JP2877414B2 - 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ―スレオニンの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、エシェリヒア属に属し、酢酸生合成活性が
欠失または低下し、かつＬ−スレオニン生産能を有する
微生物を用いるＬ−スルオニンの製造法に関する。Ｌ−
スレオニンは、アミノ酸製剤などの医薬品として有用で
あるだけでなく、飼料添加用としても利用できるアミノ
酸である。
欠失または低下し、かつＬ−スレオニン生産能を有する
微生物を用いるＬ−スルオニンの製造法に関する。Ｌ−
スレオニンは、アミノ酸製剤などの医薬品として有用で
あるだけでなく、飼料添加用としても利用できるアミノ
酸である。
従来の技術 従来、Ｌ−スレオニンはエシェリヒア属、ブレビバク
テリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属な
どに属する微生物を用いた発酵法により、工業的に生産
されている。
テリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属な
どに属する微生物を用いた発酵法により、工業的に生産
されている。
発酵法によりアミノ酸を製造する際、発酵培地中に、
リンゴ酸、コハク酸、乳酸、酢酸などの有機酸が生成さ
れる。これらの有機酸の生成は目的生産物の発酵収率を
低下させ、酢酸においてはＬ−スレオニン生合成を阻害
するということが知られている。乳酸などの有機酸の生
成を低下させる方法としては、培養液中の乳酸の量が10
〜200mg/dlになるように通常の空気よりも酸素濃度を高
めた酸素を培地に供給する方法（特開昭61−216697号公
報）が開示されているが、培養管理が煩雑であり工業的
生産には必ずしも充分ではない。
リンゴ酸、コハク酸、乳酸、酢酸などの有機酸が生成さ
れる。これらの有機酸の生成は目的生産物の発酵収率を
低下させ、酢酸においてはＬ−スレオニン生合成を阻害
するということが知られている。乳酸などの有機酸の生
成を低下させる方法としては、培養液中の乳酸の量が10
〜200mg/dlになるように通常の空気よりも酸素濃度を高
めた酸素を培地に供給する方法（特開昭61−216697号公
報）が開示されているが、培養管理が煩雑であり工業的
生産には必ずしも充分ではない。
本発明の変異株と関連のある変異株については、酢酸
を唯一の炭素源として生育できない株あるいはモノフル
オロ酢酸耐性株がジャーナル・オブ・ジェネラル・ミク
ロバイオロジー（Journal of General Microbiology,19
77年）102巻、327〜336頁に既に開示されている。しか
し、該文献中にはその変異株のアミノ酸生産に関する記
述はない。
を唯一の炭素源として生育できない株あるいはモノフル
オロ酢酸耐性株がジャーナル・オブ・ジェネラル・ミク
ロバイオロジー（Journal of General Microbiology,19
77年）102巻、327〜336頁に既に開示されている。しか
し、該文献中にはその変異株のアミノ酸生産に関する記
述はない。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、アミノ酸製剤や飼料添加物として有
用なＬ−スレオニンを、工業的により効率よく安価に製
造する方法を提供することにある。
用なＬ−スレオニンを、工業的により効率よく安価に製
造する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段 本発明によれば、エシェリヒア属に属し、酢酸生合成
活性が欠失または低下し、かつＬ−スレオニン生産能を
有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニ
ンを生成蓄積させ、該培養物よりＬ−スレオニンを採取
することを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製
造法を提供することができる。
活性が欠失または低下し、かつＬ−スレオニン生産能を
有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニ
ンを生成蓄積させ、該培養物よりＬ−スレオニンを採取
することを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製
造法を提供することができる。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で用いられる微生物としては、エシェリヒア属
に属する微生物であって、Ｌ−スレオニン生産能を有
し、しかも酢酸生合成活性が欠失または低下した菌株で
あればいずれでもよく、公知のＬ−スレオニン生産能を
有する菌に酢酸生合成活性を欠失または低下させる変異
を付与することによって取得できる。
に属する微生物であって、Ｌ−スレオニン生産能を有
し、しかも酢酸生合成活性が欠失または低下した菌株で
あればいずれでもよく、公知のＬ−スレオニン生産能を
有する菌に酢酸生合成活性を欠失または低下させる変異
を付与することによって取得できる。
また、エシェリヒア属に属する微生物における酢酸の
生合成経路と代謝経路は可逆的な関係にあり、「酢酸生
合成活性を欠失または低下させる」ということは「酢酸
代謝活性を欠失または低下させる」ということと同じこ
とを表わすので、酢酸代謝活性を欠失または低下させる
変異を付与することによっても取得できる。さらに野生
株から誘導した酢酸生合成活性もしくは酢酸代謝活性の
欠失または低下した変異株に、ジアミノピメリン酸やメ
チオニンの要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸
耐性などのＬ−スレオニン生産性を向上させる変異を付
与しても本発明に用いる菌株を得ることができる。本発
明における酢酸生合成活性もしくは酢酸代謝活性の欠失
または低下した変異株は、紫外線照射やＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）、亜硝
酸などの化学処理など、通常用いられる変異処理を施し
て得られる変異株から見出すことができる。好適な例と
してエシェリヒア・コリＨ−7596をあげることができ
る。
生合成経路と代謝経路は可逆的な関係にあり、「酢酸生
合成活性を欠失または低下させる」ということは「酢酸
代謝活性を欠失または低下させる」ということと同じこ
とを表わすので、酢酸代謝活性を欠失または低下させる
変異を付与することによっても取得できる。さらに野生
株から誘導した酢酸生合成活性もしくは酢酸代謝活性の
欠失または低下した変異株に、ジアミノピメリン酸やメ
チオニンの要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸
耐性などのＬ−スレオニン生産性を向上させる変異を付
与しても本発明に用いる菌株を得ることができる。本発
明における酢酸生合成活性もしくは酢酸代謝活性の欠失
または低下した変異株は、紫外線照射やＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）、亜硝
酸などの化学処理など、通常用いられる変異処理を施し
て得られる変異株から見出すことができる。好適な例と
してエシェリヒア・コリＨ−7596をあげることができ
る。
以下に具体的な菌株の取得方法を示す。
エシェリヒア・コリＨ−4258（FERM BP−985,ジアミ
ノピメリン酸要求性、メチオニン要求性、α−アミノ−
β−ヒドロキシ吉草酸耐性、リファンピシン耐性）にＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NT
G）による常法の変異処理（0.2mg/ml,30℃、30分間）を
おこなった後、モノフルオロ酢酸ナトリウム（1g/
）、を含む最少培地（ピルビン酸ナトリウム3g/、N
H4Cl 2g/、KH2PO4 2g、MgSO4・7H2O 0.1g/,Fe
2（SO4）3 20mg/、ジアミノピメリン酸50mg/、DL−
メチオニン50mg/、寒天20g/、pH7.2）に塗布した。
30℃で２〜６日間培養し、生育してくる耐性株のコロニ
ーを釣菌分離する。得られたモノフルオロ酢酸耐性株の
中から酢酸を唯一の炭素源として生育できない株を分離
し、Ｌ−スルオニン生産試験にかけ、培地中の酢酸生成
量がＨ−4258株より減少した株を取得し、エシェリヒア
・コリＨ−7596と命名した。この菌株はブダペスト条約
に基づき、平成１年12月21付で工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第2697号（FERM BP−2697）とし
て寄託されている。
ノピメリン酸要求性、メチオニン要求性、α−アミノ−
β−ヒドロキシ吉草酸耐性、リファンピシン耐性）にＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NT
G）による常法の変異処理（0.2mg/ml,30℃、30分間）を
おこなった後、モノフルオロ酢酸ナトリウム（1g/
）、を含む最少培地（ピルビン酸ナトリウム3g/、N
H4Cl 2g/、KH2PO4 2g、MgSO4・7H2O 0.1g/,Fe
2（SO4）3 20mg/、ジアミノピメリン酸50mg/、DL−
メチオニン50mg/、寒天20g/、pH7.2）に塗布した。
30℃で２〜６日間培養し、生育してくる耐性株のコロニ
ーを釣菌分離する。得られたモノフルオロ酢酸耐性株の
中から酢酸を唯一の炭素源として生育できない株を分離
し、Ｌ−スルオニン生産試験にかけ、培地中の酢酸生成
量がＨ−4258株より減少した株を取得し、エシェリヒア
・コリＨ−7596と命名した。この菌株はブダペスト条約
に基づき、平成１年12月21付で工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第2697号（FERM BP−2697）とし
て寄託されている。
本発明の微生物は、通常の培養法で培養することがで
きる。使用培地としては、炭素源、窒素源、無機物その
他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有する
ものならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能
である。
きる。使用培地としては、炭素源、窒素源、無機物その
他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有する
ものならば、合成培地または天然培地いずれも使用可能
である。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクト
ース、糖蜜、澱粉または粗糖の加水分解物などの炭水化
物、ピルビン酸、ギ酸、フマール酸、リンゴ酸などの有
機酸が用いられる。
ース、糖蜜、澱粉または粗糖の加水分解物などの炭水化
物、ピルビン酸、ギ酸、フマール酸、リンゴ酸などの有
機酸が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸アンモニウム
などの各種無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、ア
ミン類、その他含窒素化合物、ならびにペプトン、肉エ
キス、コーン、スティープ・リカー、カゼイン加水分解
物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物
などが用いられる。
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸アンモニウム
などの各種無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、ア
ミン類、その他含窒素化合物、ならびにペプトン、肉エ
キス、コーン、スティープ・リカー、カゼイン加水分解
物、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物
などが用いられる。
無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸第二カリウ
ム、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシ
ウムなどが用いられる。
ム、燐酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシ
ウムなどが用いられる。
培養は振とう培養または深部通気撹拌などの好気的条
件下、温度20〜40℃、好ましくは25〜35℃、pH5〜９の
範囲、好ましくは中性付近に保持しておこなわれ、通常
２〜７日で完了する。培地のpH調整は炭酸カルシウム、
無機または有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、pH緩
衝液などによっておこなわれる。
件下、温度20〜40℃、好ましくは25〜35℃、pH5〜９の
範囲、好ましくは中性付近に保持しておこなわれ、通常
２〜７日で完了する。培地のpH調整は炭酸カルシウム、
無機または有機の酸、アルカリ溶液、アンモニア、pH緩
衝液などによっておこなわれる。
培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除去し、
イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用すること
により、培養液からＬ−スレオニンを回収することがで
きる。
イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用すること
により、培養液からＬ−スレオニンを回収することがで
きる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１ エシェリヒア・コリＨ−7596株および親株であるＨ−
4258株を、グルコース20g/、ペプトン10g/、酵母エ
キス10g/、NaCl 2.5g/、ジアミノピメリン酸0.5g/
の組成からなる種培地（pH7.4）に植菌し、30℃、16
時間振とう培養した。得られた種培養液100mlを１の
下記発酵培地を含む２の発酵槽に植菌し、撹拌数800r
pm,30℃、通気量１/min.で培養した。培養中のpH調整
および窒素源の供給はアンモニア水でおこない、pHは約
6.5に維持した。グルコースを適宜供給しつつ、80時間
培養をおこなった。その際のＬ−スレオニンの生産量と
酢酸生成量を高速液体クロマトグラフィー法により定量
し、結果を第１表にまとめた。
4258株を、グルコース20g/、ペプトン10g/、酵母エ
キス10g/、NaCl 2.5g/、ジアミノピメリン酸0.5g/
の組成からなる種培地（pH7.4）に植菌し、30℃、16
時間振とう培養した。得られた種培養液100mlを１の
下記発酵培地を含む２の発酵槽に植菌し、撹拌数800r
pm,30℃、通気量１/min.で培養した。培養中のpH調整
および窒素源の供給はアンモニア水でおこない、pHは約
6.5に維持した。グルコースを適宜供給しつつ、80時間
培養をおこなった。その際のＬ−スレオニンの生産量と
酢酸生成量を高速液体クロマトグラフィー法により定量
し、結果を第１表にまとめた。
発酵培地の組成は以下の通りである。
グルコース40g/、（NH4）2SO4 12g/、KH2PO4 2g/
、MgSO4・7H2O 1g/、ジアミノピメリン酸0.9g/、
DL−メチオニン0.3g/、コーン・スチープ・リカー5g/
（pH7.4） 実施例２ 実施例１の培養条件で撹拌数を800rpmから600rpmに変
えた以外は、実施例１と同様におこなった。結果を第２
表に示した。
、MgSO4・7H2O 1g/、ジアミノピメリン酸0.9g/、
DL−メチオニン0.3g/、コーン・スチープ・リカー5g/
（pH7.4） 実施例２ 実施例１の培養条件で撹拌数を800rpmから600rpmに変
えた以外は、実施例１と同様におこなった。結果を第２
表に示した。
Ｈ−7596株を用いて得られたＬ−スレオニン含有培養
液１を遠心分離（3000rpm,10分）にかけ菌体その他の
不純物を除去した。得られた上澄液を強酸性陽イオン交
換樹脂ダイヤイオンSKI（Ｈ型）のカラムに通し、Ｌ−
スレオニンを吸着させ、水洗後0.5規定のアンモニア水
で溶出して、Ｌ−スレオニン画分を集めた。集めた画分
を濃縮し、エタノールを加えて冷却下で保存することに
より、純度98％以上のＬ−スレオニンの結晶が27g得ら
れた。
液１を遠心分離（3000rpm,10分）にかけ菌体その他の
不純物を除去した。得られた上澄液を強酸性陽イオン交
換樹脂ダイヤイオンSKI（Ｈ型）のカラムに通し、Ｌ−
スレオニンを吸着させ、水洗後0.5規定のアンモニア水
で溶出して、Ｌ−スレオニン画分を集めた。集めた画分
を濃縮し、エタノールを加えて冷却下で保存することに
より、純度98％以上のＬ−スレオニンの結晶が27g得ら
れた。
発明の効果 本発明によれば、アミノ酸製剤や飼料添加物として有
用なＬ−スレオニンを、効率よく安価に製造することが
できる。また、副生のアミノ酸が少ない。
用なＬ−スレオニンを、効率よく安価に製造することが
できる。また、副生のアミノ酸が少ない。
Claims (1)
- 【請求項１】エシェリヒア属に属し、酢酸生合成活性が
欠失または低下し、かつＬ−スレオニン生産能を有する
微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−スレオニンを生
成蓄積させ、該培養物よりＬ−スレオニンを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3117290A JP2877414B2 (ja) | 1990-02-09 | 1990-02-09 | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3117290A JP2877414B2 (ja) | 1990-02-09 | 1990-02-09 | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03236786A JPH03236786A (ja) | 1991-10-22 |
| JP2877414B2 true JP2877414B2 (ja) | 1999-03-31 |
Family
ID=12324026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3117290A Expired - Lifetime JP2877414B2 (ja) | 1990-02-09 | 1990-02-09 | 発酵法によるｌ―スレオニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2877414B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3629290B2 (ja) * | 1993-10-01 | 2005-03-16 | 協和醗酵工業株式会社 | 物質の製造法 |
| US7052883B2 (en) | 2001-04-03 | 2006-05-30 | Degussa Ag | Process for the production of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae that contain an attenuated fruR gene |
| DE10116518A1 (de) * | 2001-04-03 | 2002-10-17 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| US20050059124A1 (en) * | 2001-07-18 | 2005-03-17 | Mechthild Rieping | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced suca or sucb gene |
-
1990
- 1990-02-09 JP JP3117290A patent/JP2877414B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03236786A (ja) | 1991-10-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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