DE2600682C2

DE2600682C2 - Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure

Info

Publication number: DE2600682C2
Application number: DE2600682A
Authority: DE
Inventors: Noriaki Suita Osaka Fujita; Ko Minoo Osaka Imai; Yoshio Osaka Kamatani; Katsuhiko Minoo Osaka Ogino; Hisayoshi Kyoto Okazaki; Yoshio Toyonaka Osaka Yamazaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-01-17
Filing date: 1976-01-09
Publication date: 1987-01-02
Also published as: NL183772B; IT1057053B; NL7600467A; ES444374A1; FR2297829A1; GB1531901A; JPS5182788A; FR2297829B1; NL183772C; JPS5730473B2; DE2600682A1; US4011135A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von cis-Epoxybernsteinsäure in einem flüssigen Medium.
Für L(+)-Weinsäure, die als Säuerungsmittel in Nahrungs- und Genußmitteln verwendet wird, besteht ein großer Bedarf. Bisher war es üblich, Weinsäure als Nebenprodukt bei der Weinherstellung zu gewinnen. Die Liefermöglichkeit für ein solches Nebenprodukt ist begrenzt. Dies ist ein Hindernis für eine stetige Erzeugung großer Mengen L(+)-Weinsäure. Um diesen Nachteil zu beheben, wurden verschiedene Herstellungsverfahren vorgeschlagen oder ausprobiert, z. B. Verfahren der chemischen Synthese aus Fumarsäure, Maleinsäure oder 5-Ketogluconsäure, oder Verfahren der direkten Fermentation von Weinsäure unter Verwendung von Mikroorganismen. Alle diese Verfahren haben jedoch große Nachteile. Entweder fallen die Isomeren vom nicht-natürlichen Typ in hohem Maße als unbrauchbare Nebenprodukte an, oder die Ausbeuten an Weinsäure sind ungenügend. Diese Nachteile verhinderten völlig die Anwendung dieser Verfahren für die Großherstellung von Weinsäure.
Angesichts dieses Standes der Technik wurden von der Anmelderin eingehende Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, ein völlig neues Verfahren zu entwickeln, bei dem cis-Epoxybernsteinsäure, die in großen Mengen verfügbar ist, als Ausgangsmaterial verwendet wird, auf das Mikroorganismen so zur Einwirkung gebracht werden, daß eine stereospezifische Hydrolyse wirksam stattfindet, wodurch allein L(+)-Weinsäure in hoher Ausbeute anfällt. Diese Untersuchungen führten schließlich zur vorliegenden Erfindung.
Gegentand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von cis-Epoxybernsteinsäure in einem flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Rhizobium validum IFO 13648, Rhizobium validum IFO 13653, Agrobacterium aureum IFO 13647, Agrobacterium viscosum IFO 13652 oder Pseudomonos sp. IFO 13645 einsetzt.
Die für die Zwecke der Erfindung zu verwendenden Mikroorganismen lassen sich sehr vorteilhaft von den Mikroorganismen isolieren, die in einem Kulturmedium, das cis-Epoxybernsteinsäure als einzige Kohlenstoffquelle enthält, wachsen können. Geeignet ist beispielsweise ein Isolierungsverfahren, bei dem man (1) ein Nährmedium herstellt (ph 7), indem man 0,5 bis 2% cis-Epoxybernsteinsäure als einzige Kohlenstoffquelle dem Grundnährmedium zusetzt, das 0,2% Natriumnitrat, 0,1% Di-kaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Kaliumchlorid und 0,001% Eisen(II)-sulfat enthält, (2) eine geeignete Menge einer Probe, z. B. Boden, Pflanzenstengel, Wurzelknoten oder andere ähnliche Substanzen dem Nährmedium zusetzt und (3) das erhaltene Gemisch 3 bis 5 Tage der Schüttelkultur bei einer Temperatur im Bereich von 24° bis 37°C unterwirft und abschließend den in der Kultur gezüchteten Mikroorganismus isoliert.
Von den Mikroorganismen, die in der vorstehend beschriebenen Weise isoliert wurden, werden die für die Zwecke der Erfindung geeigneten Mikrobienstämme verwendet, die von der Anmelderin als KB-86, KB-91, KB-97, KB-105 und KB-106 beziechnet wurden.
Nachstehend werden die einzelnen bakteriologischen Eigenschaften dieser Mikroorganismen genannt:

1. Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-86

a) Zellmorphologie
- 1) Stäbchen, 0,6-0,8×1,5-3,0 µm
- 2) Nicht pleomorph
- 3) Beweglich mit polarer Geißel
- 4) keine Sporenbildung
- 5) gramnegativ
- 6) nicht säurefest
b) Kulturmerkmale
- 1) Nähragarplatte: kreisrund, ausgefüllt (entire), konvex, durchscheinend, cremigweiß, glänzend
- 2) Schrägagar: Wachstum mäßig, fadenförmig, glatt, cremeweiß, glänzend
- 3) Brühe: leicht trübe, kein Oberflächenwachstum; Sediment
- 4) Gelatine- Stichkultur: keine Verflüssigung
- 5) Lackmusmilch: unverändert
c) Physiologische Eigenschaften
- 1) Nitrate werden in Nitratnährmedium nicht reduziert.
- 2) Denitrifikation findet nicht statt.
- 3) Methylrot-Test ist negativ
- 4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
- 5) Indol wird nicht gebildet.
- 6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
- 7) Stärke wird nicht hydrolysiert.
- 8) Citrat wird verwertet.
- 9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen verwertet.
- 10) Wasserlösliche Pigmente werden nicht gebildet.
- 11) Urease wird gebildet.
- 12) Oxidase: positiv
- 13) Katalase: positiv
- 14) Bei pH 6,0 und 10,5 kein Wachstum. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 10°C. Optimale Temperatur zwischen 25 und 30°C.
- 15) Aerob
- 16) Hugh- und Leifson-Test: oxidativ
- 17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Lactose, Inosit und Stärke.
d) Andere taxonomische Eigenschaften
- 1) Stickstoffbindung findet nicht statt.
- 2) Aminosäuren und Vitamine werden zum Wachstum nicht benötigt.
- 3) Vom Boden isoliert.

2. Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-91

a) Zellmorphologie
- 1) Stäbchen 0,5-0,7×1,0-3,0 μm
- 2) nicht pleomorph
- 3) beweglich mit 1 bis 3 peritrichen Geißeln
- 4) keine Sporenbildung
- 5) gramnegativ
- 6) nicht säurefest
b) Kulturmerkmale
- 1) Nähragarplatte: kreisrund, sich ausbreitend, konvex, transparent, gelb, glänzend.
- 2) Schrägagar: Wachstum mäßig, sich ausbreitend (spreading), glatt, gelb, glänzend.
- 3) Brühe: trübe, kein Oberflächenwachstum, Sediment.
- 4) Gelatine-Stichkultur: schichtweise Verflüssigung.
- 5) Lackmusmilch: neutral bis leicht alkalisch ohne Serumzone. Keine Peptonisierung. Gräulichbraune Farbe nach 2 Wochen.
c) Physiologische Eigenschaften
- 1) Nitrate werden in Nitratmedium nicht reduziert.
- 2) Denitrifikation findet nicht statt.
- 3) Methylrot-Test negativ
- 4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
- 5) Indol wird nicht gebildet.
- 6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
- 7) Stärke wird nicht hydrolisiert.
- 8) Citrat wird verwertet.
- 9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stockstoffquellen verwertet.
- 10) Chromogen
- 11) Urease wird gebildet.
- 12) Oxidase: positiv
- 13) Katalase: positiv
- 14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 10,5. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 10°C. Optimale Temperatur etwa 30°C.
- 15) aerob
- 16) Hugh-Leifson-Test: oxidativ
- 17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit. Keine Säure und kein Gas aus D-Xylose, Maltose, Saccharose, Glycerin und Stärke.
d) Andere taxonomische Eigenschaften
- 1) 3-Ketolactosebildungstest: positiv.
- 2) Aminosäuren und Vitamine werden zum Wachstum nicht benötigt.
- 3) Wachstum auf Anilinblau-Glucoseagar. Farbstoff wird nicht absorbiert.
- 4) Cellulose wird nicht abgebaut.
- 5) Vom Boden isoliert.
- 6) Nicht parasitisch für die untersuchten Pflanzen.

3. Taxonomische Eigenschaften des Stammes KB-105

a) Zellmorphologie
- 1) Stäbchen, 0,5-0,7×1,0-3,0 μm
- 2) nicht phleomorph
- 3) beweglich mit 1 bis 3 peritrichen Geißeln
- 4) keine Sporenbildung
- 5) gramnegativ
- 6) nicht säurefest
b) Kulturmerkmale
- 1) Nähragarplatte: kreisrund, geschlossen (entire), konvex, glatt, undurchsichtig, gelblich weiß, glänzend.
- 2) Schrägagar: Wachstum mäßig, fadenförmig, gelblich weiß, gelblich.
- 3) Brühe: Sediment, Pellucula.
- 4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.
- 5) Lackmusmilch: alkalisch mit Serumzone.
c) Physiologische Eigenschaften
- 1) Nitrate werden in Nitratnährmedium nicht reduziert.
- 2) Denitrifikation findet nicht statt.
- 3) Methylrot-Test: negativ
- 4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
- 5) Indol wird nicht gebildet.
- 6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
- 7) Stärke wird nicht hydrolysiert.
- 8) Citrat wird in Christensen-Medium, aber nicht in Koser-Medium verwertet.
- 9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen verwertet.
- 10) achromogen
- 11) Urease wird gebildet.
- 12) Oxidase: positiv
- 13) Katalase: positiv
- 14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 10,5. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 10°C. Optimale Temperatur etwa 30°C.
- 15) aerob
- 16) Hugh-Leifson-Test: oxidativ
- 17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Lactose, Inosit und Stärke.
d) Andere taxonomische Eigenschaften
- 1) 3-Ketolactosebildungstest: positiv
- 2) Vitamin zum Wachstum benötigt.
- 3) Wachstum auf Anilinblau-Glucoseagar. Farbstoff wird nicht absorbiert.
- 4) Auf Zuckermedien werden viskose Kolonien gebildet.
- 5) Cellulose wird nicht abgebaut.
- 6) Vom Boden isoliert.
- 7) Nicht parasitisch für die untersuchten Pflanzen.

4. Taxonomische Eigenschaften der Stämme KB-97 und KB-106

a) Zellmorphologie
- 1) Kurze Stäbchen 0,8-1,0×1,0-1,5 μm
- 2) In jungen Kulturen werden große unregelmäßige Zellen gefunden. In älteren Kulturen werden die Zellen zu kokkenförmigen Stäbchen.
- 3) Unbeweglich
- 4) Keine Sporenbildung
- 5) Gramnegativ
- 6) Nicht säurefest
b) Kulturmerkmale
- 1) Nähragarplatte: kreisrund, geschlossen (entire), konvex, glatt, gräulich weiß, undurchsichtig, glänzend.
- 2) Schrägagar: mäßiges Wachstum, fadenförmig, glatt, gräulich weiß, glänzend.
- 3) Brühe: leicht trübe, kein Oberflächenwachstum; Sediment.
- 4) Gelatine-Stichkultur: keine Verflüssigung.
- 5) Lackmusmilch: leicht alkalisch, nicht peptonisiert; keine Serumzone.
c) Physiologische Eigenschaften
- 1) Reduktion von Nitrat: KB-106 positiv, jedoch KB-97 negativ in Nitratbrühe.
- 2) Denitrifikation findet nicht statt.
- 3) Methylrot-Test: negativ
- 4) Acetylmethylcarbinol wird nicht gebildet.
- 5) Indol wird nicht gebildet.
- 6) Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet.
- 7) Stärke wird nicht hydrolysiert.
- 8) Citrat wird nicht verwertet.
- 9) Nitrate und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquellen verwertet.
- 10) Achromgen
- 11) Urease wird gebildet.
- 12) Oxidase: positiv
- 13) Katalase: positiv
- 14) Kein Wachstum bei pH 4,5 und 8,6. Optimaler pH-Wert etwa 7. Kein Wachstum bei 40°C. Wachstum bei 10°C. Optimale Temperatur etwa 30°C.
- 15) Aerob
- 16) Hugh-Leifson-Test: oxidativ
- 17) Säure, aber kein Gas aus L-Arabinose und D-Fructose. Etwas Säure, aber kein Gas aus D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose und Glycerin. Keine Säure und kein Gas aus Maltose, Saccorose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit und Stärke.
d) Andere taxonomische Eigenschaften
- 1) 3-Ketolactose wird nicht gebildet.
- 2) Wachstum auf Hefeextrakt-Medien innerhalb von 3 Tagen.
- 3) Von Wurzelknoten von Klee isoliert.

Die taxonomischen Eigenschaften dieser fünf Stämme wurden mit Beschreibungen in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1974) verglichen, wobei die taxonomischen Standorte dieser Stämme festgelegt wurden.
Der Stamm KB-86 wird als Spezies der Gattung Pseudomonas identifiziert, weil dieser Mikroorganismus grammnegativ, Oxidase-positiv, aerob ist, die Form von beweglichen Stäbchen hat, eine einzelne polare endständige monotric Geißel aufweist und bei pH 6,0 nicht wächst.
Die Stämme KB-91 und KB-105 werden als Spezies der Gattung Agrobacterium identifiziert, weil diese beiden Mikroorganismen gramnegative, aerobe, Oxidase-positive, Katalase-positive und bewegliche Stäbchen sind, Citrat verwerten und beim 3-Ketolactosebildungstest eine positive Reaktion haben. Diese Mikroorganismen erweisen sich jedoch als nicht parasitisch für die untersuchten Pflanzen und reduzieren Nitrate in Nitratmedium nicht. Außerdem ist der Stamm KB-91 chromogen, und der Stamm KB-105 benötigt Vitamin zum Wachstum, so daß beide Mikroorganismen als neue Spezies der Gattung Agrobacterium festgelegt werden. Der Stamm KB-91 erhielt die Bezeichnung Agrobacterium aureum und der Stamm KB-105 die Bezeichnung Agrobacterium viscosum.
Die Stämme KB-97 und KB-106 wurden von den Wurzelknoten von Klee isoliert. Diese beiden Mikroorganismen sind gramnegative, aerobe Stäbchen, bilden keine 3-Ketalactose und verwerten Citrat nicht. Junge Zellen sind unregelmäßig und groß. In älteren Kulturen werden die Zellen zu kokkenförmigen Stäbchen. Aufgrund dieser Eigenschaften werden die Stämme KB-97 und KB-106 als Spezies der Gattung Rhizobium identifiziert. Beide Mikroorganismen sind jedoch unbeweglich, wachsen auf Hefeextraktmedien innerhalb von 3 Tagen und machen Lackmusmilch alkalisch ohne Serumzone. Die Stämme KB-97 und KB-106 werden somit als neue Spezies der Gattung Rhizobium festgelegt, und beide werden als Rhizobium validum bezeichnet.
Die vorstehend genannten Mikroorganismen sind bei den folgenden Stellen hinterlegt: Institute for Fermentation (IFO), Osaka, Japan; "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science &amp Technology" (FERM), Chiba-City, Japan, und "American Type Culture Collection" (ATCC), Maryland, U.S.A.
Nachstehend sind die Hinterlegungsnummern der einzelnen Mikroorganismen genannt. °=c:90&udf54;H&udf53;TA:5:9,6:14:18&udf54;&udf53;TZ5,5&udf54; &udf53;TW,4&udf54;\&udf53;sg8&udf54;Mikro-&udf50;organismus\ IFO-Nr.\ FERM-Nr.\ ATCC-Nr.&udf53;TZ5,10&udf54; &udf53;TW,4&udf54;\&udf53;sg9&udf54;KB-86\ 13645\ 2855\ 31106&udf53;TZ&udf54; \KB-91\ 13647\ 2857\ 31108&udf53;TZ&udf54; \KB-97\ 13648\ 2858\ 31109&udf53;TZ&udf54; \KB-105\ 13652\ 2862\ 31113&udf53;TZ&udf54; \KB-106\ 13653\ 2863\ 31114&udf53;TZ&udf54; &udf53;TE&udf54;&udf53;vu10&udf54;
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt, indem eine Kultur der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen oder deren behandeltes Material mit cis-Epoxybernsteinsäure, dem zu verwendenden Ausgangsmaterial, in Berührung gebracht wird. Wenn die Kultur selbst verwendet werden soll, kann das durch Kultivierung des vorgesehenen Mikroorganismus erhaltene Produkt verwendet werden. Es ist aber auch möglich, die cis-Epoxybernsteinsäure dem Kulturmedium im Verlauf der Bebrütung des Mikroorganismus zuzusetzen und auf diese Weise gleichzeitig sowohl die Kultivierung des Mikroorganismus als auch die Reaktion durchzuführen.
Das hier genannte aufgearbeitete Material der Kultur stellt die Proben dar, die das Enzymsystem enthalten, das mit der Reaktion in Verbindung steht, in der die cis- Epoxybernsteinsäure unter Bildung von L(+)-Weinsäure hydrolysiert wird. Als Beispiele solcher Materialien seien genannt: Lebende Mikrobienzellen, trockene Mikrobienzellen, eingeschlossene Mikrobienzellen, gemahlene Mikrobienzellen, rohes oder gereinigtes Enzym und unlöslich gemachtes Enzym. Diese Materialien werden durch entsprechende Behandlungen der Kultur erhalten, z. B. durch Isolierung durch Zentrifugieren, Filtration, Waschen, Trocknen, Mahlen, Extraktion und Unlöslichmachung.
Für die Kultivierung wird ein flüssiges Nährmedium verwendet. Gebräuchlich und zweckmäßig ist jedoch die Schüttelkultur oder die unteren Belüften und Rühren durchgeführte Kultur in einem im flüssigen Zustand vorliegenden Nährmedium. Die Wahl der Art des Nährmediums bzw. Kulturmediums unterliegt keiner besonderen Begrenzung oder Bedingung, d. h. beliebige Arten von Nährmedien können verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie an die Mikrobien so angepaßt sind, daß sie normal zu wachsen vermögen, und daß das Enzymsystem, das die cis-Epoxybernsteinsäure in L(+)-Weinsäure umzuwandeln vermag, in ausreichendem Maße gebildet werden kann. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise cis-Epoxybernsteinsäure, Glucose, Lactose, Glycerin, Saccharose, Melasse, organische Säuren und Kohlenwasserstoffe. Als Stickstoffquellen können verschiedene Arten von Ammoniumsalzen, Nitrate oder andere Stickstoffverbindungen verwendet werden. Ferner können als anorganische Salze die verschiedenen Arten von Phosphaten, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid usw. zugesetzt werden. Zur Begünstigung des Wachstums der Mikroorganismen können ferner verschiedene Vitamine, Verbindungen, an die Nucleinsäuren gebunden sind, zugesetzt werden. Unabhängig davon, welches Kulturverfahren im jeweiligen Falle angewandt wird, ist es zweckmäßig, zu Beginn der Kultivierung cis-Epoxybernsteinsäure, wenn auch nur in geringerer Menge, dem Nährmedium zuzusetzen, da hierdurch ein besseres Ergebnis erzielt wird.
Ferner kann je nach der Art des Kulturverfahrens und in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen der Zusatz eines Schaumverhütungsmittels, z. B. eines Silicons oder Sojabohnenöl, zum Nährmedium in gewissen Fällen eine Steigerung der Ausbeute oder Bildung von L(+)-Weinsäure bewirken. Zur Einleitung der Kultivierung ist es zweckmäßig, das Nährmedium mit einer geeigneten Menge eines Kulturmediums zu impfen, das durch eine vorher im kleineren Maßstab durchgeführte Vorkultur erhalten worden ist. Die Kultivierungsbedingungen einschließlich Kultivierungstemperatur, Kultivierungsdauer und Acidität-Alkalinität des Kulturmediums, sind verschieden in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Mikroorganismen oder von der Zusammensetzung oder den Elementen des Nährmediums. Es genügt jedoch, die Wahl und Einstellung so vorzunehmen, daß das Ziel, d. h. maximale Bildung des Enzymsystems, erreicht wird. In vielen Fällen der Praxis werden gute Ergebnisse erzielt, wenn die Kultivierung 1 bis 7 Tage unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis 40°C durchgeführt wird, während der pH-Wert des Kulturmediums bei etwa 5 bis 9 gehalten wird.
Wenn die als Ausgangsmaterial dienende cis-Epoxybernsteinsäure dem Kulturmedium im Verlauf des Kulturverfahrens zugesetzt werden soll, erfolgt die Zugabe entweder vor Beginn der Kultivierung oder zu einer geeigneten Zeit während des Verlaufs der Kultivierung. Im letzteren Fall wird das zuzusetzende Materail in Pulverform, z. B. in Form von Natrium- und Kaliumsalzen oder Ammonium-Salzen oder auch in Form einer Lösung oder Suspension in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Wasser, verwendet. Die Lösung oder Suspension wird entweder auf einmal oder kontinuierlich während einer bestimmten Zeitdauer oder intermittierend zugesetzt.
Wenn die L(+)-Weinsäure nach dem Verfahren, bei dem die Ausgangsmaterialien mit der Kultur des Mikroorganismus oder mit einem aufgearbeiteten Material der Kultur in Berührung gebracht wird, hergestellt werden soll, wird die genannte Impfung vorzugsweise in einem wäßrigen Medium vorgenommen. In diesem Fall sind vorteilhaftere Ergebnisse erzielbar, wenn die Konzentration der cis-Epoxybernsteinsäure im flüssigen Medium möglichst hoch gehalten wird, vorausgesetzt, daß die Konzentration innerhalb der Grenzen bleibt, in denen die Aktivität der Mikrobenkultur oder des aufgearbeiteten Materials der Kultur nicht gehemmt wird. Falls die Umstände es erfordern, ist es möglich, die cis-Epoxybernsteinsäure in Portionen in Zeitabständen über einen bestimmten Zeitraum zuzusetzen.
Die Reaktion kann nach beliebigen Verfahren, d. h. durch Stehenlassen, Schütteln oder Rühren, durchgeführt werden. Bei Verwendung von eingeschlossenen Mikrobienzellen oder des unlöslich gemachten Enzyms ist auch ein Verfahren anwendbar, bei dem eine Lösung der cis-Epoxybernsteinsäure durch eine mit dem verwendeten Material gefüllte Säule geleitet wird. Die Reaktionstemperatur liegt normalerweise bei etwa 5 bis 50°C. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist unterschiedlich in Abhängigkeit von Variablen wie Art der verwendeten Mikroorganismen, Menge des in der Kultur oder ihrem aufgearbeiteten Material enthaltenen Enzyms, Konzentration der cis-Epoxybernsteinsäure, Art der Durchführung der Reaktion sowie Reaktionsbedingungen. Die Reaktionszeit ist somit in Abhängigkeit von den Umständen in geeigneter Weise zu bestimmen.
Die L(+)-Weinsäure, die im Kulturmedium oder im Reaktionsmedium nach den oben beschriebenen Mechanismen gebildet worden ist, läßt sich leicht durch eine geeignete Kombination verschiedener Methoden auf der Grundlage der speziellen chemischen Eigenschaften der L(+)-Weinsäure isolieren. Gute Ergebnisse werden beispielsweise durch Ausfällung als Calciumsalz oder durch Entfernung der Verunreinigungen mit Hilfe von Ionenaustauscherharzen oder Aktivkohle erhalten.
Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Mit einem Stamm von Rhizobium validum KB-97 werden 500 ml eines flüssigen Nährmediums (pH 7,0) geimpft, das in zwei 2-l-Sakaguchikolben enthalten ist und 0,5% Glucose, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält. Dieses flüssige Kulturmedium wird der Bebrütung in hin- und hergehender Schüttelkultur 24 Stunden bei 30°C unterworfen, wobei 1 l Kulturmedium erhalten wird. Dieses Kulturmedium wird in einen 50-l-Behälter überführt, der 30 l eines flüssigen Nährmediums (pH 7,0) enthält, das 0,6% Dinatrium-cis-epoxysuccinat, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält. Der Inhalt des Behälters wird 30 Stunden bei 30°C unter Belüftung und unter Rühren bebrütet. Das hierbei erhaltene Kulturmedium (15 l) wird in einen 200-l-Tank überführt, der 100 l eines Nährmediums (pH 7,0) enthält, das 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,05% Kaliumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisen(II)-sulfat enthält. Gleichzeitig werden 2,7 kg kristallines Dinatrium-cis-epoxysuccinat zugesetzt. Das Gemisch wird der Kultivierung bei 30°C unter Belüftung und unter Rühren unterworfen. Die Kultivierung wird in dieser Weise ununterbrochen 7 Tage durchgeführt. Während des Verlaufs der Kultivierung werden je 2,0 kg kristallines Dinatirum-cis-epoxysuccinat am 3. und am 5. Tag zugesetzt. Etwa 95 l des in der beschriebenen Weise erhaltenen Kulturmediums werden mit Hilfe einer Filterpresse filtriert. Unter gutem Rühren werden dem Filtrat 5,8 kg kristallines Calciumchlorid (Dihydrat) portionsweise zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht stehen gelassen und dann mit der Filterpresse filtriert. Hierbei wird kristallines Calcium-L(+)tartrat gewonnen. Die Ausbeute beträgt 5,7 kg (als Ahydrid), d. h. 80% der Theorie.

Beispiel 2

Mit einem Stamm von Agrobacterium aureum KB-91 werden je 500 ml eines flüssigen Nährmediums (pH 7,0) geimpft, das in vier 2-l-Sakaguchikolben enthalten ist und 0,6% Dinatrium-cis-epoxysuccinat, 0,5% Ammoniumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,05% Kaliumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,001% Eisen(II)-sulfat enthält. Dieses flüssige Kulturmedium wird 48 Stunden in hin- und hergehender Schüttelkultur bei 28°C bebrütet. Etwa 1,9 l des hierbei erhaltenen Kulturmediums werden zentrifugiert, wobei etwa 0,5 g nasse Mikrobienzellen abgetrennt werden. Die nassen Zellen werden in 200 ml destilliertem Wasser suspendiert, dem 5,2 g kristallines Dinatirum-cis-epoxysuccinat zugesetzt werden. Das Gemisch wird dann 4 Stunden der Reaktion bei 37°C überlassen, wobei von Zeit zu Zeit geschüttelt oder gerührt wird. Aus dem flüssigen Reaktionsgemisch werden durch Zentrifugieren die Zellen abgetrennt. Dem hierbei erhaltenen flüssigen Überstand werden 4,5 g Calciumchlorid (Dihydrat) protionsweise unter ständigem Rühren zugesetzt. Das Gemisch wird eine Nacht im Kühlschrank stehen gelassen. Die hierbei gebildete Fällung wird auf einem Glasfilter isoliert und dann mit Wasser gut gespült. Hierbei werden 5,1 g Kristalle (als Anhydrid) von Calcium-L(+)-tartrat erhalten, d. h. 92% d. Th.

Beipiel 3

Ein Stamm von Agrobacterium viscosum KB-105 wird zum Beimpfen in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 verwendet, wobei jedoch 100 μg/ml Pyridoxal zugesetzt werden. Hierbei werden 6,0 g nasse Zellen erhalten. Die Zellen werden in 50 ml destillierten Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit Ultraschall (140 W; 1,7 A) 15 Minuten behandelt. Eine gewisse Menge der beschallten Flüssigkeit wird 15 Minuten zentrifugiert (20 000 × g), wobei 47 ml flüssiger Überstand erhalten werden. Diesem Überstand werden 50 ml einer 4,0%igen wäßrigen Lösung von Dinatrium-cis-epoxysuccinat zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden der Reaktion bei 37°C überlassen. Nach beendeter Reaktion wird das flüssige Reaktionsgemisch mit Wasser zweifach verdünnt und dann durch eine Aktivkohlesäule (1,5 × 10 cm) geleitet, wobei das Eluat aufgefangen wird. Unter Rühren werden 15 ml 12%ige Calciumchloridlösung zugetropft. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 5°C stehen gelassen. Die hierbei gebildete Fällung wird auf einem Glasfilter isoliert. Hierbei werden 2,0 g kristallines Calcium-L(+)-tartrat (als Anhydrid) erhalten, d. h. 93% d. Th.

Beispiel 4

Ein Stamm von Pseudomonas sp. KB-86 wird zum Beimpfen und Kultivieren auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise verwendet. Aus 4 l Kulturmedium werden etwa 11 g nasse Zellen gewonnen. Dieses Zellen werden in 200 ml destilliertem Wasser suspendiert. Der Suspension werden 100 ml einer wässrigen Lösung, die 30 g Acrylamid, 0,8 g N,N'-Methylen-bisacrylamid und 0,2 ml N,N,N',N'-Tetramethyläthylendiamin enthält, sowie 100 ml einer 0,3%igen wässrigen Ammoniumpersulfatlösung zugesetzt. Die erhaltene Flüssigkeit wird etwa 1 Stunde der Reaktion bei 0 bis 5°C überlassen, wobei ein Gel gebildet wird. Dieses Gel wird mit einem Homogenisator gut verrieben und dann mit 2 l destilliertem Wasser gespült. Das gespülte Gel wird dann in 900 ml destilliertem Wasser suspendiert. Dieser Suspension von eingeschlossenen Zellen werden 100 ml einer 30%igen Lösung von Dinatrium-cis-epoxysuccinat zugesetzt. Unter leichtem Rühren wird die Suspension 10 Stunden der Reaktion bei 30°C überlassen. Das flüssige Reaktionsgemisch wird in einer Säule filtriert, die ein kleines Stück Watte enthält. Unmittelbar anschließend werden 2 l destilliertes Wasser durch die Säule geleitet, um das Gel zu spülen. Das hierbei erhaltene Filtrat des Reaktionsgemisches wird mit der Spülflüssigkeit vereinigt und das Gemisch entsalzt, indem es durch das Ionenaustauscherharz "Amberlite IR-120" (H&spplus;-Form) geleitet wird. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wird über Nacht bei 5°C stehen gelassen. Die herbei gebildeten Kristalle werden auf einem Glasfilter aufgefangen, während die Mutterlauge weiter eingeengt wird. Durch Weiderholung von Einengung und Kristallisation werden etwa 23 g kristalline L(+)-Weinsäure erhalten, d.h. 72% d. Th.

Beispiel 5

Mit einem Stamm von Rhizobium validum KB-106 werden 500 ml eines flüssigen Nährmediums (pH 7,0) geimpft, das in einem 2-l-Sakaguchikolben enthalten ist und 0,6% Dinatrium-cis-epoxysuccinat, 0,5% Ammoniumsulfat, 0,1% Dikaliumsulfat und 0,05% Magnesiumsulfat enthält. Dieses Kulturmedium wird 48 Stunden bei 30°C in Schüttelkultur bebrütet. Die hierbei erhaltenen 500 ml Kulturmedium werden in einen 50-l-Tank überführt, der 30 l Nährmedium der vorstehend genannten Zusammensetzung enthält. Dieses flüssige Nährmedium wird 48 Stunden bei 28°C unter Belüftung und unter Rühren bebrütet. Aus etwa 30 l des erhaltenen Kulturmediums werden mit einer Zentrifuge die Zellen abgetrennt. Hierbei werden etwa 80 g nasse Zellen erhalten. Diese nassen Zellen werden in 1,5 l Wasser suspendiert und mit einem "Sorval Rf-1 Ribi Refrigerated Cell Fractionator" vollständig zerstört. Anschließend wird die Suspension 20 Minuten zentrifugiert (20 000 × g), wobei etwa 1,4 l Überstand erhalten werden.
Als weitere spezielle Substanz wird bei diesem Versuch β-1,3-Glucan verwendet. Diese Verbindung wird in der japanischen Patentschrift 32 673/1973 beschrieben. Sie wird nachstehend kurz als "PS" bezeichnet ("Polysaccharid").
PS wird wie folgt erhalten (vgl. DE-OS 21 14 066):
Alcaligenes faecalis var. myxogenes, Stamm NTK-u (IFO-13140) wird in 30 ml eines in einem 200-ml-Erlenmeyerkolben enthaltenen Impfkulturmediums gegeben, das aus 1,0% Glucose, 0,15% (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,005% FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,002% MhSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,001% ZnCl&sub2;, 0,001% CoCI&sub2;, 0,1% Hefeextrakt, 0,3% CaCO&sub3;, 0,01% Uracil und Wasser besteht und auf pH 7,0 eingestellt ist. Die Kultivierung wird 24 Stunden bei 32°C unter Schütteln durchgeführt.
2 ml der erhaltenen Impfkultur werden in 20 ml eines in einem 200-ml-Erlenmeyerkolben enthaltenen Hauptkulturmediums geimpft, das aus 10,0% Glucose, 0,23% (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,005% FeSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,002% MnSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,001% ZnCl&sub2;, 0,001% CoCl&sub2;, 0,3% CaCO&sub3;, 0,01% Uracil und Wasser besteht und auf pH 7,0 eingestellt ist. Die Kultivierung wird 90 Stunden bei 32°C unter Schütteln durchgeführt.
Die hierbei in mehreren Kolben erhaltenen Kulturbrühen werden zusammengegossen. Zu 80 ml der Kulturbrühe werden 240 ml einer wässrigen 0,5n-NaOH-Lösung gegeben, worauf gut gerührt wird, bis das gebildete Polysaccarid gequollen ist. Zum Gemisch werden 160 ml Wasser gegeben. Die verdünnte Lösung wird bei 12000 UpM 10 Minuten zentrifugiert, um die Feststoffe einschließlich der Zellen zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 3n-HCl neutralisiert, wobei sich ein Gel als Sediment abscheidet. Das Sediment wird durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Wasser gewaschen, bis die darin enthaltenen Salze entfernt sind. Das Sediment wird dann erneut zentrifugiert, um das gewünschte Polysaccharid abzutrennen. Durch Dehydratisierung mit Aceton und Trocknung unter vermindertem Druck werden 4,4 g PS erhalten. Die Ausbeute beträgt 55%, bezogen auf die Substraglucose.
300 g PS werden in 6 l destilliertem Wasser suspendiert. Zur Suspension werden 6 l 5%ige wässrige Bromcyanatlösung gegeben. Unter Rühren wird 2n-Natriumhydroxyd mit einer solchen Geschwindigkeit zugetropft, daß der pH-Wert um etwa 0,5/Minute steigt. Das Gemisch wird der Reaktion überlassen, bis ein pH-Wert von 11 erreicht ist. Bei diesem pH-Wert wird das flüssige Reaktionsgemisch 15 Minuten stehen gelassen. Es wird dann filtriert. Der feste Anteil wird mit destilliertem Wasser gut gespült. Hierbei wird aktiviertes PS erhalten. Diesem aktivierten PS werden 1,4 l des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Zellextraktes zusammen mit 3 l 0,2-molarer tris-Salzsäurepufferlösung (pH 8,0) zugesetzt. Das Gemisch wird mit destilliertem Wasser auf 6 l aufgefüllt und dann 4 Stunden der Reaktion bei 5°C überlassen. Nach beendeter Reaktion werden die festen Anteile mit einem Glasfilter abgetrennt und dann nacheinander mit je 8 l 0,2-molarem Glycin, 0,5-molarem Natriumchlorid und destilliertem Wasser gespült. Das hierbei erhaltene, unlöslich gemachte Enzym wird in destilliertem Wasser suspendiert und in eine Kolonne (8 × 50 cm) gefüllt. Während die Kolonne bei 30°C gehalten wird, wird eine vorher auf 30°C erwärmte 1,5%ige wässrige Lösung von Dinatrium-cis- epoxysuccinat mit einer Geschwindigkeit von 1,5 l/Std. durchgeleitet. Zu 72 l Eluat, das sich nach 2 Tagen angesammelt hat, werden 900 g Calciumchlorid(dihydrat) portionsweise unter ständigem Rühren gegeben. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert und getrocknet, wobei 1100 g Calcium-L(+)-tartrat (als Anhydrid) gewonnen werden, d. h. 95% d. Th.

Claims

Verfahren zur Herstellung von L(+)-Weinsäure durch mikrobiologische Hydrolyse von cis-Epoxybernsteinsäure in einem flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Rhizobium validum IFO 13648, Rhizobium validum IFO 13653, Agrobacterium aureum IFO 13647, Agrobacterium viscosum IFO 13652 oder Pseudomonas sp. IFO 13645 einsetzt.