JPH06169758A - 微生物及び５−アミノレブリン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ活性が弱
く、かつ嫌気明条件でも好気暗条件でも５−アミノレブ
リン酸の生産が可能な５−アミノレブリン酸生産菌と、
該菌，その休止菌体又は酵素により、５−アミノレブリ
ン酸デヒドラターゼ阻害剤を添加せず、かつ嫌気明条件
又は好気暗条件での５−アミノレブリン酸の製造方法と
を提供する。 【構成】ロドバクター セファロイデス等の光合成細菌
を変異処理して得られる５−アミノレブリン酸生産菌で
あって、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ活性が弱
く、嫌気明条件下でも、好気暗条件下でも５−アミノレ
ブリン酸を生産することができる。この菌，その休止菌
体又は酵素を使用し、５−アミノレブリン酸デヒドラタ
ーゼ阻害剤を添加せず又は少量の添加で、かつ嫌気明条
件又は既存の醗酵設備の設定条件である好気暗条件で、
高収率，低コストで５−アミノレブリン酸を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、５−アミノレブリン酸
生産菌、及び５−アミノレブリン酸生産菌，その休止菌
体又はその菌体由来の酵素により５−アミノレブリン酸
デヒドラターゼの活性を阻害する物質を添加することな
く、かつ嫌気明条件下ではもとより、好気暗条件下でも
高収率で５−アミノレブリン酸を製造する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】５−ア
ミノレブリン酸は、テトラピロール化合物のプレカーサ
として生体系中の重要な役割を果たしている化合物であ
る。この５−アミノレブリン酸は、除草剤，殺虫剤とし
て優れた効果を示し、しかも人畜に対して毒性を示さ
ず、分解性が高いため環境への残留性もないという優れ
た性質を有する天然化合物である（特許出願公表６１−
５０２８１４号，特開平２−１３８２０１号公報参
照）。しかし、この天然の５−アミノレブリン酸は、コ
ストが高く、除草剤や殺虫剤として使用するには実用性
に欠ける（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｅｅｋ／Ｏｃｔｏｂｅ
ｒ，２９，１９８４）。このような現状において、多く
の化学合成方法が検討されている（例えば、特開平２−
１１１７４７号公報参照）が、未だ充分な方法が開発さ
れていない。

【０００３】一方、光合成細菌等の微生物を用いた５−
アミノレブリン酸の製造方法も検討されている（特開平
２−９２２９３号公報，特願平１−３０７２１６号明細
書等参照）。５−アミノレブリン酸は、生体系中におい
て、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼにより２分子
が縮合されてポルフォビリノーゲンとなり、逐次反応し
て各種のテトラピロール化合物へと代謝される。

【０００４】ところで、上記の５−アミノレブリン酸デ
ヒドラターゼは、一般に強い酵素であり、通常は生体系
中の５−アミノレブリン酸を速やかに反応させるため、
生体系中に５−アミノレブリン酸が蓄積することは稀で
ある。この５−アミノレブリン酸を蓄積させるには、５
−アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性を弱める必要
がある。この手法として、一般には、レブリン酸に代表
される５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性阻害
物質を添加する方法が知られている（上記の特開平２−
９２２９３号や特願平１−３０７２１６号の微生物を用
いた５−アミノレブリン酸の製造方法でも、５−アミノ
レブリン酸デヒドラターゼの活性阻害物質としてレブリ
ン酸が使用されている）。この方法では、添加するレブ
リン酸等の活性阻害物質のコストがかかる上、５−アミ
ノレブリン酸の蓄積後に、該５−アミノレブリン酸とこ
れら活性阻害物質とを分離する必要もある。

【０００５】一方、光合成細菌は、好気暗条件で培養す
ると、５−アミノレブリン酸を生成しない。これに対
し、現在の実用的な醗酵設備は好気暗条件の培養に設定
されている。従って、光合成細菌を使用する５−アミノ
レブリン酸の製造技術においては、既存の醗酵設備が使
用できず、新たな設備あるいは既存の設備の改造を必要
とし、５−アミノレブリン酸の製造コストの上昇が必至
であった。

【０００６】本発明は、以上の諸点を考慮し、５−アミ
ノレブリン酸デヒドラターゼ活性が弱く、しかも嫌気明
条件又は好気暗条件において５−アミノレブリン酸を生
産することのできる５−アミノレブリン酸生産菌を提案
すること、及び５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの
活性阻害物質の添加を要せず、かつ嫌気明条件，好気暗
条件のいずれでも行うことのできる高収率かつ低コスト
の５−アミノレブリン酸の製造方法を提案することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために研究を重ねた結果、（１）光合成細
菌を変異させたものの中に、最小培地で生育が弱く、ポ
ルフォビリノーゲンを添加した最小培地で強い生育を示
すものがあり、この菌株が５−アミノレブリン酸デヒド
ラターゼ活性の弱い菌株であること、また光合成細菌を
変異させたものの中に好気暗条件において５−アミノレ
ブリン酸を生産する菌株が存在することを確認し、更に
（２）上記の菌株を使用すれば、５−アミノレブリン酸
デヒドラターゼ活性阻害物質を添加せずに、あるいは極
めて少量の添加により、また好気暗条件に設定された既
存の醗酵設備を使用しても５−アミノレブリン酸を高収
率で製造できることを確認して、本発明を開発するに至
った。

【０００８】すなわち、本発明の５−アミノレブリン酸
生産菌は、光合成細菌を変異処理して得られることを特
徴とする。また、本発明の５−アミノレブリン酸生産菌
は、親株である光合成細菌として、例えば、ロドバクタ
ー セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈ
ａｅｒｏｉｄｅｓ）を使用するものである。更に、本発
明の５−アミノレブリン酸生産菌は、５−アミノレブリ
ン酸デヒドラターゼ活性の弱い菌株及び好気暗条件又は
嫌気明条件で５−アミノレブリン酸を生産することので
きる菌株で、その一例として、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研寄第１１７５２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
１７５２）として寄託されたものが挙げられる。本菌株
は、上記２つの性質を同時に持つ変異株の一例である。
本発明の５−アミノレブリン酸の製造方法は、５−アミ
ノレブリン酸生産菌を、グリシン及びコハク酸の存在
下、嫌気明条件又は好気暗条件下で培養させることを特
徴とする。また、本発明の５−アミノレブリン酸の製造
方法は、上記の５−アミノレブリン酸生産菌のグロース
系のものに限らず、５−アミノレブリン酸生産菌の休止
菌体又は菌体由来の酵素を、グリシン及びコハク酸と接
触させることをも特徴とする。更に、本発明の５−アミ
ノレブリン酸の製造方法に使用される５−アミノレブリ
ン酸生産菌は、例えば上記した本発明の５−アミノレブ
リン酸生産菌であることを特徴とする。

【０００９】以下、本発明の５−アミノレブリン酸生産
菌及び５−アミノレブリン酸の製造方法の詳細を説明す
る。先ず、本発明の５−アミノレブリン酸生産菌は、例
えば、光合成細菌であるロドバクター セファロイデス
を親株とし、これを変異して得られるものであって、上
記のように５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ活性が
弱く、グリシン及びコハク酸から生産した５−アミノレ
ブリン酸のポルフォビリノーゲンへの転化を極く僅少と
し、培養液中に多量の５−アミノレブリン酸を蓄積す
る。また、本発明の５−アミノレブリン酸生産菌は、嫌
気明条件で培養することもできるし、好気暗条件でも培
養することができる。このような性質を有する本発明の
５−アミノレブリン酸生産菌の分離方法の詳細を以下に
例示する。

【００１０】上記の親株の増殖に必要な成分を試験管に
分注し、滅菌した後、親株を接種し、光照射下において
静置培養する。この培養液を緩衝液で洗浄した後、変異
操作を行う。この変異操作としては、通常の変異手法を
採用することができる。例えば、紫外線，電離放射線等
の物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、エチ
ルメタンスルフォネート（ＥＭＳ），Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ），エチル
ニトロソ尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオ
キシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログ等の化
学的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養したり、あ
るいはトランスポゾン変異法等の生物学的変異原を用い
る方法がある。このような変異手法によって上記の親株
を変異した後、更に緩衝液で洗浄し、寒天培地等に撒
き、培養する。

【００１１】デヒドラターゼ活性の弱い菌株を効率的に
得るには、上記の操作により得られたコロニーを単離
し、最小培地で弱い生育を示すか又は全く生育せず、ポ
ルフォビリノーゲンを添加した培地で強い生育を示すこ
とを確認することにより選択することができる。また、
好気暗条件でも培養液中に多量の５−アミノレブリン酸
を蓄積する株を選択するには、変異株を好気暗条件で培
養し、培地中の５−アミノレブリン酸を測定することに
よって選択することができる。なお、１回の変異で上記
の両方の性質を得ることもできるが、どちらか一方の性
質しか持たない変異株に、更に変異を施して両方の性質
を持たせることもできる。

【００１２】このような分離・変異操作に用いる培地に
は、変異前の親株の場合，変異後の変異菌の場合とも同
様のものでよく、グルタミン酸，リンゴ酸，酢酸，ピル
ビン酸，乳酸，コハク酸，フマル酸，酒石酸，グルコン
酸，エタノール，グリセロール，グルコース，フルクト
ース，マンニトール，ソルビトール，酵母エキス等の炭
素源の他に、一般的な培地成分、あるいは通常光合成細
菌の培養に用いられる成分が添加される。一般的な培地
成分としては、窒素源として、例えばアンモニア，塩化
アンモニウム，燐酸アンモニウム，硫酸アンモニウム，
炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウム，硝酸アンモニウ
ム，硝酸ナトリウム，尿素等の無機窒素化合物や、酵母
エキス，乾燥酵母，ペプトン，肉エキス，コーンスティ
ープリカー，カザミノ酸等の有機窒素源を用いることが
できる。また無機塩類として、例えばカリウム，ナトリ
ウム，鉄，マグネシウム，マンガン，銅，カルシウム，
コバルト等の各塩類等を用いることができる。

【００１３】また、光合成細菌の培養に通常用いられる
成分として、例えば、培地中に存在する鉄やコバルト等
の金属を除去し、５−アミノレブリン酸の生成を促進す
るために、キレート剤を添加することが特に好ましい。
このキレート剤としては、例えば、エチレンジアミンテ
トラ酢酸，シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸，グリコ
ールエーテルジアミンテトラ酢酸，ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸，トリエチレンテトラミンヘキサ酢酸，ニ
トリロトリ酢酸，α，α′−ジピリジル等が挙げられ
る。これらキレート剤の培地への添加量は、培地全体に
対し約１〜１０ｍｍｏｌ／ｌ、特に１〜４ｍｍｏｌ／ｌ
が好ましい。添加量が少な過ぎると鉄やコバルト等の金
属を充分除去できず、添加量が多過ぎると５−アミノレ
ブリン酸生成の阻害となる。添加方法は、連続的又は断
続的添加のいずれでもよい。更に、培養条件としては、
親株，変異株ともｐＨ約５〜８，温度約１５〜４５℃，
時間約１〜１０日間で、親株の場合は約０．５〜５０Ｋ
ｌｕｘの光照射嫌気条件下が好ましく、変異株の場合は
親株の場合と同様の光照射嫌気条件下あるいは好気暗条
件下であっても良い。

【００１４】上記の分離・変異操作によって得られる菌
株の一例であるＣＲ−１７は、親株とほぼ同様の菌学的
性質を有し、かつポルフォビリノーゲン無添加の最小培
地では生育が弱く、ポルフォビリノーゲンを添加した培
地では生育が強い。そして、グリシンとコハク酸が添加
され、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ活性阻害物
質が添加されていない培地において、嫌気明条件下又は
好気暗条件下で、５−アミノレブリン酸を生成し、多量
に蓄積する。このＣＲ−１７株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている〔微工研菌寄託第１１７
５２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１７５２）〕。

【００１５】次に、本発明の５−アミノレブリン酸の製
造方法の詳細を説明する。本発明方法では、上記したＣ
Ｒ−１７株に代表される本発明の５−アミノレブリン酸
生産菌に限らず、他の作出方法によって得られるもの，
他の菌を親株として得られるもの，その他の分離方法に
よって得られる５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ活
性の弱い、かつ嫌気明条件又は好気暗条件で５−アミノ
レブリン酸を生産する５−アミノレブリン酸生産菌を使
用することができる。なお、好気暗条件においては、５
−アミノレブリン酸デヒドラターゼ活性が弱い菌株に限
らず、該活性が普通程度の菌株をも使用することができ
る。これらの５−アミノレブリン酸生産菌を、グリシン
及びコハク酸の存在下、嫌気明条件又は好気暗条件下で
培養させるか、あるいはこれらの菌体の休止菌体又は菌
体由来の酵素を、グリシン及びコハク酸と接触させるこ
とにより、５−アミノレブリン酸を製造することができ
る。

【００１６】以下、ＣＲ−１７株を用いた５−アミノレ
ブリン酸の製造方法を説明する。前述のＣＲ−１７株を
分離する場合と同様の培地を使用し、同様の培養条件で
培養する。このとき、生育を強めるためポルフォビリノ
ーゲンを添加してもよい。また、酵母エキス等を加えた
複合培地で培養し、集菌したものを使用すれば、培養時
間を短縮することができる。更に、培養液のｐＨを５〜
８の範囲内で、ＨＣｌ水溶液又はＮａＯＨ水溶液を用い
て一定に保つことにより、より高濃度の５−アミノレブ
リン酸を生成することができる。また、グリシンとコハ
ク酸は、ＣＲ−１７株の培養開始と同時に添加すると、
ＣＲ−１７株の増殖速度が遅くなるため、或る程度増殖
した時点で添加することが好ましい。添加量は、グリシ
ンとコハク酸のいずれの場合も、培地全体に対し、約１
０〜８０ｍｍｏｌ／ｌ、特に約１５〜４５ｍｍｏｌ／ｌ
が好ましい。また、添加方法は、一度に全量添加しても
よいが、連続的に又は断続的に添加してもよい。

【００１７】また、このとき、ＣＲ−１７の５−アミノ
レブリン酸デヒドラターゼの活性阻害物質を添加するこ
ともできる。この添加量は、従来の５−アミノレブリン
酸の微生物による製造方法の場合の添加量に比し、極く
少量でよく、例えばこの阻害物質としてレブリン酸を使
用する場合、従来の必要量の１／３程度の量で、従来と
同程度の５−アミノレブリン酸の収率を得ることができ
る。なお、このレブリン酸の添加方法は、ＣＲ−１７の
培養開始時（あるいはグリシンとコハク酸の添加時）か
ら一定の間隔で少量（同量）づつ添加してもよいし、培
養開始時（あるいはグリシンとコハク酸の添加時）に全
量を添加しておいてもよい。更に、菌の生育が対数増殖
期中期を過ぎた後、添加するとなおよい。このとき、約
０．５〜５０Ｋｌｕｘの光照射嫌気条件としてもよい
し、あるいは既存の設備の設定条件である好気暗条件と
してもよい。

【００１８】上記のＣＲ−１７株を休止菌体又は本菌由
来の酵素として使用して５−アミノレブリン酸を製造す
るには、先ず、前述の変異・分離の場合と同様の培地を
使用し、同様の培養条件で培養したものをそのまま用い
るか、あるいは遠心分離等で菌体分離して用いる。な
お、分離した菌体は、更に、燐酸緩衝液等の溶液で洗浄
し、該溶液に懸濁させて使用することもできる。また、
菌体由来の酵素は、常法により精製したものを使用する
ことが望ましい。すなわち、例えば、上記した菌体の懸
濁液を、超音波，フレンチプレス，高圧ホモジナイザ等
により破砕処理して得られた菌体破砕物を、遠心分離等
により固液分離した後、カラム精製，電気泳動等の一般
的精製手段により精製酵素としたものを使用する。更
に、これらの休止菌体や菌体由来の酵素は、固定化する
と単位体積当たりの酵素量が多くなるため、固定化した
ものを使用すると、効率良く反応を行うことができる。
この固定化は、アルギン酸カルシウム法，ポリアクリル
アミドゲル法，ポリウレタン樹脂法，光架橋樹脂法等の
常法により行うことができる。

【００１９】これらの休止菌体や菌体由来の酵素に、グ
リシンとコハク酸を、燐酸緩衝液中で接触させると、反
応が生じて５−アミノレブリン酸が製造される。このと
きの反応条件は、前述のＣＲ−１７株の変異・分離の場
合の条件と同様とするのが好ましい。なお、酵素を使用
する場合は、光照射は不要である。この反応において、
エネルギ−源として、ＡＴＰ（アデノシン三燐酸），ｐ
ａｌ−Ｐ（ピリドキサール燐酸），ＣｏＡ（コエンザイ
ムＡ）、またメタノール，エタノール，水素，ニコチン
酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ），ホルムア
ルデヒド，蟻酸等の電子供与体を適宜添加するのが好ま
しい。なお、この反応においても、５−アミノレブリン
酸デヒドラターゼの活性阻害物質を添加することができ
る。

【００２０】以上のようにして得られた培養液又は反応
液中の５−アミノレブリン酸は、常法により精製するこ
とができる。例えば、溶剤抽出等の方法によって回収す
ることができ、このときカラムクロマトグラフィ等の公
知の精製方法を適宜併用することもできる。

【００２１】

【作用】本発明の５−アミノレブリン酸生産菌は、５−
アミノレブリン酸デヒドラターゼ活性が弱いため、グリ
シンとコハク酸から該生産菌の作用によって生成する５
−アミノレブリン酸を、ポルフォビリノーゲンにまで転
化することができない。このため、本発明の５−アミノ
レブリン酸生産菌は、本菌の培養液中に、５−アミノレ
ブリン酸を多量に蓄積する作用をなす。また、本発明の
５−アミノレブリン酸生産菌は、嫌気明培養条件下では
もとより、好気暗培養条件下においても５−アミノレブ
リン酸を生産する作用があるため、この菌株によれば、
既存の醗酵設備の設定条件である好気暗条件でも５−ア
ミノレブリン酸を蓄積する。

【００２２】また、本発明の５−アミノレブリン酸の製
造方法では、上記のような作用をなす本発明の５−アミ
ノレブリン酸生産菌をはじめ、他の５−アミノレブリン
酸デヒドラターゼ活性の弱い、又は嫌気明条件に限らず
好気暗条件でも５−アミノレブリン酸の生産が可能な５
−アミノレブリン酸生産菌、あるいはこれらの休止菌体
や菌体由来の酵素を使用して、グリシンとコハク酸から
５−アミノレブリン酸を製造するため、従来のように、
別途、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性阻害
物質を添加することなく、添加するとしても極く微量を
添加するのみで、かつ嫌気明条件、又は既存の醗酵設備
の設定条件である好気暗条件で、５−アミノレブリン酸
を高収率かつ低コストで製造することができる。

【００２３】

【実施例】

実施例１ 表１に示すグルタメート・マレート培地の培地成分を、
水道水１リットルに溶かして培地１を調製した。培地１
のｐＨは６．８であった。

【００２４】

【表１】

【００２５】上記の培地１に酵母エキス２ｇ／ｌを添加
して調製した培地２を、外径２１ｍｍの試験管に１０ｍ
ｌ入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、光合成細菌である
ロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ１２２０３を１白
金耳植え継ぎ、３０℃，５Ｋｌｕｘの光照射下で３日間
静置培養した。別の試験管に培地２を１０ｍｌ分注し、
滅菌した。これらの培地２に上記の培養液１を３白金耳
植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで８時間往復振盪培養
した。この培養液２を、洗浄のため、１５，０００ｒｐ
ｍにて３０秒間遠心分離し、その上清を捨て、遠心分離
前の培養液２と同量になるようにトリス・マレイン酸バ
ッファ（ｐＨ６．０）に懸濁させた。この洗浄操作を更
に２度繰り返した。この後、再び１５，０００ｒｐｍに
て３０秒間遠心分離し、その上清を捨て、化学的変異原
であるＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）を１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた
溶液を、もとの（２度目の遠心分離前の）培養液２と等
量加え、３０℃で８０分間静置インキュベートした。

【００２６】このようにして処理した菌１を、上記と同
様の方法で３回洗浄した後、別の試験管に分注し、滅菌
した培地２に植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで２日間
往復振盪培養した。培地２に寒天１７ｇ／ｌを添加して
調製した培地を１２１℃で１５分間滅菌し、同じく滅菌
したシャーレに撒いて、寒天平板培地を調製した。この
シャーレに、上記の培養液（菌１の培養液）３を滅菌水
で１，０００倍に希釈して塗布し、３０℃で４日間培養
した。上記のようにして得られたコロニーのうち、培地
１では生育が弱く、培地１にポルフォビリノーゲンを３
００μｍｏｌ／ｌ添加した培地１′では強い生育を示す
変異菌株を選別した。これらの変異菌株のうちの１つ
を、ロドバクター セファロイデス ＣＲ−１７と命名
した。

【００２７】実施例２ 実施例１で得られた変異菌株ＣＲ−１７（微工研菌寄１
１７５２号）を、培地１に植え継ぎ、３０℃，５Ｋｌｕ
ｘの光照射下で１日間培養した後、トリス塩酸バッハァ
（ｐＨ８．１）で実施例１と同様の方法で菌株を３回洗
浄し、超音波破砕により粗酵素液を得た。この粗酵素液
の５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）活
性をＳａｔｏらの方法（Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔ
ａｍｉｎｏｌ．，２７，４３９−４４７，１９８１）に
より測定した。それぞれのＡＬＡＤ活性値を、親株の活
性値と共に表２に示す。

【００２８】

【表２】

【００２９】実施例３ 実施例１で得られた変異菌株ＣＲ−１７（微工研菌寄１
１７５２号）を、培地１に接種し、３０℃，５Ｋｌｕｘ
の光照射下で２４時間培養した。次いで、グリシンを３
０ｍｍｏｌ／ｌ，コハク酸を３０ｍｍｏｌ／ｌとなるよ
うに添加し、培養を更に２４時間続けた。培養液中の５
−アミノレブリン酸をエールリッヒ試薬による発色法に
より定量したところ、５−アミノレブリン酸が１８６μ
ｍｏｌ／ｌ生産されていた。

【００３０】実施例４ 実施例１で得られた変異菌株ＣＲ−１７（微工研菌寄１
１７５２号）を、培地１で、３０℃，５Ｋｌｕｘの光照
射下で２日間予備培養した。これを、５−アミノレブリ
ン酸生産培地（グリシン６０ｍｍｏｌ／ｌ，コハク酸６
０ｍｍｏｌ／ｌ，リンゴ酸２．７ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４
０．５ｇ／ｌ，Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ／ｌ，ＣａＣｌ_２
０．０５３ｇ／ｌ，ｐＨ６．８）に２ｇ／ｌとなるよう
に接種し、３０℃，５Ｋｌｕｘの光照射下で２日間培養
した。この結果、５−アミノレブリン酸が５２２μｍｏ
ｌ／ｌ生産されていた。

【００３１】実施例５ ５−アミノレブリン酸生産培地による生産培養を開始
し、レブリン酸を培養開始時に５ｍｍｏｌ／ｌ、培養開
始後１日目に５ｍｍｏｌ／ｌ、２日目に５ｍｍｏｌ／ｌ
添加し、培養期間を３日間とした以外は、実施例４と同
様の操作を行った。この結果、５−アミノレブリン酸が
８．２ｍｍｏｌ／ｌ生産されていた。

【００３２】実施例６ 実施例１で得られた変異菌株ＣＲ−１７を培地１に植え
継ぎ、３０℃，５Ｋｌｕｘの光照射下で１日培養した
後、トリス塩酸バッファで実施例１と同様の方法で菌株
を３回洗浄し、超音波破砕により１ｍｌ当たり０．８８
ｍｇ蛋白量の粗酵素液を得た。これに、ＡＴＰ８．５ｍ
ｍｏｌ／ｌ，ＣｏＡ−ＳＨ１ｍｍｏｌ／ｌ，ピリドキサ
ール燐酸１ｍｍｏｌ／ｌ，グリシン０．１ｍｏｌ／ｌ，
コハク酸ナトリウム０．１ｍｏｌ／ｌ，塩化マグネシウ
ム１０ｍｍｏｌ／ｌ，トリス塩酸バッファ５０ｍｍｏｌ
／ｌ，グルタチオン０．３ｇ／ｌになるように添加し、
３７℃，２時間インキュベートした。この結果、５−ア
ミノレブリン酸が８２４μｍｏｌ／ｌ生産されていた。

【００３３】実施例７ 実施例１で得られたＣＲ−１７と親株を培地１に接種
し、３０℃の暗条件下で、かつ酸素量とレブリン酸量と
を表３に示すようにして培養した。培養開始１２時間後
に、グリシンを３０ｍｍｏｌ／ｌ、コハク酸を３０ｍｍ
ｏｌ／ｌ添加した。なお、レブリン酸の添加時期は培養
開始１２時間後とした。このときの５−アミノレブリン
酸生成量を表３に示す。

【００３４】

【表３】

【００３５】表３から明らかなように、好気暗条件下に
おいても、変異菌株ＣＲ−１７は、親株に比べ、５−ア
ミノレブリン酸を大量に生成していることが判る。

【００３６】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明の５−アミ
ノレブリン酸生産菌は、光合成細菌を親株として容易な
操作で作出することができる。また、本発明の５−アミ
ノレブリン酸生産菌によれば、グリシンとコハク酸から
５−アミノレブリン酸を生産することができ、しかも５
−アミノレブリン酸の２分子を縮合してポルフォビリノ
ーゲンに転化する５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ
の活性が弱いため、培養液中に多量の５−アミノレブリ
ン酸を蓄積することができる。更に、本発明の５−アミ
ノレブリン酸生産菌によれば、嫌気明条件下ではもとよ
り、好気暗条件でも５−アミノレブリン酸を生産するこ
とができる。

【００３７】そして、本発明の５−アミノレブリン酸の
製造方法によれば、上記した本発明の５−アミノレブリ
ン酸生産菌のような５−アミノレブリン酸デヒドラター
ゼの活性の弱い、かつ嫌気明条件下及び好気暗条件のい
ずれにおいても５−アミノレブリン酸の生産が可能な５
−アミノレブリン酸生産菌あるいは該菌の休止菌体や菌
体由来の酵素を使用して、グリシンとコハク酸から高収
率で５−アミノレブリン酸を製造することができる。

【００３８】このとき、５−アミノレブリン酸デヒドラ
ターゼ活性阻害物質の添加は不要であり、また添加する
としても極く微量の添加で充分であるため、本発明の５
−アミノレブリン酸の製造方法によれば、製造コストを
低減することができる。しかも、５−アミノレブリン酸
デヒドラターゼ活性阻害物質を添加しない場合は、５−
アミノレブリン酸の製造後に、該５−アミノレブリン酸
と５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ活性阻害物質の
分離工程が不要となり、設備費が低減するばかりでな
く、製造効率が大幅に向上し、製造コストを大幅に低減
することができる。加えて、好気暗条件で５−アミノレ
ブリン酸の製造ができるため、既存の醗酵設備をそのま
ま使用して５−アミノレブリン酸の工業的生産ができ、
設備コストの大幅な低減を図ることができる。更に、本
発明の５−アミノレブリン酸の製造方法によれば、上記
の５−アミノレブリン酸生産菌をグロース系で使用する
ことができるため、培養開始時に少量の５−アミノレブ
リン酸生産菌を使用するのみで、大量の５−アミノレブ
リン酸を製造することができ、製造コストはより一層低
廉となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光合成細菌を変異処理して得られる５−
   アミノレブリン酸生産菌。
2. 【請求項２】 光合成細菌がロドバクター セファロイ
   デスであることを特徴とする請求項１記載の５−アミノ
   レブリン酸生産菌。
3. 【請求項３】 工業技術院微生物工業技術研究所に微工
   研寄第１１７５２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１７５２）とし
   て寄託されたことを特徴とする請求項１，２記載の５−
   アミノレブリン酸生産菌。
4. 【請求項４】 ５−アミノレブリン酸生産菌を、グリシ
   ン及びコハク酸の存在下で培養させることを特徴とする
   ５−アミノレブリン酸の製造方法。
5. 【請求項５】 ５−アミノレブリン酸生産菌の休止菌体
   又は菌体由来の酵素を、グリシン及びコハク酸と接触さ
   せることを特徴とする５−アミノレブリン酸の製造方
   法。
6. 【請求項６】 ５−アミノレブリン酸生産菌が請求項１
   〜３記載の５−アミノレブリン酸生産菌であることを特
   徴とする請求項４，５記載の５−アミノレブリン酸の製
   造方法。