JPS63240794A - Ｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、アンスラニル酸を原料とする微生物による
Ｌ−）リプドアアンの製造法に関する。

アンスラニル酸を原料とするＬ−）リグドアアンの製造
法として、バチルス・ズブチリスの５−メチル）−ＩＪ
デトファンに耐性を有する人工変異株を用いる方法が知
られている（特公昭５３−１３５８）。

一方、最近上述のような人工変異による育種と異なると
ころの遺伝子組換え技術をＬ　−トリプトファン生産菌
の育種に利用する試みもいくつか報告されている。例え
ば、Ａｐｐｌ、　ＥｎｖｉｒｏｎＭｌｃｒｏｂｉｏｌ。

３８、（２）、１８１−１９０　、（１９７９）にはエ
シェリヒア・コリのｔｒｐ、　Ｅ　４７２遺伝子をもつ
グラスミドを含有する大腸菌の特定の変異株が、約１．
３　ｇ／ｅのＬ−）リグドアアンを生産し几ことが記載
されている。又、［日本発酵工学会　昭和５５年度大会
講演要旨集１７０頁（１９８０）Ｊにもやはりエシェリ
ヒア・コリのトリプトファンオペロンヲ組み込んだグラ
スミドを含有するエシェリヒア・コリの変異株が３６０
■／ｌのＬ−トリプトファンを生産し九ことが記載され
ている。

本発明者らは、叙上のような従来のＬ−）リグドアアン
の製造法に対し、コリネを細菌の染色体より得たトリプ
トファンオペロンもしくはその一部の遺伝子領域が組み
込まれているベクターを含有しているコリネ型細菌が高
い収率でアンスラニル酸よりＬ−トリプトファンを生産
することを知った。

本発明にいうコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｂａ
ｅｔｅｒｌｍ　）は、パーシースｅマニュアル・オプ・
デターミネイティブ・バクテリオロゾー（Ｂａｒｇｅｙ
ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｌｎａ目ｗｅ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）！　８版５９９頁（１９７
４）に定義されている一部の微生物であり、好気性、ダ
ラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌である
。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述べるよう
なコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本発明においては
、最も好ましいものである。

コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例としては
次のようなものがあげられる。

ブレビバクテリウム・ディパリカタム ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・サラカロリティクムＡＴＣＣ１４
０６６ ブレビバクテリウム番インマリオフィルムＡＴＣＣ１４
０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・ロゼラム　　ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・フラバム　　ＡＴＣＣ１３８２６
プレピパクテリウム会チオダニタリス ＡＴＣＣ１９２４０ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣ０１
３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５
８０６ コリネバクテリウム・カルナエ　ＡＴＣＣ１５９９１コ
リネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２，１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム　　ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムＡＴＣＣ１５
３５４ 本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には上記のよ
うなグルタミン酸生産性を有する野性株のほかにグルタ
ミン酸生産性を有するま之はグルタミン酸生産性を失り
念変異株も含まれる。

ここでいうトリプトファンオペロンとは、プロモーター
、およびアテニュエーター、さらにリーダーペグチドを
コードする領域（ｔｒｐＬ）、７ンスラニル酸シンター
ゼ遺伝子（ＬｒｐＥ　、　ｔｒｐＧ　）、ホスホリホシ
ルアンスラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子（ｔｒｐＤ
）、Ｎ　−（５’−ホスホリボシル）アンスラニル酸イ
ソメラーゼーインドール−３−グリセロールリン酸シン
ターゼ遺伝子（ｔｒｐｃ　）、トリプト７ア／シンター
ゼ遺伝子（ｔｒｐＢ　、　ｔｒｐＡ　）の各構造遺伝子
が隣接して配置され、一つの転写単位として機能してい
るものをいう。

各構造遺伝子を単離する方法は、コリネを細菌のトリプ
トファンオペロン、或いは、各構造遺伝子を有している
株よυ、まず染色体遺伝子を抽出しく例えばＨ，５ａｉ
ｔｏ　ａｎｄ　Ｋ、Ｍｉｕｒａ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂ（ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　７２，６１９（１９６３）
の方法が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断
する。

ついで微生物細胞内で複製し得て、かつブロモ−ター活
性をもつベクターに接続し、得られた組換えＤＮＡを用
いて、コリネ型細菌もしくはその他の微生物で、トリブ
トファン生合成系の構造遺伝子が変異を受け、＃素が活
性を失ない、そのなめてトリシト７アン要求性を示すよ
うになっている変異株を形質転換し、該酵素活性が回復
、上昇し、トリプトファン要求性が消失する菌株を採取
し、これより該構造遺伝子をもつ複合プラスミドを分離
できる。

このような方法でも、幸運てしてオペロン全域を単離で
きる場合もあるが、もしもオペロン全域を単離（クロー
ン化）できなかった場合は、上述の方法により分離した
各構造遺伝子の一部もしくは全部をアイソトープ等でラ
ベルしそれらをプローブにして、シラスミドもしくはフ
ァージベクターを用いて作成したコリネ型細菌の染色体
遺伝子のゾーンパンクからコロニーハイブリダイゼイシ
、ンにより、単離可能である。

染色体遺伝子を切断するには、切断反応時間等を調節し
て切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が使
用できる。

ＤＮＡ供与菌としては、トリプトファンアンタゴニスト
耐性などの変異を付与することにより、トリプトファン
の生合成活性が高まったような変異株を用いれば更によ
い。

トリブトファンアンタゴニストとは、コリネ型細菌の増
殖を抑制するようなものであるが、その抑制はＬ　−ト
１７グト７アンが培地中に共存すれば、全体的または部
分的に解除されるようなものである。例えば、４−フル
オロ−トリブトファン（以下４−ＦＴと記す）、５−フ
ルオロトリブトファン（以下５−ＦＴと記す）、６−フ
ルオロ−トリプトファン、７−フルオロ−トリプトファ
ン、４−メチル−トリプトファン、５−メチルトリシト
ファン、６−メチル−トリシトファン、７−メチル−ト
リシトファン、ナフチルアラニン、インドールアクリル
酸、ナフチ−ルアクリル酸、β−（２−ペンツチェニー
ル）アラニン、スチリール酢酸、インドール、トリグト
ザン等がある。

トリプトファンオペロンとして、野性型のものを用いる
ことができるし、更に変異株の遺伝子を用いることもで
きる。変異株遺伝子として、トリプトファンオペロン中
の各構造遺伝子メトリフトファンによるフィードバック
阻害の程度が軽減するように変異されたものが特に好ま
しい。

ミドに挿入後、得られた組換えＤＮＡ　ｆ：、ＤＮＡ受
容菌に導入し得られ念形質転換株を変異処理しても良い
。更に、上記組換えＤＮＡ自体を生体外で変異処理して
も、変異型遺伝子を得ることもできる。

本発明のうちトリプトファンオペロンもしくはその１部
をトリプトファンの生産に使用する場合に用いるベクタ
ーは、コリネ型細菌細胞内もしくはＥ、　ｃｏｉｌ　、
　Ｂ、　ｓｕｂｔｉｌｉｍにおいて増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれば、以
下のものがあげられる。

（１）　　ｐＡＭ　　３３０　特開昭５８−６７６９９
　　参照（２）　　ＰＡＭ　１５１９　　％開昭５８−
７７８９５　　参照（３）　　ｐＡＪ　　６５５　　％
開昭５８−１９２９００参照（４）　　　ｐＡＪ　　６
１１　　　　　同　　上（５）　　　ｐＡＪ　　１８４
４　　　　　同　　上（６）　　ｐＣＧ　　１　　　特
開昭５７−１３４５００参照（７）　　ｐＣＧ　　２　
　　％開昭５８−３５１９７　　参照（８）　　ｐＣＧ
　　４　　　特開昭５７−１８３７９９参照（９）　　
　ｐＣＧ　　１１　　　　　　　同　　上α０ｐｃｃ１
　　　ｆＦ開　　　　　（Ｍａｕ　ｔ　ｉ　ｎ／Ａｊ　
ｉ　ｃ　ｏ　）（１１）　　ｐＢＬ　１００　　特開　
　　　　（〃）（６）　　ｐＢＲ３２２ α埠　　ｐｃ　　１９４ ベクターＤＮＡの開裂は、当該ＤＮＡを一箇所で切断す
る制限酵素を用いて切断するか、複数部位を切断する制
限酵素を用いて部分的に切断することにより行う。

ベクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限酵素により切断され、または染色体ＤＮＡ切断
７ラグメント及び切断され友ベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続せしめて、ついでグラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライダージョン反応に付される。

このようにして得られ念、染色体ＤＮＡとベクターとの
組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容菌へ導入する
には、エシェリヒア・コＩＪＫ−１２について報告され
ている様な（Ｍａｎｄｅｌ　、　Ｍ、　ａｎｄ）（１ｅ
ｅ。

Ａ、　、　Ｊ、Ｍｏ１．、Ｂｌｏｌ、　、５３　、１５
９（１９７０）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して
ＤＮＡの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリ
スについテ報告されている様に（Ｄｕｎｃａｎ　、　Ｃ
，Ｈ，、Ｗｉ　１ｓｏｎ　、　Ｇｏ　Ａ。

ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ　、Ｆ、　Ｅ、　、　Ｇｏｎ＠、ユ
、１５３（１９７７）　）細胞がＤＮＡを取り込み得る
様になる増殖段階（いわゆるコンピテントセル）に導入
する方法により可能である。あるいは、バチルス・ズブ
チリス、放線菌類および酵母について知られている様に
（Ｃｈａｎｇ　、　Ｓｓ　ａｎｄ　Ｃｈｏｅｎ　、　Ｓ
、　Ｎ、　、　Ｍｏ１ｅｅ、　Ｇｅｎ、　。

Ｇｏｎｅｔ、、　１６＋１１１１　（１９７９）　：Ｂ
ｌｂｂ　１Ｍ、Ｊ、、ＷａｒｄｌＪ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｈ
ｏｐｖｒｏｏｄ　、０．Ａ、　、Ｎａｔｕｒｅ　＊　２
７４　、３９８（１９７８）　；　Ｈｌｎｎｅｎ　、Ａ
ｍ　５Ｈ１ｃｋａ　、　Ｊ、　Ｂ、　ａｎｄＦｒｉｎｋ
。

Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃ１．Ｕ
ＳＡ、７５　１９２９（１９７８））、ＤＮＡ受容菌を
、グラスミドＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストま
たはスフェロプラストにして組換えＤＮＡ受容菌に導入
することも可能である。

プロトゲラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし５％開昭５７−１８３７９９に記載され九コリ
ネバクテリウム属またはグレピパクテリウム属のプロト
ゲラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとり込
ませる方法も当然利用できる。−リエチレングリコール
またはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フィコール、プルロニッ
クＦ６８（セルパ社）などの添加によってＤＮＡのとり
込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。

かくして得られた染色体ＤＮＡ断片とベクターの結合物
の受容菌は、コリネ里劇雨ならばどのようなものでもよ
いが、Ｌ−トリブトファン要求菌を用いれば、形質転換
株を選択する際に好都合である。

もちろんアンスラニル酸からのＬ−トリプトファン生産
能がより高い菌株、あるいはよりＬ　−トリプトファン
生産菌が高い菌株より誘導したＬ−トリブトファン要求
菌を用いれば、より好ましい結果が得られる。

得られ念Ｌ−）−リプドアアン生産菌を用いてＬ−トリ
ブトファンを製造するには、アンスラニル酸を含有する
培地中にＬ−）リプドアアン生産菌を培養する。

使用する培地は、炭酸源、窒素源、無機イオン、更に必
要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有
する通常のものである。炭素源としテハ、グルコース、
シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉
加水分解液、ホエイ、糖蜜等の糖類、酢酸、フマール酸
、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸が用いられる。窒素
源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニ
ウム塩その他が使用できる。

アンスラニル酸は培養当初に培地に添加してもよいし、
Ｌ−トリプトファン生産菌がある程度増殖してから培地
に添加してもよい。アンスラニル酸は、培地中の製産が
一定限度を超えると微生物の増殖等を抑制するので、濃
度が一定限度を超えないように少量ずつを培地に添加し
てもよい。

培養は好気的条件下で培地の−及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ　−ト＋Ｊグトファンの生産蓄積が停止
するまで行なわれる。

培養液又は反応液中に生成されたＬ−トリプトファンは
通常の方法で分離、採取できる。

実施例１゜ アンスラニル酸シンターゼ遺伝子、ホスホリ？ジルアン
スラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子、トリプトファン
シンターゼβサブユニツト遺伝子のクローニング １−１ブレビバクテリウムラクトフエルメンタムのトリ
プトファンオペロンを含む染色体ＤＮＡの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ１１２
２５　（ＦＥＲＭ−Ｐ４３７０　）をｌｌのＣＭＧ培地
（ペグトンＩＬ々ｔ、酵母エキス１１７ｄｔ、グルコー
ス０．５１１／ｄｉ、及びＮａＣｔＯ，５，Ｐ溜を含み
、−７，２に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時
間像盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集め友。

この菌体をリゾチーム・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常
のフェノール処理法により、染色体ＤＮＡを抽出精製し
、最終的に３．５■のＤＮＡを得た。

１−２ベクターＤＮＡの調製 ベクターとしてｐＡＪ１８４４　（分子量５．４メガダ
ルトン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した。

ｔ　ｆ　ｐＡＪ１８４４をプラスミドとして保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ１２０３
７を１００ｒ！ＬｔのＣＭＧ培地だ接種し、３０℃で対
数増殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理
により溶菌させ、３０．ＯＯＯｘｇ、３０分の超遠心に
より上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタノ
ールを加えてＤＮＡを沈澱回収した。これを少量のＴＥ
Ｎ緩衝液（２０ｍＭ）リス塩酸塩、２０ｍＭＮａＣ２，
１ｍＭ　ｇＤＴＡ　（Ｐ）！８．０　）　）に溶解後、
塩化セシウムーエチソウムプロミド密度勾配平衡遠心に
よりプラスミド画分を分離し、最終的にｐＡＪ１８４４
プラスミドＤＮＡ約２００μＩを得た。

１−３染色体Ｉ）ＮＡ断片のベクターへの挿入１−１で
得た染色体ＤＮＡ　１０μｇと１−２で得たプラスミド
ＤＮＡ　５μｇとを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌで
それぞれを３７℃に１時間保持し、切断した。

６５℃に１０分間加熱した後、両反応液を混合し。

ＡＴＰ及びジチオスレイトール存在下、Ｔ４７アーゾ由
来のＤＮＡりが−ゼによって１０℃に２４時間保持しＤ
ＮＡ鎖を連結せしめた。ついで反応液を、６５℃にて５
分間加熱し、反応液Ｉ／ｃ２倍容のエタノールを加えて
連結されたＤＮＡの沈澱を採取した。

１−４アンスラニル酸シンターゼ遺伝子、ホスホリはジ
ルアンスラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子、及びトリ
プト７アンシンターゼβサブユニツト遺伝子のクローニ
ング ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのアンスラニ
ル酸シンターゼ欠損株ＡＳ６０　、ホスホリボシルアン
スラニル酸トランスフェラーゼ欠損株ム３８、）！Ｊグ
トファンシンターゼβサブユニット欠損株屋３０（いず
れもＡＪ１２１２５を親株とし、Ｎ−）ｆルーＮ−ニト
ロ−Ｎ−二トロア／’７ニソンにより変異処理すること
により分離した）をＤＮＡ受容菌として用いた。

形質転換の方法としては、プロトゲラストトランス７オ
ーメーシ、７法を用いた。まず、菌株を５−のＣＭＧ液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、（ニジリンＧを
０．６ユニツト／ｒｎｌ添加後、さらに１．５時間振盪
培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５Ｍシ
ュークロース、２０　ｍＭマレイン酸、２０ｍＭ塩化マ
グネシウム、３．５チペナツセイプロス（Ｄｉｒｅｏ　
）からなるＳＭＭＰ培地（ＰＨ６，５＞０、５　ｍｌで
洗浄し北。次いで１０４侃のりゾチームを含７３ＭＶＰ
培地に懸濁し３０℃で２０時間プロトプラスト化を図っ
た。６０００）ｌ、１０分間遠心分離後、プロトゲラス
トをＳＭＭＰで洗浄しＱ、　５　ｒｎｌのｓｍｐＫ再度
懸濁した。この様にして得られ九グロトデラストと１−
３で調製し之ＤＮＡ　１０μ９を５　ｍＭＥＤＴＡ存在
下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が３０
％になる様に添加しｔ後、ＤＮＡをプロトゲラストに取
り込ませる九めに室温に２分間放置し友。このプロトゲ
ラストをＳＭＭＰ培地１Ｍで洗浄後、ＳＭＭＰ培地１１
１に再懸濁し、形質発現の念め、３０℃で２時間培養し
た。この培養液を−７，０のプロトゲラスト再生培地上
に塗布し念。プロトシラスト再生培地は蒸留水１ｊあた
りトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１２９％Ｋ
Ｃｌ０．５９％グルコース１０．９　、　ＭｇＣｌ２・
６Ｈ２０Ｂ、　１　ｌＩ。

ＣａＣｌ２”２Ｈ２０２，２ｇ、ペプトン４１！、粉末
酵母エキス４Ｊ、カザミノ酸ＣＤｉｒｃｏ社）１１１％
に２ＨＰＯ４０，２９、コハク酸ナトリウム１３５ｇ、
寒天８Ｉｉ及びクロラムフェニコール３μ、！ｉ’／Ｍ
ｔ−含ム。

３０℃で２週間培養後、各受容菌について各々約２５０
００個のクロラムフェニコール耐性コロニーが出現して
きたのでこれを最少培地（２チグルコース、１ｔＩｂ硫
酸アンモニウム、０．３％尿素、０．１チりん酸二水素
カリウム、０．０４％硫酸マグネシウム７水塩、２Ｐｐ
ｍ鉄イオン％２ｐＰｍマンガンイオン、２００μＦｌ／
ｌサイアミン塩酸塩、５０μ９Ａビオチン、カザミノ酸
（Ｄｉｒｃｏ　）　３１／ｌ、クロラムフェニコール１
０μｊｉ／Ｉｌｌ、ＰＨ７，０、寒天１．８％）にレプ
リカし、クロラムフェニコール耐性でかつトリプトファ
ン要求性の消失した株をＡＳ６０を用い九区分から２株
、Ａ３８を用いた区分から１株、４３０を用いた区分か
ら１採得た。

上記５株からグラスミドを抽出し念ところ、いずれのプ
ラスミドもベクターグラスミドｐＡＪ１８４４よりも明
らかに太き（、ＡＳ６０を用いた区分から得九組換えグ
ラスミドをｐｔｒｐＥ３６、ｐｔｒｐＥ４、墓３８を用
いた区分から得た組換えプラスミドをｐｔｒｐＤ３８５
１　、　Ａ　３０を用い九区分から得た組換えプラスミ
ドをｐｔｒｐＢ３０１と名付けた。

１−５再形質転換 １−４で得た組換えプラスミドｐｔｒｐＥ３６、ｐｔｒ
ｐＥ４、ｐｔｒｐＤ３８５１、ｐｔｒｐＢ３０１上に各
々アンスラニル酸シンターゼ遺伝子、ホスホリ？ジルア
ンスラニル酸トランスフェラーゼ遺伝子、トリプトファ
ンシンターゼβサブユニツト遺伝子が存在することを確
認する念め、ｐｔｒｐＥ３６、ｐｔｒｐＥ４をＡＳ６０
に、ｐｔｒｐＤ３８５１を屋３８に、ｐｔｒｐＢ３０１
をＡ３０に再度形質転換した。

生シタクロラムフェニルコール耐性コロニーのうちそれ
ぞれ１０個を釣り上げ、トリプトファン要求性を調べた
。その結果、いずれもが要求性を消失しており、ｐ　ｔ
ｒｐＥ３６、ｐｔｒｐＥ４．にはアンスラニル酸りンタ
ーゼ遺伝子が、ｐ乞ｒｐＤ３８５１　Ｋは、ホスホリメ
シルアンスラニル酸トランスフｚラーゼ遺伝子が、ｐｔ
ｒｐＢ３０１１ｃはトリットファンシンターゼβサブユ
ニツト遺伝子が存在することが明らかになりｉ。ただし
ｐｔｒｐＥ４の形質転換株では栄養要求性の消失の程度
、及び最少培地上でのアンスラニル酸の蓄積がｐｔｒｐ
Ｅ３６の形質転換株に比較して悪＜　、　ｐｔｒｐＥ４
　Ｋハアンスラニル酸シンターゼの遺伝子の一部が欠け
ているのではないかと示唆された。

１−６組換えグラスミドの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地
図の作製 実施例１−２で用い念方法により組換えグラスミドｐｔ
ｒｐＥ３６、ｐｔｒｐＥ４、ｐｔｒｐＤ３８５１、ｐｔ
ｒｐＢ３０１を調製し、常法に従い各種制限酵素で切断
し挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作製した（第１図）
。

実施例２゜ ブレビバクテリウムラクトフェルメンタムのトリプト７
アンオベロン全域のクローニングブレビバクテリウムラ
クトフェルメンタムＡＪ１１２５５から自然突然変異に
より分離した５−フルオロトリブトファン抵抗性の４１
０４１　（トリプトファンによるアンスラニル酸シンタ
ーゼのフィードバック阻害が解除した株）から実施例１
で示し九方法により染色体ＤＮＡを調製し、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ或いは５ａｌＩｓ又はＸｈｏＩで完全に切断し
、Ｅ＊　ｃ　ｏ　ｌ　ｉのベクターｐＵｃ１８　（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ　、　Ｊ、　、　ａｔ　ａｌ、　。

Ｇｅｎｅ、３３，１０３−１１９（１９８５））の各制
限酵素切断部位に連結し、Ｌ　ｃｏｔ　ｉ　ＪＭ１０９
　（Ｍｅｎ　ｓｉｎｇ　＋　Ｊ、　＊ｅｔａ１．．Ｇｅ
ｎ５．３３，１０３−１１９（１９８５））を形質転換
し、Ｘ−Ｇａ１　（５−ｂｒｏｍｏ　−４ｃｈｌｏｒｏ
　−３−１ｎｄｏｌｙｌ−β−ｇａｌａｃＬｏｓｉｄｅ
　）　＋　ＩＰＴＧ　（１ｓｏｐｒｏｐｙｌ　−β−Ｄ
　−ｔｈｉｏ　−ｇａｌａｅｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ
　）、アンピシリンを含むＬ寒天培地にグレーティング
し友。３７℃で２４時間培養後出現した白色コロニー合
計約１５００コロニーをニトロセルロースフィルター上
に釣り上げ念。実施例１で得たアンスラニル酸シ／ター
ゼ遺伝子（ｔｒｐＥ）を有するｐＬｒｐＥ３６の１．２
ｋｂ。

のＰｓｔｒ挿入断片をグローブにして、コロニーノ１イ
プリダイゼイ’／　、　７　（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｒ
　Ｍ、　、Ｗａｌｌｓ　、　Ｊ、：Ｍｅｔｈｏｄｓ　　
ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　＋　６８　＋　３７９
　＊　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　、Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７９）　　）を行ない制限酵素Ｂ
ａｍＨＩを用した区分から１つ、制限酵素５ａｌＩを使
用し九区分から１つのポジティブクローンを得た。Ｂ　
ａｍＨＩ区分から得九組換えシラスミドをｐｔｒｐｇ９
７．５ｓｔＩ区分から得たプラスミドをｐｔｒｐＦＪ２
と名付け、実施例１で示した方法に挿入ＤＮＡ断片の制
限酵素切断地図を作成した（第１図）。

その結果、ｐｔｒｐＥ９７はｐｔｒｐＥ３６、ｐｔｒｐ
Ｄ３８５１　。

ｐｔｒｐＢ３０１の挿入ＰｓｔＩ断片と同じ制限酵素地
図を有するＰｓｔＩ断片を有しており、ｐｔｒｐＥ４２
はｐｔｒｐｇ３６のＰｍｔＩ断片及びｐｔｒｐＤ３８５
１のＰｓｔＩ断片の一部と同じ制限酵素地図を有してい
ることが明らかとなりｆｔ。又、ｐｔｒｐＥ９７とｐｔ
ｒｐＥ４２は共通のＢａｍＨＩ　−５ｓｔＩ断片を有し
ていた。

実施例３ Ｎ−（５−ホスホリゲシル）アンスラニル酸イソメラー
ゼーインドール−３−グリセロールリン酸７ンターゼ遺
伝子（ｔｒｐＣ）のサブクローニング及び）！、１７’
ドアアンシンターゼαサブユニット遺伝子（ｔｒｐＡ）
　　のサブクローニング第１図の組換えグラスミドの挿
入ＤＮＡ断片の制限酵素地図の比較からｔｒｐＤ遺伝子
とＬｒｐＢ遺伝子の間Ｖｃｔｒｐｃ遺伝子が、ｔｒｐＢ
遺伝子の下流にｔｒｐＡ遺伝子が存在するのではないか
と考えられていた。

そこで各遺伝子の存在を確認するため以下の実験を行っ
九。

３−１　ｔｒｐｃ遺伝子のサブクローニング組換えグラ
スミドｐ　ｔ　ｒｐＥ９７から第１図に示しｔ約２　ｋ
ｂ、の５ｓｔＩ−ＥｅｏＲＩ断片を分画し、５ｓｔＩｅ
ＥｃｏＲＩで切断したｐＵｃ１９　（Ｍ＠ｓｓｉｎｇ、
　Ｊ、　、　＠ｔ　ａｔ、　。

Ｇｅｎ５，３３，１０３−１１９．１９８５）に連結し
、ｌａｅプロモーターからの転写が可能になるように配
置した。或いは第１図の約２．６ｋｂ、の５ｓｔＩ−Ｈ
ｌｎｄ　Ｉｌｌ断片を分画し５ｓｔＩ　、　Ｈｌｎｄ　
ｍで切断し７’ｊ　ｐＵ０１８（Ｍｅｓｓ　ｔｎｇ　、
　Ｊｍ　ｔ　ａｔ　ａｌｅ　、　Ｇｅｎ＠、丑、ＬＯ３
−４１９゜１９８５））に連結し、ｌａｃプロモーター
からの転写が可能になるように配置し、Ｆ、、　ｃ　ｏ
　ｌ　ｉ　ＣＧ５ＣＡ３８８９（υＩｐＣ６０１ｐｙｒ
Ｆ２８７　＊　ｈｌｇＧｌ　、　１ａｃＺ５３　、　ｒ
ｐｓＬ８．λ−）を形質転換した。その結果、５ｓｔｌ
−ＥｅｏＲＩ断片、或いは５ｓＬＩ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩ
Ｉ断片を有する組換えプラスミドは、Ｅ、ｃｏｌｉの要
求性を消失させた。

３−２　ｔｒｐＡ遺伝子の存在の確認 組換えグラスミドｐｔｒｐｇ９７から第１図に示し友釣
２．４ｋｂ、のＮｒｕＩ　−ＢａｍＨＩ断片を分画し、
Ｓｍａｌ。

ＢａｍＨＩで切断し几ｐＵｃ１８に連結し、ｌａｃプロ
モーターからの転写が可能になるように配置し、Ｅ、　
ｃｏｌ　ｔ　ＣＧＳＣＡ　５６４４　（ｔｒｐＡ３３　
、　ｒｈａ−７、λ−）を形質転換した。その結果、Ｎ
ｒｕ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片を有する組換えグラスミド
を保持する形質転換株では、トリプトファン要求性の消
失が認められた。

実施例４゜ トリットファンオペロンの塩基配列の決定実施例１で得
られたｐｔｒｐＥ３６、ｐｔｒｐＤ３８５１、ｐｔｒｐ
Ｂ３０１及び実施例２で得られたｐｔｒｐＥ９７を有す
る形質転換株から各々グラスミドの調製を行った。

各々のグラスミドの挿入ＤＮＡ断片についてｐＵ０１８
或いはｐＵｃ１９又はＭ１３ｍｐｌＯ（Ｍｅｓｓｉｎｇ
、Ｊ、　ａｎｄＶｉｅｉｒａ＋Ｊ、＋Ｇｅｎｅ　１９　
ａ　２６９　（１９８２）　）を用いるｄｌｄａｏｘｙ
　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法（Ｓａｎｇ＠
ｒ、　Ｆａ　＠ｔａ１．．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７４　＃５４６３（１９７７））に
より第２図に示した塩基配列決定の九めの戦略図によっ
て、トリブトファンオペロン全塩基配列を決定した。そ
の結果、第１式に示すＤＮＡ塩基配列が得られ、この塩
基配列はプレピノ４クテリウムラクト７エルメンタムの
トリプトファンオペロンの発現に必要なＲＮＡポリメラ
ーゼの結合部位（ｔｒｐプロモーター）、リゲゾームの
結合部位、アンスラニル酸シンターゼ遺伝子（ｔｒｐＥ
。

ｔｒｐＧ　）　、ホスホリ？ジルアンスラニル酸トラン
スフェラーゼ遺伝子（ｔｒｐＤ　）　、Ｎ　−（５−ホ
スホリボシル）アンスラニル酸イソメラーゼーインドー
ル−３−グリセロールリン酸シンターゼ遺伝子（ｔｒｐ
Ｃ）、トリプトファンシンターゼ遺伝子（ｔｒｐＢ　、
　ｔｒｐＡ　）に対応するＤＮＡ配列、及び停止配列（
ターミネータ−）を含むことが判明した。

実施例５ ブレビバクテリウムラクト７エルメンタムＡＪ１２０３
６及びＡＪ１２３３７からのトリプトファンオペロンの
クローニング 染色体ＤＮＡ０調裂源として、トリプトファンオペロン
中の各構造遺伝子のトリプトファンによるフィードバッ
ク阻害の程度が軽減したことによってトリプトファンア
ナログである５Ｐｒに対して抵抗性を有するに至ったト
リブトファン生産菌ブレビバクテリウムラクトフェルメ
ンタムＡＪ１２３３７及び野性型のトリプトファンオペ ロンを有する株ブレビバクテリウム・フェルメンタムＡ
Ｊ１２０３６　（ＦＥＲＭ−Ｐ７５５９　）の両者を、
ベクターＤＮＡとして、Ｅ、ｅｏｌｉとブレビバクテリ
ウムとのシャトルベクターの一糧であるｐＡＪ１８４５
　（分子！５．７メがダルトン、クロラムフェニコール
耐性）を、制限酵素としてＢａｍＨＩを用いて実施例２
と同様な芙験を行い、ＡＪ１２０３６を用い九区分より
１つ、ＡＪ１２３３７を用いた区分より１つのポジティ
ブクローンを得た。

ＡＪ１２０３６区分から得念組換えグラスミドを、ｐＴ
ｓ−１、ＡＪ１２３３７区分から得たグラスミドをｐＴ
Ｒ−１と名付け、実施例１で示した方法に挿入ＤＮＡ断
片の制限酵素切断地図を作成した。

その結果、ｐＴｓ−１、ｐＴＲ−１共にｐｔｒｐＥ９７
の挿入ＢａｍＨＩと同じ制限酵素地図を有するＢａｍＨ
Ｉ断片を有していることが明らかとなった。ｐｔｒｐＥ
９７は、トリプトファンオペロンの全域を有しているの
で、ｐＴＳ−１、ｐＴＲ−１も同様に、トリットファン
オペロンの全域を有していると考えられる。ｐＴｓ−１
とｐＴＲ−１の有するトリプトファンオペロンの違いを
確認する之め、これらのグラスミドをＥ、ｃｏｌｉＣ６
００株に導入したものにつき、プレート上での５ＦＴの
最少生育阻止濃度を検討し、第１表の結果を得た。ｐＴ
Ｒ−１を有する株は明らかに高濃度５ＦＴに対する耐性
を有しており、トリプトファンオ（ロン中の各構造遺伝
子のトリプトファンによるフィードバック阻害の程度が
軽減していると考えられる。

Ｃ６００５μｇ〜 Ｃ６００／ＰＴＳ−１５μ！１〜 実施例６ ス トリプトファンオペロンの増幅によるアンゲラニル酸か
らのトリプトファン生産菌の育種ｐＴＲ−１、ｐＴｓ−
１を用い、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム
ＡＪ１２０３６を１−４で述べ北方法により形質転換し
、クロラムフェニコール耐性を指標として各々形質転換
株を選択し几。

かくして得られたｐＴＲ−１による形質転換株ＡＪ１２
３３８　（ｒＥＲＭ−ｐ　９Ｚ！５１　）及びｐＴＳ−
１による形質転ス 換株ＡＪ１２３３９　（Ｆ’ＥＲＭ−Ｐ　ｑ’Ｚ５’２
）を、アンゲラニル酸を添加した培地で培養し、トリプ
トファン生産能をａ；４べ念ところ第２表に示す結果を
得几。

培養はトリシトファン生産培地（グルコース１３０ｆ　
　（ＮＨ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネ型細菌の染色体より得たトリプトファンオペロン
   もしくはその一部の遺伝子領域が組み込まれているベク
   ターを含有し、アンスラニル酸よりＬ−トリプトファン
   生産能を有するコリネ型細菌を培養し、培地中に生成蓄
   積されたＬ−トリプトファンを採取することを特徴とす
   る、微生物によるＬ−トリプトファンの製造法。