JP2748418B2 - 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 - Google Patents
組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子が組
み込まれている組換えDNA、該組換えDNAを有するバリ
ン、ロイシン又はイソロイシン生産菌を用いるＬ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの製造法に関する
ものである。
み込まれている組換えDNA、該組換えDNAを有するバリ
ン、ロイシン又はイソロイシン生産菌を用いるＬ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの製造法に関する
ものである。
発酵法によりＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソ
ロイシンを製造しようとする場合、野生株は殆ど菌体外
にＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンを生
産しないので、野生株に人工的に突然変異を生起せしめ
てＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシン生産
能を付与する方法がとられている。
ロイシンを製造しようとする場合、野生株は殆ど菌体外
にＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンを生
産しないので、野生株に人工的に突然変異を生起せしめ
てＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシン生産
能を付与する方法がとられている。
Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシン生産
能を有する人工変異株としては、ブレビバクテリウム属
又は、コリネバクテリウム属、又はセラチア属のＬ−バ
リン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンのアンタゴニ
ストに耐性を有する変異株等が従来より知られている。
その内容はＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイ
シン生産に関与するキイ酵素であるところのアセトヒド
ロキシ酸シンターゼが末端生産物であるＬ−バリン、Ｌ
−ロイシン及び／又はＬ−イソロイシンと、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン及び／又はＬ−イソロイシンのアンタ
ゴニストによるフィードバック阻害を受けにくくなった
変異株を用いるものである。
能を有する人工変異株としては、ブレビバクテリウム属
又は、コリネバクテリウム属、又はセラチア属のＬ−バ
リン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンのアンタゴニ
ストに耐性を有する変異株等が従来より知られている。
その内容はＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイ
シン生産に関与するキイ酵素であるところのアセトヒド
ロキシ酸シンターゼが末端生産物であるＬ−バリン、Ｌ
−ロイシン及び／又はＬ−イソロイシンと、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン及び／又はＬ−イソロイシンのアンタ
ゴニストによるフィードバック阻害を受けにくくなった
変異株を用いるものである。
ところが、上記のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−
イソロイシン生産菌の限界は、アセトヒドロキシ酸シン
ターゼをコードする遺伝子がゲノム当り１個であり、い
かにフィードバック阻害を解除しても酵素自身の最大活
性に自ら限界がある。又、各々の生産菌でのフィードバ
ック阻害の解除も容易ではない。
イソロイシン生産菌の限界は、アセトヒドロキシ酸シン
ターゼをコードする遺伝子がゲノム当り１個であり、い
かにフィードバック阻害を解除しても酵素自身の最大活
性に自ら限界がある。又、各々の生産菌でのフィードバ
ック阻害の解除も容易ではない。
本発明は、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロ
イシンの生合成系の代謝調節の人為的制御もしくは打破
によって成立している従来のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン
又はＬ−イソロイシン生産方法の限界の一つである生合
成系の分子数の制限、即ち、遺伝子の制限という欠点を
解除し、更にはフィードバック阻害の解除を容易にする
という方法を提示するものである。具体的には、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシン生合成の共通
のキイ酵素であるアセトヒドロキシ酸シンターゼのＬ−
バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンによるフィー
ドバック阻害の解除とその遺伝子数の増強を目的とし
た、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンを
製造する方法について明らかにするものである。
イシンの生合成系の代謝調節の人為的制御もしくは打破
によって成立している従来のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン
又はＬ−イソロイシン生産方法の限界の一つである生合
成系の分子数の制限、即ち、遺伝子の制限という欠点を
解除し、更にはフィードバック阻害の解除を容易にする
という方法を提示するものである。具体的には、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシン生合成の共通
のキイ酵素であるアセトヒドロキシ酸シンターゼのＬ−
バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンによるフィー
ドバック阻害の解除とその遺伝子数の増強を目的とし
た、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンを
製造する方法について明らかにするものである。
本発明者らは、上記問題点について鋭意検討の結果、
ブレビ属細菌より得たアセトヒドロキシ酸シンターゼを
コードするDNA断片を組み込んだ自立増殖可能なプラス
ミドをコリネホルムのグルタミン酸生産菌（ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムなど）に保有せしめる
事により、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイ
シン生産能が向上することを見いだした。
ブレビ属細菌より得たアセトヒドロキシ酸シンターゼを
コードするDNA断片を組み込んだ自立増殖可能なプラス
ミドをコリネホルムのグルタミン酸生産菌（ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムなど）に保有せしめる
事により、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイ
シン生産能が向上することを見いだした。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子を含むDNA断片
は、ブレビバクテリウム属細菌の染色体DNAより得るこ
とができる。このようにアセトヒドロキシ酸シンターゼ
遺伝子を含むDAN断片等遺伝情報を担ったDNAを与えるも
のをDNA供与菌と称する。
は、ブレビバクテリウム属細菌の染色体DNAより得るこ
とができる。このようにアセトヒドロキシ酸シンターゼ
遺伝子を含むDAN断片等遺伝情報を担ったDNAを与えるも
のをDNA供与菌と称する。
DNA供与菌としては、バリン、ロイシン又はイソロイ
シンのアンタゴニストに対する耐性などの変異を付与す
ることにより、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソ
ロイシンまたはその前駆体の生合成活性が高まったよう
な変異株を用いれば更によい。バリン、ロイシン又はイ
ソロイシンのアンタゴニストの例としては、α−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸、アミノヘキシルイソ吉草酸、
イソロイシンハイドロキサメート、２−チアゾールアラ
ニン、β−ハイドロキシロイシン、トリクロロアラニ
ン、γ−メチルリジン等がある。
シンのアンタゴニストに対する耐性などの変異を付与す
ることにより、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソ
ロイシンまたはその前駆体の生合成活性が高まったよう
な変異株を用いれば更によい。バリン、ロイシン又はイ
ソロイシンのアンタゴニストの例としては、α−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸、アミノヘキシルイソ吉草酸、
イソロイシンハイドロキサメート、２−チアゾールアラ
ニン、β−ハイドロキシロイシン、トリクロロアラニ
ン、γ−メチルリジン等がある。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子を得るには、DN
A供与菌より染色体DNAを分離後、適当にこれを切断し、
得られた染色体DNA断片を適当なプラスミドに挿入した
後、この組み換えプラスミドをブレビバクテリウム属細
菌のアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株に導入し、ア
セトヒドロキシ酸シンターゼ生成能を獲得した形質転換
株を採取すればよい。
A供与菌より染色体DNAを分離後、適当にこれを切断し、
得られた染色体DNA断片を適当なプラスミドに挿入した
後、この組み換えプラスミドをブレビバクテリウム属細
菌のアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株に導入し、ア
セトヒドロキシ酸シンターゼ生成能を獲得した形質転換
株を採取すればよい。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子をブレビバクテ
リウム属細菌の菌体内で自律複製できるベクタープラス
ミド上に挿入してブレビバクテリウム属細菌のDNA受容
菌に導入すれば、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イ
ソロイシン生産能の向上した株を得ることができる。
リウム属細菌の菌体内で自律複製できるベクタープラス
ミド上に挿入してブレビバクテリウム属細菌のDNA受容
菌に導入すれば、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イ
ソロイシン生産能の向上した株を得ることができる。
アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子としては、野生
型のものを用いることができるし、更に変異型の遺伝子
を用いることもできる。変異型遺伝子としては、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンによるフィー
ドバック阻害の程度が軽減されたアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼをコードするように変異されたものが特に好ま
しい。
型のものを用いることができるし、更に変異型の遺伝子
を用いることもできる。変異型遺伝子としては、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンによるフィー
ドバック阻害の程度が軽減されたアセトヒドロキシ酸シ
ンターゼをコードするように変異されたものが特に好ま
しい。
変異型の遺伝子を得るには、DNA供与菌を変異処理し
てもよいが、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子をベ
クタープラスミドに挿入して得た組み換えDNAをDNA受容
菌に導入し、得られた形質転換株を変異処理した方が変
異型遺伝子が得られる可能性が高い。更に、上記組み換
えDNA自体を生体外で変異処理すれば、変異型遺伝子が
得られる効率が最も高い。
てもよいが、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子をベ
クタープラスミドに挿入して得た組み換えDNAをDNA受容
菌に導入し、得られた形質転換株を変異処理した方が変
異型遺伝子が得られる可能性が高い。更に、上記組み換
えDNA自体を生体外で変異処理すれば、変異型遺伝子が
得られる効率が最も高い。
Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンによ
るフィードバック阻害の程度がより軽減されたアセトヒ
ドロキシ酸シンターゼをコードする変異型遺伝子を選別
する方法は、DNA供与菌及び上記組み換えDNAが導入され
た形質転換株のいずれの場合も、また組み換えDNAを変
異処理したときは、変異処理した組み換えDNAをDNA受容
菌に導入して形質転換株を得た後、Ｌ−バリン、Ｌ−ロ
イシン又はＬ−イソロイシンのアンタゴニストに耐性を
獲得したDNA供与菌または形質転換株を選別すればよ
い。
るフィードバック阻害の程度がより軽減されたアセトヒ
ドロキシ酸シンターゼをコードする変異型遺伝子を選別
する方法は、DNA供与菌及び上記組み換えDNAが導入され
た形質転換株のいずれの場合も、また組み換えDNAを変
異処理したときは、変異処理した組み換えDNAをDNA受容
菌に導入して形質転換株を得た後、Ｌ−バリン、Ｌ−ロ
イシン又はＬ−イソロイシンのアンタゴニストに耐性を
獲得したDNA供与菌または形質転換株を選別すればよ
い。
アンタゴニストに耐性を獲得したDNA供与菌又は形質
転換株がＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシ
ンによるフィードバック阻害の程度がより軽減されたア
セトヒドロキシ酸シンターゼをコードする変異型遺伝子
を有するものであることを確認するためには、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンのアンタゴニス
トに耐性を獲得したDNA供与菌または形質転換株より適
宜酵素液を調製し、ピルビン酸を基質として種々の濃度
のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンの存
在下に上記酵素液による２アセト乳酸の生成量を測定す
る。高濃度のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロ
イシンの存在下でも２アセト乳酸の生成活性が高い酵素
液がＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンに
よるフィードバック阻害の程度がより軽減されたアセト
ヒドロキシ酸シンターゼを含有する。
転換株がＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシ
ンによるフィードバック阻害の程度がより軽減されたア
セトヒドロキシ酸シンターゼをコードする変異型遺伝子
を有するものであることを確認するためには、Ｌ−バリ
ン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンのアンタゴニス
トに耐性を獲得したDNA供与菌または形質転換株より適
宜酵素液を調製し、ピルビン酸を基質として種々の濃度
のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンの存
在下に上記酵素液による２アセト乳酸の生成量を測定す
る。高濃度のＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロ
イシンの存在下でも２アセト乳酸の生成活性が高い酵素
液がＬ−バリン、Ｌ−ロイシン又はＬ−イソロイシンに
よるフィードバック阻害の程度がより軽減されたアセト
ヒドロキシ酸シンターゼを含有する。
DNA供与菌、形質転換株または組み換えDNAに変異を与
えるには、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンまたは亜硫酸等の変異誘起剤にDNA供与菌、形
質転換株又は組み換えDNAを晒すかあるいはDNA供与菌、
形質転換株又は組み換えDNAにＸ線、紫外線、γ線等を
照射する等の方法がある。尚、このような遺伝子に変異
を与える方法は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ以外の
いかなる遺伝子についても効率よい変異方法として利用
できる。また宿主がブレビバクテリウム以外の例えばエ
シェリヒア・コリ、コリネホルム・グルタミン酸生産
菌、バチルス・ズブチリス等であっても、上記の遺伝子
に変異を与える方法は利用できる。
えるには、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンまたは亜硫酸等の変異誘起剤にDNA供与菌、形
質転換株又は組み換えDNAを晒すかあるいはDNA供与菌、
形質転換株又は組み換えDNAにＸ線、紫外線、γ線等を
照射する等の方法がある。尚、このような遺伝子に変異
を与える方法は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ以外の
いかなる遺伝子についても効率よい変異方法として利用
できる。また宿主がブレビバクテリウム以外の例えばエ
シェリヒア・コリ、コリネホルム・グルタミン酸生産
菌、バチルス・ズブチリス等であっても、上記の遺伝子
に変異を与える方法は利用できる。
また、アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子のプロモ
ーターオペレーターとして、宿主菌野生型のものを用い
ることもできるし、更にプロモーターオペレーターの変
異株由来のものを用いることもできる。また更に、すで
に他種遺伝子を効率よく発現することが知られている強
力なプロモーターを使用することも可能である。また、
プロモーターオペレーターDNAは他生物由来もしくは化
学的に合成されたものであってもよい。また、プラスミ
ド上で得られた変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼ
は、再び宿主染色体へ導入することも可能であって、ま
た、他の生物由来もしくは化学的に合成された遺伝子の
場合も同様の操作を行うことができる。
ーターオペレーターとして、宿主菌野生型のものを用い
ることもできるし、更にプロモーターオペレーターの変
異株由来のものを用いることもできる。また更に、すで
に他種遺伝子を効率よく発現することが知られている強
力なプロモーターを使用することも可能である。また、
プロモーターオペレーターDNAは他生物由来もしくは化
学的に合成されたものであってもよい。また、プラスミ
ド上で得られた変異型アセトヒドロキシ酸シンターゼ
は、再び宿主染色体へ導入することも可能であって、ま
た、他の生物由来もしくは化学的に合成された遺伝子の
場合も同様の操作を行うことができる。
以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説明する。
実施例１ （１）染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのL-Val
生産菌を50mlのCM2G培地（ポリペプトン10g,Y.E.10g,グ
ルコース5g,NaCl 15gを含む）に植菌し、31℃で一晩振
盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体1g
をリゾチウム・SDSで溶菌させたのちフェノール法によ
り染色体DNAを抽出精製し最終的に5mgのDNAを得た。
生産菌を50mlのCM2G培地（ポリペプトン10g,Y.E.10g,グ
ルコース5g,NaCl 15gを含む）に植菌し、31℃で一晩振
盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体1g
をリゾチウム・SDSで溶菌させたのちフェノール法によ
り染色体DNAを抽出精製し最終的に5mgのDNAを得た。
（２）ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ220（5445bp）を用い、そのDNAを
常法に従い調製した。
常法に従い調製した。
（３）染色体DNAのベクターへの挿入 （１）で得た染色体DNA 30μｇをSau3A Iで部分切断
し、更に２〜６キロベースを切り出した。一方ベクター
DNA 1 μｇを制限エンドヌクレアーゼBamH Iで完全に切
断した。以上両者をタカラライゲーションキットを用い
て結合した。
し、更に２〜６キロベースを切り出した。一方ベクター
DNA 1 μｇを制限エンドヌクレアーゼBamH Iで完全に切
断した。以上両者をタカラライゲーションキットを用い
て結合した。
（４）アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子のクローニ
ング アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を欠失しているブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12403（FER
M P-10140,FERM BP-2507）（Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バ
リンのダブル要求株）を受容菌として用いた。
ング アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性を欠失しているブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12403（FER
M P-10140,FERM BP-2507）（Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バ
リンのダブル要求株）を受容菌として用いた。
形質転換法としては、特開昭61-149082号公報に記載
されているプロトプラスト法を用いた。形質転換株の中
からトリメトプリム抵抗性でかつ、イソロイシン、バリ
ン非要求性となった４株を得た。
されているプロトプラスト法を用いた。形質転換株の中
からトリメトプリム抵抗性でかつ、イソロイシン、バリ
ン非要求性となった４株を得た。
（５）形質転換株のプラスミド解析 上述の４株よりリゾチーム・SDSにより溶菌液を調製
し、DNAを回収した。
し、DNAを回収した。
アガロース電気泳動によりプラスミドDNAを分析した
ところ、いずれもpAJ220より大きなプラスミドで約3kb
のDNA断片が挿入されていることが明らかとなった。こ
れらプラスミドの一つをpAJ220V3と命名した。
ところ、いずれもpAJ220より大きなプラスミドで約3kb
のDNA断片が挿入されていることが明らかとなった。こ
れらプラスミドの一つをpAJ220V3と命名した。
（６）再形質転換 プラスミドpAJ220V3で再びブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムAJ12403を形質転換した。トリメトプ
リム耐性で選択した形質転換株はすべてＬ−イソロイシ
ン、Ｌ−バリンの要求性も失っていた。よって、上述の
3kbのDNA断片上にアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子
が存在していることは明らかである。
トファーメンタムAJ12403を形質転換した。トリメトプ
リム耐性で選択した形質転換株はすべてＬ−イソロイシ
ン、Ｌ−バリンの要求性も失っていた。よって、上述の
3kbのDNA断片上にアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子
が存在していることは明らかである。
（７）形質転換株のアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性 被検株を生産培地（Ａ）で約18時間培養した菌体から
超音波処理により溶菌液を調製し、これを15,000r.p.m.
20分間遠心して上清を得た。
超音波処理により溶菌液を調製し、これを15,000r.p.m.
20分間遠心して上清を得た。
この上清を粗酵素液として用い、65mMりん酸バッファ
ー、100mMピルビン酸ナトリウムを含む反応液中で酵素
反応を行い、生じたアセト乳酸をアセトインに変換した
のち、２−ナフトールで発色させて波長530nmで定量し
た。
ー、100mMピルビン酸ナトリウムを含む反応液中で酵素
反応を行い、生じたアセト乳酸をアセトインに変換した
のち、２−ナフトールで発色させて波長530nmで定量し
た。
表−１にその測定結果を示した。
この結果、pAJ220V3にアセトヒドロキシ酸シンターゼ
遺伝子がクローン化されたことが明らかになった。
遺伝子がクローン化されたことが明らかになった。
（８）pAJ220V3の制限酵素切断地図 挿入された約3kbのDNA断片中にはEcoRv、Pstlサイト
が少なくとも２ケ所及びBcll.EcoRl、Ballサイトが１ケ
所存在する。これらの簡単な制限酵素地図を図−１に示
した。
が少なくとも２ケ所及びBcll.EcoRl、Ballサイトが１ケ
所存在する。これらの簡単な制限酵素地図を図−１に示
した。
実施例２ （１）野生株の形質転換株によるＬ−バリン生産性 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生株
ATCC13869及びブレビバクテリウム・フラバムの野生株A
J1510をpAJ220V3で形質転換して得たAJ12404（FERM P-1
0141,FERM BP-2508）及びAJ12405（FERM P-10142,FERM
BP-2516）は表−２に示したようにＬ−バリンの顕著な
生産性が認められた。
ATCC13869及びブレビバクテリウム・フラバムの野生株A
J1510をpAJ220V3で形質転換して得たAJ12404（FERM P-1
0141,FERM BP-2508）及びAJ12405（FERM P-10142,FERM
BP-2516）は表−２に示したようにＬ−バリンの顕著な
生産性が認められた。
＊生産培地（Ａ）：グルコース100g,硫酸アンモニウム4
5g,リン酸１カリウム1g,硫酸マグネシウム1g,FeSO4・7H
2O 0.01g,MnSO4・7H2O 0.01g,豆濃（総窒素量）0.15g,
ビオチン100μg,ビタミンB1塩酸塩300μｇに蒸留水を加
えてpHを7.2（KOH）に調製した後1Lとし、50ml容の坂口
コルベンフラスコに20ml分注し、オートクレイブ殺菌11
5℃‐10minを行い、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウム1g
を加えた。
5g,リン酸１カリウム1g,硫酸マグネシウム1g,FeSO4・7H
2O 0.01g,MnSO4・7H2O 0.01g,豆濃（総窒素量）0.15g,
ビオチン100μg,ビタミンB1塩酸塩300μｇに蒸留水を加
えてpHを7.2（KOH）に調製した後1Lとし、50ml容の坂口
コルベンフラスコに20ml分注し、オートクレイブ殺菌11
5℃‐10minを行い、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウム1g
を加えた。
実施例３ （１）スレオニンデアミナーゼとの共存によるＬ−イソ
ロイシン生産性 ブレビバクテリウムフラバムの野生株AJ1510にpAJ220
V3と、Ｌ−イソロイシンに脱感作したE.coliのスレオニ
ンデアミナーゼ遺伝子ilvA＊をクローン化したプラスミ
ドpDRlA4とを導入し、両者を共存させた株AJ12406（FER
M P-10143,FERM BP-2509）を取得した。
ロイシン生産性 ブレビバクテリウムフラバムの野生株AJ1510にpAJ220
V3と、Ｌ−イソロイシンに脱感作したE.coliのスレオニ
ンデアミナーゼ遺伝子ilvA＊をクローン化したプラスミ
ドpDRlA4とを導入し、両者を共存させた株AJ12406（FER
M P-10143,FERM BP-2509）を取得した。
AJ12406では、表−３に示すようにスレオニンデアミ
ナーゼ（TD）とアセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）
との比活性が共に野生株に対して上昇し、表−４に示す
ようにそれぞれを単独に導入した場合に比べてＬ−イソ
ロイシンの生産性の増加が認められた。
ナーゼ（TD）とアセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）
との比活性が共に野生株に対して上昇し、表−４に示す
ようにそれぞれを単独に導入した場合に比べてＬ−イソ
ロイシンの生産性の増加が認められた。
＊生産培地：グルコース100g,硫酸アンモニウム50g,リ
ン酸１カリウム1g,硫酸マグネシウム0.4g,FeSO4・7H2O
0.01g,MnSO4・7H2O 0.01g,豆濃（総窒素量）0.6g,ビオ
チン50μg,ビタミンB1塩酸塩3mgに蒸留水を加えてpHを
8.3（KOH）に調整した後1Lとし、50mg容の坂口コルベン
フラスコに20ml分注し、オートクレイブ殺菌115℃‐15m
inを行い、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウム1gを加え
た。
ン酸１カリウム1g,硫酸マグネシウム0.4g,FeSO4・7H2O
0.01g,MnSO4・7H2O 0.01g,豆濃（総窒素量）0.6g,ビオ
チン50μg,ビタミンB1塩酸塩3mgに蒸留水を加えてpHを
8.3（KOH）に調整した後1Lとし、50mg容の坂口コルベン
フラスコに20ml分注し、オートクレイブ殺菌115℃‐15m
inを行い、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウム1gを加え
た。
図−１はプラスミドpAJ220V3の制限酵素切断地図を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 合議体 審判長 吉村 康男 審判官 柿崎 良男 審判官 小島 隆 (56)参考文献 特開 昭61−149082（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−247392（ＪＰ，Ａ) 国際公開87／2984（ＷＯ，Ａ１) Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．186 ｐ．378−384（1982) Ａｂｓｔｒ Ａｎｎｕ Ｍｅｅｔ Ａ ｍ Ｓｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 88 （０）158（1988) Ａｐｐｌ．Ｅｎｕｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ．51 ｐ．1024−７（1986) Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．149 Ｐ．173−174（1984) 石本真他編「メタポリックマップ」 （共立出版株式会社）（1971）Ｐ．34
Claims (5)
- 【請求項１】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムに由来し、少なくとも、２カ所のEcoRV切断部位、２
カ所のPstI切断部位、１カ所のBclI切断部位、１カ所の
EcoRI切断部位、１カ所のBalI切断部位を有する、アセ
トヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子を含有する約3kbのDNA
断片。 - 【請求項２】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ12404（FERMBP−2508）又はAJ12405（FERM BP−25
16）が保持するプラスミドpAJ220V3に由来する請求項１
記載のDNA断片。 - 【請求項３】フィードバック阻害が解除される変異を有
する請求項１又は２記載のDNA断片。 - 【請求項４】請求項１乃至３記載のDNA断片がベクター
と接続されて得られる組換えDNA。 - 【請求項５】請求項４記載の組換えDNAを有する微生
物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63194031A JP2748418B2 (ja) | 1988-08-03 | 1988-08-03 | 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 |
| EP89114207A EP0356739B1 (en) | 1988-08-03 | 1989-08-01 | Recombinant DNA, microorganism carrying said recombinant DNA, and process for producing L-amino acids by the use of said microorganism |
| DE68925083T DE68925083T2 (de) | 1988-08-03 | 1989-08-01 | Rekombinante DNS, diese rekombinante DNS enthaltender Mikroorganismus und Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäure unter Verwendung dieses Mikroorganismus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63194031A JP2748418B2 (ja) | 1988-08-03 | 1988-08-03 | 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0242988A JPH0242988A (ja) | 1990-02-13 |
| JP2748418B2 true JP2748418B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=16317788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63194031A Expired - Fee Related JP2748418B2 (ja) | 1988-08-03 | 1988-08-03 | 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0356739B1 (ja) |
| JP (1) | JP2748418B2 (ja) |
| DE (1) | DE68925083T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008075483A1 (ja) | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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