JPH05130882A - 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アミノ酸製剤などの医薬品、食品、飼料添加
用として有用なＬ−イソロイシンをより収率よく安価に
製造する方法を提供する。 【構成】 エシェリヒア属に属し、イソロイシンのアナ
ログに耐性を有し、かつＬ−イソロイシン生産能を有す
る微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−イソロイシン
を生成蓄積させ、該培養物よりＬ−イソロイシンを採取
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるＬ−イソロ
イシンの製造法に関する。必須アミノ酸の１つであるＬ
−イソロイシンは、人間および動物の栄養上重要な役割
を有するアミノ酸として、アミノ酸製剤などの医薬品、
食品、飼料などに用いられており、その需要は近年増加
しつつある。

【０００２】

【従来の技術】イソロイシンには４つの光学異性体が存
在するため、化学合成あるいは酵素分割と組み合わせる
方法ではＬ−体のみ安価に製造するのは困難である。こ
のためＬ−イソロイシンの工業的生産はおもに発酵法に
よって行われている。発酵法によるＬ−イソロイシンの
製造法としては、例えばＤＬ−α−アミノ酪酸、α−ケ
ト酪酸、あるいはスレオニン等のＬ−イソロイシンの前
駆物質を発酵培地や菌体反応系に添加してＬ−イソロイ
シンに変換するいわゆる前駆体添加法（特公昭35−4534
7 、特公昭38−7091、特公昭43−8709、特公昭46−2978
9 等）が知られている。しかしこれらの方法は、原料が
高価で、収率が低く、安定性にも問題があるなど工業的
生産には有利な方法とは言えない。

【０００３】一方、直接発酵法としては、セラチア・マ
ルセスセンスのα−アミノ酪酸およびイソロイシンハイ
ドロキサメートに耐性を有する微生物を用いる方法〔ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacte
riology) 110, 761 〜763,1972、アプライド・アンド・
エンヴィロメンタル・ミクロバイオロジー（Applied an
d Environmental Microbiology) 34, 647 〜653, 1977
〕、ブレビバクテリウム属のα−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸およびｏ−メチルスレオニンに耐性を有する
微生物を用いる方法（特開昭49−93586)、コリネバクテ
リウム属のフロロピルビン酸に感受性を有する微生物を
用いる方法（特公平１−60236)などが知られている。さ
らに、変異と形質導入法を組み合わせて代謝調節の解除
されたセラチア・マルセスセンス属の微生物を用いる方
法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジ
ー（Journal of General Microbiology) 119, 51〜61,
1980〕や、組換えＤＮＡ技術によりイソロイシン合成の
鍵酵素であるスレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキ
シ酸シンターゼの活性を強化したエシェリヒア属あるい
はブレビバクテリウム属の微生物を用いる方法（特開平
２−458,特開平２−42988)等も知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はアミノ
酸製剤や飼料添加物として有用なＬ−イソロイシンを、
より収率良く安価に製造する方法を提供することにあ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、エシェ
リヒア属に属し、イソロイシンのアナログに耐性を有
し、かつＬ−イソロイシン生産能を有する微生物を培地
に培養し、培養物中にＬ−イソロイシンを生成蓄積さ
せ、該培養物よりＬ−イソロイシンを採取することを特
徴とするＬ−イソロイシンの製造法を提供することがで
きる。

【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
用いられる微生物としては、エシェリヒア属に属し、イ
ソロイシンのアナログに耐性を有し、かつＬ−イソロイ
シン生産能を有していればいずれの微生物でも用いるこ
とができる。イソロイシンのアナログとしては、チアイ
ソロイシン、イソロイシンハイドロキサメートなどが用
いられる。

【０００７】またイソロイシンのアナログに耐性なだけ
でなく、さらにアルギニンハイドロキサメートおよび／
またはエチオニンに耐性を有していてもよい。本発明の
Ｌ−イソロイシン生産菌は、エシェリヒア属のＬ−スレ
オニン生産能を有する微生物を、通常の変異手段により
変異させ、チアイソロイシンやイソロイシンハイドロキ
サメートなどのイソロイシンのアナログ耐性を付与し、
所望によりさらにアルギニンハイドロキサメートおよび
／またはエチオニン耐性を付与することにより取得でき
る。また野生株から誘導したイソロイシンのアナログ耐
性さらにアルギニンハイドロキサメートおよび／または
エチオニン耐性を有する変異株に、栄養要求性やスレオ
ニン代謝拮抗物質耐性などのＬ−スレオニン生産性を向
上させる変異を付与することによっても得ることができ
る。好適な例としてはエシェリヒア・コリ（Escherichi
a coli）Ｈ−8271、Ｈ−8272、Ｈ−8273、Ｈ−8285お
よびＨ−8362をあげることができる。

【０００８】本発明の微生物によるＬ−イソロイシンの
生産は、通常の細菌培養法にて実施可能である。使用培
地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株
の必要とする微量の栄養素を程良く含有するものなら
ば、合成培地または天然培地いずれも使用可能である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、糖蜜、セルロース加水分解物、粗糖加水分解物、澱
粉加水分解物などの炭水化物、ピルビン酸、酢酸、フマ
ル酸、リンゴ酸、乳酸などの有機酸が使用できる。さら
に微生物の資化性によってグリセリン、エタノールなど
のアルコールなども用いられる。

【０００９】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸ア
ンモニウムなどの各種無機塩類や有機酸のアンニモウム
塩、アミン類、その他の窒素化合物、ならびにペプト
ン、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分
解物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化
物などが用いられる。

【００１０】無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸
第二カリウム、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、
炭酸カルシウムなどが用いられる。培養は、深部振盪培
養または通気攪拌培養などの好気的条件下にて行われ、
培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは２５〜３８℃の
範囲である。培地のｐＨはｐＨ５〜９の範囲で、好まし
くは中性付近に保持する。培地のｐＨ調整は炭酸カルシ
ウム、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、アンモニ
ア、ｐＨ緩衝液などによって行う。通常２〜７日間の培
養により、培養液中にＬ−イソロイシンが生成蓄積す
る。

【００１１】培養終了後、培養液から菌体などの沈澱物
を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併
用することにより、培養液からＬ−イソロイシンを回収
することができる。以下に本発明の実施例を示す。

【００１２】

【実施例】

実施例１ 変異株の取得 エシェリヒア・コリＨ−4258（FERM BP-985 ：ジアミノ
ピメリン酸要求性、メチオニン要求性、α−アミノ−β
−ヒドロキシ吉草酸耐性、リファンピシン耐性）に、Ｎ
−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによ
る常法の変異処理(0.2mg／ml、30℃、30分間）を施した
後、チアイソロイシン（１ｇ／ｌ）を含む最少培地（グ
ルコース 0.5％、NH₄ Cl 0.2％、KH₂ PO₄ 0.2 ％、MgSO
₄ ・7H ₂ O 0.01％、FeSO₄ ・ 7H₂ O 20mg／l 、DL−メチ
オニン 50mg／l 、ジアミノピメリン酸 200mg／l 、寒
天２％、pH7.2)に塗布した。30℃で２〜６日間培養し、
生育してくる大きなコロニーをチアイソロイシン耐性株
として釣菌分離し、Ｈ−8271を取得した。この菌株は、
ブダペスト条約に基づいて平成３年１０月２９日付で、
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に微工研条
寄第3626号（FERM BP-3626）として寄託されている。

【００１３】チアイソロイシン（１ｇ／ｌ）のかわり
に、イソロイシンハイドロキサメート(1.5ｇ／ｌ）を用
いる以外は上記と同様におこない生育してくる大きなコ
ロニーをイソロイシンハイドロキサメート耐性株として
釣菌分離し、Ｈ−8272を取得した。この菌株はブダペス
ト条約に基づいて平成３年１０月２９日付で微工研に微
工研条寄第３６２７号（FERM BP-3627）として寄託され
ている。

【００１４】チアイソロイシン耐性変異株Ｈ−8271に同
様の変異処理を施した後、アルギニンハイドロキサメー
ト（0.3 ｇ／ｌ）を含む最少培地に塗布した。30℃で２
〜６日間培養し、生育してくる大きなコロニーをアルギ
ニンハイドロキサメート耐性株として釣菌分離し、Ｈ−
8273を取得した。この菌株は、ブダペスト条約に基づい
て平成３年１０月２９日付で微工研に微工研条寄第３６
２８号（FERM BP-3628）として寄託されている。

【００１５】また、上記のエシェリヒア・コリＨ−8271
およびエシェリヒア・コリＨ−8273に、同様の変異処理
を施し、ＤＬ−エチオニン（10ｇ／ｌ）を含む上記最少
培地に生育してくる大きなコロニーをエチオニン耐性株
として釣菌分離し、Ｈ−8362株およびＨ−8285株を取得
した。これらの菌株は、ブダペスト条約に基づいて平成
３年１０月２９日付で微工研にそれぞれ微工研条寄第３
６３０号（FERM BP-3630）、微工研条寄第３６２９号
（FERM BP-3629）として寄託されている。

【００１６】このようにして得られた変異株のチアイソ
ロイシン、イソロイシンハイドロキサメート、アルギニ
ンハイドロキサメートおよびＤＬ−エチオニンに対する
耐性度をそれぞれの親株と比較した。第１表に示した量
のチアイソロイシン、イソロイシハイドロオキサメー
ト、アルギニンハイドロキサメートおよびＤＬ−エチオ
ニンを含む最少培地に、天然培地（トリプトン １％、
酵母エキス 0.5％、NaCl １％、ジアミノピメリン酸
200mg／l 、pH7.5)上で24時間培養した菌体を殺菌水に
懸濁して塗布し、30℃、72時間培養後の生育の度合いで
示した（第１表）。

【００１７】

【表１】

【００１８】実施例2. Ｌ−イソロイシンの生産試験
（１） 実施例１で得られた変異株を用いＬ−イソロイシンの発
酵生産試験を行った。エシェリヒア・コリＨ−4258、エ
シェリヒア・コリＨ−8271、エシェリヒア・コリＨ−82
72、エシェリヒア・コリＨ−8273、エシェリヒア・コリ
Ｈ−8362およびエシェリヒア・コリＨ−8285を、グルコ
ース２％、ペプトン１％、酵母エキス１％、NaCl 0.25
％およびジアミノピメリン酸 200mg／l からなる組成の
種培地（pH7.4)にて、それぞれ30℃、16時間振盪培養し
た。得られた種培養液 0.5mlを、20mlの発酵培地（グル
コース６％、硫酸アンモニウム 1.6％、リン酸一カリウ
ム0.1％、DL−メチオニン 100mg／l 、ジアミノピメリ
ン酸 300mg／l 、コーンスチープリカー 0.2％、リン酸
第三マグネシウム４％、炭酸カリシウム１％、pH8.0)を
含む300ml 容三角フラスコに接種して、30℃、72時間振
盪培養した。培養終了液中のＬ−イソロイシンおよびＬ
−スレオニンの蓄積量は、高速液体クロマトグラフィー
法により定量した。

【００１９】結果を第２表に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】実施例3. Ｌ−イソロイシンの生産試験
（２） 実施例２に記載の方法で得られたエシェリヒア・コリＨ
−8285の種培養液100ml を下記発酵培地１リットルを含
む２ｌ容小型発酵槽に植菌し、30℃、攪拌数800rpm、通
気量１リットル／minにて培養した。培養中のpH調整お
よび窒素源の供給はアンモニア水にて行い、pHは 6.5±
0.2 に維持した。グルコースを適宜供給しつつ、45時間
培養を行った。その際のＬ−イソロイシン蓄積量は、26
mg／mlであった。 発酵培地の組成 グルコース４％、(NH ₄ ) ₂ SO₄ 0.5 ％、KH₂ PO₄ 0.1
％、MgSO₄ ・7H ₂ O 0.01％、コーンスチープリカー 0.5
％、ＤＬ−メチオニン0.35ｇ／l 、ジアミノピメリン酸
0.9ｇ／l 、pH7.4 Ｈ−8285株を用いて得た上記Ｌ−イソロイシン含有培養
液１ｌを遠心分離（3,000rpm、10min)にかけ、菌体その
他の不純物を除去した。得られた上澄液を強酸性陽イオ
ン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ⁺ 型）のカラムに
通し、Ｌ−イソロイシンを吸着させ、水洗後0.5規定の
アンモニア水で溶出して、Ｌ−イソロイシン画分を集め
た。集めた画分を濃縮し、エタノールを加えて冷却下で
保存することにより、純度98％以上のＬ−イソロイシン
結晶が19.3ｇ得られた。

【００２２】

【発明の効果】本発明により、収率良くＬ−イソロイシ
ンを得ることができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エシェリヒア属に属し、イソロイシンの
   アナログに耐性を有し、かつＬ−イソロイシン生産能を
   有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−イソロイ
   シンを生成蓄積させ、該培養物よりＬ−イソロイシンを
   採取することを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法。
2. 【請求項２】 イソロイシンのアナログがチアイソロイ
   シンまたはイソロイシンハイドロキサメートである請求
   項１記載のＬ−イソロイシンの製造法。
3. 【請求項３】 該微生物がさらにアルギニンハイドロキ
   サメートおよび／またはエチオニンに耐性を有すること
   を特徴とする請求項１記載のＬ−イソロイシンの製造
   法。
4. 【請求項４】 該微生物がＬ−スレオニン生産能を有す
   るエシェリヒア属に属する微生物から誘導されることを
   特徴とする請求項１、２または３記載のＬ−イソロイシ
   ンの製造法。