DE69116964T2

DE69116964T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Valin

Info

Publication number: DE69116964T2
Application number: DE69116964T
Authority: DE
Inventors: Shinichi Hashimoto; Ryoichi Katsumata
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1990-09-18
Filing date: 1991-09-18
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2011-09-19
Also published as: EP0477000A3; KR950005133B1; US5521074A; EP0477000B1; KR920006507A; DE69116964D1; EP0477000A2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin. L-Valin ist eine Aminosäure, die hauptsächlich als Medikament, z.B. als Nährstoffinfusion und Aminosäurekomplexpräparate, und auch als Würzmittel und Tierfuttermittel verwendet wird.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung von L-Valin durch Glutaminsäure produzierende coryneforme Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium waren bekannt; zum Beispiel ein Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen mit Resistenz gegen D.L-Aminobuttersäure (veröffentlichte ungeprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 160592/88), ein Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen mit Resistenz gegen Thiazolalanin und einer Erfordernis für Leucin, Isoleucin oder Threonin (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 116/77) und ein Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen mit Resistenz gegen Aminoethylcystein (Japanische Patentveröffentlichung Nr.2678/83).

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin bereit, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, wobei der Mikroorganismus a) die Fähigkeit zur Produktion von L-Valin, b) Resistenz gegen L-Valin in einem Medium mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle und c) Sensitivität für ein Brenztraubensäureanalog in einem Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle aufweist, Anreicherung von L-Valin im Kulturmedium und Gewinnung von L-Valin daraus.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlicher beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen sind Glutaminsäure produzierende coryneforme Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, wobei die Mikroorganismen a) die Fähigkeit zur Produktion von L-Valin. b) Resistenz gegen L-Valin in einem Medium mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle und c) Sensitivität für ein Brenztraubensäureanalog in einem Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle aufweisen. Mikroorganismen mit solchen Eigenschaften werden von nachstehend beschriebenen Glutaminsäure produzierenden coryneformen Bakterien abgeleitet:
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Das Wachstum dieser Stämme in einem Medium mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle wird durch L-Valin gehemmt.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen können durch die Selektion von Mutanten erhalten werden, die keine Sensitivität gegen L-Valin in einem Medium mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle und L-Valin in einer Konzentration aufweisen, gegen welche der Elternstamm sensitiv ist, und im Anschluß daran durch Selektion jener aus den erhaltenen Mutanten, die gegen ein Brenztraubensäureanalog in einer Konzentration sensitiv sind, gegen welche der Elternstamm in einem Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle nicht sensitiv ist. Alternativ können die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen auch durch die Selektion von Mutanten erhalten werden. die gegen ein Brenztraubensäureanalog in einer Konzentration sensitiv sind, gegen welche der Elternstamm in einem Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle nicht sensitiv ist, und anschließend durch Selektion jener aus diesen Mutanten. die keine Sensitivität gegen L-Valin in einem Medium mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle und L-Valin in einer Konzentration aufweisen. gegen welche der Elternstamm sensitiv ist.
Die Erfindung wird nachstehend genauer beschrieben. Zuerst wird ein Elternstamm mit einem üblichen Verfahren durch Mutagenese verändert, z.B. durch Ultraviolettlicht oder eine Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (nachstehend als "NTG" bezeichnet) oder mit salpetriger Säure. Zweitens werden große Kolonien, die in einem Medium mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle und L-Valin gewachsen sind, oder alternativ kleine Kolonien. die in einem Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle und einem Brenztraubensäureanalog gewachsen sind, selektiert. Anschließend werden Mutanten selektiert, die auch die verbleibenden Eigenschaften aufweisen. Beispiele des erfindungsgemäß verwendbaren Brenztraubensäureanalogen umfassen β-Fluorbrenztraubensäure. β-Brombrenztraubensäure, β-Chlorbrenztraubensäure, β-Cyclohexylbrenztraubensäure, β-Mercaptobrenztraubensäure, β-Imidazolylbrenztraubensäure, Trimethylbrenztraubensäure, β-Hydroxybrenztraubensäure, α-Ketobuttersäure, etc.
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Resistenz gegen L-Valin in einem Kulturmedium mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle und Sensitivität gegen ein Brenztraubensäureanalog in einem Kulturmedium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle aufweisen. Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Eigenschaften können sie andere Eigenschaften aufweisen, wie Auxotrophie und Resistenz gegen jene Aminosäureanaloge, von denen bekannt ist, daß sie den Mikroorganismen eine L-Valin-Produktivität verleihen. Stämme, welche diese multiplen Mutationen tragen, können durch aufeinanderfolgende Mutagenese oder durch Kreuzung der Stämme mit einer unterschiedlichen Mutation über eine Protoplastenfusion erhalten werden.
Die Produktion von L-Valin durch einen erfindungsgemäßen Mikroorganismus kann mit einem üblichen Züchtungsverfahren erzielt werden. Als Kulturmedium kann jedes synthetische Medium oder jedes natürliche Medium verwendet werden, mit der Maßgabe, daß es geeignete Mengen einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einer anorganischen Substanz und geringe Mengen von Nährstoffen enthält, welche der selektierte Stamm benötigt.
Als Kohlenstoffquellen können Kohlehydrate. wie Glucose, Glycerin. Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse; Polyalkohole; organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure, verwendet werden. Außerdem können auch Kohlenwasserstoffe oder Alkohole als Kohlenstoffquelle verwendet werden, abhängig von der Assimilierbarkeit des verwendeten Mikroorganismus.
Als Stickstoffquellen können Ammoniak; Ammoniumsalze von anorganischen und organischen Säuren, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat; Harnstoff; und andere Stickstoff enthaltende Verbindungen, Pepton, NZ-Amin. Fleischextrakt. Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl und Spaltstoffe davon verwendet werden.
Als anorganische Stoffe können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat und ähnliches verwendet werden.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen unter Schütteln oder Belüften ausgeführt. Im allgemeinen liegt die Züchtungstemperatur im Bereich von 20ºC bis 40ºC. Es wird bevorzugt, daß der pH-Wert des Mediums während der Züchtung nahezu neutral gehalten wird. Der Züchtungszeitraum liegt üblicherweise im Bereich von 1 bis 5 Tagen.
Nach der Beendigung der Züchtung erfolgt die Gewinnung von L-Valin aus der Kulturbrühe gemäß einem bekannten Verfahren. Beispielsweise werden die Zellen aus der Brühe entfernt und der verbleibenden Überstand wird konzentriert und nach der Behandlung mit Aktivkohle und/oder einem Ionenaustauscherharz, etc. kristallisiert.
Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf Beispiele weiterhin veranschaulicht.

Beispiel 1

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde bei 30ºC für 16 Stunden in einem Vollmedium gezüchtet (hergestellt durch Lösen von 20 g pulverförmiger Bouillon und 5 g Hefeextrakt in 1 Liter Wasser, pH eingestellt auf 7,2). Im Anschluß daran wurden die Zellen gewonnen und mit 0,05 M Tris-Maleinsäurepuffer (pH 6,0) gewaschen und dann in dem gleichen Puffer bis zu einer Konzentration von etwa 10&sup9; Zellen/ml suspendiert. Anschließend wurde NTG bis zu einer Endkonzentration von 500 mg/l zugegeben und das Gemisch wurden 20 Minuten bei 30ºC gehalten. Die so behandelten Zellen wurden dann mit dem gleichen Puffer gewaschen und auf einem Agarmedium mit 0.5 g/l L-Valin in einem Minimalmedium der in Tabelle 1 aufgeführten Zusammensetzung ausgestrichen. Tabelle 1 (Minimalmediumzusammensetzung) Natriumacetat Biotin Thiaminhydrochlorid p-Aminobenzoesäure Agar
Nach der Züchtung bei 30ºC für 2 bis 4 Tage wurden große Kolonien entnommen. Unter diesen Kolonien wurden jene selektiert, die in dem Minimalmedium mit 5 g/l Glucose anstelle von Natriumacetat in Tabelle 1 als Kohlenstoffquelle und 6 mg/l β-Fluorbrenztraubensäure (nachstehend als "βFP" bezeichnet) langsam wuchsen.
Auf diese Weise wurde Corynebacterium glutamicum AV1 als starker L-Valin- Erzeuger aus diesen Mutanten selektiert.
Corynbacterium glutamicum AV1 wurde beim Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 12. Juli 1990 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3006 hinterlegt.
Tabelle 2 zeigt die Sensitivität des Elternstamms ATCC 13032 und des mutierten Stamms AV1 gegen L-Valin und βFP. Die Sensitivität wurde wie folgt bewertet: im Fall der Sensitivität gegen L-Valin wurde eine verdünnte Zellsuspension auf einem Minimalagarmedium der in Tabelle 1 aufgeführten Zusammensetzung mit 0,5 g/l L-Valin ausgestrichen und im Fall der Sensitivität gegen βFP wurde eine verdünnte Zellsuspension auf einem Minimalagarmedium mit 6 mg/l βFP und 5 g/l Glucose als Kohlenstoffquelle ausgestrichen. Nach dem Inkubieren bei 30ºC für 2 Tage wurde die Sensitivität gegen L-Valin oder βFP auf der Grundlage der Koloniengröße beurteilt.

Beispiel 2

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde bei 30ºC für 16 Stunden in einem Vollmedium gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen gewonnen, mit 0,05 M Tris- Maleinsäurepuffer (pH 6,0) gewaschen und in dem gleichen Puffer bis zu einer Konzentration von etwa 10&sup9; Zellen/ml suspendiert. NTG wurde bis zu einer Endkonzentration von 500 mg/l zugegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten bei 30ºC gehalten. Die so behandelten Zellen wurden dann mit dem gleichen Puffer gewaschen und auf einem Agarmedium der in Tabelle 1 aufgeführten Zusammensetzung mit 0,5 g/l L-Valin ausgestrichen.
Nach der Züchtung bei 30ºC für 2 bis 4 Tage wurden große Kolonien entnommen. Unter ihnen wurden jene Kolonien selektiert, die in dem Minimalmedium mit 5 g/l Glucose anstelle von Natriumacetat als Kohlenstoffquelle und 6 mg/l βFP langsam wuchsen.
Brevibacterium lactofermentum AV11 wurde auf diese Weise als starker L-Valin- Erzeuger selektiert.
Brevibacterium lactofermentum AV11 wurde beim Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 12. Juli 1990 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3007 hinterlegt.
Tabelle 2 zeigt die Sensitivität des Elternstamms ATCC 13869 und des mutierten Stamms AV11 gegen L-Valin und βFP. Die Sensitivität gegen L-Valin und βFP wurde wie in Beispiel 1 bewertet. Tabelle 2 Kohlenstoffquelle L-Valin Glucose Natriumacetat +: zugegeben -: nicht zugegeben ++: große Kolonien +: kleine Kolonien

Beispiel 3

Corynebacterium glutamicum AV1 (FERM BP-3006) und Brevibacterium lactofermentum AV11 (FERM BP-3007), erhalten in den Beispielen 1 und 2, sowie ihre Elternstämme wurden getrennt in ein Teströhrchen mit 3 ml Impfmedium (1% Glucose, 2% pulverförmige Bouillon und 0,5% Hefeextrakt, pH 7,2) überimpft und unter Schütteln bei 30ºC für 24 Stunden gezüchtet. Anschließend wurde 1 ml einer jeden erhaltenen Kultur in einen 300 ml-Erlenmeyerkolben mit 20 ml Gärmedium der folgenden Zusammensetzung überimpft und unter Schütteln bei 30ºC für 48 Stunden gezüchtet. Nach der Züchtung wurde das Filtrat der Kulturbrühe einer Papierchromatographie unterzogen, gefolgt von einer Farbentwicklung mit Ninhydrin. Die Menge des produzierten L-Valins wurde kolorimetrisch bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Die Zusammensetzung des verwendeten Gärmediums ist wie folgt:
8% Glucose 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,1% Magnesiumsulfat, 5% Ammoniumsulfat, 0,2% Hamstoff 120 µg/l Thiaminhydrochlorid, 180 µg/l Biotin, 12 mg/l FeSO&sub4;. H&sub2;O, 12 mg/l MnSO&sub4;. 4-6H&sub2;O 1% Maisquellwasser, 2% Calciumcarbonat, pH 7,2. Tabelle 3 Menge des produzierten L-Valins Stamm L-Valin-Menge (mg/ml)

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Valin, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium in einem Medium, wobei der Mikroorganismus a) die Fähigkeit zur Produktion von L- Valin, b) Resistenz gegen L-Valin in einem Medium mit Essigsäure als einziger Kohlenstoffquelle und c) Sensitivität für ein Brenztraubensäureanalog in einem Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle aufweist, bis L-Valin in der Kulturbrühe angereichert ist, und Gewinnung von L-Valin daraus.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus zur Art Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium lactofermentum gehört.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum AV1 (FERM BP-3006) oder Brevibacterium lactofermentum AVi11 (FERM BP-3007) ist.

4. Biologisch reine Kultur von Corynebacterium glutamicum AV1 (FERM BP-3006).

5. Biologisch reine Kultur von Brevibacterium lactofermentum AV11 (FERM BP-3007).