die Zellen auf einem Medium ausgebreitet, das 0,3 g/l Argininhydroxamat in einem Minimalmedium enthielt. Nach Kultivierung bei 30ºC für 2 bis 6 Tage wurden große Kolonien, die auf dem Medium wuchsen, Argininhydroxamat-resistente Mutanten, aufgenommen und dem L- Isoleucin-Produktionstest unterworfen. Eine Mutante mit einer höheren L-Isoleucin-Produktivität als die von Escherichia coli H-8271 wurde ausgewählt. Dadurch wurde Escherichia coli H-8273 erhalten.
  • Escherichia coli H-8273 wurde im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, am 29. Oktober 1991 gemäß dem Budapest-Vertrag mit der Anmelde- Nr. FERM BP-3628 hinterlegt.
  • Die Thiaisoleucin-resistente Mutante H-8271 und die Argininhydroxamat-resistente Mutante H-8273 wurden weiterhin der Mutationsbehandlung in der gleichen Weise wie oben beschrieben unterworfen, und dann wurden die Zellen jeweils auf einem Medium ausgebreitet, das 10 g/l DL-Ethionin in einem Minimalmedium enthielt. Nach Kultivierung bei 30ºC für 2 bis 6 Tage wurden große Kolonien, die auf dem Medium wuchsen, DL-Ethionin-resistente Mutanten, aufgenommen und dem L-Isoleucin-Produktionstest unterworfen. Mutanten mit einer höheren L-Isoleucin-Produktivität als die von Escherichia coli H-8271 bzw. Escherichia coli H-8273 wurden ausgewählt.
  • Dadurch wurden Escherichia coli H-8362 und Escherichia coli H-8285 erhalten.
  • Escherichia coli H-8362 und Escherichia coli H-8285 wurden im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, am 29. Oktober 1991 gemäß dem Budapest- Vertrag mit den Anmelde-Nrn. FERM BP-3630 bzs. FERM BP-3629 hinterlegt.
  • Die dadurch erhaltenen Mutanten wurden mit ihren entsprechenden Ausgangsstämmen hinsichtlich der Resistenz gegenüber Thiaisoleucin, Isoleucin, Hydroxamat, Argininhydroxamat oder DL-Ethionin verglichen. D. h., jeder Stamm wurde in einem Medium bei pH 7,5 (1% Trypton, 0,5 Hefe-Extrakt, 1% NaCl, 200 mg/l Diaminopimelinsäure) für 24 h kultiviert. Die Zellen wurden dann in sterilem Wasser suspendiert, und die Suspensionen wurden auf einem Minimalmedium ausgebreitet, das Thioisoleucin, Isoleucinhydroxamat, Argininhydroxamat oder DL-Ethionin in den in Tabelle gezeigten Mengen enthielt. Nach Kultivierung vei 30ºC für 72 h wurde die Wirkstoffresistenz durch den Wachstumsgrad bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
  • +: ausreichendes Wachstum
  • ±: geringes Wachstum
  • -: kein Wachstum
    • Beispiel 2 L-Isoleucin-Produktionstest (1)
  • Escherichia coli H-8271, Escherichia coli H-8272, Escherichia coli H-8273, Escherichia coli H-8362 und Escherichia coli H-8285, die in Beispiel erhalten wurden, und Escherichia coli H-4258 wurden unter Schütteln bei 30ºC für 16 h in einem Impfmedium bei pH 7,4 kultiviert, das 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt, 0,28% NaCl, 200 mg/l Diaminopimelinsäure enthielt. Dann wurden 0,5 ml der resultierenden Impfkultur in 20 ml eines Fermentationsmediums bei pH 8,0 (6% Glucose, 1,6% Ammoniumsulfat, 0,1 Kaliumdihydrogenphosphat, 100 mg/l DL-Methionin, 300 mg/l Diaminopimelinsäure, 0,2% Maisstärkeeinweichwasser, 4% Magnesiumphosphat, 1% Kaliumcarbonat) übergeimpft, in einen 300 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt und unter Schütteln bei 30ºC für 72 h kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die angereicherten Mengen von L-Isoleucin und L-Threonin durch Hochdruck-Flüssigchromatographie quantitativ analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    • Beispiel 3 L-Isoleucin-Produktionstest (2)
  • Die resultierende Impfkultur (100 ml) von Escherichia coli H-8285, die in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde in 1 l eines Fermentationsmediums bei pH 7,4 (4% Glucose, 0,5% (NH&sub4;)SO&sub4;, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,01% MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,5% Maisstärkeeinweichwasser, 0,35 g/l DL-Methionin, 0,9 g/l Diaminopimelinsäure) übergeimpft, in einen 2 l- Fermentationstank gefüllt und unter Schütteln (bei 800 U.p.M.) bei 30ºC und bei einer Belüfungsgeschwindigkeit 1 l/min kultiviert. Während der Kultivierung wurde wäßriges Ammoniak zur Kultur hinzugegeben, um den pH auf 6,5 ± 0,2 einzustellen und eine Stickstoffquelle zu liefern. Glucose wurde ebenfalls zur Kultur hinzugegeben, wenn notwendig. Die Kultur wurde für 45 h fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung waren 26 mg/ml L-Isoleucin angereichert.
  • Ein Liter der L-Isoleucin-haltigen Fermentationsbrühe, die durch Kultivierung des oben beschriebenen Stammes H-8285 erhalten wurde, wurde bei 3 000 U.p.M. für 10 min zentrifugiert, um die Zellen und andere Verunreinigungen zu entfernen. Der erhaltene Überstand wurde durch eine Säule geleitet, die mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz Diaion SK1B (H&spplus;-Typ) gefüllt war, um daran L-Isoleucin zu adsorbieren. Nachdem die Säule mit Wasser gewaschen war wurde sie mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Die L-Isoleucin- Fraktionen wurden gesammelt, aufkonzentriert und unter Kühlung in Ethanol gelagert. Dadurch wurden 19,3 g L- Isoleucin-Kristalle (Reinheit: 98% oder höher) erhalten.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin, welches umfaßt: Kultivieren eines Mikroorganismus, der eine Resistenz gegenüber einem Isoleucin-Analogon und Ethionin aufweist und der zur Art Escherichia coli gehört, in einem Nährmedium; Zulassen der Anreicherung von L-Isoleucin in der Kultur; und Gewinnung von L- Isoleucin daraus.
2. Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin, welches umfaßt: Kultivieren eines Mikroorganismus, der eine Resistenz gegenüber Thiaisoleucin und Argininhydroxamat aufweist und der zur Art Escherichia coli gehört, in einem Nährmedium; Zulassen der Anreicherung von L- Isoleucin der Kultur; und Gewinnung von L-Isoleucin daraus.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Mikroorganismus Escherichia coli FERM BP-3629 oder Escherichia coli FERM BP-3630 ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der Mikroorganismus Escherichia coli FERM BP-3628 ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Escherichia coli resistent gegenüber Argininhydroxamat ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin Escherichia coli resistent gegenüber Ethionin ist.
7. Biologisch reine Kultur von Escherichia coli H-8273 (FERN BP-3625).
8. Biologisch reine Kultur von Escherichia coli H-8285 (FERN BP-3629).
9. Biologisch reine Kultur von Escherichia coli H-8362 (FERM BP-3630).
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