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DE2811303C3 - Enzymatische Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung - Google Patents

Enzymatische Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung

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DE2811303C3
DE2811303C3 DE2811303A DE2811303A DE2811303C3 DE 2811303 C3 DE2811303 C3 DE 2811303C3 DE 2811303 A DE2811303 A DE 2811303A DE 2811303 A DE2811303 A DE 2811303A DE 2811303 C3 DE2811303 C3 DE 2811303C3
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amino acids
enzymatic
optically active
culture
cells
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Ludwig Roma Degen
Eugenio Fascetti
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Anic SpA
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SnamProgetti SpA
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C273/00—Preparation of urea or its derivatives, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
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    • C07C273/1854—Preparation of urea or its derivatives, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups of substituted ureas by reactions not involving the formation of the N-C(O)-N- moiety
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Description

Einige Aminosäuren der D-Konfiguration, insbesondere Phenylglycin und Hydroxyphenylglycin, werden derzeit als wichtige Zwischenprodukte in der pharmazeutischen Industrie weitverbreitet angewendet.
Es wurden viele Versuche unternommen, die Trennung der optischen Antipoden durchzuführen, dennoch führte keiner davon zu einer industriell praktizierbaren Verfahrensweise.
Die bisher zur Trennung der optischen Antipoden verwendeten chemischen Methoden basierten auf der Verwendung optisch aktiver Verbindungen, wie Camphersulfonsäure, Weinsäure und anderen.
Diese weisen jedoch den Nachteil auf, daß die
NH Umwandlungsausbeuten gering sind und die Betriebskosten hoch liegen.
Alternative Methoden basieren auf der selektiven Hydrolyse einer D-Acylaminosäure durch das Enzym Acylase. Jedoch sind Acylasen vergleichsweise selten und sind immer mit L-Acylase verunreinigt, so daß dieses komplizierte Verfahren zu Produkten mit einer geringen optischen Reinheit führt.
Methoden zur enzymatischen Spaltung von D.L-Aminosäuren oder deren Derivaten wurden auch in der DE-PS 24 22 737 und in der DE-OS 26 31 048 empfoh-
len. Diese Verfahren bestehen darin, die racemische Form von Verbindungen der allgemeinen Formel
X=-H OH-OCH3
NH-C = O
der enzymatischen Hydrolyse durch Hydropyrimidin- Pseudomonas erzeugt wurde.
Hydrolase zu unterziehen, die aus der Leber von Derartige Hydrolysen finden nach dem folgenden
Kälbern extrahiert wurde, oder durch Hydropyrimidin- Reaktionsschema statt:
Hydrolyse, die von Mikroorganismen des Genus
NH
NH,
NH-C = O
Racemisierung
O
C-
-NH
CH-NH-C
Sie können jedoch nur bei relativ niedrigen
Temperaturen und daher geringen Hydantoinkonzentrationen durchgeführt werden.
Es wurde nun gefunden, daß die enzymatische
Trennung von racemischen Formen der vorstehenden
allgemeinen Formel (1) nach dem vorstehenden
Reaktionsschema (2) auch durchgeführt werden kann mit Hydrolasen, die von bestimmten thermophilen Mikroorganismen-Stämmen der Familie Bacillaceae gebildet werden. Die durch diesen Mikroorganismen erzeugten Hydropyrimidin-Hydrolasen (E. C. 3.5.2.2.) sind wärmebeständig und können daher in hydrolytischen Verfahren angewendet werden, die bei vergleichsweise hohen Temperaturen (40 bis 60°C)
durchgeführt werden können, und ermöglichen die Arbeitsweise mit einer Lösung mit einer höheren Konzentration an Hydantoin, wobei die Nachteile eingeschränkt werden, die sich mit der geringen Löslichkeit einiger Hydantoine bei niedrigen und mittleren Temperaturen ergeben.
Die Erfindung betrifft daher den in den Patentansprüchen beschriebenen Gegenstand.
Die Zellen der Mikroorganismen NRRLB-Il 079 oder NRRLB-Il 080, die der Familie Bacülaceae angehören, werden unter aeroben Bedingungen in Kulturmedien kultiviert, die Quellen für Stickstoff und Kohlenstoff und Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 30 bis 600C, vorzugsweise von 40 bis 600C, während einer Zeit von 10 Stunden bis 48 Stunden, und vorzugsweise von 10 Stunden bis 24 Stunden, und bei einem pH-Wert von 6 bis 8, und vorzugsweise von 7,4 bis 7,8. Als Kohlenstoffquellen können verwendet werden Pepton, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit und als Stickstoffquellen Nitrate sowie ammoniakalische Salze und Hydrolysate von Fleisch, Casein und Sojabohnen. Als Induktoren für die enzymatische Aktivität verwendet man D,L-Hydantoine, vorzugsweise das D,L-5-Methylhydantoin. Der Induktor kann zu dem Kulturmedium direkt vor der Sterilisierung oder während des Wachstums des Mikroorganismus zugesetzt werden.
Ein Vergleich der morphologischen und physiologsichen Merkmale der Mikrooganismen NRRLB-Il 079 und NRRL B-II 080 mit denjenigen, die von Bergey's Manual, 7th Edition, beschrieben werden, zeigt, daß sie zu der Familie Bacülaceae, Genus Bacillus, Species B. brevis, B. stearothermophilus, gehören.
Die erfindungsgemäßen enzymatischen Komplexe sind insbesondere zur Hydrolyse von Hydantoinen zu Derivaten von Aminosäuren mit der D-Konfiguration geeignet.
Die Stämme NRRLB-Il 079 und NRRLB-Il 080 wurden am 11. Februar 1977 beim Northern Regional Research Cenier in Peoria, 111, USA, als Stämme mit den Nummern 1286 und 1287 hinterlegt. Die Stämme wurden aus Erde, Kompost, Gemüsen und Abfällen oder Speiseresten verschiedenen Ursprungs isoliert und wurden bei 50°C von Schräg-Kulturen in 250 ml inokuliert. Erlenmeyer-Kolben enthielten jeweils 50 ml des folgenden Kulturmediums:
Derivats durchgeführt [J.BioL Chem, 238, 3325 (1963)1 Die Ergebnisse sind in der Tabelle I aufgeführt
Tabelle I
N-Carbamylphenylglycin in % der theor. Ausbeute
(NRRL B-11080) B. brevis 60% (NRRL B-11070) 10%
B. stearothermophilus
Fleischpepton 10 g/l
Hefe-Extrakt 10 g/l
NaCl 3 g/l
D,L-5-Methylhydantoin lg/1
PH 7,2
50
Es wurde 30 Minuten bei 110°C sterilisiert.
Nach einer Inkubation von 18 bis 20 Stunden unter orbitalem Rühren bei 500C wurden 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, die jeweils 100 ml des gleichen Kulturmediums enthielten, mit 2 ml der vorstehenden Präkultur inkubiert.
Nach 16 bis 18 weiteren Stunden wurde die Enzym-Reaktion mit den resultierenden Zellen wie folgt bo durchgeführt:
Testrohre, die 10 ml 0,07m-Phosphatpuffer vom pH 8,5 und 20 Mikromol pro ml D,L-5-Phenylhydantoin enthielten, wurden mit 1 ml der Bakteriensuspensionen (Trockengewicht 40 mg/ml) gefüllt. b5
Nach einer 15minütigen Inkubation bei 400C wurde sine Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd zur quantitativen Bestimmung des so gebildeten Carbamyl-Es zeigte sich, daß, während die enzymatische Hydrolyse von D-Hydantoin bei einem alkalischen pH-Wert (pH von 7 bis 10) verläuft, konkurrierend hierzu die nicht-enzymatische Racemisierung des restlichen L-Hydantoins abläuft Aus diesem Grunde und wegen der kontinuierlichen Subtraktion des durch enzymatische Hydrolyse erhaltenen D-Hydantoins ergibt sich als Endergebnis der Reaktion, daß das gesamte Carbamyl-Derivat in der D-Form vorliegt. Die Racemisierungsgeschwindigkeit des L-Hydantoins stellt eine Funktion der Temperatur und des pH-Werts dar und ist umso größer, je höher die Temperatur und der pH-Wert sind. Arbeitet man jedoch bei einem pH-Wert in der Umgebung von 8, ist diese Geschwindigkeit nicht so hoch, daß sie die Reaktionsgeschwindigkeit der Hydantoinase einschränkt. Die enzymatische Reaktion kann bei einer Temperatur von 10 bis 6O0C durchgeführt werden, aus praktischen Gründen kann sie bei Temperaturen von 35 bis 55° C durchgeführt werden.
Die chemische Identität des N-Carbamylphenylglycins und des N-Carbamyl-(p-methoxy)-phenylglycins wurde durch Umkristallisieren des Reaktionsprodukts auf der Basis der IR-Spektren, der NMR-Spektren und der Massen-Spektrographie sowie der Elementaranalyse bestätigt.
Die optischen Drehwerte waren [α] fc = — 137° (c=\ in 1 n-NH4OH) bzw. [<x] ve =-140° (c=\ in 1 n-NH4OH); sie entsprachen den in der chemischen Literatur angegebenen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Hydrolyse der Hydantoine nicht ausschließlich in Anwesenheit der Mikroorganismen in deren Wachstumsphasen oder in Anwesenheit intakter Zellen davon oder der entsprechenden Poren, sondern auch in Anwesenheit von Extrakten der vorstehenden Mikroorganismen.
Die Mikroorganismen können beispielsweise in einem flüssigen Nährmedium kultiviert werden zur Erzielung einer Akkumulation der Hydrolase in den Zellen, und die D,L-Hydantoine können zu einem späteren Zeitpunkt in Kulturbrühen zugesetzt werden.
Die enzymatische Hydrolyse kann auch nach der Methode der sogenannten »ruhenden Zellen« durchgeführt werden. Dabei werden die aus der Kulturbrühe gewonnenen und sorgfältig gewaschenen Zellen in einem System aufgeschlämmt, das dazu geeignet ist und sorgfältig gepuffert wurde, und das racemische Hydantoin wird zugefügt.
In gleicher Weise ist es möglich, Präparate zu verwenden, die die Hydrolase enthalten, sowie Extrakte und Konzentrate davon, Präparate von rohen oder gereinigten Hydrolasen und die aus Zellen der vorstehend genannten Mikroorganismen erhalten wurden.
Schließlich kann eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung dadurch erzielt werden.
20
daß man das Enzym durch Kombinationen mit makromolekularen Verbindungen immobilisiert über die Bildung von chemischen Bindungen mit der Matrix oder über Bindungen vom ionischen Typ oder durch physikalische Immobilisierung.
Beispiel 1
Zu 100 ml einer Kulturbrühe der vorstehenden Art von NRRLB-Il 080 in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben wurden zur 18. Inkubationsstunde (orbitales Rühren) bei 400C 100 ml Phosphatpuffer (0,14 m und pH 8,5) gefügt, die 40 Mikromol pro ml D,L-5-Phenylhydantoin enthielten. Nach 4 weiteren Stunden Inkubationszeit unter den gleichen Bedingungen wurde das so gebildete N-Carbamylphenylglycin bestimmt.
Aus 705 mg D,L-5-Phenylhydantoin erhielt man 700 mg N-Carbamylphenylglycin, was einer Ausbeute von etwa 90% entspricht.
Beispiel 2
Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 erhielt man nach 4 Stunden bei 400C mit NRRL B-11 079 aus 705 mg D,L-5-Phenylhydantoin 600 mg N-Carbamylphenylglycin, was einer Ausbeute von etwa 85% entspricht
Beispiel 3
Ein Kulturmedium der vorstehenden Zusammensetzung wurde hergestellt, das 1 g/Liter D,L-5-Methylhydantoin enthielt Der pH-Wert wurde mit Soda auf 7,5 eingestellt, und die Brühe wurde in 50 ml-Anteilen in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt Nach 30minütigem Sterilisieren bei 110° C wurden die Kolben mit NRRL B-Il 080 von einer Schräg-Kultur inokuliert, die in dem gleichen Medium mit Agar (DIFCO) in einer Konzentration von 2% enthalten war, und 22 Stunden bei 400C unter orbitalem Brühren bei 220UpM inkubiert
Aus einer derartigen Präkultur (opt Dichte bei 550 nm = 0,4; Verdünnung 1:10) wurden 2 ml in Erlenmeyer-Kolben vom Volumen von 500 ml inokuliert, 100 ml des gleichen Mediums und der Kultur wurden bei 400C unter orbitalem Rühren bei 220 UpM während 18 Stunden inkubiert (Präsporulations-Phase). Die aus der Brühe durch Zentrifugieren bei 5000 g (g steht für die Schwerkraft) während 30 Minuten abgetrennten Zellen wurden dreimal mit isotonischer Lösung beim pH-Wert von 8,0 gewaschen und in Phosphatpuffer vom pH-Wert 83 (0,07 m) aufgeschlämmt; hierbei handelte es sich um die ruhenden Zellen.
Zur Reaktion der Enzym-Hydrolyse wurden bei 400C und unter orbitalem Rühren (220 UpM) in 250-mI-Erlenmeyer-Kolben 64 ml des Reaktionsgemischs inkubiert, die 200 mg Bakterien (Trockengewicht) und 20 Mikromol pro ml D,L-5-PhenyIhydantoin (=3,52 mg/ml) enthielten. Zu geeigneten Zeitintervallen wurde das Hydrolyseprodukt, d. h. D-Carbamoylphenylglycin, mit einer colorimetrischen Methode bei 438 Millimikron gemessen. Die Zeichnung zeigt die Daten als Prozentsatz der theoretischen Ausbeute des so gebildeten Carbamoyl-Derivats; auf der Abszisse die Zeiten in Minuten und auf der Ordinate der Prozentsatz des so gebildeten D-(—)-Carbamoylphenylglycins.
Beispiel 4
Es wurden Bakterienzellen NRRLB-Il 080, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt Eine Suspension davon (41,5 mg/ml an trockenen Baterienzellen) in einem Puffer aus Phosphatsalzen (0,1 m, pH 8,5) wurde einem mechanischen Bruch mittels eines Homogenisators unterzogen, der unter einem Druck etwa von 650 bar bei einer Temperatur unter 35°C betrieben wurde. Die Zelltrümmer wurden aus dem Extrakt abzentrifugiert (25 OOOfache Schwerkraft während 30 Minuten). Zu 970 ml Puffer aus Phosphatsalzen (0,2 m, pH 8,5), die 4,7 g D,L-5-Phenylhydantoin enthielten, wurden 30 ml des Extrakts gefügt, die 280 Enzym-Einheiten enthielten. (Eine Einheit ist die Menge Enzym, die 1 Mikromol pro ml in einer Minute an Substrat in einem 0,2 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,5 bei 500C umwandelt, wobei der Puffer 20 Mikromol/ml D.L-5-Phenylhydantoin enthält) Nach einer Stunde waren 3,2 g D-Carbamoly-Derivat entsprechend etwa 63% der Gesamt-Hydrolyse gebildet.
Beispiel 5
Es wurde ein halb-synthetisches Medium hergestellt, das folgende Zusammensetzung aufwies:
NH4C1 5 g/l
Na2PO4 7,05 g/l
KH2PO4 2,72 g/l
Fleischpepton 5 g/l
Hefe-Extrakt 0,5 g/I
D,L-5-Methylhydantoin 1,0 g/l
Das Medium wurde in Anteilen von jeweils 50 ml in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben und in Anteilen von 100 ml in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gefügt und 30 Minuten bei 1100C sterilisiert Die Präkultur wurde durch Inokulieren der 250-ml-Kolben aus Schräg-Kulturen einer Kultur von NRRL B-Il 080 inokuliert und wie in Beispiel 4 bei 400C während 22 Stunden inkubiert. Aus dieser Kultur (optische Dichte bei 550 nm: 0,105, Verdünnung 1:10) wurden 2,5 ml in 500-mI-Erlenmeyer-Kolben inokuliert die das gleiche Medium enthielten. Nach 15stündiger Inkubation bei 40° C, wie vorstehend beschrieben, wurden die ruhenden Zellen wie in Beispiel 4 hergestellt Die enzymatische Hydrolyse wurde bei 40" C in einem Reaktionsgemisch durchgeführt das in 64 ml Puffer 100 mg Bakterien (bezogen auf das Trockengewicht und entsprechend 100 ml Kulturbrühe) und 20 Mikromol pro ml D,L-5-Phenylhydantoin enthielt
Nach 5 Minuten, 10 Minuten und 15 Minuten bestimmte man die Menge des so gebildeten Carbamoyl-Derivats.
Tabelle II
Zeit, Minuten
5 10 15
Gebildetes Carbamoyl-Derivat,
in Mikromol/ml
0,6 1,0 1,4
Beispiel 6
Es wurde ein Kulturmedium gebildet, das ausschließlich aus Maisquellflüssigkeit bestand, 2,6% (bezogen auf das Trockengewicht), die nicht mit frischem Wasser behandelt worden war. Das mit KOH auf den pH-Wert 7,5 gebrachte Medium wurde in Portionen von 50 ml in Kolben von 250 ml Fassungsvermögen und in Anteilen von 100 ml in 500-ml-Kolben eingebracht und 30
Minuten bei 11O0C sterilisiert. Für die Präkultur wurden die 250-ml-K.olben aus Schräg-Kulturen einer Kultur von NRRLB-Il 080 inokuliert und wie in Beispiel 4 22 Stunden bei 400C inkubiert.
Aus dieser Kultur wurden 2,5 ml in die 500-ml-Kolben inokuliert. Nach 18stündiger Inkubation bei 40°C, wie vorstehend beschrieben, wurden die ruhenden Zellen wie in Beispiel 3 hergestellt. Die enzymatische Hydrolyse wurde bei 40°C wie folgt durchgeführt:
a) in einem Reaktionsgemisch, das 64 ml Phosphatpuffer (0,07 m, pH 8,5) enthielt, die Bakterienzellen aus 100 ml der Kulturbrühe und 20 Mikromol pro ml D,L-5-Phenylhydantion;
b) in einem Reaktionsgemisch, das 64 ml Phosphatpuffer (0,07 m, pH 8,5) enthielt, die Rakterien^ellen aus 100 ml Kulturbrühe und 20 Mikromol pro ml D,L-5-p-Methoxyphenylhydantoin.
Nach 5, 10, 15 und 60 Minuten wurde die Menge des so gebildeten Carbamoyl-Derivats bestimmt.
Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Tabelle III Umwand Gebildetes N-Carb- Umwand
Zeit lung, % amoyl-p-methoxy- lung, %
Min. Gebildetes N-Carbamoyl- 32,8 phenylglycin. 32,3
phenylglycin. 55,5 Mikro- 54,5
75,5 mol/ml 74,2
Mikro- 99,0 6,45 99,2
5 mol/ml 10,9
10 6,55 14,85
15 11,1 19,85
60 15,05
19,8
Beispiel 7
Man stellte ein acetonisches Pulver der Zellen von NRRLB-Il 080 her.
80 mg dieses Pulvers, die 420 Einheiten des Enzyms enthielten, wurden in 1 1 Phosphatsalz-Puffer (0,2 m, pH 8,5) suspendiert, der 5,0 g D,L-5-Phenylhydantoin enthielt Nach einer Stunde hatten sich bei einer Temperatur von 50° C 4,8 g Derivat gebildet entsprechend etwa 87% der Gesamt-Hydrolyse. 4"i
Beispiel 8
Es wurde eine Biomasse mit NRRL B-11 080 in einem 20-1-Formel-Fermentiergefäß hergestellt, das 161 eines
Hefe-Extrakt 10 g/l
Fleischpepton 10 g/l
NaCI 3 g/l
K2HPO4 0,56 g/l
D,L-5-Methylhydantoin 1 g/l
pH 7,8
Es wurde 30 Minuten bei 1100C sterilisiert.
Die Kultur des Fermentors wurde mit 160 rr.l einer Präkultur (optische Dichte bei 550 nm: 0,360-Verdünnung 1/10) inokuliert, die in 500-ml-Kolben gezogen wurden, die 100 ml des gleichen Kulturmediums enthielten, und es wurde 16 Stunden bei 40°C unter orbitalem Rühren von 220 UpM inkubiert. Die Fermentation wurde bei 410C bei einem pH-Wert von 7,8 durch automatische Steuerung mit einer doppel-normalen HCI und Einspeisung in das System von einer O. A. R. von 0,45 gesteuert. In der 16. Fermentations-Stunde (optische Dichte bei 550 nm: 0,350-Verdünnung 1 :10) wurde die Biomeasse aus der Brühe durch Zentrifugieren bei Raumtemperatur abgetrennt. An den so erhaltenen und mit isotonischer Lösung vom pH-Wert 8,0 gewaschenen Zellen wurde die enzymatische Aktivität bestimmt. Die enzymatische Hydrolyse wurde bei 400C
(a) in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das 64 ml Phosphatsalz-Puffer (0,07 m, pH 8,5), 0,5 g Zellularpaste (entsprechend 0,120 g Trockenzellen) und 20 Mikromol pro ml D,L-5-Hydantoin enthielt, und
(b) in einem Reaktionsgemisch wie (a), das 20 Mikromol/ml D,L-5-p-Methoxyphenylhydantoin enthielt.
Nach 5, 10 , 15 und 60 Minuten wurde die Menge des gebildeten Carbamoyl-Derivats bestimmt.
Tabelle IV % Gebildetes N-Carb- %
Zeit Gebildetes amoyl-p-methoxy-
Min. 20,2 phenylglycin 20,5
; N-Carbamoyl- 38,0 Mikro 38,2
phenylglycin 52,0 mol/ml 52,5
91,0 4,10 90,5
5 Mikro 7,65
10 mol/ml 10,5
15 4,05 18,1
60 7,6
10,4
18,2
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Enzymatische Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie sich von den Mikroorganismen NRRLB-Il 079 oder NRRLB-Il 080 der Familie Bacillaceae herleiten, die Hydantoin oder ein Derivat davon als Induktor für die Enzym-Aktivität verwerten.
2. Verfahren zur enzyma tischen Hydrolyse von racemischen Hydantoinen zu optisch aktiven Derivaten von Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Anwesenheit eines enzymatischen Komplexes nach Anspruch 1 durchführt.
DE2811303A 1977-03-15 1978-03-15 Enzymatische Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung Expired DE2811303C3 (de)

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