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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf L-Sorbose
produzierende Bakterien und das Verfahren zur Herstellung von
L-Sorbose, insbesondere dem Herstellungsverfahren für L-Sorbose
mittels Mikroorganismen der Gattung Gluconobacter, welche
sowohl die Fähigkeit, L-Sorbose aus D-Sorbit zu produzieren, als
auch die verringerte Fähigkeit, mit D-Sorbit als einziger
Kohlenstoffquelle zu wachsen, besitzen.
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Die Absicht der vorliegenden Erfindung ist es, ein industriell
ökonomisches Herstellungsverfahren für L-Sorbose, einem bei
der Vitamin C-Synthese wichtigen Zwischenprodukt, zur
Verfügung zu stellen.
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L-Sorbose wird zur Zeit durch Oxydieren von D-Sorbit mittels
Mikroorganismen, hauptsächlich der Gattung Gluconobacter,
hergestellt. Bei dem herkömmlichen Herstellungsverfahren für
L-Sorbose durch Fermentation überschreitet die Ausbeute an L-
Sorbose aus D-Sorbit als Rohmaterial 90%, aber Nebenprodukte,
wie etwa D-Fructose, 5-Ketofructose, 2-Keto-D-gluconsäure und
niedermolekulare organische Säuren werden gleichzeitig
produziert; vom Gesichtspunkt der Ausbeute an gewünschtem Produkt
kann es nicht als vollständiges Verfahren angesehen werden.
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Somit ist es bei der industriellen Herstellung von Vitamin C
sehr wichtig, die Wirksamkeit der Umwandlung von D-Sorbit in
L-Sorbose zur Verringerung der Rohmaterialkosten zu
verbessern.
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Unter diesen Bedingungen unternahmen die vorliegenden Erfinder
viele Untersuchungen zur Verbesserung der Wirksamkeit der L-
Sorbose-Fermentation und fanden heraus, daß die
Bakterienstämme, welche eine verminderte Fähigkeit besitzen, mit D-Sorbit
als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen und welche von
herkömmlicherweise zur Herstellung von L-Sorbose verwendeten
Gluconobacter-Bakterien abgeleitet sind, eine bemerkenswert
verbesserte Fähigkeit besitzen, D-Sorbit in L-Sorbose zu
überführen, und entwickelten die vorliegende Erfindung.
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Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Herstellungsverfahren für L-Sorbose bereitzustellen, welches durch
die Mikroorganismen der Gattung Gluconobacter gekennzeichnet
ist, welche eine verminderte Fähigkeit besitzen, mit D-Sorbit
als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Ein weiterer
Gegenstand ist es, L-Sorbose produzierende Mikroorganismen
bereitzustellen, welche in dem vorstehenden Herstellungsverfahren
verwendet werden.
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Alle Mikroorganismen können zu dem von der vorliegenden
Erfindung umfaßten Herstellungsverfahren verwendet werden, solange
sie zur Gattung Gluconobacter gehören und sowohl die
Fähigkeit, L-Sorbose zu produzieren, als auch die verminderte
Fähigkeit, mit D-Sorbit als einziger Kohlenstoffquelle zu
wachsen, besitzen. Derartige Mikroorganismen können von L-Sorbose
produzierenden Mikroorganismen der Gattung Gluconobacter als
Elternstämme abgeleitet werden. Die Beispiele für
Mikrobenarten, welche als derartige Elternstämme verwendet werden
können, sind nachstehend aufgeführt.
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Art Stamm Nr.
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Gluconobacter oxydans IFO 3189, IFO 12467
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Gluconobacter suboxydans IFO 3254, IFO 3255, IFO 3256
TFO 3257, TFO 12528
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Gluconobacter melanogenus IFO 3292, IFO 3293, IFO 3294
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Gluconobacter albidus IFO 3250, IFO 3253
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Gluconobacter capsulatus IFO 3462
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Gluconobacter cerinus IFO 3263, IFO 3264, IFO 3265
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Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, IFO 3274
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Gluconobacter gluconicus IFO 3285, IFO 3286
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Gluconobacter industrius IFO 3260
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Gluconobacter nonoxygluconicus IFO 3275, IFO 3276
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Anmerkung: Die vorstehenden Stämme sind die in der
"Kulturenliste, 1984, Siebte Ausgabe", veröffentlicht
vom Institut für Fermentation, Osaka (IFO),
Japan, aufgeführten bekannten Stämme.
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Die für die vorliegende Erfindung verwendeten Mikroorganismen
können von ihren Elternstämmen dadurch deutlich unterschieden
werden, daß ihr Wachstum in Minimal-Medium, welches D-Sorbit
als einzige Kohlenstoffquelle enthält, äußerst langsam ist. Es
spielt keine Rolle, ob das Minimal-Medium flüssig oder fest
ist. Wenn ein festes Medium verwendet wird, ist die Replika-
Plattierungs-Methode zur Unterscheidung vom Elternstamm
bequem. Wenn ein flüssiges Medium verwendet wird, wird der an
der vorliegenden Erfindung beteiligte Mikroorganismus einem
D-Sorbit als einziger Kohlenstoffquelle enthaltenden Minimal-
Medium unter denselben Bedingungen eingeimpft, wie denjenigen,
welche für seinen Elternstamm verwendet werden, und eine
Schüttelkultur wird gewöhnlich 1 bis 3 Tage bei 30ºC
durchgeführt. Der sich daraus ergebende Mikroorganismus kann von
seinem Elternstamm durch herkömmliches Messen seines
Wachstumsgrads in der sich daraus ergebenden Kultur auf der
Grundlage entweder der optischen Absorption, der Trübung oder dem
Zellgewicht der Bakterien der Kultur unterschieden werden. Die
für die vorliegende Erfindung verwendeten Mikroorganismen
sollten ein Wachstum zeigen, dessen Grad niedriger ist, als
dasjenige ihrer Elternstämme. Der Grad ihres Wachstums sollte
weniger als 1/10 desjenigen ihrer Elternstämme betragen.
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Die für die vorliegende Erfindung verwendeten Mikroorganismen
können durch gewöhnliche Verfahren leicht abgeleitet und
isoliert werden.
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Das bedeutet, daß die gewünschten Stämme nach gewöhnlicher
mutagener Behandlung, wie etwa Bestrahlung mit ultravioletten,
Röntgen- oder γ-Strahlen oder Behandlung mit einem chemischen
Mutagen, wie etwa N-Methyl-N-'nitro-N-nitrosoguanidin,
Methylmethansulfonsäure oder salpetriger Säure, leicht von ihren
Elternstämmen abgeleitet werden können.
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Die Mikroorganismen können sowohl verschiedene Auxotrophien,
Wirkstoffresistenzen, Wirkstoffempfindlichkeiten usw. als auch
die vorstehend beschriebenen Eigenschaften besitzen.
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Mikroorganismen, welche für die vorliegende Erfindung
verwendet werden können, schließen Gluconobacter suboxydans BL-9
(IFO 14489, FERM P-8632) und Gluconobacter suboxydans BL-115
(IFO 14490, FERM P-8631), welche aus Gluconobacter suboxydans
IFO 3254, einem L-Sorbose produzierenden Bakterium abgeleitet
wurden, und Gluconobacter oxydans GO-10 (IFO 14537, FERM
BP-1169) und Gluconobacter oxydans GO-14 (IFO 14538, FERM
BP-1170) ein, welche aus Gluconobacter oxydans IFO 12467,
einem weiteren L-Sorbose produzierenden Bakterium, abgeleitet
wurden.
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Die vorstehend beschriebenen IFO-Nummern und FERM P-Nummern
stellen Nummern beim Institut für Fermentation, Osaka (IFO;
17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, Japan)
beziehungsweise jene beim Fermentationsforschungsinstitut,
Behörde für industrielle Wissenschaft und Technologie,
Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan
yatabemachi-higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaragi Japan) dar. Die FERM
BP-Nummern stellen Hinterlegungsnummern unter dem Budapester
Vertrag beim FRI dar. Die BL-9- und BL-115-Stämme wurden am
21. Januar 1986 beim IFO und am 1. Februar 1986 beim FRI
hinterlegt. Die GO-10- und GO-14-Stämme wurden am 28. August 1986
beim IFO und am 5. September 1986 beim FRI hinterlegt.
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Beim FRI hinterlegte BL-9- und BL-115-Stämme wurden am 22.
Dezember 1986 als Hinterlegungsnummern FERM BP-1241
beziehungsweise FERM BP-1240 in Hinterlegungen unter dem Budapester
Vertrag umgewandelt.
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Das Verfahren zur mikrobiologischen Oxidation von D-Sorbit
wird jetzt hier beschrieben. Um es konkret zu beschreiben:
D-Sorbit kann durch Kultivieren eines Mikroorganismus, welcher
zum Stamm Gluconobacter gehört und sowohl die Fähigkeit,
L-Sorbose zu produzieren, als auch die verminderte Fähigkeit
besitzt, mit D-Sorbit als einziger Kohlenstoffquelle in einem
D-Sorbit enthaltenden Medium zu wachsen, mikrobiologisch
oxidiert werden, um in der Kultur flüssige L-Sorbose
anzureichern, welche darauf gesammelt wird.
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D-Sorbit sollte im Kulturmedium in einer Konzentration von
ungefähr 10-50%, vorzugsweise 20-50%, enthalten sein. Das
Kulturmedium sollte entweder ein angereichertes Medium oder ein
synthetisches Medium sein und sollte wenigstens eine
Kohlenstoffquelle, wenigstens eine Stickstoffquelle, Mineralien,
Wachstumsfaktoren usw. enthalten.
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D-Glucose, D-Fructose, D-Mannit, Glycerin, Ethanol, Molassen,
Stärkehydrolysat usw. können, falls notwendig, als
Kohlenstoffquellen zugesetzt werden. Wenn zum Beispiel ein
Mikroorganismus, welcher in einem D-Sorbit als einziger
Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium kaum wächst, kultiviert wird, ist
es im allgemeinen bevorzugt, daß eine Kohlenstoffquelle in
einer Menge von ungefähr 0,1-10% derjenigen von D-Sorbit
zugesetzt wird. In Fällen, in denen der Mikroorganismus zu einem
bestimmten Grad in einem solchen Minimal-Medium wachsen kann,
obwohl seine Fähigkeit, mit D-Sorbit als einziger
Kohlenstoffquelle zu wachsen, sehr viel schwächer ist, als diejenige
seines Elternstammes, kann ein Teil des Rohstoffs D-Sorbit als
Kohlenstoffquelle verwendet werden, was es der Kultur erlaubt,
ohne irgendwelche anderen Kohlenstoffquellen kultiviert zu
werden.
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Substanzen, welche als Stickstoffquellen verwendet werden
können, schließen stickstoffhaltige organische Substanzen, wie
etwa Maisquellwasser, Hefeextrakt, Trockenhefe, entfettetes
Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton und Casaminosäure,
anorganische Stickstoffverbindungen, wie etwa Ammoniumsulfat,
Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und wäßrigem
Ammoniak, Aminosäuren wie etwa Natriumglutamat, Harnstoff und
Ammoniumacetat ein. Verschiedene Metalle, Vitamine,
Aminosäuren, Nukleinsäuren, Phosphate usw., welche für das Wachstum
des verwendeten Mikroorganismus essentiell sind, können dem
Medium ebenfalls zugesetzt werden.
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Es wird empfohlen, daß das Kultivieren unter aeroben
Bedingungen durchgeführt wird, d. h. Schüttelkultur, submerse Kultur
usw. werden bevorzugt. Die Kultiviertemperatur sollte 15-40ºC,
vorzugsweise 25-35ºC betragen, der pH des Medium sollte
zwischen 3,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 4,0 und 6,5 sein, die
Kultivierungszeit sollte etwa 10-100 Stunden, vorzugsweise
15-40 Stunden betragen.
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Die in der daraus folgenden Kultur wie vorstehend beschrieben
erhaltene L-Sorbose kann nach einem bereits im öffentlichen
Bereich veröffentlichten Verfahren gereinigt und getrennt
werden. Zum Beispiel wird die entstandene Kultur filtriert, um
Bakterienzellen zu entfernen, mittels Aktivkohle entfärbt und
dann unter vermindertem Druck eingeengt, wonach L-Sorbose
mittels Methanol, Ethanol, Aceton usw. kristallisiert wird, um
sie abzutrennen.
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Verglichen mit herkömmlichen Verfahren, macht es die
vorliegende Erfindung möglich, die L-Sorboseausbeute bei ihrer
Herstellung aus D-Sorbit durch mikrobiologische Oxidation zu
erhöhen.
Das heißt, die Ausbeute an nach herkömmlichen Verfahren
aus D-Sorbit erhaltener L-Sorbose beträgt höchstens etwa 93%,
während diejenige, welche von der vorliegenden Erfindung
umfaßt wird, mehr als 2-3% höher ist; darüberhinaus wird die
Produktion von Nebenprodukten, wie etwa D-Fructose,
2-Ketogluconsäure und 5-Ketofructose vermindert. Daher liefert das
vorliegende Verfahren L-Sorbose, deren Rohstoffkosten einen
Großteil der Gesamtkosten der Vitamin C-Herstellung darstellen,
weniger teuer, als dies herkömmliche Verfahren tun. Als
Ergebnis kann Vitamin C, welches für Pharmazeutika, Lebensmittel
usw. weitverbreitet verwendet wird, zu niedrigeren Kosten
hergestellt werden.
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Die vorliegende Erfindung wird nachstehend konkreter mit
einigen Beispielen ihrer bevorzugten Ausführungsform beschrieben.
Beispiel 1
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Gluconobacter suboxydans IFO 3254 wurde in ein Reagenzglas
eingeimpft, welches 5 ml eines aus 2,5% D-Sorbit, 1,0% Pepton
und 1,0% Hefeextrakt zusammengesetzten SCM-Mediums (pH 7,0)
enthielt, und über Nacht der Schüttelkultur bei 30ºC
unterzogen. 0,25 ml der sich daraus ergebenden Kulturbrühe wurde in
einen 200 ml-Erlenmeyerkolben überführt, welcher 25 ml
desselben Mediums enthielt, und wurde 6 Stunden der Schüttelkultur
bei 30ºC unterzogen. Die sich daraus ergebende
Kulturflüssigkeit wurde zentrifugiert (10000 Upm, 10 min) und die
abgetrennten Zellen wurden zweimal mit 10 ml
Tris-maleat-Pufferlösung (0,05 M, pH 6,0) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden
darauf in 5 ml 100 ug/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
enthaltender Tris-maleat-Pufferlösung suspendiert (2·0&sup9;
Zellen/ml) und 30 Minuten bei 30ºC geschüttelt. Die Zellen wurden
aus der behandelten Lösung durch Zentrifugation gesammelt und
zweimal mit 10 ml 0,85%iger Kochsalzlösung gewaschen.
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Die gewaschenen Zellen wurden darauf in 5 ml eines mit 2,5%
Glycerin ergänzten SCM-Mediums überführt und 1 Stunde der
Schüttelkultur bei 30ºC unterzogen, um die Abtrennung von
Mutanten zu fördern. Die sich daraus ergebende Zellsuspension
erhielt eine mutagene Behandlung und wurde anschließend auf
Platten eines Glycerin (2,5%) als einzige Kohlenstoffquelle
(Tabelle 1) enthaltenden Minimalmediums verteilt, so daß etwa
100 Kolonien je Platte gebildet wurden, und wurde 3 Tage bei
28ºC kultiviert.
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Die sich daraus ergebenden Kolonien wurden darauf durch das
Replika-Plattierungsverfahren auf Platten eines 2,5 % D-Sorbit
als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden Minimalmediums und
2,5 % L-Sorbose als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden
Minimalmediums überführt und 3 Tage bei 28ºC kultiviert. Als
Ergebnis wurde eine große Zahl von Mutanten erhalten, welche
in dem Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle enthaltendem
Minimalmedium wuchsen, welche aber entweder nicht wuchsen oder
viel langsamer als der Elternstamm IFO 3254 in dem D-Sorbit
als einzige Kohlenstoffquelle und/oder in dem L-Sorbose als
einzige Kohlenstoffquelle enthaltendem Minimalmedium wuchsen.
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Von diesen Mutanten wurden 27 auf die Fähigkeit, L-Sorbose zu
produzieren, mittels desselben Verfahrens wie demjenigen in
Beispiel 2 geprüft. Die Stämme BL-9 und BL-115 wurden
ausgewählt, von denen beide deutlich vorzüglicher als ihre
Elternstämme in der Fähigkeit, L-Sorbose zu produzieren, sind.
Tabelle 1 Zusammensetzung des Minimalmediums
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Kohlenstoffquelle 25 g/l
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* Mononatrium-L-glutamat 2 g/l
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KH&sub2;PO&sub4; 0,47 g/l
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CaCO&sub3; 0,18 g/l
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MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,10 g/l
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Nicotinamid 30 mg/l
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Calcium-pantothenat 3 mg/l
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p-Aminobenzoesäure 1 mg/l
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Vitamin B&sub2; 1 mg/l
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FeSO&sub4;·7H&sub2;O 1,5 mg/l
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MnSO&sub4;·7H&sub2;O 0,1 mg/l
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Agar (für festes Medium) 20 g/l
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* Anmerkung: Im allgemeinen können Gluconobacter-Bakterien
nicht mit L-Glutaminsäure als einziger
Kohlenstoffquelle wachsen.
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Tabelle 2 zeigt den Vergleich im Wachstumsgrad in
verschiedenen, unterschiedliche kohlenstoffhaltige Substanzen als
einzige Kohlenstoffquellen enthaltenden Minimalmedien zwischen
Gluconobacter suboxydans BL-9 (IFO 14489, FERM BP-1241) und
Gluconobacter suboxydans BL-115 (IFO 14490, FERM BP-1240) und
ihrem Elternstamm IFO 3254. Zu diesem Vergleich wurden die
folgenden experimentellen Bedingungen verwendet:
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Jeweils ein Tropfen der Zellsuspensionen der 3 Bakterienstämme
wurde 5 ml jedem der Minimalmedien, welche die in Tabelle 1
gezeigte Zusammensetzung besitzen und welche eine der in
Tabelle 2 gezeigten Kohlenstoffquellen (2,5%) enthalten,
eingeimpft und 2 Tage bei 30ºC unter Verwendung eines
Reagenzglasschüttlers kultiviert. Der sich daraus ergebenden
Kulturflüssigkeit wurden 0,1 ml 1N Salzsäure zugesetzt, um das
zurückgebliebene Calciumcarbonat zu lösen, wonach der Wachstumsgrad
auf der Grundlage der optischen Absorption der Lösung (bei 600
nm) bestimmt wurde.
Tabelle 2
Kohlenstoffquelle Stamm Glycerin D-Sorbit
D-Mannit D-Fructose L-Sorbose D-Glucose
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Wie in Tabelle 2 deutlich ist, sind sowohl der Stamm BL-9 als
auch BL-115 im Wachstumsgrad in einem D-Sorbit als einziger
Kohlenstoffquelle enthaltendem Medium deutlich niedriger als
ihr Elternstamm IFO 3254.
Beispiel 2
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Gluconobacter suboxydans BL-9 (IFO 14489, FERM BP-1241) und
Gluconobacter suboxydans BL-115 (IFO 14490, FERM BP-1240)
wurden als Impfmaterial verwendet. Jeder Stamm wurde einem 20 ml
eines aus 50 g/l D-Sorbit, 5 g/l Glycerin, 2 g/l
Mononatrium-L-glutamat, 0,3 g/l Hefeextrakt, 0,47 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,1 g/l
MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,18 g/l CaCO&sub3;, 30 mg/l Nicotinamid, 3 mg/l
Calciumpantothenat, 1 mg/l Vitamin B&sub2;, 1 mg/l p-Aminobenzoesäure,
1,5 mg/l FeSO&sub4;·7H&sub2;O und 0,1 mg/l MnSO&sub4;·7H&sub2;O zusammengesetzten
Erstanzuchtmediums (pH 6,5) enthaltenden 200
ml-Erlenmeyerkolben eingeimpft und 24 Stunden bei 30ºC kultiviert. 2 ml der
sich daraus ergebenden Kulturflüssigkeit wurden in einen 200
ml-Erlenmeyerkolben überführt, welcher 20 ml eines
Zweitanzuchtmediums (durch Erhöhung der D-Sorbitkonzentration auf 200
g/l verändertes erstes Medium) enthielt, und 24 Stunden der
Schüttelkultur bei 30ºC unterzogen, um eine
Zweitanzuchtkulturflüssigkeit zu erhalten.
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Ein ml der sich daraus ergebenden zweiten Kulturflüssigkeit
wurde anschließend in einen mit einem Stromstörer versehenen
200 ml-Erlenmeyerkolben überführt, welcher 20 ml eines aus 300
g/l D-Sorbit, 1 g/l Glycerin, 0,3 g/l Hefeextrakt, 0,47 g/l
KH&sub2;PO&sub4;, 0,1 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,18 g/l CaCO&sub3;, 0,29 g/l
Ammoniumacetat, 30 mg/l Nicotinamid, 3 mg/l Calciumpantothenat, 1 mg/l
Vitamin B&sub2;, 1 mg/l p-Aminobenzoesäure, 1,5 mg/l FeSO&sub4;·7H&sub2;O und
0,1 mg/l MnSO&sub4;·7H&sub2;O zusammengesetzten Fermentationsmediums (pH
6,5) enthielt, und 24 Stunden der Schüttelkultur bei 30ºC
unterzogen. Der Elternstamm Gluconobacter suboxydans IFO 3254
wurde gleichzeitig als Kontrolle unter denselben Bedingungen
kultiviert. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse dieser
Kultivierungsexperimente. In allen sich daraus ergebenden Kulturen
wurde gefunden, daß D-Sorbit vollständig verbraucht worden
war.
Tabelle 3 L-Sorboseausbeuten
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Stamm Molare L-Sorboseausbeute
(auf D-Sorbit)
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BL-9 97,6%
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BL-115 98,8%
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IFO 3254 93,4%
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Die Gehalte an D-Sorbit und L-Sorbose wurden durch
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (mobile Phase: pH 2,2
verdünnte Schwefelsäure; Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min;
Detektor: Differentialrefraktometer) unter Verwendung von mit
sulfoniertem Polystyrolgel (Shimadzu Corp., SCR-101H Säule, 7,9
mm·30 cm) gepackten Säulen bestimmt.
Beispiel 3
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Gluconobacter suboxydans BL-115 (IFO 14490, FERM BP-1240) als
impfmaterial wurde auf dieselbe Weise wie derjenigen in
Beispiel 2 kultiviert, um eine Zweitanzuchtkultur zu erhalten.
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150 ml der sich daraus ergebenden Zweitanzuchtkulturflüssigkeit
wurde darauf in einen 5 l-Fermenter überführt, welcher 3
l des selben Fermentationsmediums, wie dasjenige in Beispiel 2
verwendete, enthielt, und 24 Stunden bei 30ºC, 300 Upm
Rührgeschwindigkeit
und 2,4 1/min Belüftungsrate kultiviert.
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Während der Kultivierung wurde das Rohmaterial D-Sorbit
vollständig oxydiert. L-Sorbose wurde in der Kulturbrühe auf eine
Ausbeute von 98,4% auf D-Sorbit angereichert. Der Elternstamm
Gluconobacter suboxydans IFO 3254 wurde gleichzeitig unter
denselben Bedingungen kultiviert. Es wurde gefunden, daß sich
L-Sorbose in der Kultur auf eine Ausbeute von 93,7% auf
D-Sorbit angereichert hatte.
Beispiel 4
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Gluconobacter oxydans IFO 12467 wurde der mutagenen Behandlung
mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin unter Verwendung
desselben, wie in Beispiel 1 gezeigten Verfahrens unterzogen. Die
sich daraus ergebende Zellsuspension wurde darauf auf Glycerin
als einziger Kohlenstoffquelle enthaltenden
Minimalmediumplatten (Tabelle 1) verteilt, so daß nach 4 Tagen Inkubation bei
28ºC etwa 100 Kolonien je Platte gebildet wurden.
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Die sich daraus ergebenden Kolonien wurden durch das
Replikaplattierungsverfahren auf Platten eines D-Sorbit als einzige
Kohlenstoffquelle enthaltenden Minimalmediums überführt und 3
Tage bei 28ºC kultiviert. Als Ergebnis wurde eine große Zahl
von Mutanten erhalten, welche in dem Glycerin als einziger
Kohlenstoffquelle enthaltenden Minimalmedium wuchsen, welche
in dem D-Sorbit als einziger Kohlenstoffquelle enthaltenden
Minimalmedium aber nicht wuchsen oder viel langsamer als der
Elternstamm IFO 12467 wuchsen.
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Von diesen Mutanten wurden 43 auf die Fähigkeit, L-Sorbose zu
produzieren, mittels desselben, in Beispiel 5 beschriebenen
Verfahrens untersucht. Die Stämme GO-10 (IFO 14537, FERM BP-
1169) und GO-14 (IFO 14538, FERM BP-1170) wurden ausgewählt,
deren beider Fähigkeit, L-Sorbose zu produzieren, deutlich
höher ist als die ihres Elternstammes.
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Tabelle 4 zeigt den Vergleich des Wachstumsgrads zwischen
Gluconobacter oxydans GO-10 und Gluconobacter oxydans GO-14 und
dem Elternstamm IFO 12467 in verschiedenen Minimalmedien,
welche unterschiedliche kohlenstoffhaltige Substanzen als einzige
Kohlenstoffquellen enthalten. Diese Ergebnisse wurden mittels
derselben experimentellen Bedingungen wie denjenigen in
Beispiel 1 erhalten.
Tabelle 4
Kohlenstoffquelle Stamm Glycerin D-Sorbit D-Mannit D-Fructose L-Sorbose D-Glucose
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Wie in Tabelle 4 deutlich ist, können die GO-10- und GO-14-
Stämme in dem D-Sorbit als einzige Kohlenstoffquelle
enthaltenden Minimalmedium kaum wachsen. Es sollte angemerkt werden,
daß sowohl der Elternstamm IFO 12467 als auch die ausgewählten
Stämme GO-10 und GO-14 in dem L-Sorbose als einzige
Kohlenstoffquelle enthaltenden Minimalmedium kaum wuchsen.
Beispiel 5
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Gluconobacter oxydans GO-10 (IFO 14537, FERM BP-1169) und
Gluconobacter oxydans GO-14 (IFO 14538, FERM BP-1170) wurden als
Impfmaterial verwendet. Jeder wurde einem Erlenmeyerkolben
eingeimpft, welcher 20 ml eines ursprünglichen, aus 50 g/l D-
Sorbit, 5 g/l Glycerin, 2 g/l Mononatrium-L-glutamat, 1 g/l
Hefeextrakt, 0,47 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,1 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,18 g/l
CaCO&sub3;, 30 mg/l Nicotinamid, 3 mg/l Calciumpantothenat, 1 mg/l
Vitamin B&sub2;, 1 mg/l p-Aminobenzoesäure, 1,5 mg/l FeSO&sub4;·7H&sub2;O und
0,1 mg/l MnSO&sub4;·7H&sub2;O zusammengesetzten Mediums (pH 6,5)
enthielt, und 24 Stunden der Schüttelkultur bei 30ºC unterzogen.
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Ein ml der sich daraus ergebenden Kultur wurde in einen 200
ml-Erlenmeyerkolben überführt, welcher 20 ml eines
Fermentationsmediums (durch Erhöhung der D-Sorbitkonzentration auf 200
g/l verändertes ursprüngliches Medium) enthielt, und 40
Stunden der Schüttelkultur bei 30ºC unterzogen. Der Elternstamm
Gluconobacter oxydans IFO 12467 wurde gleichzeitig als
Kontrolle unter denselben Bedingungen wie vorstehend kultiviert.
Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse dieser
Kultivierungsexperimente. In der sich daraus ergebenden Kultur wurde gefunden, daß
D-Sorbit vollständig verbraucht worden ist.
Tabelle 5 L-Sorboseausbeuten
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Stamm Molare L-Sorboseausbeute
(auf D-Sorbit)
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GO-10 96,5%
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GO-14 96,3%
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IFO 12467 90,1%
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Die Gehalte an D-Sorbit und L-Sorbose wurden durch das in
Beispiel 2 beschriebene Verfahren bestimmt.