DE3110789C2

DE3110789C2 -

Info

Publication number: DE3110789C2
Application number: DE3110789A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Osaka Jp Chibata; Masahiko Kobe Hyogo Jp Kisumi; Saburo Kusatsu Shiga Jp Komatsubara; Kousaku Kyoto Jp Murata
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1980-03-21
Filing date: 1981-03-19
Publication date: 1988-01-14
Also published as: US4463094A; DE3110789A1; GB2072185A; JPS56134993A; JPS6236674B2; GB2072185B

Description

Die Erfindung betrifft die fermentative Herstellung von L-Threonin gemäß Anspruch 1. Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Bei der fermentativen Herstellung von L-Threonin ist von den Mikroben, die nicht zum Genus Serratia gehören, bekannt, Mutanten zu verwenden, die eine Aminosäure, die bei der L-Threonin-Biosynthese vorkommt, benötigen, oder die beständig gegen einen Threonin-Metabolismus-Antagonisten sind (japanische Patentveröffentlichungen 26 708/1970, 33 195/1971, 34 193/1971, 34 194/1971 und 44 876/1973). Von den Mikroben vom Genus Serratia ist auch bekannt, Mutanten zu verwenden, die kein Threonin abbauendes Enzym haben, und die beständig gegenüber einem Threonin- Metabolismus-Antogonist sind (japanische Patentveröffentlichung 48 195/1977). Die üblichen Verfahren, bei denen diese Mutanten verwendet werden, sind jedoch noch nicht geeignet, um große Mengen an L-Threonin zu bilden und zu gewinnen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren für die fermentative Herstellung von L-Threonin zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst.

Der erfindungsgemäß eingesetzte Serratia marcescens-Stamm Sr 41-P-103 wurde bei American Type Culture Collection, USA (nachfolgend als ATCC bezeichnet) am 10. Februar 1981 unter ATCC No. 31 809 hinterlegt. Dieser Mutant wurde aus Serratia marcescens Stamm AECr 301 erhalten und ist beständig gegenüber Ethionin, einem der Methionin- Metabolismus-Antogonisten.

Die für die Herstellung von L-Threonin gemäß der Erfindung zu verwendenden Brühen enthalten 10 bis 20 w/v % einer Kohlenstoffquelle, wie Saccharide (z. B. Glukose, Saccharose oder Melasse), organische Säuren (z. B. Fumarsäure, Zitronensäure), Alkohle (z. B. Glyzerin) sowie 1 bis 2 w/v % einer Stickstoffquelle wie organische Ammoniumsalze (z. B. Ammoniumacetat), anorganische Ammoniumsalze (Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid), Harnstoff und 0 bis 1 w/v % eines organischen Nährmittels, wie Maismaische, Pepton oder Hefeextrakt (w/v % = Gew./Vol.-%). Weiterhin kann eine geringe Menge an Kaliumphosphat oder Magnesiumsulfat zu der Brühe gegeben werden. Kalziumkarbonat oder, sofern erforderlich, Ammoniak kann auch zu der Brühe gegeben werden, um den pH bei 6 bis 8 zu halten. Weiterhin kann man gewünschtenfalls zu der Brühe eine Substanz, die bei der Threonin-Biosynthese vorkommmt, wie L-Asparginsäure, L-Homoserin, L-Lysin, L-Methionin oder L-Isoleucin zugeben.

Erfindungsgemäß werden große Mengen an L-Threonin in der Brühe angesammelt, indem man den Mikroorganismus Serratia marcescens ATCC 31 809 in die Brühe inokuliert und 2 bis 6 Tage unter Bedingungen, bei denen Sauerstoff ausreichend zur Verfügung steht, z. B. unter heftigem Schütteln, bei 25 bis 32°C inkubiert. Nach Beendigung der Fermentierung bildet sich L-Threonin und sammelt sich in der Brühe an. L-Threonin kann dann einfach aus der Kulturbrühe durch einfaches Abtrennen isoliert und durch übliche Reinigungsverfahren, z. B. unter Verwendung von Ionenaustauschharzen, gereinigt werden.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Brühe (pH 7,0, 15 ml) enthaltend Saccharose (17,5 w/v %), K₂HPO₄ (0,1 w/v %), MgSO₄ · 7 H₂O (0,1 w/v %), (NH₄)₂SO₄ (0,05 w/v %), Harnstoff (1,75 w/v %), Maismaische (0,1 w/v %), L-Methionin (0,1 w/v %) und Kalziumkarbonat (1 w/v %) wurde in einen 500-ml-Schüttelkolben eingefüllt und durch Autoklavisieren sterilisiert (Saccharose und L-Methionin wurden getrennt sterilisiert und aseptisch in die Brühe eingebracht).

Getrennt wurde Serratia marcescens Stamm ATCC No. 31 809 20 Stunden bei 30°C in einer Brühe, die Saccharose (12,5 w/v %), K₂HPO₄ (0,1 w/v %), MgSO₄ · 7 H₂O (0,1 w/v %), (NH₄)₂SO₄ (0,05 w/v %), Harnstoff (1,5 w/v %), Maismaische (0,1 w/ v %), L-Methionin (0,1 w/v %) und Kalziumkarbonat (1 w/v %) inkubiert und als Inokulum verwendet.

Die Kultur des Mikroorganismus (0,5 ml) wurde in die vorerwähnte Brühe inokuliert und 120 Stunden unter Schütteln (140 Umdrehungen pro Minute mit einem Schlag von 7 cm) bei 30°C inkubiert. Nach dem Inkubieren sammelte sich L-Threonin in einer Konzentration von 45,4 mg/ml in der Brühe an (L-Threonin wurde durch Ninhydrinreaktion auf einem Papierchromatogramm der Brühe nachgewiesen und wurde durch Bioassay unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides Stamm P-60 bestimmt).

Die erhaltene Brühe (1 Liter) wurde gesammelt, erwärmt und filtriert. Das Filtrat wurde durch eine Säule aus Ionenaustauschharz in der H-Form (Amberlite® IR-120) zum Adsorbieren von L-Threonin geschickt. Die Säule wurde dann mit Wasser gewaschen und mit 5%igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Die L-Threonin enthaltende Fraktion wurde gesammelt, unter vermindertem Druck konzentriert, mit Holzkohle behandelt und dann filtriert. Methanol wurde zu dem Filtrat gegeben und die erhaltenen Rohkristalle wurden aus wäßrigem Methanol umkristallisiert, wobei man 35 g L-Threonin erhielt. Wenn man Serratia marcescens Stamm AECr 301 für Vergleichszwecke unter den gleichen Bedingungen kultivierte, sammelte sich L-Threonin in einer Konzentration von nur 9,0 mg/ml in der Brühe an.

Referenz-Beispiel 1

Jeder der in der folgenden Tabelle 1 gezeigten Stämme wurde 20 Minuten auf Nähagar-Schrägkulturen kultiviert und die darauf gebildeten Zellen wurden geerntet und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und in ein Minimalmedium (3 ml) mit folgender Zusammensetzung:
Glukose 0,5 w/v %, (NH₄)₂SO₄, 0,1 w/v %; KH₂PO₄, 0,3 w/v %; K₂HPO₄, 0,7 w/v %; MgSO₄ · 7 H₂O, 0,01 2w/v % und L-Isoleucin, 0,01 w/v %, dem DL-Ethionin in einer Konzentration von 0, 1 oder 10 mg/ml zugesetzt worden war, inokuliert und 20 Stunden bei 30°C inkubiert. Das Wachstum jedes einzelnen Stammes wurde beobachtet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Aus Tabelle 1 geht hervor, daß das Wachstum von Serratia marcescens Stamm ATCC 31 809 in keinem Fall in Gegenwart von Ethionin in hoher Konzentration inhibiert wurde. Dies zeigt, daß der Stamm eine hohe Ethionin-Resistenz hatte.

Tabelle 1

Relatives Wachstum (%)*)

Claims

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin durch Züchten eines Mikroorganismus mit L-Threonin- Produktivität in einer Brühe und Gewinnen des angesammelten L-Threonins aus der Brühe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus mit L-Threonin-Produktivität den Stamm Serratia marcescens ATCC 31809 züchtet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung beim pH 6 bis 8 durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Brühe einsetzt, die 10 bis 20 Gew./Vol.-% einer Kohlenstoffquelle, 1 bis 2 Gew./Vol.-% einer Stickstoffquelle und 0 bis 1 Gew./Vol.-% eines organischen Nährmittels enthält.