CH651589A5 - Herstellung von desacetyl-cephalosporin c durch fermentierung. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C durch Fermentierung.
Cephalosporin C-Fermentierungen sind eine Hauptquelle für Cephalosporin-Kernstücke, welche in grossen Mengen zur Herstellung einer Vielzahl von semi-synthetischen Cephalosporin-Antibiotika verwendet werden. Derartige Fermentierungen erfolgen im allgemeinen während einiger Tage und es wurde beobachtet, dass aufgrund der Tatsache, dass Cephalosporin C selbst in wässriger Lösung durch ß-Lactam-Hydrolyse einem nicht-enzymatischen Abbau unterliegt, bei einem typischen industriellen Fermentierungsverfahren etwa 25 % des festgestellten Cephalosporin C-Gehaltes aufgrund von nicht-enzymati-schem Abbau verlorengehen.
Es wurde auch allgemein beobachtet, dass etwa 15 % des während der Fermentierung hergestellten Cephalosporin-Kern-stückes als Desacetyl-Cephalosporin C vorliegen. Wenngleich diese Verbindung ebenfalls als Ausgangsmaterial für das Cepha-losporin-Kernstück brauchbar ist, ist es im allgemeinen umständlich und unwirtschaftlich, die Menge an Desacetyl-Cephalospo-rin C, die sich gebildet hat, zu isolieren, da die notwendigen Verfahrenstechniken verschieden und sehr aufwendig sind. So stellen auch die 15 % des Cephalosporin-Kernstückes, die als Desacetyl-Cephalosporin C vorliegen, einen Verlust dar, so dass im allgemeinen etwa 40 % des hergestellten Cephalosporin-Kernstückes nicht zur Extraktion als Cephalosporin C zur Verfügung stehen.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass entgegen früheren Berichten (Konecny et al., J. Antib., Vol. XXVI, Nr. 3, S. 140) Desacetyl-Cephalosporin C bezüglich des nicht-enzymatischen ß-Lactam-Abbaus in Kulturbrühe sehr viel stabiler ist als Cepha-5 losporinC. Es wurde überraschenderweise kein Abbau von Desacetyl-Cephalosporin C in wässrigen Lösungen und Kulturbrühen unter Fermentierungsbedingungen festgestellt, auch nicht mit empfindlichen Messverfahren.
Aufgrund dieser Tatsache wurde nun ein Verfahren entwik-io kelt, bei dem Cephalosporin C unmittelbar nach der Bildung während der Fermentierung in Desacetyl-Cephalosporin C umgewandelt wird. Ein solches Verfahren hat zweierlei Vorteile. Erstens tritt praktisch kein Verlust an Cephalosporin-Produkt aufgrund von Abbau auf, da das Desacetyl-Cephalosporin C 15 überraschend stabil ist, und zweitens kann das Desacetyl-Cephalosporin C, das bei herkömmlichen Fermentierungen erhalten wird, ebenfalls gewonnen werden. Es wurde somit gefunden,
dass eine erhebliche Zunahme der Cephalosporin-Produktaus-beuten erreicht wird. Diese Zunahme beträgt typischerweise 20 etwa 40 %, kann jedoch, abhängig vom Desacetyl-Cephalosporin C-Gehalt der normalen Cephalosporin C-Fermentierung und der Kinetik der Cephalosporin C-Akkumulierung, variieren.
Darüber hinaus wurde gefunden, dass Desacetyl-Cephalosporin C weiter akkumuliert, wenn die Fermentierung länger als bei 25 der Cephalosporin C-Herstellung üblich, fortgeführt wird. Im allgemeinen lässt die Akkumulierung von Cephalosporin C nach etwa sechs Tagen Fermentierungszeit nach, was die Standardfer-mentierungszeit darstellt. Es wurde jedoch gefunden, dass bis zu weiteren 50 % verwertbares Cephalosporin-Kernstück erhalten 30 werden können, wenn die Fermentierungszeit in Gegenwart von Acetylesterase um beispielsweise 2 Tage oder etwa ein Drittel der Zeit verlängert wird. So kann, wenn die Fermentierung verlängert wird, die Gesamtausbeute an verwertbarem Cephalosporin-Kernstück durch absichtliche Herstellung von Desace-35 tyl-Cephalosporin C bis zu 90 % grösser sein als bei einer normalen Cephalosporin C-Fermentierung.
Dies ist somit eine beträchtliche Zunahme der Ausbeute an verwertbarem Cephalosporin-Kernstück, die einen bedeutenden wirtschaftlichen Wert darstellt. Darüber hinaus können die 40 Grenzen, welche durch die Instabilität des Cephalosporin C für die Herstellung und die Ausbeuten an Cephalosporin-Kernstück durch Fermentierung gesetzt sind, weitgehend abgebaut werden.
Desacetyl-Cephalosporin C kann leicht in pharmakologisch wertvolle Derivate, wie Cephalothin und Cephaloridin überführt 45 werden.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C, bei dem ein Cephalosporin C produzierender Mikroorganismus in Gegenwart von so viel Acetyl-esteraseenzym fermentiert wird, dass das hergestellte Cephalo-50 sporin C in Desacetyl-Cephalosporin C übergeführt wird, bevor ein nicht-enzymatischer Abbau des Cephalosporin C stattfindet.
Die Acetyl-Esterase kann entweder gleich bei Beginn der Fermentierung oder wenn die Cephalosporin C-Wachstums-phase beginnt, oder wahlweise in Intervallen während der Fer-55mentierungzugesetztwerden. Alternativ kann die Acetyl-Ester-ase während des gesamten Fermentierungsverfahrens in situ entwickelt werden.
Das Esterase-Enzym kann aus einer grossen Vielzahl von Quellen stammen. So kann die Esterase unter anderem von 6(1höheren Pflanzen, Bakterien, Hefen und Fungi stammen. Zu geeigneten höheren Pflanzen gehören die Schalen von Citrus-früchten, wie in der Britischen Patentschrift 966222 beschrieben, und Weizenkeime, wie in der Britischen Patentschrift 1121308 beschrieben. Letztere Patentschrift beschreibt auch geeignete Acetylesterase-Aktivität bei dem Bakterium genus Rhizobium. Geeignete Hefen sind die vom Genus Rhodotorula, wie sie in der Britischen Patentschrift 1474519 der Anmelderin beschrieben sind. Mikroorganismen der Klasse Basidiomycetes, wie in der
Britischen Patentschrift 1531212 der Anmelderin beschrieben und Bakterien der Species B. subtilis, wie in App. Microbiol. Vol. 30, Nr. 3, S. 413 beschrieben, sind ebenfalls geeignete Ausgangsstoffe. Ein Ausgangsmaterial für das Enzym, welches sich als besonders geeignet erwiesen hat, sind die Mikroben Genus Rhodosporidium, insbesondere die Species Rhodospori-dium toruloides, beispielsweise Stamm CBS 349, wie in der oben erwähnten Patentschrift 1531212 der Anmelderin beschrieben.
Geeignete Auswahlverfahren zur Bestimmung brauchbarer Esterase-Grundstoffe sind in der Britischen Patentschrift 1531121 der Anmelderin beschrieben. Wenngleich dort die Beschreibung des Verfahrens sich im allgemeinen auf die Bestimmung der Esterasespiegel bezieht, die durch Mikroorganismen der Klasse Basidiomycetes erhalten werden, kann das Verfahren leicht zur Bestimmung von Esterasen abgewandelt werden, die aus anderen Grundstoffen durch geeignete Wahl der Verfahrensbedingungen erhalten werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird vorzugsweise durch Kultivierung eines bekannten Cephalosporin C produzierenden Stammes in Gegenwart des Acetylesterase-Enzyms unter aeroben Bedingungen, bevorzugt in Submerskultur unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff, durchgeführt. Das verwendete Fermentierungsmedium sollte eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verwertbare Stickstoffquelle und, falls gewünscht, wachstumsfördernde Substanzen sowie anorganische Salze enthalten.
Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Sucrose, Stärke, lösliche Stärke, n-Paraffine, pflanzliche und tierische Öle, Essigsäure, Methanol, Glycerin, Sorbit und Äthanol.
Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise natürliche, Stickstoff-enthaltende Substanzen oder Materialien, die daraus hergestellt sind, wie Fleischextrakte, Pepton, Casein, Maisquellwasser, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Trypton, Baumwollsamenmehl und Weizenkleie. Es können auch Stickstoff enthaltende organische oder anorganische Verbindungen verwendet werden, beispielsweise Harnstoff, Nitrate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat.
Anorganische Salze, die in dem Fermentationsmedium verwendet werden können, sind beispielsweise Kalium-, Magnesium- und Calcium-Sulfate, -Nitrate, -Chloride, -Carbonate und -Phosphate.
Wachstumsfördernde Substanzen, die verwendet werden können, sind beispielsweise Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyloleat und insbesondere Methionin sowie auch Spurenelemente wie Eisen, Zink, Kupfer und Mangan.
Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und Fermentationszeit werden so gewählt, dass der verwendete Stamm eine maximale Menge des gewünschten Cephalosporins bilden kann. Vorteilhafterweise erfolgt die Fermentierung in einem Temperaturbereich von 15 bis 45° C, vorzugsweise bei etwa 25° C, bei einem pH von 4 bis 9, beispielsweise von 5 bis 8, und vorzugsweise etwa 6, während einer Zeit von 1 bis 20 Tagen, vorzugsweise während 4 bis 10 Tagen.
Der bevorzugteste Cephalosporin C-bildende Stamm ist ein Stamm von Acremonium chrysogenum (früher Cephalosporium acremonium genannt). Es wurde auch gefunden, dass einige Mutanten von Acremonium chrysogenum grosse Mengen an Acetylesterase in situ während der gesamten Fermentierung bilden können. Auch andere Stämme vom Genus Cephalosporium, beispielsweise Stämme von Cephalosporium polyaleurum, und einige Mikroorganismen des Genus Emericellopsis und Streptomyces, beispielsweise Stämme von Emericellopsis glabra, Emericellopsis microspora und Streptomyces lactamdurans können Cephalosporin C bilden.
Die Menge an Esterase oder Esterase-enthaltendem Material, die notwendig ist, um das bei der Fermentierung gebildete
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Cephalosporin C in Desacetyl-Cephalosporin C zu überführen, kann durch vorheriges Bestimmen der Enzymaktivität oder durch Probeversuche in kleinem Massstab leicht bestimmt werden und ist abhängig von der Esterase und den verwendeten Reaktionsbedingungen. Den Verlauf der Reaktion überwacht man am besten mit Hilfe von HPLC oder durch Abtrennen mit Dünnschicht- oder Papier-Chromatographie, unter Verwendung einer geeigneten Träger-Lösungsmittelsystem-Kombination und durch densitometrische Bestimmung. Brauchbare Verfahren sind in der Britischen Patentschrift 1531212 der Anmelderin, auf die bereits oben Bezug genommen wurde, beschrieben. Irn allgemeinen ist es angebracht, einen wesentlichen Überschuss an Esterase zu verwenden.
Das zur Isolierung des Desacetyl-Cephalosporin C-Produktes verwendete Verfahren verläuft im allgemeinen wie üblich, beispielsweise wie es in der Britischen Patentschrift 1433 528 beschrieben ist. Nach Zentrifugieren oder Filtrieren der Fermentationsbrühe, z. B. durch ein Kieselgur-Bett, kann die Isolierung erfolgen, beispielsweise indem man die Lösung durch Adsorption an Aktivkohle entsalzt und anschliessend mit Aceton und Wasser eluiert. Das Eluat kann dann noch weiter gereinigt werden, indem man es an einem Anionenaustauscherharz (z.B. Amberlite IRA-68 in Acetatform) absorbiert, das Desacetyl-Cephalosporin mit Kaliumacetatlösung aus dem Harz eluiert und das Produkt mit Aceton ausfällt.
Im allgemeinen liegt die Esterase in einer Form vor, die leicht in der Fermentierungsbrühe zur Hydrolyse des Cephalosporin C verteilt werden kann. Wenn die Esterase von einem anderen Mikroorganismus stammt, kann eine Probe der gesamten Kultur oder der abgetrennten Zellen verwendet werden, vorzugsweise nach einer Behandlung, die die Zellen nicht-lebensfähig macht und, falls gewünscht, nach Zerstören der Zellen, z. B. durch herkömmliche Methoden, wie Ultraschallbehandlung, Behandlung mit lytischen Enzymen oder mit Detergentien. Andere Zellpräparationen, bei denen während der Lagerung die Esteraseaktivität erhalten bleibt, können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise acetongetrocknete Pulver oder mit Aceton behandelte Zellen.
Die mikrobielle Esterase kann auch in zellfreier Form verwendet werden. So kann man ein Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit von der Kultur verwenden. Falls gewünscht, können die Zellen vor dem Filtrieren oder Zentrifugieren, beispielsweise wie oben beschrieben, zerstört werden. Alternativ kann die zellfreie Esterase auf herkömmliche Weise weiter gereinigt werden. Zu den Verfahrenstechniken, die angewendet werden können, gehört die Ausfällung des Enzyms, z. B. mit Salz oder mit organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, die Chromatographie, z. B. an Ionenaustauscher-Harzen oder an Trägermaterialien mit einer speziellen Affinität für das Enzym, und Entsalzen, z.B. Gelfiltrierung oder Dialyse. Die zellfreie Esterase kann als Lösung, als Niederschlag oder als geeignetes immobilisiertes Präparat verwendet werden.
Wenn die Esterase von einer höheren Pflanze stammt, ist es wünschenswert, einen enzym-haltigen Extrakt der Pflanze zu verwenden. Ein solcher Extrakt kann auf herkömmliche Weise hergestellt werden, wobei man im allgemeinen das Enzym aus der Pflanze durch physikalische Verfahrensweisen, wie Mahlen oder Pressen, freisetzt, wie es in der Britischen Patentschrift 966222 beschrieben ist, oder mittels chemischer Verfahren, beispielsweise durch Behandeln der Pflanze mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel, wie Petroläther, wie es wiederum in der Britischen Patentschrift 1121308 beschrieben ist. Das erhaltene Präparat kann dann mit oder ohne Entfernung von Zellrückständen direkt der Hydrolyselösung zugesetzt werden. Alternativ kann man, falls gewünscht, das Präparat weiter behandeln, beispielsweise unter Anwendung der oben für die mikrobiellen Enzyme beschriebenen Verfahrensweisen, wobei man dann eine
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zellfreie Esterase erhält, die dann, wie für diemikrobiellen Enzyme beschrieben, verwendet werden kann.
Selbstverständlich wird bei den oben beschriebenen Formen der Acetylesterase das Enzym der Fermentierungsbrühe zugesetzt. Nach einem Alternativverfahren ist es jedoch auch möglich, das Enzym in situ zu entwickeln, indem man eine Mischkultur der Cephalosporin produzierenden Organismen und einem der weiter oben beschriebenen Esterase produzierenden Organismus verwendet. Alternativ können auch Mikroorganismen, beispielsweise Mutanten von Acremonium chrysogenum, welche zusätzlich zu Cephalosporin C während der gesamten Fermentierung hohe Esterasespiegel produzieren, verwendet werden.
Solche Mutanten von Acremonium chrysogenum können nach einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschliesslich den Verfahrenstechniken, wie sie in «Techniques for the Development of Micro-Organisms» von H.I. Adler, in «Radiation and Radioisotopes for Industriai Microorganisms», Proceedings of the Symposium, Wien, 1973, S. 241, International Atomic Energy Authority, beschrieben sind. Bei derartigen Verfahren verwendet man:
i) Ionisierende Strahlung, z. B. Röntgen- und y-Strahlung, UV-Licht, UV-Licht in Anwesenheit eines photosensibilisieren-den Mittels, beispielsweise 8-Methoxypsoralen; Stickstoffoxyd, Hydroxylamin; Pyrimidinbasen-Analoga, z. B. 5-Bromuracil; Acridine; Alkylierungsmittel, z. B. Äthylmethansulfonatoder Senfgas; "Wasserstoffperoxid; Phenolen; Formaldehyd; Hitze, und ii) genetische Techniken, wie Rekombination, Transduktion, Transformation, Lysogenisation, Lysogene Konversion und Selektiv-Techniken für spontane Mutanten.
Es wurde gefunden, dass die Verwendung von UV-Licht geeignet ist.
Die Anwesenheit eines Mutanten kann unter Verwendung geeigneter Screeningverfahren festgestellt werden. So werden in einem ersten Verfahren Mutanten, welche während des gesamten Fermentierungsverfahrens wesentliche Mengen D AC und sehr wenig Cephalosporin C produzieren, mittels Standard-Testverfahren bestimmt.
In einem zweiten Verfahren werden Mutanten, welche die Desacetylierung von zugesetztem Cephalosporin C bewirken, ebenfalls mittels Standard-Testmethoden identifiziert. Verwendbare Mutanten sind diejenigen, welche beiden Testverfahren genügen.
Die Erfindung wird nun noch detaillierter anhand der folgenden Beispiele beschrieben. Alle Temperaturen sind in °C angegeben.
Der Stamm CMI237183 wurde beim Commonwealth Mycolo-gical Institute, Ferry Lane, Kew, Surrey, England, am 9. April 1979 hinterlegt.
Stämme dieses Typs sind unter anderem in «Cephalosporium-artige Schimmelpilze (Hyphomycetes)» von Walter Gams (Verlag, Westdeutschland) 1971, S. 109-111 beschrieben.
Beispiel 1 (a) Herstellung von Acetylesterase
Rhodosporidium toruloides CBS 349 kultiviert man in 2-1-Kolben auf einem flüssigen Medium, welches Glucose (2%), Hefe-Extrakt (1 %), Pepton (1 %), Kaliumdihydrogenphosphat (0,5 %) und Polypropylenglycol (0,1 %) enthält, während72h. Eine 100-ml-Suspension der Hefe gibt man dann in einen sterilen Kolben und kühlt auf 4°C. Dazu gibt man 30 ml Aceton, das zuvor auf—10° C gekühlt worden war. Nachdem man kurz gerührt hat, gibt man weitere Volumenteile kaltes Aceton nacheinander zu, um die Acetonkonzentration stufenweise auf 75 % (V/V) zu erhöhen. Man lässt die Hefezellen sich absetzen, dekantiert und gibt frisches, sauberes Aceton zu. Nachdem man gründlich gemischt hat, dekantiert man das überschüssige Ace-
10
ton und wäscht die behandelten Zellen zweimal durch Zentrifugieren in sterilem Wasser. Die gewaschenen Zellen nimmt man erneut in eine Suspension in sterilem Wasser auf, wobei man eine Suspension mit einer Esteraseaktivität von 3,5 iu/ml erhält.
(b) Fermentierung von Desacetylcephalosphorin C (DAC) Die Fermentierung erfolgt in Schüttelkolben, welche 9,5 ml Medium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthalten, denen man dann 0,4 ml der unter (a) hergestellten Esterasesuspension nach der Autoklaven-Behandlung zusetzt:
0,5 % als Stickstoff 46 g/1 2g/l
2.3 g/1 1,5 g/1 16 g/1 0,8 g/1
3.4 g/1
6 Tropfen pro Kolben TaOH p.incTpsfp.llfi 6,6
Maisquellwasser Lactose Glucose 15 Methionin Phenylacetyläthanolamin Calciumcarbonat Harnstoff
Ammoniumsulfat 3
20 Maisöl 6 Tropfen pro Ko pH (vor der Autoklkavenbehandlung mit NaOH eingestellt)
Man inokuliert die Kolben mit A. chrysogenum Stamm CMI 25 237183 (0,5 ml) der zuvor 48 h lang in einem Medium kultiviert worden war, das Maisquellwasser (0,1 % als Stickstoff), Ammo-niumacetat (5,5 g/1), Sucrose (25 g/1) und Calciumcarbonat (10 g/1) enthält. Man inkubiert die Kolben 5 Tage lang bei 25° C auf einem Schüttler und bestimmt den D AC-Gehalt durch HPLC. Tabelle I zeigt den Gehalt an DAC nach 3,4 und 5 Tagen. Jede Zahl bedeutet das Mittel aus drei individuell getesteten Kolben. Zur Kontrolle wurden Kolben, welche Medium und Mikroorganismen, aber keine Esterase enthielten, gleichzeitig getestet.
30
35
Tabelle I
40
Zeit (Tage)
DAC (ug/ml)
DAC (ug/ml)
Esterase vorhanden keine Esterase
3
352
89
4
1732
137
5
2615
478
45
Beispiel 2 Inokulum-Entwicklung Eine gefriergetrocknete Ampulle A. chrysogenum CMI 237183 wird unter Verwendung von 2 ml flüssigem Sabouraud-Medium rekonstituiert. Die erhaltene Zellsuspension verwendet 50 man, um einen 250-ml-Kolben mit abgeflachter Seite (Blake bottle), der verfestigtes Sabouraud'sches Medium enthält, zu inokulieren. Man inkubiert die Kultur 14 Tage lang bei 25° C.
Sabouraud'sches Medium
55 Maltose Malzextrakt Pepton Agar mit Wasser auf
4,0%Gew./Vol.
2,4% 1,0% 2,5% 100 % auffüllen
60 Der pH wird vor der Sterilisation auf 7,5 eingestellt.
Nach beendeter Inkubation werden etwa 50 ml steriles Wasser und Glasperlen zugegeben, um die Oberflächenkultur abzuwaschen. Die suspendierten Zellen verwendet man dann um einen 65 500-ml-Kolben mit abgeflachter Seite (Roux-Kolben) zu inokulieren, der verfestigtes Sabouraud'sches Medium enthält. Für jeden der Kolben verwendet man dann etwa 4 ml Suspension und inkubiert dann 12 Tage bei 25° C.
5
651 589
Man stellt eine Zellsuspension her, indem man die Oberflächenkultur mit 40 ml sterilem Wasser und Glasperlen abwäscht. Diese Suspension verwendet man zum Inokulieren der flüssigen Saatansätze in 2-1-Kolben mit flachem Boden und Wandvorsprüngen, die 600 ml Pepton/Malzextrakt-Medium enthalten.
Pepton/Malzextrakt-Medium
Pepton Malzextrakt Yeatex Granulat Kalk
Sojabohnenöl mit Wasser auf
1,0% Gew./Vol.
2,4% 2,68% 0,5% 1,96% 100 % auffüllen
Der pH wird vor dem Sterilisieren auf 7,5 eingestellt.
Die flüssigen Saatansätze werden jeweils mit 6-ml-Zellsuspen-sion aus dem Roux-Kolben inokuliert und dann bei 25° C auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 4,9 cm bei 110 U/min 72 h lang inkubiert. Man sammelt zwei flüssige Saatkulturen, um ein Inokulum für die Haupt-Fermentierungs-stufe zu schaffen.
Es werden zwei Fermentierungsvorgänge, jeweils in einem 7-1-Kolben durchgeführt, wobei man bei 25° C rührt und das Fermen-tierungsmedium nach Beispiel l(b) verwendet, jedoch mit der Ausnahme, dass Maisöl in einem Anteil von 3,0% Vol/Vol enthalten ist. Der pH wird auf 6,0 ±0,1 eingestellt, wobei man IM Schwefelsäure und 8M Ammoniumhydroxyd verwendet. Während der gesamten Fermentierung wurde eine mehr als 30%ige Sättigung an gelöstem Sauerstoff aufrechterhalten. Ein Zusatz von 24%iger Ammoniumsulfatlösung wurde bei einem Teil der Fermentierung verwendet, um den Gehalt an freiem Ammoniak höher als 500 ppm zu halten.
Wenn die eingesetzten Kohlenstoffvorräte nach etwa 72 h verbraucht waren, wurde während der restlichen Fermentierungszeit ein Glucosezusatz zugegeben, um die Atmungsrate aufrechtzuerhalten. Dies waren etwa 15 ml/h 55%ige Cerelose (Glucosemonohydrat).
10
15
Um den Vorteil einer Fermentierung unter Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C (DAC) zu veranschaulichen, wurde Acetylesterase von Rhodosporidium toruloides CBS 349 (wie in Beispiel l(a) hergestellt) zu einer der Fermentierungen beim Beginn der Cephalosporin-Akkumulierungsphase (48 h) zugegeben. Es wurde eine Menge äquivalent 400 ml Hefebrühe zugesetzt.
Die Fermentierung dauerte 8 Tage, wobei täglich Proben entnommen und auf Cephalosporin C und DAC unter Verwendung von HPLC-Assays untersucht wurden.
Ein Vergleich zwischen der Vergleichsfermentierung, bei der Cephalosporin C hergestellt wurde, und der mit Esterase behandelten Fermentierung zur Erzeugung von DAC ist in Tabelle III zusammengefasst.
Tabelle III
Zeit
Kontrolle
Esterase-behandelt
Std.
711
Ceph C M-g/g
DAC ng/g
Ceph C (xg/g
DAC fxg/g
45
400
50
500
0
69
1800
120
200
1500
93
1800
160
0
2200
117
2700
320
0
3000
25 141
2500
430
0
3300
165
2600
610
0
3500
189
2300
720
0
3900
30
35
Tabelle IV zeigt die DAC-Gehalte nach 141 und 189 h, ausgedrückt in Äquivalenten Cephalosporin C.
Tabelle IV
Zeit
Kontrolle
Esterase-behandelt
% Zunahme an
Std.
Ceph C (ng/g)
DAC (in Cèph C
Ausbeute für
Äquiv.)
DAC
141
2500
3663
47%
189
2300
4329
88%
M
Claims (9)
- 651 589PATENTANSPRÜCHE1. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-Cephalosporin C, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus in Abwesenheit von soviel Ace-tylesterase-Enzym fermentiert, dass das erzeugte Cephalosporin Cin Desacetyl-Cephalosporin C übergeführt wird, bevor der nicht-enzymatische Abbau des Cephalosporin C stattfindet.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentierung bei 15-45° C und einem pH-Wert von 4-9 während 1-20 Tagen erfolgt.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Cephalosporin C produzierender Mikroorganismus ein Stamm der Species Acremonium chrysoge-num verwendet wird.
- 4. Verfahrennach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Überschuss des Acetylesterase-Enzyms zugibt, bevor sich das Cephalosporin C bildet.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Acetylesterase von der Bakterienart Rhizo-bium, der Hefenart Rhodotorula oder der Klasse Basidomycetes oder der Species B. subtilis stammt.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Acetylesterase von Rhodosporidium toruloi-des, Stamm CBS 349 stammt.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase in Form eines zellfreien Präparates verwendet wird.
- 8. Verfahhren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Acetylesterase in situ durch Fermentierung des Esterase-produzierenden Mikroorganismus gebildet wird.
- 9. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Acetylesterase-produzie-render Mikroorganismus ist, der bei der Fermentierung eine solche Menge Acetylesterase erzeugt, dass das erzeugte Cephalosporin C in Desacetyl-Cephalosporin C umgewandelt wird, bevor der nicht-enzymatische Abbau des Cephalosporin C auftritt.
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