JPH0575390B2 - - Google Patents
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- JPH0575390B2 JPH0575390B2 JP58071945A JP7194583A JPH0575390B2 JP H0575390 B2 JPH0575390 B2 JP H0575390B2 JP 58071945 A JP58071945 A JP 58071945A JP 7194583 A JP7194583 A JP 7194583A JP H0575390 B2 JPH0575390 B2 JP H0575390B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるＬ−トリプトフアンの製
造法に関する。 発酵法によりＬ−トリプトフアンを製造しよう
とする場合、野性株は殆んど菌体外にＬ−トリプ
トフアンを生産しないので、野性株に人工的に突
然変異を生起せしめてＬ−トリプトフアン生産能
を付与する方法がとられている。 従来知られているＬ−トリプトフアン生産能を
有する人工変異株としては、ブレビバクテリウ
ム、ミクロバクテリウム又はコリネバクテリウム
属の５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変
異株（米国特許3700539）、コリネバクテリウム属
のチロシンとフエニルアラニンを要求し、フエニ
ルアラニンアンタゴニストに耐性を有する変異株
（特公昭51−19037）、バチルス属の５−フルオロ
トリプトフアンに耐性を有する変異株（特開昭49
−85289）、ブレビバクテリウム属の５−メチルト
リプトフアン及びｍ−フルオロトリプトフアンに
耐性を有する変異株（特開昭50−42091）等が知
られている。 一方、最近上述のような人工変異による育種と
異なるところの遺伝子組換え技術をＬ−トリプト
フアン生産菌の育種に利用する試みもいくつか報
告されている。例えば、Appl.Environ.
Microbiol.38，(2)，181−190，（1979）にはエシ
エリヒア・コリのtrp E472遺伝子をもつプラス
ミドを含有するE.coliの特定の変異株が、約1.3
ｇ／のＬ−トリプトフアンを生産したことが記
載されている。又、「日本発酵工学会 昭和55年
度大会講演要旨集170頁（1980）」にもやはりエシ
エリヒア・コリのトリプトフアンオペロンを組み
込んだプラスミドを含有するエシエリヒア・コリ
の変異株が360mg／のＬ−トリプトフアンを生
産したことが記載されている。 本発明者らは、叙上のような従来の発酵法によ
るＬ−トリプトフアンの製造法に対し、コリネホ
ルムグルタミン酸生産菌に属する受容菌にコリネ
ホルムグルタミン酸生産菌より誘導された少なく
ともＬ−トリプトフアンを要求する変異株に導入
されたときに該変異株のＬ−トリプトフアン要求
性を消去せしめうるような遺伝子（以下トリプト
フアン生合成系遺伝子と記す）を含むDNA（デオ
キシリボ核酸）断片、好ましくは、ブレビバクテ
リウム属に属するDNA供与菌より得られるアン
スラニル酸ホスホリボシルトランスフエラーゼを
コードするDNA断片が組み込まれているプラス
ミドを含有せしめることにより、高い収率でＬ−
トリプトフアンを生産するようになつた株が得ら
れることを知つた。 即ち本願発明は、ブレビバクテリウム属に属す
るDNA供与菌より得られるアンスラニル酸ホス
ホリボシルトランスフエラーゼをコードする
DNA断片が、ブレビバクテリウム属細菌の菌体
内で自律複製できるベクタープラスミドに接続さ
れて、ブレビバクテリウム属に属するDNA受容
菌に導入されて得られるＬ−トリプトフアン生産
能を有する微生物を培養し、培養液中に蓄積され
たＬ−トリプトフアンを採取することを特徴とす
るＬ−トリプトフアンの製造法であり、あるいは
また、遺伝子がトリプトフアンアンタゴニストに
耐性を有するブレビバクテリウム属細菌より得ら
れたものである上記発明、DNA供与菌がトリプ
トフアンアンタゴニストに耐性を有するブレビバ
クテリウム属細菌である上記発明、及び、DNA
受容菌がトリプトフアン・アンタゴニストに耐性
を有するブレビバクテリウム属細菌である上記発
明も本願発明である。 トリプトフアン生合成系遺伝子を含むDNA断
片はコリネホルムグルタミン酸生産菌の染色体
DNAより得ることができる（トリプトフアン生
合成系遺伝子を含むDNA断片を与えるものを
DNA供与菌と称する） コリネホルム・バクテリアは好気生、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテリオロジー
第８版599頁（1974）に記載されている。本発明
の宿主菌として利用しうるコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の野性株の例としては次のようなも
のがあげられる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC 13032，13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ
ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC 15354 コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタ
ミン酸生産性を失なつた変異株、あるいは、リジ
ン、アルギニン等のアミノ酸、イノシン等のプリ
ンヌクレオシド、イノシン5′−モノりん酸等のプ
リンヌクレオチド、又はその他の生産物を生産す
る変異株も含まれる。 DNA供与菌としては、トリプトフアンアンタ
ゴニスト耐性などの変異を付与することにより、
トリプトフアンまたはその前駆体の生合成活性が
高まつたような変異株を用いれば更によい。 トリプトフアンアンタゴニストの例としては４
−フルオロ−トリプトフアン（以下４−FTと記
す）、５−フルオロトリプトフアン（以下５−FT
と記す）、６−フルオロ−トリプトフアン、７−
フルオロ−トリプトフアン、４−メチル−トリプ
トフアン、５−メチルトリプトフアン、６−メチ
ル−トリプトフアン、７−メチル−トリプトフア
ン、ナフチルアラニン、インドールアクリル酸、
ナフチールアクリル酸、β−（２−ベンゾチエニ
ール）アラニン、スチリール酢酸、インドール、
トリプトザン等がある。ここにいうトリプトフア
ンの前駆体とは３−デヒドロキシ−Ｄ−アラビノ
−ヘプツロン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ
酸、３−デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキミ酸
−３−リン酸、５−エノールピルビルシキミ酸、
３−リン酸、コリズミ酸、アンスラニル酸、Ｎ−
Ｏ−カルボキシフエニルＤ−リボシルアミン5′−
リン酸、１−（Ｏ−カルボキシフエニルアミノ）−
１−デオキシリブロース5′−リン酸、インドール
−３−グリセロールリン酸などをいう。 このような変異株の例としてはブレビバクテリ
ウム、ミクロバクテリウム又はコリネバクテリウ
ム属の５−メチルトリプトフアンに耐性を有する
変異株（米国特許3700539）、ブレビバクテリウム
属の５−メチルトリプトフアン及びｍ−フルオロ
トリプトフアンに耐性を有する変異株（特開昭50
−42091）等が知られる。 トリプトフアン前駆体の生合成活性が高まつた
ような変異株の例として、Agric.Biol.Chem.39
627（1975）に記載されているブレビバクテリウ
ム・フラバムのアンスラニル酸合成酵素のトリプ
トフアンによるフイードバツク阻害が解除され、
前駆体であるアンスラニル酸の生合成活性が高ま
つた株が得られている。 DNA供与菌としては例えばエシエリヒア・コ
リなどのコリネホルム・グルタミン酸生産菌以外
の菌株も当然用いうる。 トリプトフアン生合成系遺伝子としては３−デ
オキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチユロン酸−７−リ
ン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、３−デヒドロ
キナ酸合成酵素遺伝子、３−デヒドロキナ酸デヒ
ドラターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子、シキミ酸キナーゼ遺伝子、５−エノールピ
ルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素遺伝子、コ
リズミ酸合成酵素遺伝子、アンスラニル酸合成酵
素遺伝子、アンスラニル酸ホスホリボシルトラン
スフエラーゼ遺伝子、Ｎ−（5′−ホスホリボシル）
アンスラニル酸イソメラーゼ遺伝子、インドール
−３−グリセロールリン酸合成酵素遺伝子、トリ
プトフアン合成酵素遺伝子などがあげられるが、
好ましくはアンスラニル酸ホスホリボシルトラン
スフエラーゼである。これらの遺伝子をコリネホ
ルムグルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製でき
るベクタープラスミド上に挿入してコリネホルム
グルタミン酸生産菌に属するDNA受容菌に導入
すれば、トリプトフアン生産能の向上した株を得
ることができる。用いる遺伝子としては野生型の
ものの他前述のようなトリプトフアンアンタゴニ
スト耐性などにより誘導された変異型の遺伝子を
用いると更によい。野生型遺伝子を取得後、これ
が導入されたDNA受容菌に変異処理を施してベ
クター上の遺伝子を改良するか、野生型遺伝子を
含むプラスミドDNAに試験管内で、修飾を施し
て遺伝子を改良することは当然良好な結果を生む
場合がある。ここにいう遺伝子の改良とは、遺伝
子産物であるトリプトフアン生合成系酵素の合成
量が増強される１分子当りの比活性が上昇する、
生成物、最終産物による酵素阻害か軽減または解
除されるなどトリプトフアン生産を促進するよう
な望ましい影響を与える遺伝子の修飾をいう。 具体的にはプロモーター領域の変異または変換
あるいは構造遺伝子の変異、修飾によりこれらは
達せられうる。 トリプトフアン生合成系遺伝子の複数の遺伝子
を同一のベクタープラスミド上に挿入するか、共
存しうる複数のベクター上に別々に挿入したのち
受容菌に導入すればよりよい結果を与える場合が
ある。 DNA受容菌として用いるコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌に属する菌としては、前述したよう
な各種の菌株を用いうる。受容菌としてトリプト
フアン要求性をもつ菌株を用いればその要求性の
消失により容易に、トリプトフアン生合成系遺伝
子の導入された形質転換株を選択することができ
る。またトリプトフアンアンタゴニストに感受性
の株を受容菌として用いた場合、トリプトフアン
アンタゴニスト耐性に関与するトリプトフアン生
合成系遺伝子の導入された形質転換株をトリプト
フアンアンタゴニスト耐性株として容易に選択す
ることができる。より高いトリプトフアン生産能
をもつ形質転換株を得るためには、トリプトフア
ンアンタゴニスト耐性、栄養要求性などの変異を
付与することによつてトリプトフアンまたはその
前駆体の生合成活性が高まつたような変異株を受
容菌として用いるとよりよい結果を与える。 トリプトフアンの菌体外への透過生が改善され
た変異株、トリプトフアンの分解性の低下した変
異株、セリン、グルタミン、ピルビン酸などトリ
プトフアン生合成に素材として供給される代謝産
物の生合成能が高まつたような変異株または組換
え体も当然良い結果を生む場合がある。 使用するベクターとしてはコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌の中で自律複製できるプラスミドで
あればいかなるものでもよい。 例として以下のものがあげられる。 (1) pAM330： (a) 分離源：ブレビバクテリウムラクトフエル
メンタム ATCC 13869 (b) 分子量：3.0メガダルトン（アガロースゲ
ル電気泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下
でのDNA鎖長から計算した） (c) 制限酵素による切断箇所： 第１表参照 (d) 制限酵素切断地図 ： 第１図参照 (e) 性 質 ： クリプテイツクプラスミド 【表】 【表】 (2) pAM286： (a) 分離源：コリネバクテリウムグルタミカム
AJ 11560（FERM−P5485） (b) 分子量：3.0メガダルトン（アガロースゲ
ル電気泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下
でのDNA鎖長から計算した） (c) 制限酵素による切断箇所： 第２表参照 (d) 制限酵素切断地図： 第２図参照 (e) 性 質： フリプテイツクプラスミド 【表】 【表】 (3) pHM1519： (a) 分離源：コリネバクテリウムグルタミカム ATCC 13058 (b) 分子量： 1.8メガダルトン (c) 制限酵素による切断箇所： 第３表参照 (d) 制限酵素切断地図： 第３図参照 (e) 性 質： クリプテイツクプラスミド 【表】 【表】 (4) pAJ655 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ 11882
（FERM−P6517＝FERM−BP136など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第４図参照 (d) 性 質：pAM330とpBR325（Gene ４121
（1978））の複合プラスミド。クロラムフエニ
コール耐性に与る。 (5) pAJ611 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ 11884
（FERM−P6519＝FERM−BP138など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第５図参照 (d) 性 質：pAM281とpBR325の複合プラス
ミド。 クロラムフエニコール耐性に与る。 (6) pAJ440 (a) 宿主菌：バチルスズブチリスAJ 11901
（FERM−BP140＝ATCC 39139など） (b) 分子量： 6.0メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第６図参照 (d) 性 質：pAM330とpUB110（J.Bacteriol.，
134 318（1978）の複合プラスミド。 カナマイシン耐性に与る。 (7) pAJ1844 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11883
（FERMP−6518＝FERMBP−137など） (b) 分子量： 5.4メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第７図参照 (d) 性 質：pHM1519とpBR325の複合プラ
スミド。 クロラムフエニコール耐性に与る。 (8) pAJ3148 (a) 宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミカ
ムSR 8203 ATCC39137など (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第８図参照 (d) 性 質：pHM1519とpUB110との複合プ
ラスミド。 カナマイシン耐性に与る。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で増
殖可能なプラスミドのその他の例としてはpCG1
（特開昭57−134500），pCG2（特開昭58−35197），
pCG4，pCG11（特開昭57−183799）があり、これ
らはいずれも当然使用可能であろう。 DNA供与菌の染色体DNA及び、ベクター
DNAは通常の方法により抽出することができる。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
酵素を用いて切断する。ベクターDNAの開裂は
当該ベクターDNAを一ケ所で切断する制限酵素
を用いて切断するか、複数部位切断する制限酵素
を部分的に作用させることにより達せられる。染
色体DNAについては、制限エンドヌクレアーゼ
による切断が部分的に行われるように反応条件を
調節すれば、多くの種類の制限酵素が使用でき
る。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の方法が使用できる。 一方、ターミナルトランスフエラーゼを用い
て、染色体DNA断片と開裂したベクターDNAと
にデオキシアデニル酸とデオキシチシジル酸、ま
たは、デオキシグアニル酸とデオキシチシジル酸
をそれぞれ付加し、混合したのち、アニーリング
して連結せしめる方法も利用しうる。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの連結物のコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌に属する受容菌への導入は、エシエ
リヒア・コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，
159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し
てDNAの透過性を増す方法、またはバチルス・
ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスの方法でも充分高い頻度を得ることができる
し、特開昭57−183799に記載されたコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属のプロトプ
ラストにポリエチレングリコールまたはポリビニ
ルアルコールと二価金属イオンとの存在下に
DNAをとり込ませる方法も当然利用できる。ポ
リエチレングリコールまたはポリビニルアルコー
ルのかわりに、カルボキシメチルセルロース、デ
キストラン、フイコール、プルロニツクF68（セ
ルバ社）などの添加によつてDNAのとり込みを
促進させる方法でも同等の結果が得られる。 トリプトフアン生合成系遺伝子がベクタープラ
スミドに接続されて、導入された形質転換株を選
択は、トリプトフアン要求性を受容菌とした場合
にはトリプトフアン要求性を失なつた株を選ぶこ
とにより、トリプトフアンアンタゴニスト感受性
菌を受容菌としてトリプトフアンアンタゴニスト
耐性に与るトリプトフアン生合成系遺伝子を導入
する場合は該アンタゴニスト耐性となつた株を選
ぶことにより、容易に達せられるが、トリプトフ
アン生産性の向上を指標として選択することも可
能である。ベクターに薬剤耐性などの遺伝マーカ
ーが存在する場合にはこの形質を併せて選択に用
いれば。より容易に形質転換株を選ぶことができ
る。 得られたＬ−トリプトフアン生産菌を培養する
方法は、従来のＬ−トリプトフアン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては、炭素
源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 かくして培養液中には著量のＬ−トリプトフア
ンが生成蓄積される。培養液よりＬ−トリプトフ
アンを採取するには、通常の方法が適用できる。 実施例 (1) アンスラニル酸ホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ遺伝子を含む染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869を１のCMG培地（ペプトン１
ｇ／ｄ、酵母エキス１ｇ／ｄ、グルコース
0.5ｇ／ｄ、及びNaCl0.5ｇ／ｄを含み、PH
7.2に調整したもの）に植菌し、30℃で約３時間
振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。
この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたのち、
通常のフエノール処理法により、染色体DNAを
抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダルト
ン）を用い、そのDNAを次の様にして調製した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメンタムAJ
12037を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対数
増殖期後期まで培養したのち、リゾチームSDS処
理により溶菌させ、30000×ｇ30分の超遠心によ
り上清を得た。フエノール処理ののち、２容のエ
タノールを加えてDNAを沈澱回収した。これを
少量のTEN緩衝液（20mMトリス塩酸塩、
20mM NaCl，1mM EDTA（PH8.0）に溶解後、
アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出し
てpAJ 1844プラスミドDNA約15μｇを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA2μｇと(2)で得たプラスミ
ドDNA10μｇとを制限エンドヌクレアーゼPst
でそれぞれを37℃，１時間処理し、完全に切断し
た。65℃10分の熱処理後、両反応液を混合し、
ATP及びジチオスレイトール存在下、T4フアー
ジ由来のDNAリガーゼによつて10℃、24時間
DNA鎖の連結反応を行つた。65℃５分の熱処理
後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反
応終了後のDNAを沈澱採取した。 (4) アンスラニル酸ホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ（PRT）遺伝子のクローニング PRT遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・
ラクトフアーメンタムＴ−13（NRRLB−15347）
を受容菌として用いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストトラ
ンスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌株を
５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地（PH
6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリゾチ
ームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図つた。6000×ｇ，10分間遠心
分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと(3)で調製したDNA10μｇを
5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が30％になる様に添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませる為に室温
に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地１mlで洗浄後、SMMP培地１mlに再
懸濁し、形質発現の為、30℃で２時間培養した。
この培養液をPH7.0のプロトプラスト再生培地上
に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留水１
あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン12ｇ，KCl0.5ｇ，グルコース10ｇ，MgCl2・
6H2O8.1ｇ，CaCl2・2H2O2.2ｇ，ペプトン４ｇ，
粉末酵母エキス４ｇ，カザミノ酸（Difco社）１
ｇ，K2HPO40.2ｇ，コハク酸ナトリウム135ｇ，
寒天８ｇ及びクロラムフエニコール3μｇ／mlを
含む。 30℃で２週間培養後、約10000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれ
をトリプトフアンを含まない培地（−Trp培地：
２％グルコース、１％硫酸アンモニウム、0.25％
尿素、0.1％りん酸二水素カリウム、0.04％硫酸
マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、2ppmマン
ガンイオン、200μｇ／サイアミン塩酸塩、50μ
ｇ／ビチオン、0.5％カザミノ酸、PH7.0、寒天
1.8％）にレプリカし、クロラムフエニコール耐
性でかつトリプトフアン要求性の消失した22株を
得た。 (5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌株
を調製し、アガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを検出したところ、３株でベクタ
ーのpAJ 1844よりも明らかに大きなプラスミド
が検出された。 これらのうちの代表株をAJ 12029（FERM−
BP−275）と名付けた。AJ 12029株のもつプラ
スミドを、組換えに用いた制限酵素Pstで切断
するとPRT遺伝子を含むと思われる約1.3メガダ
ルトンのDNA断片が検出された。 (6) 再トランスホーメーシヨン (5)で検出された1.3メガダルトンのDNA断片を
含む組換えプラスミド上にPRT遺伝子が存在す
ることを確認するためこのプラスミドDNAを用
いブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＴ
−13（NRRLB−15347）を再度、形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれ10個を釣り上げトリプトフアン要求性
をテストしたところ、これらのいずれも要求性が
消失しており、上記の組換えプラスミド上に
PRT遺伝子が存在することが明らかとなつた。 (7) 形質転換株のPRT活性 被検株をCMG培地50mlで培養した菌体より、
超音波処理により、溶菌液を調製し、これを
32000×ｇ 30分遠心分離して上清を得た。この
上清を粗酵素液として用い、10mMトリス塩酸塩
（PH7.8）、5μMアンスラニル酸0.25mM PRPP、
2mM塩化マグネシウム、20％グリセロールから
成る酵素反応液を用い、PRT活性を測定した。
反応は22℃で行ない、アンスラニル酸の減少を螢
光光度計で測定（励起320nm、測光395nm）する
ことによつて定量した。第４表に測定結果を示
す。 【表】 第４表の結果、Ｔ−13株ではPRT活性はほと
んど見られず同株で同酵素が欠如していることは
明らかである。このＴ−13株にPRT遺伝子を含
む組換えプラスミドが導入された形質転換株AJ
12029株では野生株の約17倍のPRT活性が観察さ
れた。 (8) 形質転換株のトリプトフアン生産能 上記のAJ 12029株よりPRT遺伝子を含む組換
えプラスミドを(2)の方法で抽出し、(4)に記載した
トランスホーメーシヨン法によりブレビバクテリ
ウム・ラクトフアーメンタムNo.9232株に導入し、
クロラムフエニコール耐性を指標として形質転換
株を選択した。 かくして得られたAJ 12030（FERM−BP276）
及びNo.9232株を培養しトリプトフアン生産能をし
らべたところ第５表に示す結果を得た。 培養はグルコース100ｇ，（NH4）2SO440ｇ，
KH2PO4１ｇ，MgSO4・7H2O0.4ｇ，FeSO4・
7H2O10mg，MnSO4・4H2O10mg，カザミノ酸１
ｇ，ビオチン300μｇ／，サイアミン塩酸塩
200μｇ／，セリン５ｇ，アンスラニル酸５ｇ
及びCaCO350ｇを水１に含むPH7.0の培地３ml
を試験管に分注したものに被検菌株を植えつけ30
℃にて70時間、振盪下に行なつた。培養後、遠心
上清中のＬ−トリプトフアンを液体クロマトグラ
フイーにより定量した。 【表】 なお、上記NO9232株はブレビバクテリウム・
ラクトフアーメンタムATCC 13869株由来のトリ
プトフアンシンセターゼ欠損株の復帰変異株であ
り、ATCC 13869株が上記の生産培地でのトリプ
トフアン生産能が検出されないのに対し５mg／ｄ
以下のトリプトフアンを生産する性質（５mg／
ｄ以下）をもつため本実験に使用した。 No.9232株を得るためには寄託されたAJ 12030
より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プ
ラスミドを除去することが可能である：プラスミ
ドは宿主より自然に失なわれることもあるし、
「除去」操作によつて除くこともできる（Bact.
Rev.，36，p361−405（1972））。 除去操作の一例は以下の通りである：宿主の生
育を不完全に阻害する濃度（２−50mg／ml）のア
クリジンオレンジを含む培地に、１ml当り約104
細胞程度になる様に少量の菌株を接種し宿主菌の
生育を不完全に阻害してから27−35℃で一夜培養
する（J.Bacteriol.，88．261（1964））。培養液を
寒天培地に塗布し、27−42℃で一夜培養する。培
地上に出現したコロニーの多くは、プラスミドが
除去されている可能性が高い。 AJ 12037株はATCC 13869株にpAJ 1844プラ
スミドを(4)に述べたような形質転換法により導入
した株である。 本発明にベクターとして用いたプラスミドpAJ
1844はエシエリヒアコリAJ 11883に導入された
形で微工研に寄託されており（FERMP−6518＝
FERMBP−137）AJ 11883株を対数増殖期後期
まで生育させた後、リゾチーム及びSDSにより溶
菌せしめ、30000×ｇで遠心分離して得られた上
清にポリエチレングリコールを加え、沈澱させた
DNAを塩化セシウム・エチジウムブロミド平衡
密度勾配遠心で分画することにより精製すること
ができる。
造法に関する。 発酵法によりＬ−トリプトフアンを製造しよう
とする場合、野性株は殆んど菌体外にＬ−トリプ
トフアンを生産しないので、野性株に人工的に突
然変異を生起せしめてＬ−トリプトフアン生産能
を付与する方法がとられている。 従来知られているＬ−トリプトフアン生産能を
有する人工変異株としては、ブレビバクテリウ
ム、ミクロバクテリウム又はコリネバクテリウム
属の５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変
異株（米国特許3700539）、コリネバクテリウム属
のチロシンとフエニルアラニンを要求し、フエニ
ルアラニンアンタゴニストに耐性を有する変異株
（特公昭51−19037）、バチルス属の５−フルオロ
トリプトフアンに耐性を有する変異株（特開昭49
−85289）、ブレビバクテリウム属の５−メチルト
リプトフアン及びｍ−フルオロトリプトフアンに
耐性を有する変異株（特開昭50−42091）等が知
られている。 一方、最近上述のような人工変異による育種と
異なるところの遺伝子組換え技術をＬ−トリプト
フアン生産菌の育種に利用する試みもいくつか報
告されている。例えば、Appl.Environ.
Microbiol.38，(2)，181−190，（1979）にはエシ
エリヒア・コリのtrp E472遺伝子をもつプラス
ミドを含有するE.coliの特定の変異株が、約1.3
ｇ／のＬ−トリプトフアンを生産したことが記
載されている。又、「日本発酵工学会 昭和55年
度大会講演要旨集170頁（1980）」にもやはりエシ
エリヒア・コリのトリプトフアンオペロンを組み
込んだプラスミドを含有するエシエリヒア・コリ
の変異株が360mg／のＬ−トリプトフアンを生
産したことが記載されている。 本発明者らは、叙上のような従来の発酵法によ
るＬ−トリプトフアンの製造法に対し、コリネホ
ルムグルタミン酸生産菌に属する受容菌にコリネ
ホルムグルタミン酸生産菌より誘導された少なく
ともＬ−トリプトフアンを要求する変異株に導入
されたときに該変異株のＬ−トリプトフアン要求
性を消去せしめうるような遺伝子（以下トリプト
フアン生合成系遺伝子と記す）を含むDNA（デオ
キシリボ核酸）断片、好ましくは、ブレビバクテ
リウム属に属するDNA供与菌より得られるアン
スラニル酸ホスホリボシルトランスフエラーゼを
コードするDNA断片が組み込まれているプラス
ミドを含有せしめることにより、高い収率でＬ−
トリプトフアンを生産するようになつた株が得ら
れることを知つた。 即ち本願発明は、ブレビバクテリウム属に属す
るDNA供与菌より得られるアンスラニル酸ホス
ホリボシルトランスフエラーゼをコードする
DNA断片が、ブレビバクテリウム属細菌の菌体
内で自律複製できるベクタープラスミドに接続さ
れて、ブレビバクテリウム属に属するDNA受容
菌に導入されて得られるＬ−トリプトフアン生産
能を有する微生物を培養し、培養液中に蓄積され
たＬ−トリプトフアンを採取することを特徴とす
るＬ−トリプトフアンの製造法であり、あるいは
また、遺伝子がトリプトフアンアンタゴニストに
耐性を有するブレビバクテリウム属細菌より得ら
れたものである上記発明、DNA供与菌がトリプ
トフアンアンタゴニストに耐性を有するブレビバ
クテリウム属細菌である上記発明、及び、DNA
受容菌がトリプトフアン・アンタゴニストに耐性
を有するブレビバクテリウム属細菌である上記発
明も本願発明である。 トリプトフアン生合成系遺伝子を含むDNA断
片はコリネホルムグルタミン酸生産菌の染色体
DNAより得ることができる（トリプトフアン生
合成系遺伝子を含むDNA断片を与えるものを
DNA供与菌と称する） コリネホルム・バクテリアは好気生、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテリオロジー
第８版599頁（1974）に記載されている。本発明
の宿主菌として利用しうるコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の野性株の例としては次のようなも
のがあげられる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC 13032，13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ
ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC 15354 コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタ
ミン酸生産性を失なつた変異株、あるいは、リジ
ン、アルギニン等のアミノ酸、イノシン等のプリ
ンヌクレオシド、イノシン5′−モノりん酸等のプ
リンヌクレオチド、又はその他の生産物を生産す
る変異株も含まれる。 DNA供与菌としては、トリプトフアンアンタ
ゴニスト耐性などの変異を付与することにより、
トリプトフアンまたはその前駆体の生合成活性が
高まつたような変異株を用いれば更によい。 トリプトフアンアンタゴニストの例としては４
−フルオロ−トリプトフアン（以下４−FTと記
す）、５−フルオロトリプトフアン（以下５−FT
と記す）、６−フルオロ−トリプトフアン、７−
フルオロ−トリプトフアン、４−メチル−トリプ
トフアン、５−メチルトリプトフアン、６−メチ
ル−トリプトフアン、７−メチル−トリプトフア
ン、ナフチルアラニン、インドールアクリル酸、
ナフチールアクリル酸、β−（２−ベンゾチエニ
ール）アラニン、スチリール酢酸、インドール、
トリプトザン等がある。ここにいうトリプトフア
ンの前駆体とは３−デヒドロキシ−Ｄ−アラビノ
−ヘプツロン酸−７−リン酸、３−デヒドロキナ
酸、３−デヒドロシキミ酸、シキミ酸、シキミ酸
−３−リン酸、５−エノールピルビルシキミ酸、
３−リン酸、コリズミ酸、アンスラニル酸、Ｎ−
Ｏ−カルボキシフエニルＤ−リボシルアミン5′−
リン酸、１−（Ｏ−カルボキシフエニルアミノ）−
１−デオキシリブロース5′−リン酸、インドール
−３−グリセロールリン酸などをいう。 このような変異株の例としてはブレビバクテリ
ウム、ミクロバクテリウム又はコリネバクテリウ
ム属の５−メチルトリプトフアンに耐性を有する
変異株（米国特許3700539）、ブレビバクテリウム
属の５−メチルトリプトフアン及びｍ−フルオロ
トリプトフアンに耐性を有する変異株（特開昭50
−42091）等が知られる。 トリプトフアン前駆体の生合成活性が高まつた
ような変異株の例として、Agric.Biol.Chem.39
627（1975）に記載されているブレビバクテリウ
ム・フラバムのアンスラニル酸合成酵素のトリプ
トフアンによるフイードバツク阻害が解除され、
前駆体であるアンスラニル酸の生合成活性が高ま
つた株が得られている。 DNA供与菌としては例えばエシエリヒア・コ
リなどのコリネホルム・グルタミン酸生産菌以外
の菌株も当然用いうる。 トリプトフアン生合成系遺伝子としては３−デ
オキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチユロン酸−７−リ
ン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、３−デヒドロ
キナ酸合成酵素遺伝子、３−デヒドロキナ酸デヒ
ドラターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子、シキミ酸キナーゼ遺伝子、５−エノールピ
ルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素遺伝子、コ
リズミ酸合成酵素遺伝子、アンスラニル酸合成酵
素遺伝子、アンスラニル酸ホスホリボシルトラン
スフエラーゼ遺伝子、Ｎ−（5′−ホスホリボシル）
アンスラニル酸イソメラーゼ遺伝子、インドール
−３−グリセロールリン酸合成酵素遺伝子、トリ
プトフアン合成酵素遺伝子などがあげられるが、
好ましくはアンスラニル酸ホスホリボシルトラン
スフエラーゼである。これらの遺伝子をコリネホ
ルムグルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製でき
るベクタープラスミド上に挿入してコリネホルム
グルタミン酸生産菌に属するDNA受容菌に導入
すれば、トリプトフアン生産能の向上した株を得
ることができる。用いる遺伝子としては野生型の
ものの他前述のようなトリプトフアンアンタゴニ
スト耐性などにより誘導された変異型の遺伝子を
用いると更によい。野生型遺伝子を取得後、これ
が導入されたDNA受容菌に変異処理を施してベ
クター上の遺伝子を改良するか、野生型遺伝子を
含むプラスミドDNAに試験管内で、修飾を施し
て遺伝子を改良することは当然良好な結果を生む
場合がある。ここにいう遺伝子の改良とは、遺伝
子産物であるトリプトフアン生合成系酵素の合成
量が増強される１分子当りの比活性が上昇する、
生成物、最終産物による酵素阻害か軽減または解
除されるなどトリプトフアン生産を促進するよう
な望ましい影響を与える遺伝子の修飾をいう。 具体的にはプロモーター領域の変異または変換
あるいは構造遺伝子の変異、修飾によりこれらは
達せられうる。 トリプトフアン生合成系遺伝子の複数の遺伝子
を同一のベクタープラスミド上に挿入するか、共
存しうる複数のベクター上に別々に挿入したのち
受容菌に導入すればよりよい結果を与える場合が
ある。 DNA受容菌として用いるコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌に属する菌としては、前述したよう
な各種の菌株を用いうる。受容菌としてトリプト
フアン要求性をもつ菌株を用いればその要求性の
消失により容易に、トリプトフアン生合成系遺伝
子の導入された形質転換株を選択することができ
る。またトリプトフアンアンタゴニストに感受性
の株を受容菌として用いた場合、トリプトフアン
アンタゴニスト耐性に関与するトリプトフアン生
合成系遺伝子の導入された形質転換株をトリプト
フアンアンタゴニスト耐性株として容易に選択す
ることができる。より高いトリプトフアン生産能
をもつ形質転換株を得るためには、トリプトフア
ンアンタゴニスト耐性、栄養要求性などの変異を
付与することによつてトリプトフアンまたはその
前駆体の生合成活性が高まつたような変異株を受
容菌として用いるとよりよい結果を与える。 トリプトフアンの菌体外への透過生が改善され
た変異株、トリプトフアンの分解性の低下した変
異株、セリン、グルタミン、ピルビン酸などトリ
プトフアン生合成に素材として供給される代謝産
物の生合成能が高まつたような変異株または組換
え体も当然良い結果を生む場合がある。 使用するベクターとしてはコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌の中で自律複製できるプラスミドで
あればいかなるものでもよい。 例として以下のものがあげられる。 (1) pAM330： (a) 分離源：ブレビバクテリウムラクトフエル
メンタム ATCC 13869 (b) 分子量：3.0メガダルトン（アガロースゲ
ル電気泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下
でのDNA鎖長から計算した） (c) 制限酵素による切断箇所： 第１表参照 (d) 制限酵素切断地図 ： 第１図参照 (e) 性 質 ： クリプテイツクプラスミド 【表】 【表】 (2) pAM286： (a) 分離源：コリネバクテリウムグルタミカム
AJ 11560（FERM−P5485） (b) 分子量：3.0メガダルトン（アガロースゲ
ル電気泳動上の移動距離と電子顕微鏡観察下
でのDNA鎖長から計算した） (c) 制限酵素による切断箇所： 第２表参照 (d) 制限酵素切断地図： 第２図参照 (e) 性 質： フリプテイツクプラスミド 【表】 【表】 (3) pHM1519： (a) 分離源：コリネバクテリウムグルタミカム ATCC 13058 (b) 分子量： 1.8メガダルトン (c) 制限酵素による切断箇所： 第３表参照 (d) 制限酵素切断地図： 第３図参照 (e) 性 質： クリプテイツクプラスミド 【表】 【表】 (4) pAJ655 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ 11882
（FERM−P6517＝FERM−BP136など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第４図参照 (d) 性 質：pAM330とpBR325（Gene ４121
（1978））の複合プラスミド。クロラムフエニ
コール耐性に与る。 (5) pAJ611 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ 11884
（FERM−P6519＝FERM−BP138など） (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第５図参照 (d) 性 質：pAM281とpBR325の複合プラス
ミド。 クロラムフエニコール耐性に与る。 (6) pAJ440 (a) 宿主菌：バチルスズブチリスAJ 11901
（FERM−BP140＝ATCC 39139など） (b) 分子量： 6.0メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第６図参照 (d) 性 質：pAM330とpUB110（J.Bacteriol.，
134 318（1978）の複合プラスミド。 カナマイシン耐性に与る。 (7) pAJ1844 (a) 宿主菌：エシエリヒア・コリAJ11883
（FERMP−6518＝FERMBP−137など） (b) 分子量： 5.4メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第７図参照 (d) 性 質：pHM1519とpBR325の複合プラ
スミド。 クロラムフエニコール耐性に与る。 (8) pAJ3148 (a) 宿主菌：コリネバクテリウム・グルタミカ
ムSR 8203 ATCC39137など (b) 分子量： 6.6メガダルトン (c) 制限酵素切断地図： 第８図参照 (d) 性 質：pHM1519とpUB110との複合プ
ラスミド。 カナマイシン耐性に与る。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で増
殖可能なプラスミドのその他の例としてはpCG1
（特開昭57−134500），pCG2（特開昭58−35197），
pCG4，pCG11（特開昭57−183799）があり、これ
らはいずれも当然使用可能であろう。 DNA供与菌の染色体DNA及び、ベクター
DNAは通常の方法により抽出することができる。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
酵素を用いて切断する。ベクターDNAの開裂は
当該ベクターDNAを一ケ所で切断する制限酵素
を用いて切断するか、複数部位切断する制限酵素
を部分的に作用させることにより達せられる。染
色体DNAについては、制限エンドヌクレアーゼ
による切断が部分的に行われるように反応条件を
調節すれば、多くの種類の制限酵素が使用でき
る。 かくして得られた染色体DNA断片と、切断さ
れたベクターDNAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の方法が使用できる。 一方、ターミナルトランスフエラーゼを用い
て、染色体DNA断片と開裂したベクターDNAと
にデオキシアデニル酸とデオキシチシジル酸、ま
たは、デオキシグアニル酸とデオキシチシジル酸
をそれぞれ付加し、混合したのち、アニーリング
して連結せしめる方法も利用しうる。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの連結物のコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌に属する受容菌への導入は、エシエ
リヒア・コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，
159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し
てDNAの透過性を増す方法、またはバチルス・
ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスの方法でも充分高い頻度を得ることができる
し、特開昭57−183799に記載されたコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属のプロトプ
ラストにポリエチレングリコールまたはポリビニ
ルアルコールと二価金属イオンとの存在下に
DNAをとり込ませる方法も当然利用できる。ポ
リエチレングリコールまたはポリビニルアルコー
ルのかわりに、カルボキシメチルセルロース、デ
キストラン、フイコール、プルロニツクF68（セ
ルバ社）などの添加によつてDNAのとり込みを
促進させる方法でも同等の結果が得られる。 トリプトフアン生合成系遺伝子がベクタープラ
スミドに接続されて、導入された形質転換株を選
択は、トリプトフアン要求性を受容菌とした場合
にはトリプトフアン要求性を失なつた株を選ぶこ
とにより、トリプトフアンアンタゴニスト感受性
菌を受容菌としてトリプトフアンアンタゴニスト
耐性に与るトリプトフアン生合成系遺伝子を導入
する場合は該アンタゴニスト耐性となつた株を選
ぶことにより、容易に達せられるが、トリプトフ
アン生産性の向上を指標として選択することも可
能である。ベクターに薬剤耐性などの遺伝マーカ
ーが存在する場合にはこの形質を併せて選択に用
いれば。より容易に形質転換株を選ぶことができ
る。 得られたＬ−トリプトフアン生産菌を培養する
方法は、従来のＬ−トリプトフアン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては、炭素
源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース、ラクトース等及びこれらを含有する
澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 かくして培養液中には著量のＬ−トリプトフア
ンが生成蓄積される。培養液よりＬ−トリプトフ
アンを採取するには、通常の方法が適用できる。 実施例 (1) アンスラニル酸ホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ遺伝子を含む染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC 13869を１のCMG培地（ペプトン１
ｇ／ｄ、酵母エキス１ｇ／ｄ、グルコース
0.5ｇ／ｄ、及びNaCl0.5ｇ／ｄを含み、PH
7.2に調整したもの）に植菌し、30℃で約３時間
振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。
この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたのち、
通常のフエノール処理法により、染色体DNAを
抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダルト
ン）を用い、そのDNAを次の様にして調製した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメンタムAJ
12037を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対数
増殖期後期まで培養したのち、リゾチームSDS処
理により溶菌させ、30000×ｇ30分の超遠心によ
り上清を得た。フエノール処理ののち、２容のエ
タノールを加えてDNAを沈澱回収した。これを
少量のTEN緩衝液（20mMトリス塩酸塩、
20mM NaCl，1mM EDTA（PH8.0）に溶解後、
アガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出し
てpAJ 1844プラスミドDNA約15μｇを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA2μｇと(2)で得たプラスミ
ドDNA10μｇとを制限エンドヌクレアーゼPst
でそれぞれを37℃，１時間処理し、完全に切断し
た。65℃10分の熱処理後、両反応液を混合し、
ATP及びジチオスレイトール存在下、T4フアー
ジ由来のDNAリガーゼによつて10℃、24時間
DNA鎖の連結反応を行つた。65℃５分の熱処理
後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反
応終了後のDNAを沈澱採取した。 (4) アンスラニル酸ホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ（PRT）遺伝子のクローニング PRT遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・
ラクトフアーメンタムＴ−13（NRRLB−15347）
を受容菌として用いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストトラ
ンスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌株を
５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地（PH
6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリゾチ
ームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図つた。6000×ｇ，10分間遠心
分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと(3)で調製したDNA10μｇを
5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が30％になる様に添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませる為に室温
に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地１mlで洗浄後、SMMP培地１mlに再
懸濁し、形質発現の為、30℃で２時間培養した。
この培養液をPH7.0のプロトプラスト再生培地上
に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留水１
あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン12ｇ，KCl0.5ｇ，グルコース10ｇ，MgCl2・
6H2O8.1ｇ，CaCl2・2H2O2.2ｇ，ペプトン４ｇ，
粉末酵母エキス４ｇ，カザミノ酸（Difco社）１
ｇ，K2HPO40.2ｇ，コハク酸ナトリウム135ｇ，
寒天８ｇ及びクロラムフエニコール3μｇ／mlを
含む。 30℃で２週間培養後、約10000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれ
をトリプトフアンを含まない培地（−Trp培地：
２％グルコース、１％硫酸アンモニウム、0.25％
尿素、0.1％りん酸二水素カリウム、0.04％硫酸
マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、2ppmマン
ガンイオン、200μｇ／サイアミン塩酸塩、50μ
ｇ／ビチオン、0.5％カザミノ酸、PH7.0、寒天
1.8％）にレプリカし、クロラムフエニコール耐
性でかつトリプトフアン要求性の消失した22株を
得た。 (5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌株
を調製し、アガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを検出したところ、３株でベクタ
ーのpAJ 1844よりも明らかに大きなプラスミド
が検出された。 これらのうちの代表株をAJ 12029（FERM−
BP−275）と名付けた。AJ 12029株のもつプラ
スミドを、組換えに用いた制限酵素Pstで切断
するとPRT遺伝子を含むと思われる約1.3メガダ
ルトンのDNA断片が検出された。 (6) 再トランスホーメーシヨン (5)で検出された1.3メガダルトンのDNA断片を
含む組換えプラスミド上にPRT遺伝子が存在す
ることを確認するためこのプラスミドDNAを用
いブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＴ
−13（NRRLB−15347）を再度、形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれ10個を釣り上げトリプトフアン要求性
をテストしたところ、これらのいずれも要求性が
消失しており、上記の組換えプラスミド上に
PRT遺伝子が存在することが明らかとなつた。 (7) 形質転換株のPRT活性 被検株をCMG培地50mlで培養した菌体より、
超音波処理により、溶菌液を調製し、これを
32000×ｇ 30分遠心分離して上清を得た。この
上清を粗酵素液として用い、10mMトリス塩酸塩
（PH7.8）、5μMアンスラニル酸0.25mM PRPP、
2mM塩化マグネシウム、20％グリセロールから
成る酵素反応液を用い、PRT活性を測定した。
反応は22℃で行ない、アンスラニル酸の減少を螢
光光度計で測定（励起320nm、測光395nm）する
ことによつて定量した。第４表に測定結果を示
す。 【表】 第４表の結果、Ｔ−13株ではPRT活性はほと
んど見られず同株で同酵素が欠如していることは
明らかである。このＴ−13株にPRT遺伝子を含
む組換えプラスミドが導入された形質転換株AJ
12029株では野生株の約17倍のPRT活性が観察さ
れた。 (8) 形質転換株のトリプトフアン生産能 上記のAJ 12029株よりPRT遺伝子を含む組換
えプラスミドを(2)の方法で抽出し、(4)に記載した
トランスホーメーシヨン法によりブレビバクテリ
ウム・ラクトフアーメンタムNo.9232株に導入し、
クロラムフエニコール耐性を指標として形質転換
株を選択した。 かくして得られたAJ 12030（FERM−BP276）
及びNo.9232株を培養しトリプトフアン生産能をし
らべたところ第５表に示す結果を得た。 培養はグルコース100ｇ，（NH4）2SO440ｇ，
KH2PO4１ｇ，MgSO4・7H2O0.4ｇ，FeSO4・
7H2O10mg，MnSO4・4H2O10mg，カザミノ酸１
ｇ，ビオチン300μｇ／，サイアミン塩酸塩
200μｇ／，セリン５ｇ，アンスラニル酸５ｇ
及びCaCO350ｇを水１に含むPH7.0の培地３ml
を試験管に分注したものに被検菌株を植えつけ30
℃にて70時間、振盪下に行なつた。培養後、遠心
上清中のＬ−トリプトフアンを液体クロマトグラ
フイーにより定量した。 【表】 なお、上記NO9232株はブレビバクテリウム・
ラクトフアーメンタムATCC 13869株由来のトリ
プトフアンシンセターゼ欠損株の復帰変異株であ
り、ATCC 13869株が上記の生産培地でのトリプ
トフアン生産能が検出されないのに対し５mg／ｄ
以下のトリプトフアンを生産する性質（５mg／
ｄ以下）をもつため本実験に使用した。 No.9232株を得るためには寄託されたAJ 12030
より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プ
ラスミドを除去することが可能である：プラスミ
ドは宿主より自然に失なわれることもあるし、
「除去」操作によつて除くこともできる（Bact.
Rev.，36，p361−405（1972））。 除去操作の一例は以下の通りである：宿主の生
育を不完全に阻害する濃度（２−50mg／ml）のア
クリジンオレンジを含む培地に、１ml当り約104
細胞程度になる様に少量の菌株を接種し宿主菌の
生育を不完全に阻害してから27−35℃で一夜培養
する（J.Bacteriol.，88．261（1964））。培養液を
寒天培地に塗布し、27−42℃で一夜培養する。培
地上に出現したコロニーの多くは、プラスミドが
除去されている可能性が高い。 AJ 12037株はATCC 13869株にpAJ 1844プラ
スミドを(4)に述べたような形質転換法により導入
した株である。 本発明にベクターとして用いたプラスミドpAJ
1844はエシエリヒアコリAJ 11883に導入された
形で微工研に寄託されており（FERMP−6518＝
FERMBP−137）AJ 11883株を対数増殖期後期
まで生育させた後、リゾチーム及びSDSにより溶
菌せしめ、30000×ｇで遠心分離して得られた上
清にポリエチレングリコールを加え、沈澱させた
DNAを塩化セシウム・エチジウムブロミド平衡
密度勾配遠心で分画することにより精製すること
ができる。
第１図：pAM330の制限酵素切断地図、第２
図：pAM286の制限酵素切断地図、第３図：
pHM1519の制限酵素切断地図、第４図：複合プ
ラスミドpAJ655の制限酵素切断地図、第５図：
複合プラスミドpAJ611の制限酵素切断地図、第
６図：複合プラスミドpAJ1844の制限酵素切断地
図、第７図：複合プラスミドpAJ440の制限酵素
切断地図、第８図：複合プラスミドpAJ3148の制
限酵素切断地図。
図：pAM286の制限酵素切断地図、第３図：
pHM1519の制限酵素切断地図、第４図：複合プ
ラスミドpAJ655の制限酵素切断地図、第５図：
複合プラスミドpAJ611の制限酵素切断地図、第
６図：複合プラスミドpAJ1844の制限酵素切断地
図、第７図：複合プラスミドpAJ440の制限酵素
切断地図、第８図：複合プラスミドpAJ3148の制
限酵素切断地図。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ブレビバクテリウム属に属するDNA供与菌
より得られるアンスラニル酸ホスホリボシルトラ
ンスフエラーゼをコードするDNA断片が、ブレ
ビバクテリウム属細菌の菌体内で自律複製できる
ベクタープラスミドに接続されて、ブレビバクテ
リウム属細菌に属するDNA受容菌に導入されて
得られるＬ−トリプトフアン生産能を有する微生
物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ−トリプト
フアンを採取することを特徴とするＬ−トリプト
フアンの製造法。 ２ 遺伝子がトリプトフアンアンタゴニストに耐
性を有するブレビバクテリウム属細菌より得られ
たものである特許請求の範囲第１項記載の製造
法。 ３ DNA供与菌がトリプトフアンアンタゴニス
トに耐性を有するブレビバクテリウム属細菌であ
る特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ４ DNA受容菌がトリプトフアン・アンタゴニ
ストに耐性を有するブレビバクテリウム属細菌で
ある特許請求の範囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58071945A JPS59196098A (ja) | 1983-04-23 | 1983-04-23 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
| DE84104498T DE3485823T4 (de) | 1983-04-23 | 1984-04-19 | Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan durch Gärung. |
| EP84104498A EP0124048B1 (en) | 1983-04-23 | 1984-04-19 | Method for producing l-tryptophan by fermentation |
| US07/501,329 US5034318A (en) | 1983-04-23 | 1990-03-22 | Method for producing L-tryptophan by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58071945A JPS59196098A (ja) | 1983-04-23 | 1983-04-23 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59196098A JPS59196098A (ja) | 1984-11-07 |
| JPH0575390B2 true JPH0575390B2 (ja) | 1993-10-20 |
Family
ID=13475135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58071945A Granted JPS59196098A (ja) | 1983-04-23 | 1983-04-23 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5034318A (ja) |
| EP (1) | EP0124048B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59196098A (ja) |
| DE (1) | DE3485823T4 (ja) |
Families Citing this family (12)
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
Family Cites Families (7)
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|---|---|---|---|---|
| US4371614A (en) * | 1980-08-22 | 1983-02-01 | Ajinomoto Co., Inc. | E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan |
| JPS57134500A (en) * | 1981-02-12 | 1982-08-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Plasmid pcg1 |
| JPS57186492A (en) * | 1981-04-17 | 1982-11-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Transformation of bacterium |
| JPS57174096A (en) * | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-tryptophan by fermentation method |
| JPS5889194A (ja) * | 1981-11-24 | 1983-05-27 | Ajinomoto Co Inc | 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
| DE3486147T2 (de) * | 1983-02-17 | 1993-10-28 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin. |
| JPS59196098A (ja) * | 1983-04-23 | 1984-11-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
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- 1983-04-23 JP JP58071945A patent/JPS59196098A/ja active Granted
-
1984
- 1984-04-19 DE DE84104498T patent/DE3485823T4/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-19 EP EP84104498A patent/EP0124048B1/en not_active Expired
-
1990
- 1990-03-22 US US07/501,329 patent/US5034318A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3485823T4 (de) | 1993-10-14 |
| DE3485823T2 (de) | 1993-03-11 |
| DE3485823D1 (de) | 1992-08-27 |
| JPS59196098A (ja) | 1984-11-07 |
| EP0124048A2 (en) | 1984-11-07 |
| EP0124048A3 (en) | 1987-05-27 |
| EP0124048B1 (en) | 1992-07-22 |
| US5034318A (en) | 1991-07-23 |
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