JPH06225776A - リボフラビンの製造法 - Google Patents
リボフラビンの製造法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 効率よく安価にリボフラビンを製造する方法
を提供する。 【構成】 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求性を有
する宿主微生物に導入されたとき、該宿主微生物のリボ
フラビン要求性を相補することができる性質を有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに組み込んでなる組み換え体ＤＮ
Ａを保有する微生物を培地に培養し、培養物中にリボフ
ラビンを生成蓄積させる。
を提供する。 【構成】 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求性を有
する宿主微生物に導入されたとき、該宿主微生物のリボ
フラビン要求性を相補することができる性質を有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに組み込んでなる組み換え体ＤＮ
Ａを保有する微生物を培地に培養し、培養物中にリボフ
ラビンを生成蓄積させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はリボフラビン（ビタミン
Ｂ2 ）の製造法に関する。リボフラビンは医薬品、飼料
添加剤、食品の着色剤等に利用される重要なビタミンで
ある。
Ｂ2 ）の製造法に関する。リボフラビンは医薬品、飼料
添加剤、食品の着色剤等に利用される重要なビタミンで
ある。
【０００２】
【従来の技術】発酵法によるリボフラビンの製造法とし
てはエレモテシウム・アシビイ( Eremothecium ashbyi
i)、アシビア・ゴシッピイ( Ashbya gossypii) 、キャ
ンディダ・フラレリ( Candida flareri)、サッカロマイ
セス・セレビシエ( Saccharomyces cerevisiae) 等を用
いた方法が知られている（プログレス・インダストリア
ル・マイクロバイオロジー、１巻、１３９頁、１９５９
年、特開昭６２−２２８２９７号公報、特開昭６３−１
１２９９６号公報）。
てはエレモテシウム・アシビイ( Eremothecium ashbyi
i)、アシビア・ゴシッピイ( Ashbya gossypii) 、キャ
ンディダ・フラレリ( Candida flareri)、サッカロマイ
セス・セレビシエ( Saccharomyces cerevisiae) 等を用
いた方法が知られている（プログレス・インダストリア
ル・マイクロバイオロジー、１巻、１３９頁、１９５９
年、特開昭６２−２２８２９７号公報、特開昭６３−１
１２９９６号公報）。
【０００３】また、遺伝子組換え技術を利用した方法と
してはバチルス属由来のリボフラビン生合成に関与する
酵素をコードする遺伝子を組み込んだバチルス属細菌を
用いた方法が知られている（特開平３−１１７４８９号
公報）。しかしながら、バチルス属細菌由来のリボフラ
ビン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子に関する
記載があるのみでコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求
性を有する宿主微生物に導入されたとき、宿主微生物の
リボフラビン要求性を相補することができる性質を有す
るＤＮＡについては具体的な記載はない。
してはバチルス属由来のリボフラビン生合成に関与する
酵素をコードする遺伝子を組み込んだバチルス属細菌を
用いた方法が知られている（特開平３−１１７４８９号
公報）。しかしながら、バチルス属細菌由来のリボフラ
ビン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子に関する
記載があるのみでコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求
性を有する宿主微生物に導入されたとき、宿主微生物の
リボフラビン要求性を相補することができる性質を有す
るＤＮＡについては具体的な記載はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、効率
よく安価にリボフラビンを製造することにある。
よく安価にリボフラビンを製造することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、コリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微
生物由来で、リボフラビン要求性を有する宿主微生物に
導入されたとき、該宿主微生物のリボフラビン要求性を
相補することができる性質を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを
ベクターＤＮＡに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、該組
換え体ＤＮＡを保有する微生物および該微生物を培地中
に培養し、培養物中にリボフラビンを生成蓄積させ、該
培養物よりリボフラビンを採取することを特徴とするリ
ボフラビンの製造法を提供することができる。
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微
生物由来で、リボフラビン要求性を有する宿主微生物に
導入されたとき、該宿主微生物のリボフラビン要求性を
相補することができる性質を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを
ベクターＤＮＡに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、該組
換え体ＤＮＡを保有する微生物および該微生物を培地中
に培養し、培養物中にリボフラビンを生成蓄積させ、該
培養物よりリボフラビンを採取することを特徴とするリ
ボフラビンの製造法を提供することができる。
【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
おけるＤＮＡは、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求
性を有する宿主微生物に導入されたとき、該宿主微生物
のリボフラビン要求性を相補することができる性質を有
するＤＮＡである。このＤＮＡは、リボフラビン生合成
に関与する酵素の欠損したリボフラビン要求株に導入さ
れたとき、リボフラビンを含有しない培地に生育しうる
ような性質を該要求株に付与することができるので、リ
ボフラビンの生合成に関与する酵素の遺伝情報を担うＤ
ＮＡを含むことが類推される。
おけるＤＮＡは、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求
性を有する宿主微生物に導入されたとき、該宿主微生物
のリボフラビン要求性を相補することができる性質を有
するＤＮＡである。このＤＮＡは、リボフラビン生合成
に関与する酵素の欠損したリボフラビン要求株に導入さ
れたとき、リボフラビンを含有しない培地に生育しうる
ような性質を該要求株に付与することができるので、リ
ボフラビンの生合成に関与する酵素の遺伝情報を担うＤ
ＮＡを含むことが類推される。
【０００７】本発明のＤＮＡとしては、具体的には配列
番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがあげられ
る。また、該塩基配列の一部が削除されたＤＮＡ、また
は他の塩基配列に置換されたＤＮＡでも、リボフラビン
要求性を相補する性質を微生物に付与することができれ
ば本発明のＤＮＡとして利用できる。例えば、塩基配列
１に示される塩基配列につき、制限酵素ＰｓｔＩおよび
ＢｇｌIIで切断される１４７６番目から４１６４番目の
塩基配列で示される2.７kbのＤＮＡがあげられる。ま
た、このＤＮＡ断片中には、リボフラビン生合成に関与
する少なくとも２種の酵素、グアノシン三リン酸シクロ
ヒドロラーゼおよびリボフラビンシンターゼをコードす
る遺伝子が含まれている。
番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがあげられ
る。また、該塩基配列の一部が削除されたＤＮＡ、また
は他の塩基配列に置換されたＤＮＡでも、リボフラビン
要求性を相補する性質を微生物に付与することができれ
ば本発明のＤＮＡとして利用できる。例えば、塩基配列
１に示される塩基配列につき、制限酵素ＰｓｔＩおよび
ＢｇｌIIで切断される１４７６番目から４１６４番目の
塩基配列で示される2.７kbのＤＮＡがあげられる。ま
た、このＤＮＡ断片中には、リボフラビン生合成に関与
する少なくとも２種の酵素、グアノシン三リン酸シクロ
ヒドロラーゼおよびリボフラビンシンターゼをコードす
る遺伝子が含まれている。
【０００８】該ＤＮＡの供与菌としては、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物が
あげられ、とくにコリネバクテリウム属に属する微生物
が好適である。具体的にはコリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネスＫＹ１３３１３〔Amino acid Nucleic acid,
22,15(1970) 〕があげられる。供与菌から染色体ＤＮ
Ａの調製法としては公知の方法たとえばフェノールを用
いて染色体ＤＮＡを抽出する方法〔バイオキミカ・エ・
バイオフィジカ・アクタ（Biochem. Biophys. Acta.),
72 , 619 (1963) 〕が用いられる。
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物が
あげられ、とくにコリネバクテリウム属に属する微生物
が好適である。具体的にはコリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネスＫＹ１３３１３〔Amino acid Nucleic acid,
22,15(1970) 〕があげられる。供与菌から染色体ＤＮ
Ａの調製法としては公知の方法たとえばフェノールを用
いて染色体ＤＮＡを抽出する方法〔バイオキミカ・エ・
バイオフィジカ・アクタ（Biochem. Biophys. Acta.),
72 , 619 (1963) 〕が用いられる。
【０００９】該ＤＮＡを組み込むためのベクターＤＮＡ
としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属またはエッシェリヒア属菌種中で自律複製できるもの
であればファージ・ベクター、プラスミド・ベクターな
どいずれでも使用できる。好適にはｐＣＧ１、ｐＣＧ
２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３、
ｐＣＥ５４（特開昭５７−１３４５００号公報、特開昭
５７−１８３７９９号公報、特開昭５８−１０５９９９
号公報）などを例示することができる。
としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属またはエッシェリヒア属菌種中で自律複製できるもの
であればファージ・ベクター、プラスミド・ベクターな
どいずれでも使用できる。好適にはｐＣＧ１、ｐＣＧ
２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３、
ｐＣＥ５４（特開昭５７−１３４５００号公報、特開昭
５７−１８３７９９号公報、特開昭５８−１０５９９９
号公報）などを例示することができる。
【００１０】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求性を
有する宿主微生物に導入されたとき、該宿主微生物のリ
ボフラビン要求性を相補することができる性質を有する
ＤＮＡ（供与体ＤＮＡ）をベクターＤＮＡに組み込んで
なる組み換え体ＤＮＡは、供与体ＤＮＡを適当な制限酵
素、たとえばＰｓｔＩ、ＢｇｌIIなどにより切断し、該
制限酵素切断断片をベクターＤＮＡに組み込むことによ
り、種々の組換え体ＤＮＡ混成物とともに得ることがで
きる。組換え体ＤＮＡの受容菌としては、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属し、リボフラ
ビン生合成に関与する酵素の欠損したリボフラビン要求
株であればよい。受容菌の例としては、コリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネスＲＫ１２２株（実施例４）があ
げられる。
リウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求性を
有する宿主微生物に導入されたとき、該宿主微生物のリ
ボフラビン要求性を相補することができる性質を有する
ＤＮＡ（供与体ＤＮＡ）をベクターＤＮＡに組み込んで
なる組み換え体ＤＮＡは、供与体ＤＮＡを適当な制限酵
素、たとえばＰｓｔＩ、ＢｇｌIIなどにより切断し、該
制限酵素切断断片をベクターＤＮＡに組み込むことによ
り、種々の組換え体ＤＮＡ混成物とともに得ることがで
きる。組換え体ＤＮＡの受容菌としては、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属し、リボフラ
ビン生合成に関与する酵素の欠損したリボフラビン要求
株であればよい。受容菌の例としては、コリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネスＲＫ１２２株（実施例４）があ
げられる。
【００１１】こうして得られる種々の組換え体ＤＮＡ混
成物を用いて、前記したような受容菌を形質転換し、目
的とするリボフラビン生合成の酵素活性を有する形質転
換株を得ることができる。組換え体ＤＮＡを受容菌に導
入するには、プロトプラストを用いる方法（特開昭６３
−２４８３９４号公報）、エレクトロポーレイション法
〔W.J.Dower etal, ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acids Research）, 16, 6127(1988)〕、コー
エンらの方法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.
Sci.) USA., 69 , 2110(1979)〕などが用いられる。
成物を用いて、前記したような受容菌を形質転換し、目
的とするリボフラビン生合成の酵素活性を有する形質転
換株を得ることができる。組換え体ＤＮＡを受容菌に導
入するには、プロトプラストを用いる方法（特開昭６３
−２４８３９４号公報）、エレクトロポーレイション法
〔W.J.Dower etal, ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acids Research）, 16, 6127(1988)〕、コー
エンらの方法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.
Sci.) USA., 69 , 2110(1979)〕などが用いられる。
【００１２】リボフラビン要求性を有する宿主微生物に
導入されたとき、該宿主微生物のリボフラビン要求性を
相補する性質を有するＤＮＡの組み込まれた組換え体Ｄ
ＮＡを保有する形質転換株の選択には、リボフラビンを
含有しない培地に生育しうるような菌株を選択すればよ
い。また、供試するベクターＤＮＡが抗生物質耐性など
の選択マーカーを有する場合には、上記の選択用培地に
当該抗生物質を添加する等の方法を用いれば、目的とす
る形質転換株の選択がより一層容易となる。
導入されたとき、該宿主微生物のリボフラビン要求性を
相補する性質を有するＤＮＡの組み込まれた組換え体Ｄ
ＮＡを保有する形質転換株の選択には、リボフラビンを
含有しない培地に生育しうるような菌株を選択すればよ
い。また、供試するベクターＤＮＡが抗生物質耐性など
の選択マーカーを有する場合には、上記の選択用培地に
当該抗生物質を添加する等の方法を用いれば、目的とす
る形質転換株の選択がより一層容易となる。
【００１３】このようにして得られる組換え体ＤＮＡ
は、その保有株から、抽出して、他のコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に導入
したり、あるいは、組み込まれたＤＮＡを切り出し、こ
れを他のベクターＤＮＡに結合して、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に導入
して用いることもできる。このようなコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物の例と
してはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ３４
５４(ATCC6872)、ＫＹ１３３１３などがあげられる。
は、その保有株から、抽出して、他のコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に導入
したり、あるいは、組み込まれたＤＮＡを切り出し、こ
れを他のベクターＤＮＡに結合して、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に導入
して用いることもできる。このようなコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物の例と
してはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ３４
５４(ATCC6872)、ＫＹ１３３１３などがあげられる。
【００１４】また、該ＤＮＡを含むＤＮＡ断片を他菌種
の宿主・ベクター系を用いてサブクローニングすること
により、該遺伝子を他菌種に導入することも可能であ
る。宿主・ベクター系としては従来知られているものは
すべて用いることができるが、例えば、エシェリヒア
属、バチルス属などの宿主・ベクター系があげられる。
具体的には、エシェリヒア・コリＪＭ１０５株〔GENE,
33 , 103(1985)〕があげられる。
の宿主・ベクター系を用いてサブクローニングすること
により、該遺伝子を他菌種に導入することも可能であ
る。宿主・ベクター系としては従来知られているものは
すべて用いることができるが、例えば、エシェリヒア
属、バチルス属などの宿主・ベクター系があげられる。
具体的には、エシェリヒア・コリＪＭ１０５株〔GENE,
33 , 103(1985)〕があげられる。
【００１５】このようにして得られる形質転換株とし
て、具体的には、該ＤＮＡを含むＤＮＡ断片の組み込ま
れた組換え体ＤＮＡ ｐＦＭ２１を保有するコリネバク
テリウム・アンモニアゲネスＫＹ１３３１３／ｐＦＭ２
１およびｐＦＭ４１を保有するコリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネスＫＹ１３３１３／ｐＦＭ４１があげられ
る。ＫＹ１３３１３／ｐＦＭ４１菌株はブダペスト条約
に基づいて平成４年９月９日付で、工業技術院微生物工
業技術研究所（微工研）に、コリネバクテリウム・アン
モニアゲネスＦＭ４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００３）と
して寄託されている。
て、具体的には、該ＤＮＡを含むＤＮＡ断片の組み込ま
れた組換え体ＤＮＡ ｐＦＭ２１を保有するコリネバク
テリウム・アンモニアゲネスＫＹ１３３１３／ｐＦＭ２
１およびｐＦＭ４１を保有するコリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネスＫＹ１３３１３／ｐＦＭ４１があげられ
る。ＫＹ１３３１３／ｐＦＭ４１菌株はブダペスト条約
に基づいて平成４年９月９日付で、工業技術院微生物工
業技術研究所（微工研）に、コリネバクテリウム・アン
モニアゲネスＦＭ４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００３）と
して寄託されている。
【００１６】コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属またはエッシェリヒア属に属し、かつコリネバクテ
リウム属またはブレブバクテリウム属に属する微生物由
来でリボフラビン要求性を有する宿主微生物に導入され
たとき、該宿主微生物のリボフラビン要求性を相補する
ことができる性質を有するＤＮＡとベクターＤＮＡから
なる組換え体ＤＮＡを保有するリボフラビン生産菌を培
養することにより、リボフラビンを効率よく安価に製造
することができる。リボフラビン生産菌の培養は、通常
の微生物の培養方法に従って行う。すなわち、該微生物
を、炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなど
を含有する通常の培地中で、好気的条件下で温度、ｐＨ
などを調節しつつ培養を行えばよい。培地に用いる炭素
源としては、例えばグルコース、フラクトース、シュー
クロース、糖蜜、澱粉、澱粉加水分解物などの炭水化
物、グルコン酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸などの有機
酸、グリシン、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン
酸などのアミノ酸など、該微生物が資化可能なものであ
ればいずれでも使用できる。これらの使用濃度は５〜４
０％が好ましい。
ム属またはエッシェリヒア属に属し、かつコリネバクテ
リウム属またはブレブバクテリウム属に属する微生物由
来でリボフラビン要求性を有する宿主微生物に導入され
たとき、該宿主微生物のリボフラビン要求性を相補する
ことができる性質を有するＤＮＡとベクターＤＮＡから
なる組換え体ＤＮＡを保有するリボフラビン生産菌を培
養することにより、リボフラビンを効率よく安価に製造
することができる。リボフラビン生産菌の培養は、通常
の微生物の培養方法に従って行う。すなわち、該微生物
を、炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなど
を含有する通常の培地中で、好気的条件下で温度、ｐＨ
などを調節しつつ培養を行えばよい。培地に用いる炭素
源としては、例えばグルコース、フラクトース、シュー
クロース、糖蜜、澱粉、澱粉加水分解物などの炭水化
物、グルコン酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸などの有機
酸、グリシン、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン
酸などのアミノ酸など、該微生物が資化可能なものであ
ればいずれでも使用できる。これらの使用濃度は５〜４
０％が好ましい。
【００１７】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どの各種無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプト
ン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティ
ープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールま
たはその消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グル
タミン酸などの各種アミノ酸など種々のものが使用でき
る。その使用濃度は通常０. １〜１０％である。
ニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どの各種無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプト
ン、ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティ
ープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールま
たはその消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グル
タミン酸などの各種アミノ酸など種々のものが使用でき
る。その使用濃度は通常０. １〜１０％である。
【００１８】無機物としてはリン酸二水素カリウム、リ
ン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
硫酸亜鉛、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
さらに、用いる微生物が、アミノ酸、核酸、ビタミンな
どの栄養素を生育に要求する場合には、培地にこれらの
物質を適当量添加するが、前記したような他の培地成分
に伴って培地に供給されれば特に加えなくてもよい。
ン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
硫酸亜鉛、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
さらに、用いる微生物が、アミノ酸、核酸、ビタミンな
どの栄養素を生育に要求する場合には、培地にこれらの
物質を適当量添加するが、前記したような他の培地成分
に伴って培地に供給されれば特に加えなくてもよい。
【００１９】培養は、振盪培養または通気攪拌培養など
の好気的条件下に行われる。培養温度は２０〜４０℃、
培養期間は２４〜１４４時間が好適である。培地のｐＨ
はアンモニア水、尿素液、水酸化ナトリウム溶液などで
中性付近に保つことが望ましい。生成されたリボフラビ
ン量は逆相カラム〔たとえば、ＲＰ−１８（メルク社
製）〕を用いた高速液体クロマトグラフィーにて、発光
波長530nmおよび励起波長450nmにおける蛍光強度を測定
することにより定量することができる。培養物から、リ
ボフラビンを分離・取得するには、通常の精製手段、例
えば沈澱法、イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー
法などの分離精製法が用いられる。
の好気的条件下に行われる。培養温度は２０〜４０℃、
培養期間は２４〜１４４時間が好適である。培地のｐＨ
はアンモニア水、尿素液、水酸化ナトリウム溶液などで
中性付近に保つことが望ましい。生成されたリボフラビ
ン量は逆相カラム〔たとえば、ＲＰ−１８（メルク社
製）〕を用いた高速液体クロマトグラフィーにて、発光
波長530nmおよび励起波長450nmにおける蛍光強度を測定
することにより定量することができる。培養物から、リ
ボフラビンを分離・取得するには、通常の精製手段、例
えば沈澱法、イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー
法などの分離精製法が用いられる。
【００２０】以下に本発明の実施例を示す。
【００２１】
【００２２】実施例１．染色体ＤＮＡの調製 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ１３３１３
を完全培地にアデニンとグリシンを添加したＡIII ＡＧ
培地〔ポリペプトン１０g/l ，肉エキス１０g/l ，酵母
エキス５g/l ，塩化ナトリウム３g/l ，ビオチン３０μ
g/l ，アデニン２０mg/l，グリシン１０g/l(pH7.2)〕に
接種して、３０℃で１０時間振盪培養した。この培養菌
体０. ６ｇをＰ−４緩衝液〔25mM N−トリス（ハイドロ
キシメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン酸(p
H7.6), 70mM 塩化ナトリウム, 5mM 塩化マグネシウム,
5mM 塩化カルシウム, 1.6M D−ソルビトール〕１８mlに
懸濁し、これに、リゾチーム１２mg/ml とアクロモペプ
チダーゼ３mg/ml を含むＰ−４緩衝液を２ml加え、３０
℃で２０時間放置しプロトプラストを調製した。遠心分
離によりプロトプラストを取得し、ＴＳＭＣ緩衝液〔50
mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5), 0.6M コハク酸ナトリウ
ム, 10mM 塩化マグネシウム, 10mM 塩化カルシウム〕
で懸濁後、再び、遠心分離を行い、沈澱として得られた
プロトプラストをＴＥＳ緩衝液〔10mM トリス塩酸緩衝
液(pH8.0), 1mM エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
(EDTA), 10mM 塩化ナトリウム〕１２mlに懸濁し、４℃
で３０分間放置した。これに５Ｍ塩化ナトリウムを０.
２８mlと５mg/ml リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を
０. ０４ml加え、３７℃で２０分間放置した。次に、１
０％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を０. ７２ml加え、４
℃で２時間放置後、６５℃で５分間加熱した。この溶液
にＴＥＳ緩衝液で飽和したフェノール１３mlを加え、十
分に攪拌した。この溶液を遠心分離し、水層を分取し
た。このフェノール抽出の操作をさらに、２回行った
後、等量のクロロホルムを加え、十分に攪拌し、遠心分
離により水層を分取した。得られた溶液１２mlに２. ５
Ｍ酢酸ナトリウム１. ２mlを加え、さらに、エタノール
３０mlを加えた。析出した染色体ＤＮＡをガラス棒で巻
き取り、乾燥させた。次いで、これをＴＥ緩衝液〔10mM
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.０），１mM EDTA 〕１mlに
溶解させた。
を完全培地にアデニンとグリシンを添加したＡIII ＡＧ
培地〔ポリペプトン１０g/l ，肉エキス１０g/l ，酵母
エキス５g/l ，塩化ナトリウム３g/l ，ビオチン３０μ
g/l ，アデニン２０mg/l，グリシン１０g/l(pH7.2)〕に
接種して、３０℃で１０時間振盪培養した。この培養菌
体０. ６ｇをＰ−４緩衝液〔25mM N−トリス（ハイドロ
キシメチル）−メチル−２−アミノエタンスルホン酸(p
H7.6), 70mM 塩化ナトリウム, 5mM 塩化マグネシウム,
5mM 塩化カルシウム, 1.6M D−ソルビトール〕１８mlに
懸濁し、これに、リゾチーム１２mg/ml とアクロモペプ
チダーゼ３mg/ml を含むＰ−４緩衝液を２ml加え、３０
℃で２０時間放置しプロトプラストを調製した。遠心分
離によりプロトプラストを取得し、ＴＳＭＣ緩衝液〔50
mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5), 0.6M コハク酸ナトリウ
ム, 10mM 塩化マグネシウム, 10mM 塩化カルシウム〕
で懸濁後、再び、遠心分離を行い、沈澱として得られた
プロトプラストをＴＥＳ緩衝液〔10mM トリス塩酸緩衝
液(pH8.0), 1mM エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
(EDTA), 10mM 塩化ナトリウム〕１２mlに懸濁し、４℃
で３０分間放置した。これに５Ｍ塩化ナトリウムを０.
２８mlと５mg/ml リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を
０. ０４ml加え、３７℃で２０分間放置した。次に、１
０％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を０. ７２ml加え、４
℃で２時間放置後、６５℃で５分間加熱した。この溶液
にＴＥＳ緩衝液で飽和したフェノール１３mlを加え、十
分に攪拌した。この溶液を遠心分離し、水層を分取し
た。このフェノール抽出の操作をさらに、２回行った
後、等量のクロロホルムを加え、十分に攪拌し、遠心分
離により水層を分取した。得られた溶液１２mlに２. ５
Ｍ酢酸ナトリウム１. ２mlを加え、さらに、エタノール
３０mlを加えた。析出した染色体ＤＮＡをガラス棒で巻
き取り、乾燥させた。次いで、これをＴＥ緩衝液〔10mM
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.０），１mM EDTA 〕１mlに
溶解させた。
【００２３】実施例２．組換え体ＤＮＡの調製 上記実施例１で得られた染色体ＤＮＡ５０μｇを含む液
に制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）４０単位を加え、３７
℃で３時間作用させ、消化反応を行った。一方、特願昭
５７−１８３７９９号に記載の方法にしたがって調製し
たベクターｐＣＧ１１のＤＮＡ５０μｇを含む液に制限
酵素ＰｓｔＩ４０単位を加え、３７℃、３時間処理後、
アルカリホスファターゼ５単位を加え、６５℃で１時間
脱リン酸化反応を行った。両反応液から染色体ＤＮＡお
よびベクターＤＮＡを、上記と同じ方法によりフェノー
ル抽出およびエタノール沈澱により精製した。こうして
得られた染色体ＤＮＡ１０μｇおよびベクターＤＮＡ２
０μｇを、Ｔ４リガーゼ緩衝液〔66mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.6), 6.6mM塩化マグネシウム, 10mMジチオスライト
ールおよび0.1mM ＡＴＰ〕中でＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造製）７００単位を添加し、１６℃で１６時間連結反
応を行い、組換え体ＤＮＡ混成物を得た。
に制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）４０単位を加え、３７
℃で３時間作用させ、消化反応を行った。一方、特願昭
５７−１８３７９９号に記載の方法にしたがって調製し
たベクターｐＣＧ１１のＤＮＡ５０μｇを含む液に制限
酵素ＰｓｔＩ４０単位を加え、３７℃、３時間処理後、
アルカリホスファターゼ５単位を加え、６５℃で１時間
脱リン酸化反応を行った。両反応液から染色体ＤＮＡお
よびベクターＤＮＡを、上記と同じ方法によりフェノー
ル抽出およびエタノール沈澱により精製した。こうして
得られた染色体ＤＮＡ１０μｇおよびベクターＤＮＡ２
０μｇを、Ｔ４リガーゼ緩衝液〔66mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.6), 6.6mM塩化マグネシウム, 10mMジチオスライト
ールおよび0.1mM ＡＴＰ〕中でＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造製）７００単位を添加し、１６℃で１６時間連結反
応を行い、組換え体ＤＮＡ混成物を得た。
【００２４】同様に、染色体ＤＮＡ５０μｇを含む液に
制限酵素ＢｇｌII（宝酒造製）４０単位を加え、３７℃
で３時間作用させ、消化反応を行った。一方、ベクター
ｐＣＧ１１ＤＮＡ５０μｇを含む液に制限酵素ＢｇｌII
４０単位を加え、３７℃、３時間処理後、アルカリホス
ファターゼ５単位を加え、６５℃で１時間脱リン酸化反
応を行った。両反応液から染色体ＤＮＡおよびベクター
ＤＮＡを、上記と同じ方法によりフェノール抽出および
エタノール沈澱により精製した。こうして得られた染色
体ＤＮＡ１０μｇおよびベクターＤＮＡ２０μｇを、Ｔ
４リガーゼ緩衝液中でＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）
７００単位を添加し、１６℃で１６時間連結反応を行
い、組換え体ＤＮＡ混成物を得た。
制限酵素ＢｇｌII（宝酒造製）４０単位を加え、３７℃
で３時間作用させ、消化反応を行った。一方、ベクター
ｐＣＧ１１ＤＮＡ５０μｇを含む液に制限酵素ＢｇｌII
４０単位を加え、３７℃、３時間処理後、アルカリホス
ファターゼ５単位を加え、６５℃で１時間脱リン酸化反
応を行った。両反応液から染色体ＤＮＡおよびベクター
ＤＮＡを、上記と同じ方法によりフェノール抽出および
エタノール沈澱により精製した。こうして得られた染色
体ＤＮＡ１０μｇおよびベクターＤＮＡ２０μｇを、Ｔ
４リガーゼ緩衝液中でＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）
７００単位を添加し、１６℃で１６時間連結反応を行
い、組換え体ＤＮＡ混成物を得た。
【００２５】実施例３．コリネバクテリウム・アンモニ
アゲネス( Corynebacterium ammoniagenes) のリボフラ
ビン要求株の取得 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ１３３１３
株より、リボフラビン要求株ＲＫ１２２株の取得は以下
のように行った。コリネバクテリウム・アンモニアゲネ
スＫＹ１３３１３株をＡIII ＡＧ培地からグリシンを除
いた培地で３０℃で７時間種培養して得られた菌体をＮ
−メチル- Ｎ'-ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン１００
μg/mlで３０℃、９０分間、変異処理を行った。菌体を
集菌、洗浄後、リボフラビンを含まない最少液体培地
〔グルコース ２０ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 0.１ｇ／
ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 0.３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
0.３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ 0.０１ｇ／ｌ、
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０mg／ｌ、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ １mg／ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ４mg／
ｌ、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ 0.２mg／ｌ、Ｌ−システイ
ン４０mg／ｌ、ビタミンＢ1 １０mg／ｌ、Ｃａ−Ｄ−パ
ントテン酸２０mg／ｌ、ビオチン６０μｇ／ｌ、ＮＨ4
Ｃｌ ３ｇ／ｌ、尿素２ｇ／ｌ、アデニン５０mg／ｌ、
（ｐＨ7.２）〕に植菌し、３０℃で培養をおこなった。
対数増殖期にペニシリンＧを１００U/ml添加後、３０℃
でさらに１６時間培養を継続し、リボフラビン要求株の
濃縮を行った。上記の処理を行った菌体をリボフラビン
（５mg／ｌ）を含む最少寒天平板培地およびリボフラビ
ンを含まない最少寒天平板培地〔２％寒天を含んだ最少
液体培地〕に塗布し、リボフラビンを含む最少寒天平板
培地でのみ生育できるリボフラビン要求株ＲＫ１２２株
を取得した。
アゲネス( Corynebacterium ammoniagenes) のリボフラ
ビン要求株の取得 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ１３３１３
株より、リボフラビン要求株ＲＫ１２２株の取得は以下
のように行った。コリネバクテリウム・アンモニアゲネ
スＫＹ１３３１３株をＡIII ＡＧ培地からグリシンを除
いた培地で３０℃で７時間種培養して得られた菌体をＮ
−メチル- Ｎ'-ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン１００
μg/mlで３０℃、９０分間、変異処理を行った。菌体を
集菌、洗浄後、リボフラビンを含まない最少液体培地
〔グルコース ２０ｇ／ｌ、ＫＨ2 ＰＯ4 0.１ｇ／
ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 0.３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
0.３ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ 0.０１ｇ／ｌ、
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０mg／ｌ、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ １mg／ｌ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ４mg／
ｌ、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ 0.２mg／ｌ、Ｌ−システイ
ン４０mg／ｌ、ビタミンＢ1 １０mg／ｌ、Ｃａ−Ｄ−パ
ントテン酸２０mg／ｌ、ビオチン６０μｇ／ｌ、ＮＨ4
Ｃｌ ３ｇ／ｌ、尿素２ｇ／ｌ、アデニン５０mg／ｌ、
（ｐＨ7.２）〕に植菌し、３０℃で培養をおこなった。
対数増殖期にペニシリンＧを１００U/ml添加後、３０℃
でさらに１６時間培養を継続し、リボフラビン要求株の
濃縮を行った。上記の処理を行った菌体をリボフラビン
（５mg／ｌ）を含む最少寒天平板培地およびリボフラビ
ンを含まない最少寒天平板培地〔２％寒天を含んだ最少
液体培地〕に塗布し、リボフラビンを含む最少寒天平板
培地でのみ生育できるリボフラビン要求株ＲＫ１２２株
を取得した。
【００２６】実施例４．組換え体ＤＮＡによるコリネバ
クテリウム・アンモニアゲネス( Corynebacterium ammo
niagenes) のリボフラビン要求株の形質転換 組換え体ＤＮＡによる該菌株の形質転換はエレクトロポ
ーレイション法〔W.J.Dower et al, ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research),16, 6127
(1988)〕によった。
クテリウム・アンモニアゲネス( Corynebacterium ammo
niagenes) のリボフラビン要求株の形質転換 組換え体ＤＮＡによる該菌株の形質転換はエレクトロポ
ーレイション法〔W.J.Dower et al, ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research),16, 6127
(1988)〕によった。
【００２７】すなわち、コリネバクテリウム・アンモニ
アゲネスＲＫ１２２株をＡIII ＡＧ培地に３０℃で５時
間培養し、氷冷した２７２mMシュークロースを含む、１
５％グリセロール溶液で洗浄後、同溶液で懸濁した。こ
の菌体懸濁液に、上記実施例３で制限酵素ＰｓｔＩを用
いて調製した組換え体ＤＮＡ溶液を混合し、ジーン・パ
ルサー装置（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) を
用いたエレクトロポーレイション法（電圧２. ５ｋＶ、
電気容量２５μＦ、抵抗２００Ω）により、形質転換を
行った。
アゲネスＲＫ１２２株をＡIII ＡＧ培地に３０℃で５時
間培養し、氷冷した２７２mMシュークロースを含む、１
５％グリセロール溶液で洗浄後、同溶液で懸濁した。こ
の菌体懸濁液に、上記実施例３で制限酵素ＰｓｔＩを用
いて調製した組換え体ＤＮＡ溶液を混合し、ジーン・パ
ルサー装置（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) を
用いたエレクトロポーレイション法（電圧２. ５ｋＶ、
電気容量２５μＦ、抵抗２００Ω）により、形質転換を
行った。
【００２８】次に、この形質転換株を含む懸濁液をスペ
クチノマイシン１５０μg/l を含む最少培地寒天平板上
に塗抹して３０℃で３日培養した。寒天平板培地上に生
じたコロニーから、形質転換株コリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネスＲＫ１２２／ｐＦＭ２１（スペクチノマ
イシンに耐性で、かつリボフラビン要求性を消失してい
る）を取得した。
クチノマイシン１５０μg/l を含む最少培地寒天平板上
に塗抹して３０℃で３日培養した。寒天平板培地上に生
じたコロニーから、形質転換株コリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネスＲＫ１２２／ｐＦＭ２１（スペクチノマ
イシンに耐性で、かつリボフラビン要求性を消失してい
る）を取得した。
【００２９】同様にして、実施例３で制限酵素ＢｇｌII
を用いて得た組換え体ＤＮＡにより形質転換株ＲＫ１２
２／ｐＦＭ４１を得た。
を用いて得た組換え体ＤＮＡにより形質転換株ＲＫ１２
２／ｐＦＭ４１を得た。
【００３０】 実施例５．形質転換株からのプラスミドの抽出 形質転換株ＲＫ１２２／ｐＦＭ２１およびＲＫ１２２／
ｐＦＭ４１をスペクチノマイシンを含むＡIII ＡＧ培地
２５０mlを用いて培養し、得られた菌体から、実施例２
に記載した方法により、各々約１００μｇのプラスミド
ＤＮＡを得た。これらのプラスミドをｐＦＭ２１および
ｐＦＭ４１と命名した。組換え体プラスミドpFM21 およ
びpFM41 の制限酵素切断地図は図１に示した通りであり
挿入断片の大きさは各々4.７キロベースおよび4.２キロ
ベースである。図１のpFM41 においてカッコに示したBg
l II部位は染色体ＤＮＡの切断の際に認識配列がゆがん
だため、あるいはベクターＤＮＡのホスファターゼ処理
等の原因で、Ｂｇｌ II では切断されなくなっている。
制限酵素Ｐｓｔ I およびＢｇｌ II で切断される2.７
キロベースは両者に共通していた。
ｐＦＭ４１をスペクチノマイシンを含むＡIII ＡＧ培地
２５０mlを用いて培養し、得られた菌体から、実施例２
に記載した方法により、各々約１００μｇのプラスミド
ＤＮＡを得た。これらのプラスミドをｐＦＭ２１および
ｐＦＭ４１と命名した。組換え体プラスミドpFM21 およ
びpFM41 の制限酵素切断地図は図１に示した通りであり
挿入断片の大きさは各々4.７キロベースおよび4.２キロ
ベースである。図１のpFM41 においてカッコに示したBg
l II部位は染色体ＤＮＡの切断の際に認識配列がゆがん
だため、あるいはベクターＤＮＡのホスファターゼ処理
等の原因で、Ｂｇｌ II では切断されなくなっている。
制限酵素Ｐｓｔ I およびＢｇｌ II で切断される2.７
キロベースは両者に共通していた。
【００３１】 実施例６．リボフラビンシンターゼ活性の測定 KY13313/pCG11 株、KY13313/pFM21 株、KY13313/pFM41
株につきメソッド・イン・エンザイモロジー〔(Method
in Enzymology) 122 192(1986) 〕記載の方法によりリ
ボフラビンシンターゼ活性を測定したところ、pFM21 お
よびpFM41 保有株の酵素活性はベクターのみを保有する
株に比べて、それぞれ4.８倍および13倍に上昇してい
た。
株につきメソッド・イン・エンザイモロジー〔(Method
in Enzymology) 122 192(1986) 〕記載の方法によりリ
ボフラビンシンターゼ活性を測定したところ、pFM21 お
よびpFM41 保有株の酵素活性はベクターのみを保有する
株に比べて、それぞれ4.８倍および13倍に上昇してい
た。
【００３２】実施例７．グアノシン三リン酸シクロヒド
ロラーゼ活性の測定 KY13313/pCG11 株、KY13313/pFM21 株およびKY13313/pF
M41 株につき、文献記載の方法〔Archives of Microbio
logy, 124, 255(1980) 〕にてグアノシン三リン酸シク
ロヒドロラーゼ活性を測定したところ、pFM21 およびpF
M41 保有株においてはベクターのみを保有する株に比べ
て、それぞれ6.１倍および4.３倍の酵素活性を示した。
ロラーゼ活性の測定 KY13313/pCG11 株、KY13313/pFM21 株およびKY13313/pF
M41 株につき、文献記載の方法〔Archives of Microbio
logy, 124, 255(1980) 〕にてグアノシン三リン酸シク
ロヒドロラーゼ活性を測定したところ、pFM21 およびpF
M41 保有株においてはベクターのみを保有する株に比べ
て、それぞれ6.１倍および4.３倍の酵素活性を示した。
【００３３】実施例８．リボフラビン要求性を相補する
性質を微生物に付与できるＤＮＡの解析 上記で得られたプラスミドｐＦＭ２１およびｐＦＭ４１
に組み込まれた断片のうち両者に共通する２. ７キロベ
ースを含むＳａｌＩ〜ＳａｌＩの５. ６キロベースの断
片につき、そのＤＮＡ塩基配列をジデオキシ法〔メッシ
ング(Messing.J.),メソッド・イン・エンジモロジー(Me
thod in Enzymol.), 101 ,20(1983) 〕で決定した。そ
の結果を配列番号１に示した。
性質を微生物に付与できるＤＮＡの解析 上記で得られたプラスミドｐＦＭ２１およびｐＦＭ４１
に組み込まれた断片のうち両者に共通する２. ７キロベ
ースを含むＳａｌＩ〜ＳａｌＩの５. ６キロベースの断
片につき、そのＤＮＡ塩基配列をジデオキシ法〔メッシ
ング(Messing.J.),メソッド・イン・エンジモロジー(Me
thod in Enzymol.), 101 ,20(1983) 〕で決定した。そ
の結果を配列番号１に示した。
【００３４】 実施例９．プラスミドのエシェリヒア・コリへの導入 実施例５で得られたプラスミドｐＦＭ２１のＤＮＡ１μ
ｇを含む液に制限酵素ＰｓｔＩ２単位を加え、３７℃で
１時間反応後、アガロースゲル電気泳動により４. ７キ
ロベースの断片を単離精製した。一方、ベクターｐＵＣ
１９（宝酒造製）0.５μｇを含む液にＰｓｔＩ２単位を
加え、３７℃、１時間消化反応をした後、実施例２記載
の方法と同様にアルカリホスファターゼで、脱リン酸化
反応を行った。反応終了後、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱により、ベクターＤＮＡを調製した。こうして得
られたｐＦＭ２１由来のＤＮＡ断片１００ｎｇとベクタ
ーＤＮＡ５０ｎｇを混合し、Ｔ４リガーゼ緩衝液中で、
Ｔ４リガーゼ１００単位を添加し、１６℃で２時間連結
反応を行った。得られた組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌
ＪＭ１０５株をコーエンらの方法〔プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA., 69, 2110(1979)〕により
形質転換し、100mg/l アンピシリン、0.1mM イソプロピ
ルチオガラクトサイドおよび0.004 ％の５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドを含むＬＢ寒天平板培地〔ＬＢ液体培地（バクトトリ
プトン10g/l, 酵母エキス５g/l ，塩化ナトリウム5g/l
(pH7.2) 〕に１. ５％の寒天を含有する培地〕に塗抹し
た。
ｇを含む液に制限酵素ＰｓｔＩ２単位を加え、３７℃で
１時間反応後、アガロースゲル電気泳動により４. ７キ
ロベースの断片を単離精製した。一方、ベクターｐＵＣ
１９（宝酒造製）0.５μｇを含む液にＰｓｔＩ２単位を
加え、３７℃、１時間消化反応をした後、実施例２記載
の方法と同様にアルカリホスファターゼで、脱リン酸化
反応を行った。反応終了後、フェノール抽出、エタノー
ル沈澱により、ベクターＤＮＡを調製した。こうして得
られたｐＦＭ２１由来のＤＮＡ断片１００ｎｇとベクタ
ーＤＮＡ５０ｎｇを混合し、Ｔ４リガーゼ緩衝液中で、
Ｔ４リガーゼ１００単位を添加し、１６℃で２時間連結
反応を行った。得られた組換え体ＤＮＡを用いて大腸菌
ＪＭ１０５株をコーエンらの方法〔プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA., 69, 2110(1979)〕により
形質転換し、100mg/l アンピシリン、0.1mM イソプロピ
ルチオガラクトサイドおよび0.004 ％の５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドを含むＬＢ寒天平板培地〔ＬＢ液体培地（バクトトリ
プトン10g/l, 酵母エキス５g/l ，塩化ナトリウム5g/l
(pH7.2) 〕に１. ５％の寒天を含有する培地〕に塗抹し
た。
【００３５】得られた白色を呈する形質転換株から、プ
ラスミドＤＮＡをManiatisらの著書〔モレキュラー・ク
ローニング(Molecular Cloning A Laboratory Manual,
ColdSpring Harbor Laboratory)(1982)〕に記載された
方法により分離精製した。プラスミドＤＮＡの構造を制
限酵素による消化実験により解析し、ｐＵＣ１９のｌａ
ｃプロモーターの下流にｐＦＭ２１由来のリボフラビン
生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片が挿入された図２に示す構造であるものを選択しｐ
ＦＭ２０１と命名した。
ラスミドＤＮＡをManiatisらの著書〔モレキュラー・ク
ローニング(Molecular Cloning A Laboratory Manual,
ColdSpring Harbor Laboratory)(1982)〕に記載された
方法により分離精製した。プラスミドＤＮＡの構造を制
限酵素による消化実験により解析し、ｐＵＣ１９のｌａ
ｃプロモーターの下流にｐＦＭ２１由来のリボフラビン
生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片が挿入された図２に示す構造であるものを選択しｐ
ＦＭ２０１と命名した。
【００３６】実施例１０．エシェリヒア・コリの形質転
換株を用いるリボフラビンの生産 実施例９で得られた形質転換株JM105/pFM201を100mg/l
のアンピシリンを含有する８mlのＬＢ液体培地に接種
し、３０℃で１６時間培養した。得られた培養液0.08ml
を100mg/l のアンピシリンを含有する８mlの最少培地
（KH2PO4 3g/l,NaCl5g/l, NH4Cl 1g/l, NaHPO4 6g/l, M
gSO4 ・7H2O 0.25g/l, ビタミンB1 4mg/l, グルコース3g
/l）に接種し、３７℃で２４時間培養した。培養液中の
リボフラビンの蓄積量は１４. ４mg/lであった。同一条
件下、ベクターのみを保持する大腸菌JM105/pUC19 の培
養液中には０. ３mg/lのリボフラビンが含まれていた。
換株を用いるリボフラビンの生産 実施例９で得られた形質転換株JM105/pFM201を100mg/l
のアンピシリンを含有する８mlのＬＢ液体培地に接種
し、３０℃で１６時間培養した。得られた培養液0.08ml
を100mg/l のアンピシリンを含有する８mlの最少培地
（KH2PO4 3g/l,NaCl5g/l, NH4Cl 1g/l, NaHPO4 6g/l, M
gSO4 ・7H2O 0.25g/l, ビタミンB1 4mg/l, グルコース3g
/l）に接種し、３７℃で２４時間培養した。培養液中の
リボフラビンの蓄積量は１４. ４mg/lであった。同一条
件下、ベクターのみを保持する大腸菌JM105/pUC19 の培
養液中には０. ３mg/lのリボフラビンが含まれていた。
【００３７】実施例１１．コリネバクテリウム・アンモ
ニアゲネスの形質転換株を用いるリボフラビンの生産 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ１３３１３
を実施例５で取得したｐＦＭ４１のＤＮＡを用いて、実
施例４に記載した方法により形質転換し、形質転換株を
含む懸濁液を１５０μg/mlのスペクチノマイシンを含む
培地に塗沫して、３０℃で３日間培養し、生じたコロニ
ーからスペクチノマイシンに耐性な形質転換株コリネバ
クテリウム・アンモニアゲネスＦＭ４１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４００３）を取得した。
ニアゲネスの形質転換株を用いるリボフラビンの生産 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ１３３１３
を実施例５で取得したｐＦＭ４１のＤＮＡを用いて、実
施例４に記載した方法により形質転換し、形質転換株を
含む懸濁液を１５０μg/mlのスペクチノマイシンを含む
培地に塗沫して、３０℃で３日間培養し、生じたコロニ
ーからスペクチノマイシンに耐性な形質転換株コリネバ
クテリウム・アンモニアゲネスＦＭ４１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４００３）を取得した。
【００３８】次に、種培地〔ポリペプトン１０g/l ，肉
エキス１０g/l ，酵母エキス５g/l，塩化ナトリウム３g
/l ，ビオチン３０μg/l ，アデニン２０mg/l，スペク
チノマイシン１５０mg/l(pH7.2) 〕８mlを含む太型試験
管に、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＦＭ４１
株を一白金耳接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。
この培養液１. ５mlを、第１表の発酵培地３０mlを含む
３００ml容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間振
盪培養したところ、培養液中にリボフラビンが６２０mg
/l蓄積した。なお、ベクタープラスミドｐＣＧ１１のみ
を保有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ
１３３１３を上記と同一の条件で培養した際のリボフラ
ビン蓄積量は３５mg/lであった。
エキス１０g/l ，酵母エキス５g/l，塩化ナトリウム３g
/l ，ビオチン３０μg/l ，アデニン２０mg/l，スペク
チノマイシン１５０mg/l(pH7.2) 〕８mlを含む太型試験
管に、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＦＭ４１
株を一白金耳接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。
この培養液１. ５mlを、第１表の発酵培地３０mlを含む
３００ml容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間振
盪培養したところ、培養液中にリボフラビンが６２０mg
/l蓄積した。なお、ベクタープラスミドｐＣＧ１１のみ
を保有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＹ
１３３１３を上記と同一の条件で培養した際のリボフラ
ビン蓄積量は３５mg/lであった。
【００３９】
【表１】
【００４０】 実施例１２．バチルス属細菌由来遺伝子との相違 バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis) １６８株
の染色体ＤＮＡ ２μｇを含む液に制限酵素ＰｓｔＩ
５単位を加え、３７℃、５時間消化反応を行った後、ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡをナイロン
フィルター上に固定した。これにｐＦＭ２０１由来のＸ
ｈｏＩ〜ＨｉｎｄIII の１kb断片をプローブとして、ベ
ーリンガー・マンハイム山之内社製のノンラジオシステ
ムＤＮＡ標識及び検出キットを用いてサザンハイブリダ
イゼイションを行った。その結果、このプローブは１６
８株の染色体のＤＮＡとは会合が認められなかった。
の染色体ＤＮＡ ２μｇを含む液に制限酵素ＰｓｔＩ
５単位を加え、３７℃、５時間消化反応を行った後、ア
ガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＮＡをナイロン
フィルター上に固定した。これにｐＦＭ２０１由来のＸ
ｈｏＩ〜ＨｉｎｄIII の１kb断片をプローブとして、ベ
ーリンガー・マンハイム山之内社製のノンラジオシステ
ムＤＮＡ標識及び検出キットを用いてサザンハイブリダ
イゼイションを行った。その結果、このプローブは１６
８株の染色体のＤＮＡとは会合が認められなかった。
【００４１】
【発明の効果】本発明によれば、リボフラビンを発酵法
により効率よく製造することができる。
により効率よく製造することができる。
【００４２】
【００４３】配列番号：１ 配列の長さ：5589 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：コリネバクテリウム・アンモニアゲネス 配列： GTCGACATTA TGGACGGCCA TTTCGTCCCG AACCTGTCCT TTGGTCCAGA TATCACCAAG 60 GCCGTCGATG GGATCACGGA TCAAACCCTT GATGTGCATT TGATGATCCA GGAGCCAGCA 120 CAGTGGGTAG ACACTTACGC TAAGGCGGTG CAGATTGCAT CATCTTCCAC GTCGAGGCGG 180 TTGAAGACGA GGCAGCAGCG CTTGCATTGG CAGCTAAGAT CCGCGAGCTC GGCGTTCGCG 240 CTGGATTTTC CATTAAGCCC AATACCCCAA TTGAGCCGTG GCTAGATAAG CTGTCCCACT 300 TCGACTTAGT TCTGGTGATG AGTGTTGAAC CGGGCTTTGG CGGGCAGAAA TTTATGCCGG 360 AGATGCTCGA TAAGGTGCGC AAGCTCCGCT CAGCTATCGA TGAGCAAGGC TTAGATACGC 420 TCATCGAAAT TGATGGCGGA ATTTCTGCTG ACACCATCGC GCAAAGCGCG GAAGCTGGCT 480 GCGATGCATT CGTGGCGGGT TCGGCAATCT TTAAGCAACG TGACCGCGCA GCCGAGGTAG 540 AGAACCTGCG CGCTTTGGCC ACCGTCTAAT TAAGGGATTA CTGGATTATG GATAGCAACC 600 CCGGTGCAGA CCAAGCCGTG GCTCCGATTG TGGAGCAGGC GTTGCGCACC GCAATGTCTG 660 CAGGGTGGGA AGTGCGCGGG ACTACCAGCC CGAATCCACC GGTGGGTGCG GTAATTATTT 720 CGACTTCGGG TGAGATTGTG GGCACCGGTG CGACTCAGCC GGTGGGCGGG GTGCACGCAG 780 AAGTCCAAGC TCTAGCCGAT GCCGCGGGCA AGACCGAAGG CGCTACCGCC GTGGTGACGC 840 TGGAGCCGTG CCGGCATACC GGCCGCACGG GACCGTGCAC GCAGGCTTTA ATTGAAGCCG 900 GCATCAAAGA TGTCCTTTTC TTACACTCCG ACCCGAATCC CAGTGCGGGC GGCGGGGAAC 960 AGGTGCTTGT CGATGCCGGC ATCAACGTCG TGCAGCTGCC CAGCCCGGAG GGGGTACCGG 1020 ATGCGCTCAT TCCGTGGTTG AAGTCCGTGC AGTTGCGACG TCCCCACGTT ACGTTGAAAT 1080 TTGCGCAAAC TATCGATGGC TTTACTGCAG CTGCCGATGG CACCAGCCAG TGGATCACTG 1140 GGGAAATGGC GCGTGACTAT GTCCACGCTG ACCGTGAACA CCGCGATGCC ATTATCATCG 1200 GCACTGGCAC GGCCTTGATT GATAATCCAT CGCTTACTGC CCGCTATCCA GACGGCACCC 1260 AACGCGAACA CCAACCCCGG CGAGTTGTCA TTGGCCGTCG CAATATTGCG GATGCCGGCG 1320 ATGCCGCGTC TAATCTCAAC CGGCTTGGAT TTGAGCAATA TGCCACCATC GATGAAGCTC 1380 TGGCCGAGCT TTATGCCACC GGTGCCCGTG ATGTGCTCGT CGAAGGCGGA GCAGGTTTGG 1440 CCTCAGGCTT TGCCAACCAA GGACTGGTGG ATTGGCTGCA GGTCTACCAG GCGCCGCTCC 1500 TACTCGGTGA GGGAATTTCG GTCTTGGCAC ATCCGTTGAC CAATACGTTG AAAGGCGCCA 1560 GCGCGCTTTG CCCGCGGGCA GCTTCTGGCG CTGGGCGATG ATTTATTAAT CAACTACGTG 1620 CGTACTGCAC ACACTAAATA ATTTCACTAA AGGAGAATTG GTTGTTTACT GGGCTGGTTG 1680 AAGAAAAAGG CAAGGTTATC GCGCTGGAGG AGCTTGGGGA TTCTATCCGC ATGCAAATTG 1740 AGGCACCGGT GGTAACCGCT GATGCTCAAC TAGGAGACTC CATTTCTGTC AACGGCGTGT 1800 GCTTGACCGT CGCGGAGCTG GGAGACGCGA CGTTTATCGC CGACATTATG CAGGAATCTC 1860 TAAACCGCTC AGCTTTGGGT GAACTTGCGC CACAGAGCAC GGTAAACCTC GAACGCGCAT 1920 TGCTACCTAC CACCCGATTG GGCGGGCATA TCGTGCAAGG CCATGTCGAT GGCACCGCCA 1980 AACTTATCTC CCGCACTCCG TCGGAGCACT GGGATATTTT GCGTTTCGAA TTGCCTGCGG 2040 ATCTGGCACG TTATGTTGTT GAAAAGGGCT CGATTGCGAT TAGCGGCACG TCTTTGACGG 2100 TATCTGCAAT TGGGGAAGCC TGGTTTGAGG TCTCTTTGAT TCCAGTTACT TTGCGCGACA 2160 CCATCTTGGG TGATTTAGCC GACGGTGATC TGGTTAATCT CGAGGTTGAC GTGTTAGCGA 2220 AGTATGTCGA GAAGATGGTT CGCCCCCAAG GCGAGGTTTA ACAAGGGTAG AGACTAAGCT 2280 AGATAGCTAT GAACGCACCT TTAAATAGCG CAGTTCGTCT GGACTCCATC GAGGAGGCGA 2340 TTGCGGATAT CGCTGCCGGC AAGGCAGTAG TTGTAGTTGA CAACGAGGAC CGTGAGAATG 2400 AGGGTGACCT GATTTTCGCC GCGGAGCTTG CAACACCTGA GCTCGTAGCT TTTATGGTGC 2460 GCTATTCCTC GGGTTATATT TGCGTGCCTT TGCTGCCTGA AGACTGCAAG CGTTTGAACC 2520 TGCCACCGAT GATGGGCAGA AATGAAGACG TGCGCGGTAC TGCGTATACC GTCACGGTTG 2580 ATGCAAATAC AGGCACCACC GGAATCTCCG CCACTAGCCG CGCAGAAACT ATGCTGCGTC 2640 TCGCAGACCC TATGAGCGTG GTGGATGACT TTACCCGTCC AGGGCATGTG GTTCCGCTGG 2700 CTGCACGTCC TAACGGTGTT CTTGAGCGTG ATGGGCACAC GGAAGCCGCC ATCGACTTGG 2760 CTCGCTTGGC GGGCCTGCGT CCAGCGGGTG TTTTGTGTGA AATCGTCTCT GAAGAAGACC 2820 CGACCACGAT GGCTCGTTCC GAAGAGCTGC GTCGTTTTTC TGATGAGCAT GACTTGAAGA 2880 TGATATCCAT CGAGCAGCTC ATCGAATGGC GCCGTCACAA TGAGACTCAG GTACGTCGCA 2940 CGGTCGAAAC CCAGTTGCCG ACGGACTTCG GCTCTTTTAC CGCACTGGGC TACAAGCACG 3000 AGATCGACGG CCAAGAGCAC GTGGCACTGA TTGCAGGTGG CGTGGAAGAA CTCAACGGTG 3060 CCGAGGATGT CTTTGTCCGC GTGCACTCAG AATGCCTCAC CGGCGATGTC TTCCATTCCC 3120 GTCGTTGCGA CTGTGGCCAG CAGCTGCACC AGTCTATGGA GATTATCCAA GAGGCTGGCC 3180 AGGGAATCAT CATTTACTTG CGCGGTCACG AAGGCCGCGG CATTGGACTT TTGGCAAAGC 3240 TTAAGGCCTA CAGCCTGCAA GATTCAGGCC TCGATACTGT CGATGCCAAC CTGGAGCAAG 3300 GCTTGCCGGA AGATGCCCGT GAATACTCAG TCGCCGGGCA AATCCTGCGC GATCTGGGCA 3360 TCAAGTCAGC AAACCTGTTG ACCAATAACC CGCACAAAGG CGAAGGCCTG CGTGGCTTCG 3420 GGGTAGAAGC GTCCGCGCAT ACTCCGGTAG AAATAGAGCC AAACGCAGAC AATATTGATT 3480 ACCTGCGCAC CAAGCGTGAC CGTATGAACC ACGATTTGCC GCAGGTTGCG CGGTGGGACG 3540 CTGCGCACGC GCTGAAGTAA GAACCCTGAA AAACGTCGAA GAAAGCAAGA ACATGAGCAA 3600 AGAAGGACTA CCAGAAGTCG CCACGATTGA TGCCACCGGC ATCTCCGTCG CGGTTATCAG 3660 CGCAACCTGG AACGCAGATA TTTGTGACCG CCTCCATGAG CGAGCACTTG CTCATGCACA 3720 GCAACTTGGC GCCGAAGCAG ATGGTTTCCG CGTCGTCGGC GCACTGGAGA TTCCCGTCGC 3780 GGTACAAGAA GCAGCACGCC ACTACGACGC AGTTGTAGCA CTGGGTTGTG TCATCCGTGG 3840 TGGCACTCCG CACTTTGATT ATGTCTGTGA CTCCGTCACT CAGGGCCTAA CCCGAATTGC 3900 GCTGGATACT TCCAAGCCGA TTGCTAATGG CGTCTTGACA GTCAACACCC ACGACCAAGC 3960 GGTGGATCGT TCAGGTGCAC CAGGTGCTGC CGAAGACAAG GGCGTAGAAG CCATGCAAGC 4020 GGCTTTAGAT ACTGTGCTGC AATTGCGTAA TATCAAAGAA CGCGCATCAA AGCGCGGACT 4080 GTAGGAGATG ACTAATTCCA TGACTGACTC AACGGCTGGT GCCCCCGGCG ACTACCAACC 4140 GAAGAAGAAG CTAACTGATG AAGAGATCTT GGCGTATACC ACCGCCGATC CCTTCGCTAT 4200 GACCTCCACG AAGCCGTGGG AGTTGACTAT TTCCTCGCCA TTTCTGCGCA AAGTGGCGTG 4260 GGTGTGCATC GCGATTGTGA TTCCCGTGCA CCTTTTTATG GGCATCATGC TGGATGTCGA 4320 ATTTACCGGT GCGTATATCA CTTTCATCGA TAAGCTAGCT TTCCCTGGCA TCGGTATTGT 4380 CATATCGATA ATCGCGTGGC TGGCGTTCAA CCGTCCACGT CTGCGCGCTA ATTCTGATGG 4440 CGTAGAAATC CGCAACATCA TCGGCACGCG CTTTTACCCG TGGGAAGTCA TCTACGGCAT 4500 GTCTTTCCCC GAAGGCTCAC GCATGGCGCG CATTGAATTG CCGAATTTCG AATACGTGCC 4560 AGTCTGGGCA ATCCAATCCG GCGATAAAGA AGCAGCGATT GCTGCTACCC GGAACTTCCG 4620 CGAACTTGAA GCGAAGTACA TGCCGCTGGA TTAACCAGCA CAAAAGAAGG GAAGTTGGCC 4680 ACCGTGGCAG ATCCAAGCAC TTACCGGCCT GCTCCTGGAA CCATCCCGAC AGATCCAGGC 4740 GTATATAAAT TCCGCGATGA AAATAAACGC GTTGTATATG TCGGGAAGGC GAAAAACCTT 4800 CGCTCGCGGC TCTCGAACTA TTTCCAAGAC ATCACGCAGC TGCATCCTCG CACTCGCCAA 4860 ATGGTGCAAA CCGCGGCGAG CGTCGAGTGG ACGGTTGTTG CCAGCGAAGT AGAAGCTCTT 4920 GCGCTGGAAT ATACGTGGAT TAAGAAATTC GATCCGCGCT TCAACGTCAA ATACCGTGAC 4980 GATAAAACTT ATCCGATGCT GGCGGTATCC GTTGGCGAGC GCATTCCGCG AGCATTTTTC 5040 TACCGTGGTC CGCGCCGTAA AGGTGTGCGC TACTTCGGGC CTTATTCCCA CGCGTGGGCT 5100 GTGCGTGAAG CCCTGGATCT ACTCACGCGC GTCTTTCCCA TGCGCACGTG CTCCAAGGGC 5160 GTATACAACC GGCACGAAAG CCTTGGCCGA CCGTGTCTTT TGGGCTATAT TGGCAAGTGC 5220 AATGCACCGT GTATTGGGCG AGTGAGCGAG GACGAGCACC GCGATACTGT TAATCAGCTG 5280 GTCTCGTTTA TGAACGGTAA CACCGGCCCG GTGGTACGCC AGCTTACGGC ACAGATGCAG 5340 GAAGCATCGG AAGCACTAGA GTTTGAACGC GCGGCACGCC TGCGCGATGA CCTTGAGGCC 5400 ATTAATAAAA TCATGGAGCA ACAAGCTGTT GTCTTCACTG ATTCGACGGA TGCGGACCTC 5460 ATCGCTTTTC ACACTGATGA GCTGGAAGCC GCATTGCAGA TTTTCCACGT GCGCGATGGA 5520 CGTATCCGCG GCCAACGCGG CTGGGTTGTA GAGCGCATGG GCGACCAAGC CCCATTGAAG 5580 AAAGTCGAC 5589
【図１】はプラスミドｐＦＭ２１およびｐＦＭ４１の制
限酵素地図を示す。
限酵素地図を示す。
【図２】はプラスミドｐＦＭ２０１の制限酵素地図を示
す。
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/52 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】 コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物由来で、リボフラビン要求性
を有する宿主微生物に導入されたとき、該宿主微生物の
リボフラビン要求性を相補することができる性質を有す
るＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＤＮＡがリボフラビン生合成に関与する
酵素をコードする遺伝子である請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 ＤＮＡが、少なくともグアノシン三リン
酸シクロヒドロラーゼおよびリボフラビンシンターゼを
コードしている遺伝子である請求項２記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 ＤＮＡが配列番号１に示される塩基配列
またはその一部からなるＤＮＡである請求項１記載のＤ
ＮＡ。 - 【請求項５】 ＤＮＡが配列番号１に示される塩基配列
につき、１４７６番目から４１６４番目の塩基配列で示
される2.７kbのＤＮＡである請求項４記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 コリネバクテリウム属に属する微生物が
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに属する微生物
である請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項１記載のＤＮＡをベクターＤＮＡ
に組み込んでなる組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項７記載の組換え体ＤＮＡを保有す
る微生物。 - 【請求項９】 微生物が、コリネバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム属またはエッシェリヒア属に属する微生
物である請求項８記載の微生物。 - 【請求項１０】 請求項８記載の微生物を培地中に培養
し、培養物中にリボフラビンを生成蓄積させ、該培養物
より、リボフラビンを採取することを特徴とするリボフ
ラビンの製造法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP5303815A JPH06225776A (ja) | 1992-12-07 | 1993-12-03 | リボフラビンの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
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| JP32657892 | 1992-12-07 | ||
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Family Applications (1)
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-
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-
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