JP2574786B2 - Ｌ−スレオニンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＬ−スレオニンの製造法に関する。Ｌ−スレ
オニンはアミノ酸製剤などの医薬品、飼料添加物として
有用なアミノ酸である。

従来の技術 従来、発酵法によるＬ−スレオニンの製造法として
は、エッシェリヒア属に属し、ボレリジン感受性を示す
微生物を用いる方法（特公昭51−6752号公報）、エッシ
ェリヒア属に属し、ジアミノピメリン酸とメチオニンの
要求性を示し、かつスレオニン生合成系がスレオニンの
フィードバック阻害に対して抵抗性を示す微生物を用い
る方法（特公昭56−10037号公報）、セラチア属に属
し、スレオニン脱水素酵素が欠損し、かつスレオニン代
謝拮抗物質に耐性を示す微生物を用いる方法（特公昭52
−48195号公報）、コリネバクテリウム属に属し、α−
アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸およびＳ−（２−アミノ
エチル）−Ｌ−システインに耐性で、かつメチオニンの
要求性を有する微生物を用いる方法（特開昭47−19087
号公報）、ブレビバクテリウム属に属し、α−アミノ−
β−ヒドロキシ吉草酸およびＳ−（２−アミノエチル）
−Ｌ−システインに耐性で、かつロイシンの要求性を有
する微生物を用いる方法（特開昭50−31093号公報）、
ブレビバクテリウム属に属し、α−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸およびＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−シス
テインに耐性で、かつＬ−イソロイシンおよびＬ−リジ
ンの要求性を有する微生物を用いる方法（特開昭58−22
4684号公報）などが知られている。

発明が解決しようとする問題点 アミノ酸製剤飼料添加物等として有用なＬ−スレオニ
ンを、より収率よく安価に製造する方法が求められてい
る。

問題点を解決するための手段 本発明方法によると、エッシェリヒア属に属し、Ｌ−
スレオニン生産能を有し、かつリファンピシン、リジ
ン、メチオニン、アスパラギン酸およびホモセリンの少
なくとも１種に耐性を有するか、またはＬ−スレオニン
の分解能の低下した微生物を用いることにより高収率で
Ｌ−スレオニンを得ることができる。

本発明に使用する微生物としては、エッシェリヒア属
に属し、Ｌ−スレオニン生産能を有し、かつリファンピ
シン、リジン、メチオニン、アスパラギン酸およびホモ
セリンの少なくとも１種に耐性を有するか、またはＬ−
スレオニンの分解能の低下した微生物であればいずれも
用いられる。

リファンピシンに耐性の菌株は、エッシェリヒア属の
Ｌ−スレオニン生産菌を通常の変異手段により変異さ
せ、リファンピシン20γ/ml以上含有する培地上で生育
してくる菌として得ることができる。好適な例として
は、リファンピシン耐性を有するエッシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｈ−4258（FERM BP−985）（以
下、Ｈ−4258と称す）をあげることができる。

リジン、メチオニン、アスパラギン酸またはホモセリ
ンに耐性を示す菌株はエッシェリヒア属のＬ−スレオニ
ン生産菌を通常の変異手段により変異させ、リジン、メ
チオニン、アスパラギン酸またはホモセリン10g/以上
含有する最少培地上で生育してくる菌として得ることが
できる。

好適な例としては、リジン耐性を有するエッシェリヒ
ア・コリＨ−4435（FERM BP−1094）（以下、Ｈ−4435
と称す）、メチオニン耐性を有するＨ−4436（FERM BP
−1095）（以下、Ｈ−4436と称す）、アスパラギン酸耐
性を有するエッシェリヒア・コリＨ−4225（FERM BP−1
236）（以下、Ｈ−4225と称す）およびホモセリン耐性
を有するＨ−4226（FERM BP−1237）（以下、Ｈ−4226
と称す）をあげることができる。

Ｌ−スレオニンの分解能の低下した微生物とは、Ｌ−
スレオニンからグリシンへの分解能が低下した微生物を
意味する。Ｌ−スレオニン生産能を有するエッシェリヒ
ア属菌株のＬ−スレオニンの分解経路がグリシンを経る
ことは、後記参考例１に示すとおりである。

Ｌ−スレオニンの分解能の低下した微生物は、Ｌ−ス
レオニン生産性菌株を通常の変異手段を用いて変異し、
Ｌ−スレオニンからグリシンへの分解活性の低下した変
異株を選び、そのＬ−スレオニン生産能を調べることに
より得ることができる。Ｌ−スレオニンからグリシンへ
の分解活性は、後記参考例１に示した方法でＬ−スレオ
ニンの分解反応を行い、ペーパークロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィーなどにより、Ｌ−スレオニ
ンの残存量を調べることによりわかる。つまりＬ−スレ
オニンの残存量が多いほど、Ｌ−スレオニンからグリシ
ンへの分解活性が低い。

本発明では、Ｌ−スレオニンの分解反応を行い、親株
よりも分解活性が50％以上低下した微生物、つまり、Ｌ
−スレオニンの残存量が親株の残存量の２倍以上の微生
物を、Ｌ−スレオニンの分解活性が低下した微生物とし
て用いることができる。

好適な例としてエッシェリヒア・コリＨ−4257（FERM
BP−984）（以下、Ｈ−4257と称す）があげられる。

以下に前記各好適な菌株の取得方法を説明する。

（１） Ｈ−4258株の取得方法 エッシェリヒア・コリATCC 21530（ジアミノピメリン
酸要求性、メチオニン要求性、α−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸耐性）（以下、ATCC 21530と称す）にＮ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、
NTGと称す）による常法の変異処理（200γ/ml、30℃、3
0分間）を行った後、100γ/mlのリファンピシンを含む
イースト・ブイヨン寒天培地（肉エキス5g、ペプトン10
g、酵母エキス5g、NaCl2.5g、ジアミノピメリン酸0.1
g、寒天20gを水１に含む培地、pH7.2）に塗布する。3
0℃で２〜６日培養し、生育してくるリファンピシンの
耐性株のコロニーを取得する。リファンピシンの耐性変
異株50株を釣菌し、実施例１に示すＬ−スレオニン生産
試験にかけ、親株よりＬ−スレオニン生産能が向上した
菌株を選んだ。そのうちの１株がＨ−4258である。本菌
株は昭和61年２月13日付で工業技術院微生物工業技術研
究所（以下微工研と称す）にFERM BP−985として寄託さ
れている。

（２） Ｈ−4435及びＨ−4436株の取得方法 ATCC 21530にNTGによる常法の変異処理（200γ/ml、3
0℃、30分間）を行った後、15g/のリジンまたはメチ
オニンを含む最少培地〔グルコース0.5％、（NH₄）₂SO₄
0.1％、K₂HPO₄ 0.7％、KH₂PO₄ 0.2％、MgSO₄・7H₂O 0.
1g/、Fe₂（SO₄）₃ 20mg/、ジアミノピメリン酸50mg
/、メチオニン50mg/、寒天２％（pH7.2）〕に塗布
する。30℃で２〜６日培養し、生育してくるリジンまた
はメチオニンの耐性株のコロニーを取得する。リジンお
よびメチオニンの耐性変異株各50株を釣菌し、実施例１
に示すＬ−スレオニン生産試験にかけ、親株よりＬ−ス
レオニン生産能が向上した菌株を選んだ。そのうち、リ
ジン耐性株として取得された菌株がＨ−4435であり、メ
チオニン耐性株として取得された菌株がＨ−4436であ
る。これらの菌株は昭和61年６月28日付で微工研にそれ
ぞれFERM BP−1094およびFERM BP−1095として寄託され
ている。

（３） Ｈ−4225及びＨ−4226株の取得方法 前記（２）項の取得方法において15g/のリジンまた
はメチオニンの代わりに15g/のアスパラギン酸または
ホモセリンを用いた以外は（２）項と同様に行い、アス
パラギン酸耐性株としてＨ−4225を、ホモセリン耐性株
としてＨ−4226を得た。

これらの菌株は昭和61年12月17日付で微工研にそれぞ
れFERM BP−1236およびFERM BP−1237として寄託されて
いる。

（４） Ｈ−4257株の取得方法 親株としてATCC 21530を用い、NTGによる通常の変異
処理（200γ/ml、30℃、30分間）を行い、最少培地〔グ
ルコース0.5％、（NH₄）₂SO₄ 0.1％、K₂HPO₄ 0.7％、KH
₂PO₄ 0.2％、MgSO₄・7H₂O 0.1g/、Fe₂（SO₄）₃ 20mg/
、ジアミノピメリン酸50mg/、メチオニン50mg/〕
では十分な生育を示し、Ｌ−スレオニンを唯一の窒素源
とする培地〔上記最少培地において（NH₄）₂SO₄ 0.1％
の代わりにＬ−スレオニン0.2％を使用〕においては生
育が著しく悪い菌株200株を釣菌した。

これらの菌株を用いて参考例１に示したのと同様にし
てＬ−スレオニン分解反応を行ったところほとんどの菌
株は親株と比較しＬ−スレオニンからグリシンへの分解
活性は低下していた。分解活性の低下が著しい30株を選
択し、実施例１のＬ−スレオニン生産試験にかけ、親株
よりＬ−スレオニンの生産能が著しく向上した菌株を選
んだ。そのうちの１株がＨ−4257である。

本菌株は、昭和61年２月13日付で微工研にFERM BP−9
84として寄託されている。

本発明で用いられる培地としては、炭素源、窒素源、
無機物、生育因子などを含有するものであれば合成培地
または天然培地のいずれも用いられる。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、糖蜜、
デンプン加水分解物などの炭水化物、酢酸、プロピオン
酸、ギ酸、フマール酸、リンゴ酸などの有機酸が用いら
れる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチー
プ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕酸加水分解
物、各種発酵菌体およびその消化物などが用いられる。

無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カ
リウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸
カルシウムなどが用いられる。

生育因子としてはアミノ酸（DL−メチオンなど）、ジ
アミノピメリン酸などが用いられる。

培養は振とう培養、深部通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃
の範囲である。培地のpHは５〜９の範囲で、好ましくは
中性付近に保持する。培地のpH調整は炭酸カルシウム、
無機または有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、pH緩
衝剤などによって行う。

培養期間は、通常２〜７日間で培養物中にＬ−スレオ
ニンが生成蓄積する。

培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を遠心分離
などにより除去した後、イオン交換処理法、濃縮法、吸
着法、塩析法などを併用することにより、培養液からＬ
−スレオニンを回収することができる。

以下に実施例および参考例を示す。

実施例１ 種菌としてＨ−4258株を用いＬ−スレオニン生産試験
を行った。Ｈ−4258株をグルコース２％、ペプトン１
％、酵母エキス１％、NaCl 0.25％、ジアミノピメリン
酸0.1g/の組成の種培地（pH7.4）で30℃、16時間振と
う培養した。得られた種培養液2mlを20mlの下記発酵培
地を含む250mlの三角フラスコに植菌し、30℃で72時間
振とう培養した。そのときのＬ−スレオニン生成量は、
18.6g/であった。対照として親株ATCC 21530株を用い
て同様に培養した結果、Ｌ−スレオニン生成量は、15.8
g/であった。

発酵培地の組成は次のとおりである。

グルコース７％、（NH₄）₂SO₄ 1.4％、KH₂PO₄ 0.2
％、MgSO₄・7H₂O 0.1％、ジアミノピメリン酸300γ/m
l、DL−メチオニン100γ/ml、コーン・スチープ・リカ
ー0.2％、CaCO₃ 3％（pH7.4） Ｈ−4258株を用いて得たＬ−スレオニン含有培養液20
0mlを遠心分離（3,000rpm、10分）し、菌体その他の不
純物を除去した。得られた上澄液を強酸性陽イオン交換
樹脂ダイヤイオンSKI（H⁺型）（三菱化成工業社製）の
カラムに通し、Ｌ−スレオニンを吸着させ、水洗後0.5
規定のアンモニア水で溶出して、Ｌ−スレオニン画分を
集めた。集めた画分を濃縮し、エタノールを加えて冷却
下で保存することにより、Ｌ−スレオニン2.1gを得た。

実施例２ 種菌としてＨ−4258株の代わりにＨ−4435,H−4436お
よびATCC 21530株を用いる以外は実施例１と同様に培養
して第１表の結果を得た。

ついで、Ｈ−4435株を用い実施例１と同様に処理して
Ｌ−スレオニン2.1gを得た。

実施例３ 種菌としてＨ−4258株の代わりにＨ−4225,H−4226お
よびATCC 21530株を用いる以外は実施例１と同様に培養
して第２表の結果を得た。

ついで、Ｈ−4226株を用い実施例１と同様に処理して
Ｌ−スレオニン2.1gを得た。

実施例４ 種菌としてＨ−4258株の代わりにＨ−4257およびATCC
21530株を用いる以外は実施例１と同様に培養して培養
液中にＬ−スレオニン17.3g/および15.8g/をそれぞ
れ得た。

ついで、Ｈ−4257株を用い実施例１と同様に処理して
Ｌ−スレオニン1.9gを得た。

実施例５ 種菌としてＨ−4257株を用いた。Ｈ−4257株をグルコ
ース２％、ペプトン１％、酵母エキス１％、NaCl 0.25
％、ジアミノピメリン酸0.1g/の組成の種培地（pH7.
4）で30℃で16時間振とう培養した。得られた種培養液2
00mlを遠心分離して集菌洗浄後、Ｌ−スレオニン10g/
および硫酸マグネシウム1g/を含む、0.1Mリン酸緩衝
液（pH6.7）20mlに懸濁し、300ml容三角フラスコにて、
30℃、220rpmで８時間振とう反応を行った。反応後、残
存したＬ−スレオニンの濃度は7.2g/であった。対照
として親株ATCC 21530株を用いて同様に試験した結果、
残存したＬ−スレオニン濃度は0.5g/であった。

参考例１ ATCC 21530株におけるＬ−スレオニンの分解経路を調
べるために生理食塩水で洗浄した菌株をＬ−スレオニン
１％を含む、リン酸バッファー（pH6.7）20mlに懸濁
し、300ml容フラスコにて220rpmにて振とう反応を行っ
た。その結果、第１図に示したようにＬ−スレオニンは
８時間でほぼ完全に分解され、著量のグリシンの蓄積が
認められた（第１図実線）。また同様の条件においてＬ
−スレオニンのかわりにグリシン、Ｌ−イソロイシンを
それぞれ１％ずつ含む反応液を用いた場合、グリシンは
約34％分解され（第１図点線）Ｌ−イソロイシンはまっ
たく分解されなかった（第１図１点破線）。

これらの知見から、ATCC 21530株におけるＬ−スレオ
ニンの分解の主な経路はグリシンを経る経路であること
が明らかとなった。従って、Ｌ−スレオニンからグリシ
ンへの分解能が低下したＬ−スレオニン生産菌を用いる
ことによりＬ−スレオニンを高収率で得ることができ
る。

発明の効果 本発明方法により、収率よくＬ−スレオニンを得るこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ATCC 21530株のスレオニン、グリシンおよび
イソロイシンの分解反応におけるスレオニン、グリシン
およびイソロイシンの相対モル濃度を示す。 図中 はスレオニン（Thr）、 はスレオニン分解反応より生成されたグリシン（Gl
y）、 はグリシン（Gly）、 はイソロイシン（Ile）の相対モル濃度を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−９８４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−９８５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２３６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２３７

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エッシェリヒア属に属し、Ｌ−スレオニン
   生産能を有し、かつリファンピシン、リジン、メチオニ
   ン、アスパラギン酸およびホモセリンの少なくとも１種
   に耐性を有するか、またはＬ−スレオニンからグリシン
   への分解能の低下した微生物を培地に培養し、培養物中
   にＬ−スレオニンを生成蓄積させ、該培養物よりＬ−ス
   レオニンを採取することを特徴とするＬ−スレオニンの
   製造法。