DE69620954T2

DE69620954T2 - Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Dimethylolcarbonsäure

Info

Publication number: DE69620954T2
Application number: DE69620954T
Authority: DE
Inventors: Takashi Echigo; Masahiko Hiramoto; Keijitsu Tanaka
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1995-06-26
Filing date: 1996-06-25
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2016-06-26
Also published as: JPH0912506A; EP0751223B1; EP0751223A3; JP3653801B2; EP0751223A2; US5716815A; DE69620954D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten, wie 2,2- Bis(hydroxymethyl)propionsäure und 2,2-Bis(hydroxymethyl)buttersäure, die als wasserlösliche Vernetzungsmittel nützlich sind, und ein Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten mit hoher Selektivität durch Oxidation von Tris(hydroxymethyl)derivaten unter Einsatz von Mikroorganismen.

Beschreibung des Standes der Technik

Als Verfahren zur Herstellung von 2,2-Bis(hydroxymethyl)carbonsäure durch ein chemisches Verfahren sind beispielsweise ein Verfahren, bei dem Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel eingesetzt wird (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 263141/1987), und ein Verfahren bekannt, bei dem Isovalerianpersäure als Oxidationsmittel eingesetzt wird (Yuki Gosei Kagaku Kyokai Shi, 36, 1095 (1978)). Bei der chemischen Oxidation sind jedoch Oxidationsmittel beteiligt, die schwer zu handhaben sind, und außerdem ist die Ausbeute an Dimethylolcarbonsäurederivaten gering.
Ein weiteres chemisches Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäure durch Oxidation von Tris(hydroxymethyl)derivaten ist ein Verfahren, bei dem Natriumtrimethylolacetat aus Pentaerythrit durch katalytische Luftoxidation unter Einsatz von Platin und/oder Palladium als Hauptkatalysator synthetisiert wird, wie in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 138886/1979 beschrieben. Dieses Verfahren ist nicht wirtschaftlich, da es den Einsatz von teueren Platinkatalysatoren erfordert.
Deshalb wurde versucht, ein Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten in hohen Ausbeuten durch Oxidation von Tris(hydroxymethyl)derivaten unter Einsatz von Mikroorganismen zu entwickeln.
Tris(hydroxymethyl)derivate, die eine Neopentanstruktur haben, welche in einem metabolischen Hauptweg von Lebewesen nicht vorkommen, sind jedoch auf biologische Weise schwer zu oxidieren.
Beispielsweise sind, da die Mikroorganismen, die Hydroxymethylderivate mit einer Neopentanstruktur oxidieren, nur solche Mikroorganismen bekannt, die zur Gattung Flavobacterium (japanische Patentveröffentlichung Nr. 18827/1973), Corynebacterium oder Arthrobacter gehören (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 72882/1977), welche Pentaerythrit oxidieren. Es ist jedoch bislang kein Mikroorganismus bekannt, der Tris(hydroxymethyl)derivate, die nicht Pentaerythrit sind, oxidieren kann.
Deshalb ist es ein Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten aus Tris(hydroxymethyl)derivaten bei Normaltemperatur und Normaldruck auf sichere und kostengünstige Weise in hohen Ausbeuten und mit hoher Selektivität unter Einsatz der Oxidationsfähigkeit von Mikroorganismen bereitzustellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Im Hinblick auf das Erreichen des vorstehend genannten Ziels haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung umfangreich Untersuchungen durchgeführt, um in der natürlichen Umwelt Mikroorganismen zu finden, die Tris(hydroxymethyl)derivate oxidieren können. Obwohl solche Mikroorganismen schwer zu erhalten sind, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung schließlich solche Mikroorganismen gefunden, die zur Gattung Rhodococcus und Agrobacterium gehören, und sie haben gefunden, daß Dimethylolcarbonsäurederivate in hoher Ausbeute und mit hoher Effizienz durch Verwendung dieser Mikroorganismen aus Tris(hydroxymethyl)derivaten hergestellt werden können. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Entdeckung gemacht.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten bereit, die durch die allgemeine Formel (1)
dargestellt sind, worin R ein Wasserstoffatom, eine Aminogruppe, eine Alkylgruppe oder eine Alkylgruppe mit einer Hydroxygruppe ist, welches das Umsetzen von Tris(hydroxymethyl)derivaten der allgemeinen Formel (2)
worin R dieselbe Bedeutung wie vorstehend definiert hat, mit einer Kulturbrühe oder mit Zellen eines Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus oder Agrobacterium mit der Fähigkeit, eine Methylolgruppe des Tris(hydroxymethyl)derivats zu oxidieren, umfasst.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen Mikroorganismen der Gattung Rhodococcus und Agrobacterium mit der Fähigkeit, Methylolgruppen von Tris(hydroxymethyl)derivaten der vorstehenden allgemeinen Formel (2) zu oxidieren.
Tabelle 1 zeigt die Eigenschaften des Stammes Rhodococcus erythropolis SD806, ein typischer Stamm der Gattung Rhodococcus unter den Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.

Tabelle 1

Eigenschaften des Stamms Rhodococcus erythropolis SD806

Morphologie polymorpher Stab
Gramfärbung +
Sporen -
Mobilität -
Oxidase -
Catalase +
Koloniefarbe orange
Bildung von Carotenoidpigmenten +
Stab-Kokken-Zyklus +
Verlängerung der Zellen am Kolonierand beobachtet
Vorhandensein von Luftmycel nicht beobachtet
Verhalten gegenüber Sauerstoff aerob
Diaminsäure in Zellwänden* meso-Diaminopimelinsäure
Glycolyltest + (Glycolyltyp)
Zuckerzusammensetzung der Zellwände* Arabinogalactanpolymer +
Mycolsäure +
Chinon MK-8 (H&sub2;)
Adeninzersetzung +
Tyrosinzersetzung +
Harnstoffzersetzung +
Assimilierbarkeit
Inositol +
Maltose +
Mannitol +
Rahmnose -
Sorbitol +
m-Hydroxybenzoesäure -
Natriumbenzoat -
L-Tyrosin -
Wachstum in Anwesenheit von 0,02% Natriumazid -
*: Annahme aufgrund des Säurehydrolysats der Gesamtzelle
Im Vergleich mit anderen Stämmen unter Bezugnahme auf "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Vol. 1 (1984), wurde dieser Stamm durch die Bildung von roten Kolonien, der Proliferation durch multilaterale Knospung, keine Bildung von Ascosporen und keine Fermentation von Zucker charakterisiert und somit als Rhodococcus erythropolis identifiziert. Der Stamm wurde Rhodococcus erythropolis SD806 genannt und am 29. Mai 1995 beim National Institute of Bioscience and Human- Technology Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM P-14956 hinterlegt und am 24. April 1996 in eine internationale Hinterlegung mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5521 überführt.
Tabelle 2 zeigt die Eigenschaften von Agrobacterium sp. SD807, ein typischer Stamm, der zur Gattung Agrobacterium gehört und in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann.

Tabelle 2

Eigenschaften des Stamms Agrobacterium sp. SD807

Morphologie Stab
Gramfärbung -
Sporen -
Mobilität +
Flagellen peritrich
Verhalten gegenüber Sauerstoff aeorb
Koloniefärbung stellt keine charakteristischen Koloniepigmente her
Oxidase +
Katalase +
OF 0
Schleimbildung +
Bildung von 3-Ketolactose -
Reduktion von Nitraten -
Reduktion von Nitriten -
Wachstum bei 35ºC +
Wachstum bei 28ºC +
Wachstum auf Schroth et al. selektivem Medium -
Wachstum in Anwesenheit von 2% NaCl +
Herstellung von Säuren meso-Erythrit -
Ethanol -
Glucose +
Produktion von Basen Natriummalonat -*
Simon's Zitronensäure Agar -
Lackmusmilch Oxidation*
Verflüssigung von Gelatine -
Harnstoffzersetzung +
β-Galactosidase +
Onkogenese auf Sonnenblumenstengeln -
Chinone Q-10
*: Stimmt nicht mit den Eigenschaften von Agrobacterium biovar 3 überein, das in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Voll 1 (1984) beschrieben wird.
Im Vergleich mit anderen Stämmen unter Bezugnahme auf "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Vol. 1 (1984) wurde dieser Stamm durch die Mobilität durch Peritrichon, Gram-negative Stäbchen, Bildung von 3-Ketolactose, keine Bildung von Säuren aus Ethanol usw. charakterisiert, und somit wurde angenommen, daß es sich um Agrobacterium biovar 3 handelt. Dieser Stamm stellt jedoch keine Basen aus Natriummalonat her, sondern oxidierte Lackmusmilch. Deshalb stimmen die Eigenschaften dieses Stamms nicht vollständig mit Agrobacterium biovar 3 überein, und somit wurde dieser Stamm nicht identifiziert.
Deshalb wurde dieser Stamm Agrobacterium sp. SD807 genannt und am 29. Mai 1995 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305 Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM P-14957 hinterlegt und am 24 April 1996 in eine international Hinterlegung mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5522 überführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten unter Einsatz von Mikroorganismen wird im folgenden anhand eines Beispiels zur Herstellung von 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure aus 1,1,1-Tris- (hydroxymethyl)ethan beschrieben.
Als Mikroorganismen können solche der Gattung Rhodococcus oder Agrobacterium mit der Fähigkeit, die vorstehend genannte Methylolgruppe zu oxidieren, sowie solche Mikroorganismen eingesetzt werden, die unter Mutanten und/oder Varianten dieser Mikroorganismen ausgewählt sind, die erhöhte Produktivität von 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure haben.
Als solche Mutanten und/oder Varianten können solche mit erhöhter Beständigkeit gegen 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure, Mutanten und/oder Varianten, die 2,2- Bis(hydroxymethyl)propionsäure nicht assimilieren, und dergleichen genannt werden.
Solche Mutanten und/oder Varianten können üblicherweise durch Mutationsinduktionsbehandlung von vegetativen Zellen erhalten werden, beispielsweise von solchen Zellen, die nach der Inkubation in einem Nährmedium 2 bis 3 Tage unter Schütteln bei 30ºC inkubiert wurden. Als Mutagen können solche Substanzen genannt werden, die üblicherweise als Mutagene bekannt sind, wie Alkylierungsmittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin (NTG), Basenanaloga, wie 5-Bromuracil (5BU), Natriumdimethylaminobenzoldiazosulfonat (DAPA), Azaserin, Acridinorange, usw., und UV-Strahlen genannt werden. Im Fall vom DAPA werden Zellen behandelt, während sie in Anwesenheit von Nahrungsquellen wachsen. Im Fall von anderen Mutagenen oder von UV-Strahlen werden jedoch die Zellen in physiologischer Saline oder Phosphatpufferlösungen vor der Behandlung suspendiert.
Im Hinblick auf die Eigenschaften, die sich auf die Produktion von 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure beziehen, sind Mutanten und/oder Varianten wirksam, die eine dieser Eigenschaften haben. Eine deutliche Erhöhung der Produktivität kann jedoch durch die Verwendung von Varianten erzielt werden, die zwei oder mehr Eigenschaften in Kombination haben.
Die Bakterienstämme, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sind als Quelle nützlich, aus der Gene erhalten werden, die für Enzyme kodieren, welche im Zusammenhang mit der Oxidation einer Hydroxygruppe in Tris(hydroxymethyl)derivaten stehen.
Für das Selektieren von Klonen mit den Zielgenen wird als Kriterium die Erhöhung des pH-Werts, die mit der Herstellung von 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure aus 1,1,1-Tris- (hydroxymethyl)ethan einhergeht, verwendet. Genauer gesagt werden die Bakterienzellen nach der Behandlung auf ein Agarplattenmedium verbreitet, das 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan, geeignete Nahrungsquellen und einen pH-Indikator enthält, und inkubiert, und danach wird auf Kolonien geprüft, die eine Farbänderung des pH-Indikators zeigen, die aufgrund der Bildung von 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure einer Verringerung des pH-Werts entsprechen. Unter den so erhaltenen Clonen können Stämme mit der Fähigkeit gefunden werden, Tris- (hydroxymethyl)derivate mit hoher Häufigkeit zu oxidieren.
Als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Kulturmedien, die in der vorliegenden Erfindung für die Kultivierung von Mikroorganismen eingesetzt werden, können jegliche Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen eingesetzt werden, die von den Mikroorganismen assimiliert werden können und auf denen oder in denen sie wachsen können. Die Induktion von Enzymen, die Hydroxymethylgruppen oxidieren, ist nicht erforderlich, und unmittelbar nach der üblichen Kultivierung kann 1,1,1- Tris(hydroxymethyl)ethan oder dergleichen zugegeben werden, um das Fortschreiten der Oxidationsreaktion zu bewirken.
Die Kultivierung kann üblicherweise unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35ºC, vorzugsweise 27 bis 32ºC, durchgeführt werden. Während die Kultivierungsdauer in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Kulturmediums und der Kultivierungsbedingungen variieren kann, wird die Kultivierung üblicherweise während 1 bis 3 Tagen durchgeführt. Der pH-Wert des Kulturmediums ist im Bereich von 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,4 bis 7,6.
Die erfindungsgemäße Herstellung von Dimethylolcarbonsäure kann auch durch das sogenannte Verfahren der Suspension von ruhenden Zellen (resting cell suspension method) durchgeführt werden, bei dem Zellen nach der Kultivierung aus dem Kulturmedium geerntet werden, in einer Pufferlösung, die Tris(hydroxymethyl)derivate enthält, resuspendiert und mit dieser umgesetzt werden. Gemäß diesem Verfahren sind die Abtrennung und die Reinigung von Dimethylolcarbonsäurederivaten einfach, da die Lösung weniger Komponenten des Kulturmediums und Metabolite enthält, die durch die Zellen hergestellt werden.
Die Bakterienzellen können nach der Kultivierung durch Zentrifugation oder dergleichen geerntet werden. Zu den Fällen wird eine Pufferlösung eines Gemisches aus Phosphorsäure, Essigsäure oder dergleichen mit ihrem Salz oder Wasser gegeben, um die Zellen zu suspendieren. Die Konstellation der Pufferlösung ist etwa 50 bis 200 mM. Der pH Wert der Lösung bei der Reaktion ist innerhalb des Bereichs von 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,4 bis 7,2.
Die Konzentration eines Substrats, d. h. eines Tris(hydroxymethyl)derivats, ist 0,5 bis 100 g/l, vorzugsweise 5 bis 10 g/l. Die Reaktion wird unter aeroben Bedingungen bei einer Reaktionstemperatur innerhalb des Bereichs von 20 bis 35ºC, vorzugsweise 27 bis 32ºC durchgeführt. Während der Reaktion variiert der pH Wert entsprechend der Bildung von Carbonsäure, und somit wird der pH Wert wünschenswerter Weise innerhalb des bevorzugten Bereichs kontrolliert. Hinsichtlich der Tris(hydroxymethyl)derivate, die als Substrate für die Oxidation durch Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, gibt es keine besondere Einschränkung, solange sie Tris(hydroxymethyl)derivate der allgemeinen Formel (2) sind
worin R ein Wasserstoffatom, eine Aminogruppe, eine Alkylgruppe oder eine Alkylgruppe mit einer Hydroxygruppe ist. Wenn R eine Alkylgruppe ist, enthält die Alkylgruppe vorzugsweise 1 bis 20 Kohlenstoffatome, wobei eine Methylgruppe und eine Ethylgruppe besonders bevorzugt sind. Außerdem ist, wenn R eine Alkylgruppe mit einer Hydroxygruppe ist, R vorzugsweise eine Gruppe, die eine Kohlenstoffkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen hat, wobei mindestens eines der Kohlenstoffatome mit einer Hydroxygruppe substituiert ist. Eine Hydroxymethylgruppe ist besonders bevorzugt.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Trennung und die Reinigung von Dimethylolcarbonsäurederivaten, die in dem Kulturmedium akkumuliert werden, durch Entfernen der Bakterienzellen durch herkömmliche Verfahren, beispielsweise durch Zentrifugation, Filtration, Membrantrennung oder dergleichen, und danach durch Ionenaustauscherchromatographie oder Kristallisation durchgeführt werden.

BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN ZUM DURCHFÜHREN DER ERFINDUNG

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung durch die repräsentativen Beispiele genauer erklärt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Tabelle 3 zeigt die Zusammensetzung und den pH Wert der Kulturmedien 1 bis 3, die in den Beispielen eingesetzt werden. Tabelle 3
In den Beispielen wurden der Nachweis und die Bestimmung von Tris(hydroxymethyl)derivaten und Dimethylolcarbonsäurederivaten durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Einsatz von Showdex KC-811-Säulen durchgeführt.

Beispiel 1

Bakterienzellen des Stamms Rhodococcus erythropolis SD806 und des Stamms Agrobacterium sp. SD807, die jeweils auf Festagarmedien gezüchtet wurden, die jeweils aus dem Kulturmedium der Zusammensetzung des Kulturmediums 1 (L-Brühe), gezeigt in Tabelle 3, plus 1,8% Agar bestanden, wurden mit 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung, die 1,1,1- Tris(hydroxymethyl)ethan, 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)propan, Pentaerythrit oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan in einer Konzentration von 1% enthielt, gemischt, wobei die Suspensionsreaktionsgemische mit ruhenden Zellen erhalten wurden. Die Reaktionsgemische hatten eine Trübung, ausgedrückt als Absorption, von 1,0 bei 660 nm. Diese wurden 40 Stunden bei 30ºC für die Reaktion geschüttelt. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert, und es wurde die Herstellung und die Akkumulation von Substanzen mit oxidierten Hydroxymethylgruppen, die von den jeweiligen Substraten abgeleitet sind, beobachtet.

Beispiel 2

Bakterienzellen des Stamms Rhodococcus erythropolis SD806 wurden von einer Impföse in 200 ml eines Kulturmediums mit derselben Zusammensetzung wie Kulturmedium 1 in Tabelle 3 geimpft und 2 Tage bei 30ºC geschüttelt. Nach dem vollständigen Ablauf der Inkubation wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation geerntet, und 1 Liter einer 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung, die 5 g 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan enthielt, wurde zugegeben, um das Reaktionsgemisch mit der Suspension von ruhenden Zellen herzustellen. Das Reaktionsgemisch hatte eine Trübung, ausgedrückt als Absorption, von 0,8 bei 660 nm. Es wurde 24 Stunden bei 30ºC geschüttelt. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert, und es wurde gefunden, daß 3,3 g 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan oxidiert und zersetzt wurde, wobei 1,1 g 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionaldehyd und 2,0 g 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure hergestellt wurden.

Beispiel 3

5 ml eines Kulturmediums mit derselben Zusammensetzung wie Kulturmedium 2 aus Tabelle 3 wurde mit einer Impföse mit Bakterienzellen des Stamms Agrobacterium sp. SD807 angeimpft, und es wurde einen Tag bei 30ºC unter Schütteln inkubiert. Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation geerntet, und eine 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung, die 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan in einer Konzentration von 5 g/l enthielt, wurde dazugegeben, wobei ein Reaktionsgemisch aus einer Suspension von ruhenden Zellen hergestellt wurde. Dieses wurde bei 30ºC geschüttelt. Das Reaktionsgemisch hatte eine Trübung, ausgedrückt als Absorption, von 0,2 bei 660 nm. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert, und es wurde gefunden, daß 4,9 g/l 1,1,1- Tris(hydroxymethyl)ethan nach 66 Stunden Reaktion oxidiert worden waren, wobei 0,1 g/l 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionaldehyd und 4,8 g/l 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure hergestellt wurden. Das Umwandlungsverhältnis von 1,1,1- Tris(hydroxymethyl)ethan zu 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure war etwa 88%.

Beispiel 4

10 ml eines Kulturmediums mit derselben Zusammensetzung wie Kulturmedium 3 in Tabelle 3 wurde mit einer Impföse mit Bakterienzellen des Stamms Agrobacterium sp. SD807 angeimpft, und gleichzeitig wurde 0,5 g 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan zugegeben. Während der Inkubation unter aeroben Bedingungen bei 30ºC wurden die Absorption bei 660 nm und die Änderung der Zusammensetzung des Reaktionsgemisches in Zeitabständen untersucht. Da der pH-Wert entsprechend der Herstellung von 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure fiel, wurde das Reaktionsgemisch mit 1 N NaOH auf einem pH Wert von 6,8 eingestellt. Die Trübung der Bakterienzellen nach 20 Stunden Kultivierung, Inkubation und Reaktion stieg auf 2,0, und danach blieb die Menge der Bakterienzellen im wesentlichen konstant. Die Menge an 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan sank während 30 Stunden nach der Initiation der Inkubation und Reaktion linear, während gleichzeitig 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure akkumuliert wurde. Nach 30stündiger Kultivierung und Reaktion wurde 0,4 g 1,1,1-Tris(hydroxymethyl)ethan oxidiert und 0,41 g 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure hergestellt und akkumuliert. Das Umwandlungsverhältnis von 1,1,1-Tris- (hydroxymethyl)ethan zu 2,2-Bis(hydroxymethyl)propionsäure war etwa 93%.

Beispiel 5

Nachdem sie mit einer 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung gewaschen worden waren, wurden Bakterienzellen von Agrobacterium sp. SD807, die auf L-Agarmedium gewachsen waren, zu einer 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung gegeben, die ein Tris- (hydroxymethyl)derivat in einer Konzentration von 5 g/l enthielt, wobei ein Reaktionsgemisch aus einer Suspension von ruhenden Zellen hergestellt wurde. Dieses wurde 6 Stunden bei 30ºC geschüttelt. Das Reaktionsgemisch hatte eine Trübung, ausgedrückt als Absorption, von 1,0 bei 660 nm. Nach Beendigung der Reaktion wurde ein Teil des Reaktionsgemisches durch Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert und die Produktionsrate und die Akkumulation von Oxiden aus den jeweiligen Derivaten wurde berechnet. Tabelle 4 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. Tabelle 4
*: Die Konzentration des angehäuften Oxids war gering, da die Oxidationsprodukte weiter assimiliert und zersetzt wurden.

VORTEILHAFTE WIRKUNGEN

Mit der vorliegenden Erfindung können Dimethylolcarbonsäurederivate effizient und sicher durch Einsatz von Mikroorganismen der Gattung Rhodococcus oder Agrobacterium mit der Fähigkeit, Tris(hydroxymethyl)derivate unter Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten zu oxidieren, hergestellt werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten der allgemeinen Formel (1)

worin R ein Wasserstoffatom, eine Aminogruppe, eine Alkylgruppe oder eine Alkylgruppe mit einer Hydroxygruppe ist, welches das Umsetzen von Tris(hydroxymethyl)-Derivaten der allgemeinen Formel (2)

worin R dieselbe Bedeutung wie vorstehend definiert hat, mit einer Kulturbrühe oder Zellen eines Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus oder Agrobacterium mit der Fähigkeit, eine Methylolgruppe des Tris(hydroxymethyl)-Derivats zu oxidieren, umfaßt.

2. Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten nach Anspruch 1, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.

3. Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten nach Anspruch 2, wobei R eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe ist.

4. Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten nach Anspruch 1, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer Hydroxygruppe ist.

5. Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten nach Anspruch 1, wobei das Tris(hydroxymethyl)- Derivat Pentaerythrit ist.

6. Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der zur Gattung Rhodococcus gehörende Mikroorganismus Rhodococcus erythropolis ist.

7. Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus Rhodococcus erythropolis mit der Hinterlegungsnummer FERM BP- 5521 ist.

8. Verfahren zur Herstellung von Dimethylolcarbonsäurederivaten nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Mikroorganismus Agrobacterium mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5522 ist.

9. Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus erythropolis mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5521.

10. Mikroorganismus der Gattung Agrobacterium mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5522.