DE10129711A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von PyruvatInfo
- Publication number
- DE10129711A1 DE10129711A1 DE2001129711 DE10129711A DE10129711A1 DE 10129711 A1 DE10129711 A1 DE 10129711A1 DE 2001129711 DE2001129711 DE 2001129711 DE 10129711 A DE10129711 A DE 10129711A DE 10129711 A1 DE10129711 A1 DE 10129711A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- pyruvate
- microorganisms
- expressed
- nucleotide sequences
- less
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 30
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 24
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 10
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 10
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 101100462488 Phlebiopsis gigantea p2ox gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 claims description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 2
- 108010057366 Flavodoxin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 claims 1
- 101150015189 aceE gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150077561 aceF gene Proteins 0.000 claims 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 21
- 102000012751 Pyruvate Dehydrogenase Complex Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010090051 Pyruvate Dehydrogenase Complex Proteins 0.000 abstract description 8
- 108010031852 Pyruvate Synthase Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 abstract 1
- 108010005284 pyruvate-flavodoxin oxidoreductase Proteins 0.000 abstract 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 81
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 30
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 9
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 7
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 7
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 4
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 4
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 4
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 4
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000015176 Proton-Translocating ATPases Human genes 0.000 description 2
- 108010039518 Proton-Translocating ATPases Proteins 0.000 description 2
- 241000589614 Pseudomonas stutzeri Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M (R)-lactate Chemical compound C[C@@H](O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UWTATZPHSA-M 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPZHKLJPVMYFCU-UHFFFAOYSA-N 2-(5-bromopyridin-2-yl)acetonitrile Chemical compound BrC1=CC=C(CC#N)N=C1 DPZHKLJPVMYFCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004251 Ammonium lactate Substances 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 108010022613 Cytochrome d Group Proteins 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N Gluconic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010093369 Multienzyme Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000002568 Multienzyme Complexes Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 101710182361 Pyruvate:ferredoxin oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940059265 ammonium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000019286 ammonium lactate Nutrition 0.000 description 1
- RZOBLYBZQXQGFY-HSHFZTNMSA-N azanium;(2r)-2-hydroxypropanoate Chemical compound [NH4+].C[C@@H](O)C([O-])=O RZOBLYBZQXQGFY-HSHFZTNMSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 101150080183 cydC gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- CNNRFBWVTKFGRE-UHFFFAOYSA-N formic acid;2-oxopropanoic acid Chemical compound OC=O.CC(=O)C(O)=O CNNRFBWVTKFGRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004868 gas analysis Methods 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007483 microbial process Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000012619 stoichiometric conversion Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 150000003538 tetroses Chemical class 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat. DOLLAR A Die nach dem Stand der Technik bekannten chemischen Verfahren zur Herstellung von Pyruvat sind technisch aufwendig und kostenintensiv. Die bekannten biologischen Verfahren weisen den Nachteil auf, daß die Substrate nicht zu 100% in Pyruvat umgesetzt werden und dadurch die Produktausbeute verschlechtert wird. DOLLAR A Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich mikrobiell Pyruvat mit einer nahezu 100%igen Umsetzung des Substrates herzustellen. Durch Verwendung von Mikroorganismen, die genetisch verändert wurden, d. h. Deletion bzw. geringere Expression der Nukleotidsequenzen, die für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat-Decarboxylase, die Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreductase, die Pyruvat-Flavodoxin-Oxidoreductase, die Pyruvat-Formiat-Lyase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase und/oder die Pyruvat-Oxidase kodieren, konnte eine erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat.
- Ein klassisches Verfahren zur Herstellung von Pyruvat (das Salz der Brenztraubensäure) ist die Pyrolyse (d. h. das Brenzen) von Traubensäure. Dabei werden Schwermetalle sowie Temperaturen von etwa 200°C benötigt (Römp Chemie Lexikon, 1995). Weiterhin sind folgende mikrobielle Verfahren zur Pyruvat Synthese aus Lactat bekannt: Produktion von Pyruvat aus Lactat mit permeabilisierten Zellen der methylotrophen Hefen Hansenula polymorpha oder Pichia pastoris, die das Gen für die (S)- Hydroxysäure-Oxidase aus Spinat exprimieren (DiCosimo, R.; Eisenberg, A.; Seip, J. E.; Gavagan J. E.; Payne, M. S.; Anton D. L. (1997): Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Cat. B: Enzymatic Volume 2, 223-232; US-Patent 5538875). Das bei der Lactat-Oxidation gebildete H2O2 wird durch endogene Katalase zu H2O und O2 umgesetzt. Mit diesem Prozeß konnte eine 1 M Lösung von Natrium- oder Ammonium-Lactat zu über 98% in Pyruvat umgesetzt werden. Daneben ist auch die Möglichkeit zur zellfreien Oxidation von Lactat zu Pyruvat mit immobilisierter (S)-Hydroxysäure-Oxidase und Katalase bekannt (Burdick, B. A.; Schaeffer, J. R. (1987): Co-immobilized coupled enzyme systems on nylon mesh capable of gluconic and pyruvic acid production. Biotechnol. Lett. 9: 253-258). Ein weiteres Verfahren stellt die Umsetzung von Lactat zu Pyruvat mit ruhenden, anaerob gezüchteten Zellen von Proteus mirabilis oder Proteus vulgaris dar (Simon, H.; Schinschel, C. (1993): Preparation of pyruvate from (R)- lactate with Proteus species. J. Biotechnol. 31: 191-203). Mit diesem System konnte eine 0,65 M Lactat- Lösung in 1 h zu 94% in Pyruvat umgesetzt werden. Alternativ zu Lactat wird Glucose als Substrat für die Pyruvatproduktion mittels Ganzzell-Biotransformation durch Hefen oder Bakterien eingesetzt, wobei Pyruvat primär durch die Reaktionen der Glycolyse gebildet wird. Es wurden beispielsweise Torulopsis glabrata Stämme mit einer multiplen Vitamin-Auxotrophie beschrieben, die 1,17 Mol Pyruvat/Mol Glucose produzierten (Yonehara, T.; Miyata, R. (1994): Fermentative production of pyruvate from glucose by Torulopsis glabrata. J. Ferm. Bioeng. 78: 155-159). Die mit diesen Stämmen maximal erreichte Pyruvat-Konzentration bei Fed- Batch-Fermentationen betrug 67,8 g/L (0,77 M). Eine vergleichbare Methode zur Pyruvat-Produktion aus Glucose wurde auch für Liponsäure-auxotrophe Stämme von Enterobacter aerogenes (Yokota A. (1989): Pyruvic acid production by lipoic acid auxotrophs of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 53: 705-711) und Escherichia coli beschrieben (Yokota A.; Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994b): Pyruvic acid production by a lipoic acid auxotroph of Escherichia coli W1485. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41: 638-643). Bei Anzucht auf Glucose unter Liponsäure-Mangelbedingungen produzierten die Enterobacter aerogenes Stämme maximal 0,8 Mol Pyruvat pro Mol Glucose, die Escherichia coli Stämme bis zu 1,2 Mol Pyruvat/ Mol Glucose (Yokata A. Shimizu, H.; Terasawa Y.; Takaoka, N.; Tomita. F. (1994a): Pyruvic acid production by an F1-ATPasedefective mutant of Escherichia coli W1485lip2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58 : 2164-2167; Yokota, A.; Henmi, M.; Takaoka, N.; Hayashi, C.; Takezawa Y.; Fukumori, Y.; Tomita, F. (1997): Enhancement of glucose metabolism in pyruvic acid-hyperproducing Escherichia coli mutant defective in F1-ATPase activity. J. Ferm. Bioeng. 83: 132-138). Die Herstellung von Pyruvat durch Pyrolyse der Traubensäure hat den Nachteil, daß 1. für den Prozeß ein hoher Energieverbrauch (Siedepunkt der Traubensäure: ca. 200°C) anfällt sowie 2. Schwermetalle benötigt werden und 3. Traubensäure nur begrenzt zur Verfügung steht. Der Nachteil der mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Lactat liegt darin, daß das Substrat zunächst produziert werden muß, z. B. mit Hilfe von Milchsäurebakterien aus Glukose. Bei den Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Bildung aus Glucose ist der entscheidende Nachteil, daß die erreichten Ausbeuten signifikant unter der maximal theoretisch erreichbaren Ausbeute liegen.
- Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu schaffen, mit dem es möglich ist, Pyruvat mit nahezu maximal erreichbaren Produktausbeuten mikrobiell zu gewinnen.
- Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
- Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pyruvat zu produzieren. Die Erfinder fanden heraus, daß bei Verwendung von Mikroorganismen mit keiner oder reduzierter Aktivität der Pyruvat umsetzenden Enzyme: Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, Pyruvat-Decarboxylase, Pyruvat-Feredoxin-Oxidoreductase, Pyruvat-Flavodoxin-Oxidoreductase, Pyruvat-Formiat- Lyase, die Pyruvat-Oxidase und/oder die Phosphoenolpyruvat-Synthetase, in verbesserter Weise Pyruvat produziert werden konnte. Diese Reduzierung der Enzymaktivität bzw. komplette Inaktivierung der Enzyme kann beispielsweise durch genetische Veränderungen, z. B. nach Mutation, Deletion oder Reduzierung der Expression der Gene, die für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat-Formiat-Lyase, die Pyruvat-Oxidase und/oder die Phosphoenolpyruvat-Synthetase kodieren, erreicht werden. Es konnte eine nahezu stöchiometrische Umsetzung der Kohlenstoffquelle in Pyruvat erreicht werden, d. h. beispielsweise:
C6H12O6 (Glucose) + O2 → 2 C3H4O3 (Brenztraubensäure) + 2 H2O
- Die Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können Pyruvat beispielsweise aus Kohlenhydraten wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose, oder aus organischen Säuren wie z. B. Lactat oder auch aus Alkoholen wie z. B. Glycerin herstellen. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
- Es kann sich um gram-negative Bakterien, wie z. B. Escherichia coli handeln. Als besonders geeignet hat sich der Stamm Escherichia coli YYC202, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) unter der DSM-Nummer 14335, erwiesen. Dieser Organismus ist in der Literatur hinsichtlich seiner genetischen Eigenschaften beschrieben (Chang, Y-Y.; Cronan, J. E. (1982): Mapping nonselectable genes of Escherichia coli by using transposon Tn10: location of a gene affecting pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 151: 1279-1289; Chang, Y-Y.; Cronan, J. E. (1983): Genetic and biochemical analyses of Escherichia coli strains having a mutation in the structural gene (poxB) for pyruvate oxidase. J. Bacteriol. 169 (5): 756-762; Georgiou, D. Ch.; Fang, H.; Gennis, R. B. (1987): Identification of the cydC locus required for expression of the functional form of the cytochrom d terminal oxidase complex in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169: 2107-2112).
- Als Kultivierungsmethoden können kontinuierliche oder diskontinuierliche im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed-batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pyruvat-Produktion durchgeführt werden.
- Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der Mikroorganismen genügen. Die Fermentationen können sowohl aerob als auch anaerob durchgeführt werden.
- Der im folgenden verwendete Begriff "geringer exprimiert" beinhaltet die Abschwächung der Synthese bzw. die vollständige Deletion der für den Pyruvat- Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat-Formiat-Lyase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase und/oder die Pyruvat- Oxidase kodierenden Gene oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der genannten Enzyme.
- Der im folgenden verwendete Begriff "natürlich" soll dabei solche Nukleotidsequenzen umfassen, die aus genetisch nicht veränderten Mikroorganismen, den Wildtypstämmen, isoliert werden können.
- Folgender Mikroorganismus wurde am 01.06.2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
Escherichia coli YYC202 als DSM 14335 - Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
- Die Figuren zeigen eine Übersicht des Pyruvat- Stoffwechselweges sowie experimentelle Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- Es zeigt:
- Fig. 1 Übersicht Pyruvat-Stoffwechselweg in E. coli YYC202
- Fig. 2 Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202 in M9- Minimalmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat.
- Fig. 3 Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit ruhenden Zellen von E. coli YYC202 bei pH 7
- Fig. 4 Konzentration von Substrat, Produkt und Biomasse während einer aeroben Fed-batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202
- Fig. 5 CO2-Bildungsrate (CTR) und Acetataufnahmerate (ACR) während einer aeroben Fed-batch Fermentation zur Gewinnung von Pyruvat mit E. coli YYC202
- Fig. 1 zeigt schematisch die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat im Stoffwechsel von E. coli YYC202. Dabei bezeichnet
PTS: Phosphotransferase-System
Glucose-6-P: Glucose-6-Phosphat
PEP: Phosphoenolpyruvat
pps: Gensequenz codierend für Phosphoenolpyruvat-Synthetase (PPS)
aceEF: Gensequenz codierend für die Untereinheiten E1 und E2 des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes
pflB: Gensequenz codierend für Pyruvat-Formiat- Lyase (PFL)
poxB: Gensequenz codierend für Pyruvat-Oxidase (POX) - Die Glucose wird über das Phosphotransferase-System (PTS) durch die Cytoplasmamembran (1) in das Innere der Zelle transportiert und anschließend über Glucose-6- Phosphat und Phosphoenolpyruvat (PEP) zu Pyruvat umgesetzt. Pyruvat kann mit Hilfe der Pyruvat-Oxidase (POX), kodiert durch die Gensequenz poxB, zu Acetat umgesetzt werden. Mit Hilfe des Pyruvat-Dehydrogenase- Komplexes, welcher ein Multienzymkomplex ist, der aus mehreren Untereinheiten (E1, E2) besteht, die durch die Gensequenz aceEF kodiert werden, wird die Umsetzung von Pyruvat zu Acetyl-CoA katalysiert, welches dann zur weiteren Umsetzung in den Citrat-Zyklus eingeschleust werden kann. Unter anaeroben Bedingungen kann Pyruvat mit Hilfe der Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL), kodiert durch die Gensequenz pflB, zu Acetyl-CoA umgesetzt werden. Weiterhin kann Pyruvat mit Hilfe der Phosphoenol- Pyruvat-Synthetase (PPS), kodiert durch die Gensequenz poxB, wieder zu Phosphoenolpyruvat (PEP) umgesetzt werden.
- Fig. 2 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben batch Fermentation mit E. coli YYC202. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y1 zeigt die optische Dichte (OD600).
- Die Ordinate Y2 gibt die Konzentration von Glucose bzw. Pyruvat in mM an. Der zeitliche Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als optische Dichte OD600. wird durch die Symbole (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol (●) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkonzentration wird durch das Symbol ( ≙) dargestellt.
- Fig. 3 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben batch Fermentation mit ruhenden Zellen von E. coli YYC202. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y1 zeigt die optische Dichte (OD600). Die Ordinate Y2 gibt die Konzentration von Glucose bzw. Pyruvat in mM an. Der zeitliche Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als optische Dichte OD600, wird durch die Symbole (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol (●) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkonzentration wird durch das Symbol ( ≙) dargestellt.
- Fig. 4 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben Fed-batch Fermentation mit E. coli YYC202 als Funktion der Zeit (X). Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y1 zeigt die optische Dichte (OD600). Die Ordinate Y2 gibt die Konzentration der Glucose bzw. des Pyruvats in mM an. Der Verlauf der Biomassekonzentration, gemessen als optische Dichte OD600 wird durch das Symbol (♦) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Glucosekonzentration wird durch das Symbol ( ≙) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Pyruvatkonzentration wird durch das Symbol (●) dargestellt.
- Fig. 5 zeigt experimentell gewonnene Ergebnisse einer aeroben Fed-batch Fermentation mit E. coli YYC202 als Funktion der Zeit. Die Abszisse X gibt die Zeit der Fermentation in Stunden (h) an. Die Ordinate Y1 bzw. Y2 gibt die CO2-Bildungsrate CTR (mmol/L.h) bzw. die Acetat-Aufnahmerate ACR (mmol/L.h) an. Der zeitliche Verlauf der CO2-Bildungsrate CTR wird durch das Symbol (○) dargestellt. Der zeitliche Verlauf der Acetat- Aufnahmerate ACR wird durch das Symbol (▪) dargestellt.
- Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.
- Durch Verwendung von Mikroorganismen, deren Aktivität der Pyruvat umsetzenden Enzyme durch Veränderung der für diese Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen verringert bzw. komplett inaktiviert wurde, konnte eine erhöhte Pyruvat-Produktion erreicht werden. Diese Enzyme können den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat- Decarboxylase (insbesondere bei Hefen), die Pyruvat- Formiat-Lyase, die Phosphoenolpyruvat-Synthetase sowie die Pyruvat-Oxidase, die Pyruvat : Ferredoxinoxidoreductase (z. B. bei Clostridien) oder die Pyruvat : Flavodoxin-Oxidoreductase umfassen. Als Mikroorganismen können sowohl Hefen als auch Bakterien eingesetzt werden. Mikroorganismen aus der Gruppe der Enterobacteriaceae, insbesondere aus der Gattung Escherichia haben sich als besonders geeignet erwiesen. Dabei hat sich insbesondere der Organismus Escherichia coli YYC202 als sehr geeignet erwiesen. Dieser Bakterienstamm weist gegenüber dem Wildtypstamm (WT) einige genetische Veränderungen auf. So ist bekannt, daß folgende Gensequenzen so verändert wurden, daß keine bzw. nur eine geringe Aktivität der von diesen Sequenzen kodierten Enzyme nachweisbar war: aceEF - kodierend für die Untereinheiten E1 und E2 des Pyruvat-Dehydrogenase- Komplexes, poxB - kodierend für die Pyruvat-Oxidase (POX); pps - kodierend für die Phosphoenol-Pyruvat- Synthetase (PPS); pflB - kodierend für die Pyruvat- Formiat-Lyase (PFL). Die höchste Pyruvat-Ausbeute wird durch die Inaktivierung/Hemmung aller genannten Enzyme erreicht. Die Inaktivierung eines einzelnen Enzyms, z. B. durch Deletion der aceEF-Gene führt jedoch ebenfalls zu einer deutlich erhöhten Pyruvat-Produktion.
- Es konnte sowohl mit ruhenden Zellen als auch mit wachsenden Zellen eine Umsetzung des Substrates in Pyruvat erreicht werden, die erheblich über den mit bisher bekannten Verfahren erzielten Ausbeuten lag. Auf Grund des Genotyps sind die Organismen nicht in der Lage Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat oder Phosphoenolpyruvat umzusetzen. Diese Acetat-Auxotrophie erlaubt es, Wachstum und produktbildung durch die Dosierung des essentiellen Co-Substrats Acetat zu regulieren. In Anwesenheit von Acetat und weiterer Nährstoffe wie z. B. Stickstoff im Fermentationsmedium kann stoffwechselbedingt Zellteilung/Wachstum stattfinden. Da bei Wachstum aber auch ein Teil der Kohlenstoffquelle zur Biosynthese neuen Zellmaterials eingesetzt wird, ist eine maximale Pyruvat-Ausbeute nicht zu erwarten. Dies ist mit Zellen möglich, die auf Grund der Medienbedingungen keine Biosynthese zum Zweck der Bildung neuen Zellmaterials betreiben, d. h. "ruhende" Zellen. Diese Zellen werden zunächst in ein Medium gegeben, im dem eine hohe Zellkonzentration gebildet werden kann. Danach werden die Zellen z. B. durch Zentrifugation geerntet und in ein Medium gegeben, welches kein Acetat und keine weiteren für Wachstum erforderlichen Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff enthält. Unter diesen Bedingungen kann eine noch höhere Pyruvatausbeute erreicht werden. Auf Grund der Stoffwechseleigenschaften der Organismen können sowohl aerobe als auch anaerobe Fermentationen durchgeführt werden.
- Als Kohlenstoffquellen eignen sich Kohlenhydrate (z. B. Tetrosen, Hexosen, Pentosen, Heptosen), organische Säuren sowie auch Alkohole. Um die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu gewährleisten werden Substrate bevorzugt, die als Abfallstoffe anfallen bzw. direkt verfügbar sind, d. h. nicht in besonderer Weise zur weiteren Verarbeitung für das erfindungsgemäße Verfahren vorbehandelt oder produziert werden müssen.
- Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin beispielsweise markiertes Pyruvat in hohen Ausbeuten hergestellt werden, indem z. B. C13-markierte Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Die Wirtschaftlichkeit dieses Verfahrens wird durch die hohen Produktausbeuten erheblich verbessert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich zusätzlich positiv auf den weiteren Stoffwechsel des Organismus auswirken, indem zunächst ein hoher Pyruvat-Pool erzeugt wird und im weiteren gezielt Stoffwechselwege verstärkt werden, wie z. B. eine erhöhte Lysinproduktion mit Corynebacterium glutamicum.
- Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
- Um den Einfluß der Acetatkonzentration auf Wachstum und Pyruvat-Bildung von Escherichia coli YYC202 zu untersuchen wurde der Organismus in M9-Minimalmedium (Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. (1989): Molecular cloning, Second Edition, Vol. 3) mit 10 mM Glucose und Acetatkonzentrationen von 0, 1, 2, 6, und 10 mM kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 37°C auf einem Rotationsschüttler bei 140 Umdrehungen pro Minute (Upm) wurde die im Kulturüberstand vorhandene Pyruvat-Konzentration mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt. Das Wachstum wurde anhand der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) photometrisch bestimmt. In Fig. 2 sind Wachstum, Glucose- Verbrauch und Pyruvat-Bildung bei einer initialen Acetat-Konzentration von 2 mM dargestellt. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Versuche. In Abwesenheit von Acetat zeigte der Organismus kein Wachstum. Mit steigender Acetatkonzentration stieg die maximale Wachstumsrate und die maximal erreichte OD600, während die Pyruvat- Ausbeute kontinuierlich abnahm. Dennoch konnten Pyruvat Ausbeuten erreicht werden, die mit 1,3 bis 1,7 Mol Pyruvat/Mol Glucose höher waren als die der bisher publizierten Verfahren. Tabelle 1 Pyruvat-Ausbeute bei unterschiedlicher Acetat- Ausgangskonzentration im Medium
- Bei aerobem Wachstum von E. coli Wildtypstämmen auf Glucose-Minimalmedium werden ca. 50% der verbrauchten Glucose für die Biosynthese von neuem Zellmaterial eingesetzt. Eine maximale Pyruvat-Ausbeute (2 Mol Pyruvat/Mol Glucose) ist daher nur mit "ruhenden", nicht wachsenden Zellen möglich. Zur Charakterisierung der Pyruvat-Bildung durch solche Zellsuspensionen wurden Zellen von E. coli YYC202, die in M9-Minimalmedium mit Glucose und Acetat gezüchtet worden waren, abzentrifugiert und die Zellen zweimal mit 1/10 Kulturvolumen 0,9%iger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in einem Puffer (50 mM MES, 50 mM MOPS, und 50 mM TRICINE) mit 10 mM Glucose, aber ohne Acetat und weitere Nährstoffe, wie z. B. Stickstoff- und Schwefelquellen, resuspendiert. Die OD600 der Zellsuspension betrug ca. 1,0. Die Pyruvat-Bildung wurde bei pH-Werten von 6, 6,5, 7, 7,5, und 8 untersucht. Das verwendete Puffergemisch wurde dabei auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Nach Inkubation der Zellsuspension für 24 h bei 37°C auf einem Rotationsschüttler bei 140 Upm (Umdrehungen pro Minute) wurde die im Kulturüberstand akkumulierte Pyruvat-Konzentration mittels üblicher Analyseverfahren wie z. B. HPLC oder enzymatische Tests bestimmt. In Fig. 3 ist die Kinetik des Glucose Verbrauchs und der Pyruvat-Bildung bei einem pH-Wert von 7 dargestellt. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Pyruvat-Ausbeute bei verschiedenen pH-Werten dargestellt. Es zeigte sich, daß die Ausbeute bei einem pH-Wert oberhalb 7 abnahm. Tabelle 2 Pyruvat-Ausbeute mit ruhenden Zellen bei verschiedenen pH-Werten
- Zur Untersuchung des Einflusses der Zellkonzentration ruhender Zellen auf die Pyruvat-Ausbeute wurden Fermentationen mit ruhenden Zellen durchgeführt, die in unterschiedlichen Konzentrationen mit einer optischen Dichte OD600 von 0,65 bis 5,77 eingesetzt wurden. Mit steigender Zellkonzentration war eine Zunahme der Pyruvat-Bildungsrate zu verzeichnen.
- Fed-batch Fermentationen zur Pyruvat-Produktion wurden im Labormaßstab (7,5 l Bioreaktor) unter aeroben Bedingungen (pO2 ≥ 40%) bei 37°C und pH 7 unter Verwendung des "Pan"-Mediums (Pan, J. G.; Rhee, J. S.; Lebeault, J. M. (1987): Physiological Constraints in Increasing Biomass Concentration of Escherichia coli B in Fedbatch Culture, Biotechnol. Letters, Vol 9 (2): 89-94.) durchgeführt. Aufgrund der Acetat-Auxotrophie des eingesetzten Produktionsstammes korreliert die CO2- Bildungsrate (CTR) des Citrat-Zyklus direkt mit der Acetat-Aufnahmerate (ACR) der Zellen. Unter Wachstumsbedingungen auf Glucose mit Acetat konnte die allgemeine Beziehung
gefunden werden, wobei die Konstante den Wert 1 annimmt. Die Fig. 4 und 5 verdeutlichen diese Korrelation anhand eines fed-batch Experimentes, bei dem eine OD600 von 22 und eine Pyruvat-Konzentration von ca. 330 mM erreicht wurden. Die Glucose-Konzentration war während des gesamten Experimentes nicht limitierend. - Die Verwendung der Beziehung (1) ermöglicht es, eine gezielte Prozessführung über die on-line Messung des vergleichsweise einfach zugänglichen Signals CTR (z. B. via NIR (Near Infra-Red)-Abgasanalytik) zu realisieren. Soll eine hohe Wachstumsrate eingestellt werden, so kann eine nicht-limitierende Acetatversorgung eingeregelt werden. Ebenso ist es möglich, eine möglichst hoch selektive Pyruvat-Produktion unter Acetat-limitierenden Bedingungen einzustellen. Die Verwendung der Beziehung (1) ermöglicht somit die on-line Regelung des Prozesses über beispielsweise Einsatz eiern CO2 Meßanalytik hin zu hohen Raum-Zeit-Ausbeuten oder hohen Produkt/Substrat-Selektivitäten oder hohen Produkttitern.
Claims (21)
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von
Pyruvat,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen, deren Aktivität der Pyruvat
umsetzenden Enzyme verringert bzw. komplett
inaktiviert wurde, eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für den Pyruvat-
Dehydrogenase-Komplex kodieren, deletiert werden
oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen
nicht oder geringer exprimiert werden.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die Pyruvat-Decarboxylase
kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich
vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer
exprimiert werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die Pyruvat-Ferredoxin-
Oxidoreductase kodieren, deletiert werden oder
gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder
geringer exprimiert werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die Pyruvat-Flavodoxin-
Oxidoreductase kodieren, deletiert werden oder
gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder
geringer exprimiert werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die Pyruvat-Formiat-Lyase
kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich
vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer
exprimiert werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die Phosphoenolpyruvat-
Synthetase kodieren, deletiert werden oder
gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder
geringer exprimiert werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die Pyruvat-Oxidase
kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich
vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer
exprimiert werden.
9. Verfahren nach eine der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die aceE und aceF-Gene
kodieren, deletiert werden oder gegenüber natürlich
vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer
exprimiert werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die poxB-Gene kodieren,
deletiert werden oder gegenüber natürlich
vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert
werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die pps-Gene kodieren,
deletiert werden oder gegenüber natürlich
vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert
werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen eingesetzt werden, deren
Nukleotidsequenzen, die für die pflB-Gene kodieren,
deletiert werden oder gegenüber natürlich
vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert
werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen aus der Gruppe der
Enterobacteriaceae eingesetzt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia
eingesetzt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß Escherichia coli eingesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß Escherichia coli YYC202, hinterlegt unter der
Bezeichnung DSM 14335, eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß sowohl anaerobe als auch aerobe Fermentationen
durchgeführt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Substrat bei der Fermentation
Kohlenhydrate, organische Säuren oder Alkohole eingesetzt
werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß Acetat bei der Fermentation mit wachsenden
Zellen eingesetzt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19
dadurch gekennzeichnet,
daß bei Fermentationen mit ruhenden Zellen kein
Acetat eingesetzt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20,
dadurch gekennzeichnet,
daß bei den Fermentationen eine CO2 Meßanalytik
eingesetzt wird.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2001129711 DE10129711B4 (de) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat |
| PCT/DE2002/002144 WO2003000913A2 (de) | 2001-06-22 | 2002-06-12 | Verfahren zur fermentativen herstellung von pyruvat |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2001129711 DE10129711B4 (de) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10129711A1 true DE10129711A1 (de) | 2003-01-09 |
| DE10129711B4 DE10129711B4 (de) | 2007-08-23 |
Family
ID=7688814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2001129711 Expired - Fee Related DE10129711B4 (de) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE10129711B4 (de) |
| WO (1) | WO2003000913A2 (de) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003093488A1 (de) * | 2002-05-06 | 2003-11-13 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren sowie mikroorganismen zur mikrobiellen herstellung von pyruvat aus kohlenhydraten sowie alkoholen |
| US7749740B2 (en) | 2002-02-20 | 2010-07-06 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Microbial production of pyruvate and pyruvate derivatives |
| US8278076B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-10-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Microbial production of pyruvate and pyruvate derivatives |
| DE102016008326A1 (de) | 2016-07-07 | 2018-01-11 | André Pick | Chemo-enzymatische Katalyse zur Herstellung von Pyruvat und anderen α-Keto-Säuren |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8372989B2 (en) | 2002-04-23 | 2013-02-12 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors |
| US7572607B2 (en) | 2002-04-23 | 2009-08-11 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors |
| US7405068B2 (en) * | 2003-05-02 | 2008-07-29 | Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. | Pyruvate producing yeast strain |
| WO2005042756A2 (en) | 2003-10-21 | 2005-05-12 | Cargill, Incorporated | Production of monatin and monatin precursors |
| US8158389B2 (en) | 2005-04-20 | 2012-04-17 | Cargill, Incorporated | Products and methods for in vivo secretion of monatin |
| WO2006113897A2 (en) | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Cargill, Incorporated | Products and methods for in vivo secretion of monatin |
| US8076108B2 (en) | 2005-04-26 | 2011-12-13 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors |
| US7582455B2 (en) | 2005-04-26 | 2009-09-01 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors |
| DE102005045301A1 (de) * | 2005-09-22 | 2007-04-05 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| US8512714B2 (en) | 2006-05-22 | 2013-08-20 | Biogasol Ipr Aps | Thermoanaerobacter mathranii strain BG1 |
| CN103087950A (zh) * | 2013-01-10 | 2013-05-08 | 江南大学 | 一株高产丙酮酸的大肠杆菌菌株的构建及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63258586A (ja) * | 1987-04-15 | 1988-10-26 | Toray Ind Inc | 発酵法によるピルビン酸の製造法 |
| JPH09252790A (ja) * | 1996-03-21 | 1997-09-30 | Japan Energy Corp | 発酵法によるピルビン酸の製造方法 |
| WO1998007843A1 (en) * | 1996-08-22 | 1998-02-26 | Chr. Hansen A/S | Metabolically engineered lactic acid bacteria and their use |
| US5869301A (en) * | 1995-11-02 | 1999-02-09 | Lockhead Martin Energy Research Corporation | Method for the production of dicarboxylic acids |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3783141T2 (de) * | 1987-08-21 | 1993-05-19 | Toray Industries | Verfahren zur herstellung von ketotraubensaeure mittels gaerung. |
-
2001
- 2001-06-22 DE DE2001129711 patent/DE10129711B4/de not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-06-12 WO PCT/DE2002/002144 patent/WO2003000913A2/de not_active Application Discontinuation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63258586A (ja) * | 1987-04-15 | 1988-10-26 | Toray Ind Inc | 発酵法によるピルビン酸の製造法 |
| US5869301A (en) * | 1995-11-02 | 1999-02-09 | Lockhead Martin Energy Research Corporation | Method for the production of dicarboxylic acids |
| JPH09252790A (ja) * | 1996-03-21 | 1997-09-30 | Japan Energy Corp | 発酵法によるピルビン酸の製造方法 |
| WO1998007843A1 (en) * | 1996-08-22 | 1998-02-26 | Chr. Hansen A/S | Metabolically engineered lactic acid bacteria and their use |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Appl. Microbiol. Biotechnol. (1994) 41:638-643 * |
| Chemical Abstract 131: 335899 * |
| Chemical Abstract 131: 72762 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7749740B2 (en) | 2002-02-20 | 2010-07-06 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Microbial production of pyruvate and pyruvate derivatives |
| US8278076B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-10-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Microbial production of pyruvate and pyruvate derivatives |
| US8652825B2 (en) | 2002-02-20 | 2014-02-18 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Microbial production of pyruvate and other metabolites |
| WO2003093488A1 (de) * | 2002-05-06 | 2003-11-13 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren sowie mikroorganismen zur mikrobiellen herstellung von pyruvat aus kohlenhydraten sowie alkoholen |
| DE102016008326A1 (de) | 2016-07-07 | 2018-01-11 | André Pick | Chemo-enzymatische Katalyse zur Herstellung von Pyruvat und anderen α-Keto-Säuren |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003000913A3 (de) | 2003-05-30 |
| WO2003000913A2 (de) | 2003-01-03 |
| DE10129711B4 (de) | 2007-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69226844T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin | |
| EP0885962B1 (de) | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolindinderivaten | |
| EP1999264B1 (de) | Verfahren zur enzymatischen herstellung von 2-hydroxy-2-methylcarbonsäuren | |
| DE69228640T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Threonin | |
| DE10129711B4 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat | |
| DE69929264T2 (de) | Methode zur Herstellung von L-Serin mittels Fermentation | |
| EP2670837A1 (de) | Verfahren zur fermentativen herstellung von 2,3-butandiol | |
| EP0301572A2 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin | |
| EP1583838B1 (de) | Herstellung von milchsäure aus einem pentose-enthaltenden substrat | |
| EP0046284A2 (de) | Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketo-D-Gluconsäure und Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens | |
| EP2670836A1 (de) | Verfahren zur fermentativen herstellung von 2,3-butandiol | |
| DE102011003383A1 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von 2,3-Butandiol | |
| EP1924694B1 (de) | Verfahren zur produktion von aminosäuren mit mikroorganismen | |
| US5686277A (en) | Fermentation process for preparing xylitol using mutant cells | |
| US7083955B2 (en) | Preparation of lactic acid from a pentose-containing substrate | |
| DE2811303C3 (de) | Enzymatische Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung | |
| DE10220234B4 (de) | Verfahren sowie Mikroorganismen zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen | |
| DE3878421T2 (de) | Verfahren zur herstellung von carnitin. | |
| KR101576183B1 (ko) | 부산물을 이용한 에리스리톨 제조 방법, 에리스리톨 생산성이 우수한 모닐리엘라 폴리니스 변이 균주 및 이의 이용 | |
| DE69614760T2 (de) | Optische Trennung von Chlorhydrin mittles Mikroorganismen | |
| EP0313850B1 (de) | Verfahren zur Herstelllung von Brenztraubensäure | |
| DE69126213T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch Fermentation | |
| EP0972065A1 (de) | Mikrobielles verfahren zur herstellung von polyhydroxyalkanoaten | |
| US5962286A (en) | Process for the production of gluconic acid with a strain of Aureobasidium pullulans (de bary) Arnaud | |
| DE69620954T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Dimethylolcarbonsäure |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee | ||
| R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |
Effective date: 20150101 |