DE69222092T2

DE69222092T2 - Mikrobielle Umwandlung von Gallensäuren

Info

Publication number: DE69222092T2
Application number: DE69222092T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kawaide; Hiromi Kimura; Akio Okamura; Takurou Yamaura
Original assignee: Tokyo Tanabe Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Tokyo Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-06-12
Filing date: 1992-06-11
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2012-06-12
Also published as: ES2106141T3; DE69222092D1; KR100225157B1; US5480781A; CA2070720A1; AU1810492A; ATE158023T1; KR930000674A; EP0518661A1; EP0518661B1; AU645426B2

Description

Die Erfindung betrifft neuartige Mikroorganismen, die Gallensäuren umzuwandeln vermögen, und insbesondere ein Verfahren zur spezifischen Oxidation von Hydroxygruppen, die sich in den Dihydroxycholansäuren in bestimmten Stellungen befinden.
Speziell betrifft diese Erfindung solche Mikroorganismen der Gattung Bacillus sowie Verfahren zur Züchtung und zum Einsatz solcher Mikroorganismen zum Zwecke der Herstellung von 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure, einer nützlichen Zwischenverbindung bei der Gewinnung von 3α,7β-Dihydroxy-5β-cholansäure (nachstehend als Ursodesoxycholsäure bezeichnet, die selbst als Cholagogum Verwendung findet) aus 3α,7α-Dihydroxy-5β-cholansäure (nachstehend als Chenodesoxycholsäure bezeichnet).
Bislang wurde Ursodesoxycholsäure aus Chenodesoxycholsäure nach einem Verfahren synthetisiert, welches die chemische Umwandlung der α-Hydroxylgruppe in der 7-Stellung von Chenodesoxycholsäure in eine β-Hydroxylgruppe umfaßt, d.h. ein Verfahren, das die selektive Oxidation der α-Hydroxylgruppe in der 7-Stellung von Chenodesoxycholsäure zur Gewinnung von 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure und die anschließende stereoselektive Reduktion dieser 7-Ketogruppe zur Gewinnung von Ursodesoxycholsäure, in deren 7-Stellung sich eine β-Hydroxylgruppe befindet, umfaßt.
Die Herstellung von 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure aus Chenodesoxycholsäure unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas ist ebenfalls beschrieben worden (geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 25356/1987).
Das dem Stand der Technik entsprechende Verfahren der chemischen Synthese ist jedoch mit Problemen im Hinblick auf die Reaktionsbereitschaft, Selektivität und Verfahrenssicherheit behaftet und wurde in bezug auf die Ausbeute und die Reinheit der entstehenden Produkte als nicht befriedigend befunden.
Das obengenannte Herstellngsverfahren unter Einsatz von Mikroorganismen hat sich ebenfalls als unbefriedigend erwiesen, da die als Substrat zum Einsatz kommende Chenodesoxycholsäure in niedriger Konzentration (etwa 1 %) verwendet werden muß und ihre Umwandlung in 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure ebenfalls gering (etwa 30,5 %) ausfällt.
Unsere gleichfalls anhängige europäische Anmeldung Nr. 0539216 beschreibt Mikroorganismen der Gattung Bacillus, die die 12α-Hydroxygruppe von Cholsäure selektiv zu oxidieren vermögen, so daß 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure gebildet wird, einschließlich des Stammes TTUR 2-M4 (Ferm BP 3393), der spezifisch 3α-Hydroxy- 7α,12-diketo-5β-cholansäure produziert, wenn er in einem cholsäurehaltigen Medium inkubiert wird. Diese Veröffentlichung liegt nur als eine gegenüber der vorliegenden Anmeldung bekannte technische Lösung gemäß Art. 54(3) EPÜ vor.
In Anbetracht der Probleme des Standes der Technik haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Herstellung von 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure aus in hohen Konzentrationen als Substrat verwendeter Chenodesoxycholsäure intensiv untersucht und im Ergebnis dessen festgestellt, daß neuartige Mikroorganismen der Gattung Bacillus 3α- Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure in hoher Ausbeute aus Chenodesoxycholsäure, das in hoher Konzentration als Substrat verwendet wird, produzieren. Diese Mikroorganismen wurden in der Stadt Yonezawa, Präfektur Yamagata, aus dem Boden isoliert und als Bacillus sp. TTUR 2-2 (FERM BP-365), Bacillus sp. TTUR 4-1 (FERM P-11862) und Bacillus sp. TTUR 4-2 (FERM P-11863) bezeichnet. Die Stämme wurden am 13. November 1991 (Stamm TTUR 2-2) bzw. am 13. Mai 1991 im Fermentation Research Institute unter den oben in Klammern angegebenen Registriernummern hinterlegt.
Alle diese Stämme verfügen über eine Fähigkeit zur Oxidation der vor allem in der 7- Stellung von Chenodesoxycholsäure befindlichen Hydroxylgruppe(n) in eine Ketogruppe (bzw. in Ketogruppen), wobei allerdings auch - im geringeren Maße - eine schwache Fähigkeit zur Oxidation der in der 3-Stellung befindlichen Hydroxylgruppe in eine Ketogruppe zu verzeichnen war, aber offensichtlich nutzen bzw. zersetzen sie das Substrat Chenodesoxycholsäure anderweitig nicht.
Indem die Erfinder solche in der Natur vorkommenden Mikroorganismen Mutationen auslösenden Behandlungen unterzogen, gewannen sie auch Mutantenstämme von Mikroorganismen, die als Substrat verwendete Chenodesoxycholsäure in sogar noch größerer Ausbeute (in einigen Fällen - wie später noch beschrieben wird - in einer Ausbeute von bis zu 100 %) in 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure umzuwandeln vermögen. Derartige Stämme oxidieren die 7α-Hydroxygruppe offensichtlich weit spezifischer als die Elternstämme. Solche Mutantenstämme erhielt man unter anderem durch herkömmliche Mutationsbehandlungen des obengenannten Bacillus sp. TTUR 2-2, indem dieser beispielsweise mit UV-, Röntgen-, τ-Strahlen ö.ä. bestrahlt oder mit einem mutagenen Mittel wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, 4-Nitrochinolin-N-oxid, Acriflavin oder Ethylmethansulfonat in Kontakt gebracht wurde.
Beispielsweise erhielt man die folgenden derartigen Mutantenstämme:
(1) Bacillus sp. TTUR 2-M4 (FERM BP-3393)
(2) Bacillus sp. TTUR 2-M5 (FERM BP-3398)
(3) Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 (FERM BP-3395)
(4) Bacillus sp. TTUR 2-M4-294 (FERM BP-3396)
Solche Mutantenstämme sind in der Lage, Chenodesoxycholsäure 100%ig bzw. fast 100%ig und mit einer Selektivität von 100 % bzw. fast 100 %, und zwar mit einer Ausbeute von 100 % bzw. fast 100 %, umzuwandeln und dabei 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure zu produzieren.
Nach einem Aspekt der Erfindung wird ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus zur Verfügung gestellt, der eine 7α-Hydroxygruppe einer Chenodesoxycholsäure selektiv zu oxidieren vermag, wobei es sich um einen anderen Mikroorganismus als Bacillus sp. TTUR 2-M4 (Registriernummer FERM-BP 3393) handelt.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur selektiven Oxidation einer 7α-Hydroxygruppe einer Chenodesoxycholsäure bereitgestellt, welches das Züchten eines Mikroorganismus gemäß obiger Definition in einem Kulturmedium mit Chenodesoxycholsäuregehalt zur Herstellung von 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure umfaßt.
Nach einem der speziellen Aspekte der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure Verfügung gestellt, welches das Züchten eines Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört und Chenodesoxycholsäure in 3α- Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure umzuwandeln vermag, in einem Nährmedium mit Chenodesoxycholsäuregehalt und gegebenenfalls das Rückgewinnen des auf diese Weise erhaltenen Produktes umfaßt. Die obengenannten Bacillus-Stämme Bacillus sp. TTUR 2-2, Bacillus sp. TTUR 4-1, Bacillus sp. TTUR 4-2, Bacillus sp. TTUR 2-M5, Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 und Bacillus sp. TTUR 2-M4 294 sowie deren Mutantenstämme mit der erforderlichen Stoffwechselaktivität stellen besonders bevorzugte Aspekte der Erfindung dar.
Diese Erfindung soll nachstehend ausführlicher beschrieben werden.
Die Isolation der Wildstämme Bacillus sp. TTUR 2-2, Bacillus sp. TTUR 4-1 und Bacillus sp. TTUR 4-2 aus dem Boden wurde nach den folgenden Verfahren durchgeführt.
Eine kleine Menge Erde wurde in Horikoshi Medium I (1 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % Kaliumhydrogenphosphat, 0,02 % Magnesiumsulfatheptahydrat, 1 % Natriumcarbonat, pH 10) mit einem Gehalt von 5 % Natriumcholat suspendiert und bei 30 ºC fünf Tage lang auf Anreicherungskultur gesetzt. Von der entstehenden Kulturflüssigkeit wurde ein Platinlöffel voll auf einer Horikoshi-Medium-Agarplatte mit einem Gehalt von 5 % Natriumcholat für Kulturzwecke ausgestrichen, und die entstehenden Stämme wurden isoliert. Diese Stämme wurden jeweils zwei Tage bei 30 ºC in Horikoshi Medium I, das 5 % Natriumchenodesoxycholat enthielt, kultiviert, und die in der Kulturflüssigkeit enthaltene 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäuremenge wurde bestimmt, wobei sich herausstellte, daß Stämme mit einem hohen Vermögen zur Umwandlung in 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure entstanden waren.
Die bakteriologischen Merkmale dieser Stämme sind in den nachstehenden Tabellen 1 bis 8 dargestellt. Diese Prüfungen und Einteilungen erfolgten auf der Grundlage von "BERGEY'S MANUAL of Systematic Bacteriology"; bei den entsprechenden Prüfungen wurden Medien verwendet, deren pH-Wert - sofern nicht anders angegeben - durch den Zusatz von Natriumcarbonat auf 10 eingestellt war.
Aus den obigen Untersuchungsergebnissen geht hervor, daß es sich bei den Stämmen TTUR 2-2, TTUR 4-1 und TTUR 4-2 um Mikroorganismen der Gattung Bacillus handelt, da es aerobe sporenbildende Bakterien sind. Sie unterscheiden sich jedoch von den allgemein verbreiteten Mikroorganismen der Gattung Bacillus insofern, als die optimalen pH-Werte für ihr Wachstum auf der basischen Seite bei etwa pH 10 liegen.
Bei einem Vergleich dieser Stämme mit entsprechenden Stämmen von Bacillus alcalophilus und Bacillus alcalophilus subsp. halodurans unterschieden sich erstere hinsichtlich Kolonieform und Aussehen der peripheren Kolonoieabschnitte deutlich von den letztgenannten Stämmen.
Bacillus cereus 8-1 (FERM P-2885, geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr.13708/1978) und Bacillus alcalophilus 202-1 (FERM P-2674, geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr.27786/1978) wurden als alkalophile Stämme beschrieben, deren Kolonien in einer basischen Atmosphäre unregelmäßig und an der Peripherie gelappt waren, aber die vorliegenden Stämme unterscheiden sich von diesen Stämmen noch in vielen Merkmalen.
In Tabelle 9 sind die Hauptmerkmale der Stämme TTUR 2-2, TTUR 4-1 und TTUR 4-2 aufgeführt, in Tabelle 10 die Hauptmerkmale von Bacillus alcalophilus, Bacillus alcalophilus subsp. halodurans, Bacillus cereus 8-1 und Bacillus alcalophilus 202-1.
Obwohl es sich bei den Stämmen TTUR 2-2, TTUR 4-1 und TTUR 4-2 um aerobe sporenbildende Bakterien handelt, unterscheiden sie sich also - wie oben festgestellt - von bekannten Arten der Gattung Bacillus in verschiedenen bakteriologischen Merkmalen, insbesondere insofern, als der für Wachstum optimale pH-Wert auf der basischen Seite bei etwa 10 liegt und daß diese Stämme Chenodesoxycholsäure in 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure umzuwandeln vermögen. Somit ist es also angemessen, diese Stämme als neuartige Spezies anzuerkennen.
Ein spezifisches Verfahren zur Gewinnung der Mutantenstämme Bacillus sp. TTUR 2-M4, Bacillus sp. TTUR 2-M5, Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 und Bacillus sp. TTUR 2-M4-294 ist in dem nachfolgend beschriebenen Beispiel aufgeführt. Zudem sind die bakteriologischen Eigenschaften der obengenannten Mutantenstämme in den Tabellen 11 bis 20 zusammen mit den bakteriologischen Eigenschaften ihres Elternstamms Bacillus sp. TTUR 2-2 zum Vergleich angegeben.
Wie bei dem Elternstamm erfolgten die Prüfungen in den Tabellen sowie die Einteilung nach "BERGEY'S MANUAL of Systematic Bacteriology", und bei den entsprechenden Prüfungen wurden Medien verwendet, deren pH-Wert - sofern nicht anders angegeben - durch den Zusatz von Natriumcarbonat auf 10 eingestellt war.
Da Mutantenstämme im allgemeinen als zur gleichen Art gehörig wie ihre Elternstämme angesehen werden, wurde geschlossen, daß alle Mutantenstämme von Bacillus sp. TTUR 2-2 zur gleichen neuartigen Spezies gehören. Somit sind die Mutantenstämme der Erfindung nicht auf Bacillus sp. TTUR 2-M4, TTUR 2-M5, TTUR 2-M4-250 und TTUR 2- M4-294 beschränkt, sondern umfassen alle Stämme, die zur Gattung Bacillus gehören und unter Verwendung von Chenodesoxycholsäure als Substrat 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure produzieren, sowie alle Stämme, die zur Gattung Bacillus gehören und unter Verwendung von Cholsäure als Substrat 3α-Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure oder 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure produzieren.
Erfindungsgemäß kann 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure hergestellt werden, indem ein Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört und Chenodesoxycholsäure in 3α- Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure umzuwandeln vermag, in einem Nährmedium mit Chenodesoxycholansäuregehalt kultiviert wird.
Ferner kann 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure erfindungsgemäß dadurch hergestellt werden, daß ein Mutantenstamm, der zur Gattung Bacillus gehört und Cholsäure in 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure umzuwandeln vermag, in einem Nährmedium mit Cholsäuregehalt kultiviert wird.
Zwar besteht für die Konzentration des Substrats in dem Nährmedium, nämlich Chenodesoxycholsäure oder Cholsäure, keine Begrenzung, dennoch ist es mit Blick auf die Ausbeute an dem erwünschten Umwandlungsprodukt und die Kultivierungsbedingungen angebracht, daß die Konzentration im Bereich von 5 bis 500 g/l, vorzugsweise von 40 bis 300 g/l, liegt.
Bei der Erfindung können alle Medien zum Einsatz kommen, in denen sich die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen stark vermehren können; beispielsweise können als Kohlenstoffquellen verschiedene Saccharid-Rohstoffe wie Glucose, Fructose, Saccharose, Glycerol, Stärke, Kleie und Endmelassen und als Stickstoffquellen organische stickstoffhaltige Substanzen wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojaschrot, Rapskuchen, Harnstoff, verschiedene Aminosäuren und Aminozucker sowie anorganische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid und Natriumnitrat verwendet werden.
Außerdem werden vorzugsweise des weiteren anorganische Metallsalze, Vitamine, Wachstumsfaktoren usw. in sehr kleinen Mengen zugesetzt.
Die Kultivierung kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden, beispielsweise mittels eines Kulturverfahrens mit Belüftung und Rührbewegung bzw. durch ein Verfahren mit hin- und hergehender Schüttelbewegung. Für die Bedingungen, unter denen die Kultivierung durchgeführt wird, gelten keine speziellen Grenzen, aber im allgemeinen erfolgt sie bei einer Temperatur von 20 bis 40 ºC, einem pH-Wert von 7 bis 11 und über einen Zeitraum von 1 bis 6 Tagen. Erfolgt die Kultivierung bei einem hohen basischen pH-Wert, beispielsweise bei pH 10, kann die aus Gründen einer eventuellen Verunreinigung während der Kultivierung mit verschiedenen Keimen üblicherweise durchgeführte Sterilisation der Medien wegfallen. Selbstverständlich kann aber auch in einem solchen Fall eine Sterilisation vorgenommen werden.
Bei der Gewinnung des gewünschten Umwandlungsprodukts, d.h. 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure, 3α-Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure bzw. 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-β- cholansäure aus der Kulturflüssigkeit werden zuerst die in der Kulturflüssigkeit befindlichen Mikroorganismen und unlöslichen Substanzen durch Filtration, Zentrifugierung o.ä. entfernt, und das entstehende Kulturfiltrat bzw. die überstehende Flüssigkeit wird durch Zusatz von Salzsäure oder Schwefelsäure angesäuert. Dadurch scheidet sich das gebildete Umwandlungsprodukt mit einer guten Ausbeute ab. Anschließend wird dieses Präzipitat durch Filtration abgetrennt und wieder auskristallisiert, wodurch das Umwandlungsprodukt in einem hochreinen Zustand gewonnen werden kann.
Alle diese Umwandlungsprodukte können entweder allein durch mikrobielle Umwandlung oder kombiniert mit chemischer Umwandlung weiter in Ursodesoxycholsäure umgewandelt werden.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von Beispielen näher beschrieben werden, es versteht sich aber von selbst, daß die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
Bei allen Beispielen wurden die Produkte mittels Dünnschichtchromatographie bzw. Hochleistungsflüssigchromatographie jeweils unter den folgenden Bedingungen nachgewiesen.
(1) Dünnschichtchromatographie
Träger: Kieselgel 60 (0,25 mm dick, Hersteller: Merck Co.)
Entwicklungsflüssigkeit:
(1) Benzen/Isopropylalkohollessigsäure (Volumenverhältnis 40/10/1)
(2) Chloroform/Aceton/Essigsäure (Volumenverhältnis 7/2/1)
Färben Es wird ein Phosphormolybdänsäure-Schwefelsäure-Reagens (Herstellung durch Lösen von 1 g Phosphormolybdänsäure in 20 ml Methanol und Zusetzen von 1 ml konzentrierter Schwefelsäure) aufgesprüht, und der entstehende Träger wird unter Erwärmung angefärbt, bis der Gallensäurefleck tief blau ist. Einsatzvolumen einer Probe: 1 µl der Kulturflüssigkeit
(2) Hochleistungsflüssigchromatographie
(1) Säule: Capcell Pak C18 (Typ AG 120, S - 5µm, Säulengröße: 4,6 mm Durchmesser x 150 mm, Hersteller: Shiseido Co., Ltd.)
Mobile Phase: Methanol/gereinigtes Wasser/Phosphorsäure (Masseverhältnis 70/30/0,02 mol)
Durchflußgeschwindigkeit: 1,7 ml/min
(2) Säule: Inertcil ODS (Säulengröße: 4,6 mm Durchmesser x 250 mm, Hersteller: GL Science Co.)
Mobile Phase: Methanol/gereinigtes Wasser/Phosphorsäure (Masseverhältnis 70/30/0,02 mol)
Durchflußgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Nachweis: RI
Peakidentifizierung: Vergleich mit Bezugssubstanz
Die Mutantenstämme wurden durch folgende Verfahren abgetrennt:

(1) Bacillus sp. TTUR 2-M4 und Bacillus sp. TTUR 2-M5

Auf einem alkalischen NA-Medium [Zusammensetzung: 1,8 % Nährlösung "Eiken" (Warenzeichen, Hersteller; Eiken Chemical Co., Ltd.), 1,8 % Agar, 0,75 % Natriumcarbonat, pH10] in einem Schrägröhrchen gezüchteter Bacillus sp. TTUR 2-2 wurde in einer Menge von einem Platinlöffel voll in 20 ml in einem Reagenzglas (30 mm Durchmesser x 190 mm) befindliches Horikoshi Medium I (Zusammensetzung: 1 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,1 % Kaliumhydrogenphosphat, 0,02 % Magnesiumsulfatheptahydrat, 1 % Natriumcarbonat, pH 10) eingeimpft und unter Schütteln 16 Stunden lang bei 30 ºC gezüchtet.
Anschließend wurden die obengenannten Zeilen während der logarithmischen Wachstumsphase unter sterilen Bedingungen durch Zentrifugierung gesammelt und dreimal mit 10 ml eines 0,1 M Trismaleatpuffers (pH 8,0) gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen in 25 ml des gleichen Puffers suspendiert, N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin (nachstehend als NTG bezeichnet) wurde in einer solchen Menge zugesetzt, daß die endgültige Konzentration 60 µg/ml betrug, und es erfolgte eine 30minütige Inkubation der Zeilen bei 30 ºC, um die Mutationsbehandlung zu bewirken. Die Absterberate von Bacillus sp. TTUR 2-2 betrug unter diesen Behandlungsbedingungen 85 %.
Anschließend wurde 1 ml dieser Zellsuspension entnommen und sofort mit 9 ml eines 0,1 M Natriumcarbonatpuffers (pH 9,5) verdünnt, und die Zeilen wurden durch Zentrifugierung gesammelt. Nach zweimaliger Wiederholung des gleichen Waschvorgangs mit dem obengenannten Puffer wurden die resultierenden Zellen in 10 ml eines alkalischen NB-Mediums (Zusammensetzung: 1,8 % Nährlösung "Eiken", 0,75 % Natriumcarbonat, pH 10) suspendiert. Die Zellsuspension wurde mit einem alkalischen NB-Medium angemessen verdünnt, auf das alkalische NA-Plattenmedium aufgebracht, so daß sich 10 bis 100 Kolonien entwickeln konnten, und zwei Tage bei 30 ºC kultiviert.
Von den entstandenen Kolonien wurden diejenigen, die nach zwei Tagen Wachstum eine mittlere Koloniegröße erreicht hatten, isoliert, in ein Schrägröhrchen mit einem 5 % Cholsäure enthaltenen Agarmedium (pH 10, Herstellung durch Zusatz von 5 % Cholsäure, 0,5 % Natriumhydroxid und 1,8 % Agar zu Horikoshi Medium I) übertragen und 3 Tage lang bei 30 ºC kultiviert. Es wurden hinreichend gewachsene Stämme ausgewählt, von denen jeweils ein Löffel voll in 4-ml-Portionen eines flüssigen Mediums mit 5 % Cholsäuregehalt (pH 10, bestehend aus dem 5 % Cholsäure enthaltenden Agarmedium, von dem das Agar entfernt worden war), die sich in Reagenzgläsern (16,5 mm Durchmesser x 165 mm) befanden, eingeimpft und unter Schütteln 3 Tage lang bei 30 ºC gezüchtet. Die in der jeweils entstehenden Kulturlösung enthaltenen Umwandlungsprodukte wurden durch Dünnschichtchromatographie untersucht, dabei wurden Mutantenstämme (Bacillus sp. TTUR 2-M4 und Bacillus sp. TTUR 2-M5) gefunden, denen beiden vollständig die Fähigkeit fehlte, die Hydroxylgruppe in der 3- Stellung von Cholsäure in eine Ketogruppe umzuwandeln. Nachstehend wird auf das obengenannte Verfahren zur Gewinnung eines Mutantenstamms unter der Bezeichnung NTG-Behandlung Bezug genommen.

(2) Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 und Bacillus sp. TTUR 2-M4-294

Die NTG-Behandlung wurde unter Verwendung eines durch die NTG-Behandlung von (1) gewonnenen Elternstamms wiederholt, mit dem Unterschied, daß das 5 % Cholsäure enthaltende flüssige Medium als Startmedium für die Zellvermehrung verwendet wurde. Es wurde von einer NTG-Konzentration von 60 µg/ml zum Zeitpunkt der NTG-Behandlung ausgegangen. Im Ergebnis dessen wurden Mutantenstämme (Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 und Bacillus sp. TTUR 2-M4-294) gefunden, die beide vollständig der Fähigkeit entbehrten, die Hydroxylgruppen in der 3- und 12-Stellung von Cholsäure in Ketogruppen umzuwandeln. Die Absterberate von Bacillus sp. TTUR 2-M4 betrug bei diesem Vorgang 15%.
Die durch die NTG-Behandlungen von (1) und (2) erhaltenen Mutantenstämme wurden 3 Tage lang bei 30 ºC in 4-ml-Portionen von 5 % Chenodesoxycholsäure enthaltendem Horikoshi Medium I in Reagenzgläsern (16,5 mm Durchmesser x 165 mm) kultiviert, und das entstehende Umwandlungsprodukt wurde durch Dünnschichtchromatographie untersucht, wobei sich die spezifische Produktion der gewünschten 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure bestätigte.

Beispiel 1

Bacillus sp. TTUR 2-2 (FERM BP-3651) wurde nach dem im folgenden dargestellten Verfahren gezüchtet. 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat wurden in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Getrennt davon wurden 50 g Chenodesoxycholsäure, 5 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen gemischt, um ein Medium (pH 10) zu erhalten.
Von diesem Medium wurden 20 ml in ein Reagenzglas (3 cm Durchmesser x 19 cm) gegeben, das unter sterilen Bedingungen mit 0,1 ml kulturlösung beimpft wurde, die durch 20stündiges Kultivieren des Stammes bei 30 ºC in 20 ml eines in einem Reagenzglas befindlichen Mediums hergestellt worden war, welches die gleiche Zusammensetzung wie das obengenannte Medium hatte, nur mit dem Unterschied, daß keine Chenodesoxycholsäure und kein Natriumhydroxid enthalten waren. Danach wurde der Stamm bei 30 ºC zwei Tage lang unter Schütteln gezüchtet. Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugierung abgetrennt, und die überstehende Kulturflüssigkeit wurde mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert, um 3α-Hydroxy-7-keto- 5β-cholansäure und nichtumgesetzte Chenodesoxycholsäure auszufällen. Das Präzipitat wurde gesammelt und getrocknet, wobei 0,98 g als weißes Pulver gewonnen wurden. Ein Teil dieses Pulvers wurde entnommen und der Hochleistungsflüssigchromatographie unterzogen, um den Anteil von Chenodesoxycholsäure, 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure und anderen Oxidationsprodukten von Chenodesoxycholsäure (nachstehend als "andere Gallensäuren" bezeichnet) in dem Produkt zu bestimmen. Es ergab sich, daß das Produkt aus 2,8 % Chenodesoxycholsäure, 85,9 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure und 11,3 % anderen Gallensäuren bestand. Dieses Gemisch wurde aus Methanol wieder auskristallisiert, wobei reine 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure entstand.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel wurde wiederholt, nur mit dem Unterschied, daß anstelle des Stamms von Beispiel 1 Bacillus sp. TTUR 4-1 (FERM P-11862) verwendet wurde. Als anteilige Zusammensetzung des Produkts wurde ermittelt: 1,6 % Chenodesoxycholsäure, 75,3 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 23,1 % andere Gallensäuren.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, allerdings mit dem Unterschied, daß Bacillus sp. TTUR 4-2 (FERM P-11863) anstelle des Stamms von Beispiel 1 verwendet wurde. Als anteilige Zusammensetzung des Produkts wurde ermittelt: 0 % Chenodesoxycholsäure, 87,7 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 12,3 % andere Gallensäuren.

Beispiel 4

In 500 ml gereinigtem Wasser wurden 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 2 g Magnesiumsulfatheptahydrat gelöst. Getrennt davon wurden 100 g Chenodesoxycholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden bei 121 ºC 15 Minuten sterilisiert und nach dem Abkühlen gemischt, um ein Medium (pH 10) zu erhalten.
Von diesem Medium wurden 100 ml in einen Sakaguchi-Kolben (Fassungsvermögen: 500 ml) gegeben, der unter sterilen Bedingungen mit 0,1 ml Kulturlösung beimpft wurde, die durch 20stündiges Kultivieren von Bacillus sp. TTUR 2-2 bei 30 ºC in 20 ml eines in einem Reagenzglas (3 cm Durchmesser x 19 cm) befindlichen Mediums hergestellt worden war, welches die gleiche Zusammensetzung wie das obengenannte Medium hatte, nur mit dem Unterschied, daß keine Chenodesoxycholsäure und kein Natriumhydroxid enthalten waren. Danach wurde der Stamm 4 Tage lang bei 30 ºC unter Schütteln kultiviert.
Die entstehende Kulturlösung wurde anschließend auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure zu erhalten. Die anteilige Zusammensetzung des Produkts war wie folgt: 4,2 % Chenodesoxycholsäure, 88,5 % 3α- Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 7,3 % andere Gallensäuren.

Beispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, nur mit dem Unterschied, daß die in Beispiel 2 verwendete Menge Natriumhydroxid in 7 g (pH 10,5) verändert wurde. Als anteilige Zusammensetzung des Produkts wurde folgendes ermittelt: 4,2 % Chenodesoxychosäure, 85,9 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 9,9 % andere Gallensäuren.

Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt, nur mit dem Unterschied, daß die Einsatzmengen von Chenodesoxycholsäure und Natriumhydroxid in 150 g bzw. 15 g verändert wurden und daß als Kultivierungszeit im Gegensatz zu Beispiel 3 vier Tage genommen wurden. Als anteilige Zusammensetzung des Produkts wurde folgendes ermittelt: 22,2 % Chenodesoxycholsäure, 65,3 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 12,5 % andere Gallensäuren.

Beispiel 7

Bacillus sp. TTUR 2-M4 (FERM BP-3393) wurde nach dem folgenden Verfahren gezüchtet. 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat wurden in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Getrennt davon wurden 50 g Chenodesoxycholsäure, 5 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen gemischt, um ein Medium (pH 10) zu erhalten.
Von diesem Medium wurden 20 ml in ein Reagenzglas (3 cm Durchmesser x 19 cm) gegeben, das unter sterilen Bedingungen mit 0,1 ml einer Kulturlösung beimpft wurde, die durch Kultivieren des Stammes über Nacht bei 30 ºC in 20 ml eines in einem Reagenzglas befindlichen Mediums hergestellt worden war, welches die gleiche Zusammensetzung wie das obengenannte Medium hatte, nur mit dem Unterschied, daß keine Chenodesoxycholsäure und kein Natriumhydroxid enthalten waren. Danach wurde der Stamm 3 Tage lang bei 30 ºC unter Schütteln kultiviert.
Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugierung abgetrennt, und die überstehende Kulturflüssigkeit wurde mit verdünnter Schwefelsäure angesäuert, um ein Präzipitat zu erhalten. Das Präzipitat wurde gesammelt und getrocknet, wobei 0,999 g in Form eines weißen Pulvers gewonnen wurden. Ein Teil dieses Präzipitats wurde entnommen und der Hochleistungsflüssigchromatographie unterzogen, um den Anteil von Chenodesoxycholsäure und 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure in dem Produkt zu bestimmen. Es wurde ermittelt, daß das Produkt aus 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure bestand (Ausbeute 99,9 %).

Beispiel 8

Das Verfahren von Beispiel 7 wurde wiederholt, allerdings mit dem Unterschied, daß anstelle des Stamms von Beispiel 7 Bacillus sp. TTUR 2-M5 (FERM BP-3398) verwendet wurde. Das Produkt setzte sich anteilig wie folgt zusammen: 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure (Ausbeute 99,9 %).

Beispiel 9

Das Verfahren von Beispiel 7 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß anstelle des in Beispiel 7 verwendeten Stamms Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 (FERM BP-3395) verwendet wurde. Die anteilige Zusammensetzung des Produkts war wie folgt: 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure (Ausbeute 99,9 %).

Beispiel 10

Das Verfahren von Beispiel 7 wurde wiederholt, allerdings mit dem Unterschied, daß anstelle des Stamms von Beispiel 7 Bacillus sp. TTUR 2-M4-294 (FERM BP-3396) verwendet wurde. Das Produkt setzte sich anteilig wie folgt zusammen: 1,4 % Chenodesoxycholsäure und 98,6 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure (Ausbeute 99,9 %).

Beispiel 11

Das Verfahren von Beispiel 7 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß ein Medium (pH 10) verwendet wurde, welches das Medium von Beispiel 7 umfaßte, das allerdings keine Glucose enthielt. Das Produkt setzte sich anteilig wie folgt zusammen: 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure.

Beispiel 12

Das Verfahren von Beispiel 10 wurde wiederholt, allerdings mit den Unterschied, daß ein Medium (pH 10) verwendet wurde, welches das Medium von Beispiel 10 umfaßte, das jedoch keine Glucose enthielt. Das Produkt setzte sich anteilig wie folgt zusammen: 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure.

Beispiel 13

Bacillus sp. TTUR 2-M5 wurde nach dem folgenden Verfahren gezüchtet. In 500 ml gereinigtem Wasser wurden 5 g Hefeextrakt, 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat gelöst. Getrennt davon wurden 50 g Chenodesoxychosäure, 5 g Natriumhydroxid und 4 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen gemischt, um ein Medium (pH 9,7) zu erhalten.
Danach wurde das Verfahren von Beispiel 8 wiederholt. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure zusammen.

Beispiel 14

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde wiederholt, allerdings mit dem Unterschied, daß es sich bei dem verwendeten Stamm um Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 handelte. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure zusammen.

Beispiel 15

Bacilius sp. TTUR 2-M4 wurde nach dem folgenden Verfahren gezüchtet. In 500 ml gereinigtem Wasser wurden 10 g Sojaprotein (Ajipron E3; Warenzeichen, Hersteller Ajinomoto Co., Ltd.), 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat gelöst. Getrennt davon wurden 50 g Chenodesoxychosäure, 5 g Natriumhydroxid und 2 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen gemischt, um ein Medium (pH 10,2) zu erhalten.
Danach wurde das Verfahren von Beispiel 7 wiederholt. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure zusammen.

Beispiel 16

Das Verfahren von Beispiel 15 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß es sich bei dem verwendeten Stamm um Bacillus sp. TTUR 2-M5 handelte. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure zusammen.

Beispiel 17

Bacillus sp. TTUR 2-M5 wurde nach dem folgenden Verfahren gezüchtet. In 500 ml gereinigtem Wasser wurden 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat gelöst. Getrennt davon wurden 100 g Chenodesoxycholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen gemischt, um ein Medium (pH 10) zu erhalten.
Von diesem Medium wurden 100 ml in einen Sakaguchi-Kolben (Fassungsvermögen: 500 ml) gegeben, der unter sterilen Bedingungen mit 2 ml einer Kulturlösung beimpft wurde, die durch 48stündiges Kultivieren des Stamms bei 30 ºC in 20 ml eines in einem Reagenzglas (3 cm Durchmesser x 19 cm) befindlichen Mediums hergestellt worden war, welches die gleiche Zusammensetzung wie das obengenannte Medium hatte. Anschließend wurde der Stamm 6 Tage lang bei 30 ºC unter Schütteln kultiviert.
Danach wurde das Verfahren von Beispiel 8 wiederholt. Das Produkt setzte sich anteilig wie folgt zusammen: 5,8 % Chenodesoxycholsäure und 94,2 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure.

Beispiel 18

Bacillus sp. TTUR 2-M4 wurde nach dem folgenden Verfahren gezüchtet. In 500 ml gereinigtem Wasser wurden 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat gelöst. Getrennt davon wurden 50 g Cholsäure, 5 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen gemischt, um ein Medium (pH 10) zu erhalten.
Von diesem Medium wurden 20 ml in ein Reagenzglas (3 cm Durchmesser x 19 cm) gegeben, das unter sterilen Bedingungen mit 0,1 ml einer Kulturlösung beimpft wurde, die durch Kultivieren des Stamms über Nacht bei 30 ºC in 20 ml eines in einem Reagenzglas befindlichen Mediums hergestellt worden war, welches die gleiche Zusammensetzung wie das obengenannte Medium hatte, nur mit dem Unterschied, daß Cholsäure und Natriumhydroxid nicht enthalten waren. Anschließend wurde der Stamm 6 Tage lang bei 30 ºC unter Schütteln kultiviert.
Danach wurde das Verfahren von Beispiel 7 wiederholt, um den prozentualen Anteil von Cholsäure und 3α-Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure an dem Produkt zu bestimmen.
Das Produkt setzte sich wie folgt zusammen: 0 % Cholsäure und 100 % 3α-Hydroxy-7- keto-5β-cholansäure (Ausbeute 99,7 %).

Beispiel 19

Das Verfahren von Beispiel 18 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß es sich bei dem verwendeten Stamm um Bacillus sp. TTUR 2-M5 handelte und die Kultivierung 2 Tage lang durchgeführt wurde. Das Produkt setzte sich anteilig wie folgt zusammen: 0 % Cholsäure und 98,2 % 3α-Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure, 1,4 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 0,3 % 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β- cholansäure (Ausbeute 99,6 %).

Beispiel 20

Das Verfahren von Beispiel 18 wurde wiederholt, nur mit dem Unterschied, daß es sich bei dem verwendeten Stamm um Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 handelte. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0 % Cholsäure und 100 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β- cholansäure zusammen.

Beispiel 21

Das Verfahren von Beispiel 18 wurde wiederholt, nur mit dem Unterschied, daß es sich bei dem verwendeten Stamm um Bacillus sp. TTUR 2-M4-294 handelte. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0,8 % Cholsäure und 99,2 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β- cholansäure zusammen.

Beispiel 22

Das Verfahren von Beispiel 19 wurde wiederholt, allerdings mit dem Unterschied, daß ein Medium (pH 10) verwendet wurde, welches das Medium von Beispiel 19 umfaßte, das jedoch keine Glucose enthielt. Die anteilige Zusammensetzung des Produkts war: 0 % Chenodesoxycholsäure und 100 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure.

Beispiel 23

Das Verfahren von Beispiel 21 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß ein Medium (pH 10) verwendet wurde, welches das Medium von Beispiel 21 umfaßte, das ohne Glucose vorlag. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0 % Cholsäure und 100 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure zusammen.

Beispiel 24

Bacillus sp. TTUR 2-M4 wurde nach dem folgenden Verfahren gezüchtet. in 500 ml gereinigtem Wasser wurden 10 g Sojaprotein (Essanmeat; Warenzeichen, Hersteller Ajinomoto Co., Ltd.), 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat gelöst. Getrennt davon wurden 50 g Cholsäure, 5 g Natriumhydroxid und 2 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen gemischt, um ein Medium (pH 10,2) zu erhalten.
Danach wurde das Verfahren von Beispiel 18 wiederholt. Das Produkt setzte sich anteilig wie folgt zusammen: 0 % Cholsäure, 99,5 % 3α-Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure, 0,3 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 0,2 % 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β- cholansäure.

Beispiel 25

Das Verfahren von Beispiel 24 wurde wiederholt, nur mit dem Unterschied, daß es sich bei dem verwendeten Stamm um Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 handelte. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0,5 % Cholsäure und 99,5 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β- cholansäure zusammen.

Beispiel 26

Bacillus sp. TTUR 2-M4 wurde nach dem folgenden Verfahren gezüchtet. In 500 ml gereinigtem Wasser wurden 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat gelöst. Getrennt davon wurden 100 g Cholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden 15 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und nach dem Abkühlengemischt, um ein Medium (pH 10) zu erhalten. Von diesem Medium wurden 20 ml in ein Reagenzglas (3 cm Durchmesser x 19 cm) gegeben, das unter sterilen Bedingungen mit 0,1 ml einer Kulturlösung beimpft wurde, die durch 24stündiges Kultivieren des Stamms bei 30 ºC in 20 ml eines in einem Reagenzglas befindlichen Mediums hergestellt worden war, welches die gleiche Zusammensetzung wie oben hatte. Anschließend wurde der Stamm 4 Tage lang bei 30 ºC unter Schütteln gezüchtet.
Danach wurde das Verfahren von Beispiel 19 wiederholt. Das anteilige Verhältnis sah wie folgt aus: 2,0 % Cholsäure, 74,0 % 3α-Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure, 12,8 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 11,2 % 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β- cholansäure.

Beispiel 27

Das Verfahren von Beispiel 26 wurde wiederholt, nur mit dem Unterschied, daß es sich bei dem verwendeten Stamm um Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 handelte. Das Produkt setzte sich anteilig aus 5,0 % Cholsäure und 95,0 % 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β- cholansäure zusammen.

Beispiel 28

Bacillus sp. TTUR 2-M5 wurde nach dem folgenden Verfahren gezüchtet. In 1000 ml gereinigtem Wasser wurden 10 g Sojaprotein (Ajipron E3), 1 g Hefeextrakt, 2 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat gelöst. Getrennt davon wurden 100 g Chenodesoxycholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 5 g Natriumcarbonat in 1000 ml gereinigtem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden ohne Sterilisierung in einem 5-Liter-Laborfermentor gemischt, um ein Medium (pH 10,4) zu erhalten.
Dieses wurde mit 40 ml einer Kulturlösung von Bacillus sp. TTUR 2-M5 beimpft, die durch 20stündiges Züchten des Stamms bei 30 ºC unter Schütteln in 20 ml eines in einem Reagenzglas befindlichen Mediums hergestellt worden war, welches die gleiche Zusammensetzung wie das obengenannte Medium hatte, allerdings mit dem Unterschied, daß Chenodesoxycholsäure und Natriumhydroxid nicht enthalten waren. Anschließend erfolgte eine dreitätige Kultivierung bei 30 ºC unter Belüftung (2 l/min) sowie Rühren (300 U/min).
Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugierung (3500 U/min für 15 min) abgetrennt, und die überstehende Kulturflüssigkeit wurde mit Schwefelsäure auf pH 2,5 eingestellt, um ein Präzipitat zu erhalten. Das Präzipitat wurde filtriert und mit Wasser gewaschen, und die erhaltenen Kristalle wurden bei 50 ºC getrocknet, wobei 92,2 g in Form eines weißen Pulvers gewonnen wurden. Ein Teil davon wurde entnommen und der Hochleistungsflüssigchromatographie unterzogen. Das dabei gewonnene Produkt setzte sich anteilig aus 0 % Chenodesoxychosäure und 100 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure (Ausbeute 99,1 %) zusammen.

Beispiel 29

Das Verfahren von Beispiel 28 wurde wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß es sich bei dem verwendeten Stamm um Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 handelte. Das Produkt setzte sich anteilig aus 0,5 % Chenodesoxycholsäure und 99,5 % 3α-Hydroxy-7-keto-5β- cholansäure zusammen.
Durch den Einsatz erfindungsgemäßer neuartiger Mikroorganismen der Gattung Bacillus kann eine in einer hohen Konzentration als Substrat dienende Chenodesoxycholsäure oder Cholsäure mit hoher Ausbeute in 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure oder 3α- Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure oder 3α, 12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure umgewandelt werden, bei denen es sich jeweils um eine Zwischenverbindung für die Herstellung von Ursodesoxycholsäure handelt. Tabelle 1 (1) Morphologie Tabelle 2 (2) Wachstum in verschiedenen Medien (Die Stämme TTUR 2-2, TTUR 4-1 und TTUR 4-2 wiesen alle das folgende Wachstum auf) Tabelle 3 Physikalische Eigenschaften des Stammes TTUR 2-2 (Teil 1) Tabelle 4 Physikalische Eigenschaften des Stamms TTUR 2-2 (Teil 2) Tabelle 5 Physikalische Eigenschaften des Stammes TTUR 4-1 (Teil 1) Tabelle 6 Physikalische Eigenschaften des Stamms TTUR 4-1 (Teil 2) Tabelle 7 Physikalische Eigenschaften des Stammes TTUR 4-2 (Teil 1) Tabelle 8 Physikalische Eigenschaften des Stamms TTUR 4-2 (Teil 2) Tabelle 9 Hauptmerkmale der einzelnen Stämme Tabelle 10 Hauptmerkmale von Vergleichsstämmen Tabelle 11 (1) Morphologie (Die Stämme TTUR 2-2, TTUR 2-M4, TTUR 2-M5, TTUR 2-M4-250 und TTUR 2-M4-294 wiesen alle die folgenden Eigenschaften auf) Tabelle 12 (2) Wachstum in verschiedenen Medien Tabelle 13 Physikalische Eigenschaften (Die Stämme TTUR 2-2, TTUR 2-M4, UUR 2-M5, TTUR 2-M4-250 und TTUR 2-M4-294 wiesen alle die folgenden Eigenschaften auf) Tabelle 14 Bildung von Säure oder Gas aus Sacchariden (pH 9) Tabelle 15 Bildung von Säure oder Gas aus Sacchariden (pH 9) Tabelle 16 Bildung von Säure oder Gas aus Sacchariden (pH 9) Tabelle 17 Bildung von Säure oder Gas aus Sacchariden (pH 9) Tabelle 18 Bildung von Säure oder Gas aus Sacchariden (pH 9) Tabelle 19 Hauptmerkmale der einzelnen Stämme (Teil 1) Tabelle 20 Hauptmerkmale der einzelnen Stämme (Teil 2)

Claims

1. Ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der eine 7α-Hydroxygruppe von Chenodesoxycholsäure selektiv zu oxidieren vermag, wobei sich der Mikroorganismus von Bacillus sp. TTUR 2-M4 (Registriernummer Ferm BP-3393 beim Fermentation Research Institute, Japan) unterscheidet.

2. Ein Mikroorganismus nach Anspruch 1, der Chenodesoxycholsäure in 3α-Hydroxy- 7-keto-5β-cholansäure umzuwandeln vermag.

3. Ein Mikroorganismus, ausgewählt unter Bacillus sp. TTUR2-2 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Registriernummer Ferm BP-3651), Bacillus sp. TTUR 2-M5 (Registriernummer Ferm BP-3398), Bacillus sp. TTUR 2-M4-250 (Registriernummer Ferm BP-3395), Bacillus sp. TTUR 2-M4-294 (Registriernummer Ferm BP-3396) und deren Mutantenstämmen, die eine 7α-Hydroxygruppe von Chenodesoxycholsäure selektiv zu oxidieren vermögen.

4. Ein Verfahren zur selektiven Oxidation einer 7α-Hydroxygruppe von Chenodesoxycholsäure, welches das Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der die 7α-Hydroxygruppe einer Chenodesoxycholsäure selektiv zu oxidieren vermag, in einem Kulturmedium mit Chenodesoxycholsäuregehalt umfaßt.

5. Ein Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus Chenodesoxycholsäure in 3α-Hydroxy-7-keto-5β-cholansäure umzuwandeln vermag.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus ausgewählt wird unter Bacillus sp. TTUR2-2 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Registriernummer Ferm BP-3651), Bacillus sp. TTUR 2-M4 (Registriernummer Ferm BP-3393), Bacillus sp. TTUR 2-M5 (Registriernummer Ferm BP-3398), Badilus sp. TTUR 2-M4-250 (Registriernummer Ferm BP-3395), Bacillus sp.

TTUR 2-M4-298 (Registriernummer Ferm BP-3396) und deren Mutantenstämmen, die die 7α-Hydroxygruppe von Chenodesoxycholsäure selektiv zu oxidieren vermögen.

7. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei der pH-Wert des Kulturmediums bei pH7 bis pH11 liegt.