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DE69225039T2 - Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von 3-Alpha, 7-Alpha-Dihydroxy-12-Keto-Cholansäure - Google Patents

Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von 3-Alpha, 7-Alpha-Dihydroxy-12-Keto-Cholansäure

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DE69225039T2
DE69225039T2 DE69225039T DE69225039T DE69225039T2 DE 69225039 T2 DE69225039 T2 DE 69225039T2 DE 69225039 T DE69225039 T DE 69225039T DE 69225039 T DE69225039 T DE 69225039T DE 69225039 T2 DE69225039 T2 DE 69225039T2
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DE
Germany
Prior art keywords
acid
ttur
cholanic acid
bacillus
keto
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DE69225039T
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DE69225039D1 (de
Inventor
Hiroshi Kawaide
Hiromi Kimura
Akio Okamura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Tokyo Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Tokyo Tanabe Co Ltd
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Publication date
Application filed by Tokyo Tanabe Co Ltd filed Critical Tokyo Tanabe Co Ltd
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Publication of DE69225039D1 publication Critical patent/DE69225039D1/de
Publication of DE69225039T2 publication Critical patent/DE69225039T2/de
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Mikroorganismen und ein Verfahren zur Herstellung von 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure (im weiteren als 12-Ketocholsäure bezeichnet) aus 3α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cholansäure (im weiteren als Cholsäure bezeichnet) unter der Verwendung von Mikroorganismen, wobei die 12-Ketocholsäure ein Zwischenprodukt bei der Herstellung von Chenodesoxycholsäure ist, die als Agens zum Auflösen eines Gallensteines nützlich ist und die ein Ausgangsmaterial für die Herstellung von Ursodesoxycholsäure ist, die ihrerseits selbst ein Gallensäure bildendes Agens ist.
  • Ein chemisches Verfahren zum Herstellen von 12-Ketocholsäure aus Cholsäure mittels selektiver Oxidation der Hydroxygruppe in der 12-Position von Cholsäure ist bekannt. Mikrobiologische Verfahren zum Herstellen von 12-Ketocholsäure aus Cholsäure sind ebenfalls bekannt, wie beispielsweise mittels der Verwendung von Mikrococcus (japanische Patentveröffentlichung Nr. 1- 51998), und mittels der Verwendung von Arthrobacter (japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 1-20873, japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 2-62234).
  • Das chemische Verfahren zum Herstellen von 12-Ketocholsäure nach dem Stand der Technik weist jedoch Probleme in Bezug auf die Reaktivität, auf die Selektivität der Reaktion und auf die Betriebssicherheit auf und ist unbefriedigend im Hinblick auf die Ausbeute und die Reinheit des resultierenden Produktes. Das letztere Verfahren, das Mikroorganismen verwendet, ist notgedrungen ebenfalls nicht zufriedenstellend, da die Mikroorganismen das Cholsäuresubstrat im wesentlichen assimilieren und ei nige Nebenprodukte herstellen, wobei das Verfahren zudem mit Blick auf die Ausbeute und die Reinheit der Produkte unbefriedigend ist.
  • Als Ergebnisse unserer Untersuchungen im Hinblick auf Mikroorganismen, die in der Lage sind, 12-Ketocholsäure herzustellen und im Hinblick auf Verfahren zum Herstellen von 12-Ketocholsäure unter Verwendung dieser Mikroorganismen haben wir herausgefunden, daß ein Mikroorganismus, der zu einer Bacillus-Gattung, die in der Lage ist, in einem stark alkalischen Kulturmedium zu wachsen, das eine hohe Konzentration Folsäure enthält, worin normale Mikroorganismen nicht wachsen und der 12-Ketocholsäure, 3α,12α-Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure und 3α- Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure als Hauptumwandlungsprodukte aus dem Cholsäuresubstrat hergestellt. Wir nannten den Mikroorganismus Bachlus sp. TTUR 2-2 (am 22. November 1990 am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Japan) unter der Lagernummer FERM P-11861 (im weiteren als FERM11861 bezeichnet) gelagert). Dieser Mikroorganismus wurde aus dem Boden der Yamagata Präfektur in der Stadt Yonezawa isoliert.
  • Diese Bakterium hat die Fähigkeit Hydroxygruppen, insbesondere in der 7-Position und in der 12-Position, und in einem geringeren Ausmaß in der 3-Position der Cholsäure zu Ketogruppen zu oxidieren. Es hat jedoch keine Fähigkeit Cholsäure zu assinilieren oder abzubauen.
  • Weiterhin ist es möglich, ein Kulturmedium herzustellen, das eine hohe Konzentration an Cholsäure enthält, da das Bakterium in einem stark alkalischen Medium wachsen kann. Zudem ist die Sterilisation des Kulturmediums vor der Kultivierung des Bakte riums, die normalerweise für herkömmliche Kulturmedien notwendig ist, nicht erforderlich.
  • Die vorliegende Erfindung wurde durch die Isolation von Mutantenstämmen, die 12-Ketocholsäure aus Cholsäure mit im wesentlichen 100%iger Umwandlung und im wesentlichen 100%iger Ausbeute herstellen mittels einer mutagenen Behandlung, wie beispielsweise einer Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und dergleichen oder durch den Kontakt mit einem mutagenen Agens, wie beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (im weiteren als NTG bezeichnet), 4-Nitrochinolin-N-oxid, Acriflavin, Ethylmethansulfonat und dergleichen erreicht.
  • Aus diesem Grund bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen von 12-Ketocholsäure, das folgendes umfaßt:
  • - Züchten eines Bakteriums, das zu der Gattung Bacillus gehört, das die Fähigkeit hat, in einem Meermedium, das Cholsäure enthält, 12-Ketocholsäure herzustellen,
  • - Ermöglichen, daß das Bakterium in dem Kulturmedium 12-Ketocholsäure herstellt, und optional
  • - Sammeln der 12-Ketocholsäure.
  • Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus zur Verfügung, der in der Lage ist, überwiegend 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure aus 3a, 7α, 12α-Trihydroxy-5β-Cholansäure (Cholsäure) herzustellen und sie stellt Mutantenstämme davon zur Verfügung, die die Aktivität besitzen, die 12α-Hydroxygruppe der Cholsäure zu oxidieren, um überwiegend 3a,7α-Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure herzustellen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure zur Verfügung, das folgendes umfaßt:
  • - Züchten eines Mikroorganismus, der in der Lage ist 3α,7α- Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure in einem Meermedium, das 3α,7α, 12α-Trihydroxy-5β-cholansäure enthält, herzustellen, der zu der Gattung Bacillus gehört,
  • - Herstellen lassen von 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium, und optional
  • - Sammeln der Säure.
  • Beispiele von Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung, die von dem Bacillus sp. TTUR 2-2 abstammen, sind Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 (am 13. Mai 1991 am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer FERM BP-3394 gelagert) und der Bacillus sp. TTUR 2-M4- 336 (am 13. Mai 1991 am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer FERM BP-3397 gelagert) 4 Die Verfahren zum Isolieren der Bakterien sind wie folgt:
    • 1) Bacillus sp. TTUR 2-M4-124
  • Eine Platinschleife voll mit Bacillus sp. TTUR 2-2, der auf einer Schräge eines alkalischen NA-Mediums (Zusammensetzung: normale Nährlösung "EIKEN" (Handelsname) 1,8%, Agar 1,8%, Natriumcarbonat 0,75%, pH 10) gezüchtet worden ist, wird in einem Teströhrchen (30 x190mm) geimpft, das 20 ml von HORIKOSHI-Medium I (Zusammensetzung: Glucose 1%, Pepton 0,5%, Hefeextrakt 0,5%, Dikaliumhydrogenphosphat 0,1%, Magnesiumsulfat-7-hydrat 0,02%, Natriumcarbonat 1%, pH 10) enthält und unter Schütteln bei 30ºC für 16 Stunden gezüchtet.
  • Anschließend werden die obigen Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase keimfrei mittels einer Zentrifugen-Trennung gesammelt und drei Mal mit 10 ml eines 0,1-molaren Tris-Maleinsäurepuffers (pH 8,0) gewaschen. Nach dem Waschen werden die Zellen zu 25 ml der gleichen Pufferlösung hinzugegeben, um eine Suspension zu bilden, worauf anschließen NTG zu der Suspension hinzugegeben wird, so daß die NTG-Endkonzentration 60 ug/ml beträgt. Die Zellsuspension wird bei 30ºC für 30 Minuten inkubiert und einer mutagenen Behandlung unterworfen. Die Absterberate des Bacillus sp. TTUR 2-2 während der Behandlung beträgt 85%.
  • Anschließend werden 1 ml der Bakteriensuspension mit 9 ml eines 0,1-molaren Natriumcarbonatpuffers (pH 9,5) verdünnt und die Zellen werden mittels eines Zentrifugalseparators gesammelt; nach dem zweimaligen Waschen mit dem gleichen Puffer werden die Zellen in 10 ml eines alkalischen NB-Mediums (Zusammensetzung: normale Nährlösung "EIKEN" 1,8%, Natriumcarbonat 0,75%, pH 10) suspendiert. Die auf diese Weise hergestellte Bakteriensuspension wird optional mit einem alkalischen NB-Medium verdünnt, auf das alkalische NA-Plattenkulturmedium so aufgebracht, daß 10 bis 100 Kolonien erscheinen sollten und bei 30ºC für zwei Tage gezüchtet.
  • Unter den Kolonien, die erschienen, wird eine Kolonie mittlerer Größe nach zwei Tagen Wachstum, vom Start der Züchtung an gerechnet, isoliert und auf eine Schräge eines 5%-igen CA-Agarmediums (Zusammensetzung: ein Medium, bei dem Cholsäure 5%, Natriumhydroxid 0,5%, Agar 1,8% zu dem HORIKOSHI-Medium I hinzugegeben ist, pH 10) übertragen, und die Bakterien von der Kolonie werden für drei Tage bei einer Temperatur von 30ºC gezüchtet. Ein gut gewachsener Stamm wird ausgewählt und eine Plattenschleife voll des Stammes wird in einem Teströhrchen (16,5 x 165mm) geimpft, das 5% eines CA-Flüssigmediums (Zusammensetzung: Entfernen des Agars aus 5%-igem CA-Agar, pH 10) enthält. Die Menge an Medium in dem Teströhrchen beträgt 4 ml. Der Stamm in dem Teströhrchen wird unter Schütteln bei 30ºC für drei Tage gezüchtet. Produkte, die in dem Kulturmedium um gewandelt worden sind, werden mit Dünnschichtchromatographie untersucht. Hierbei haben wir einen Mutantenstamm gefunden, der spezifisch 3α-Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure herstellt; dieser Stamm ist Bacillus sp. TTUR 2-M4 genannt worden (und ist am 13. Mai 1991 am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Ablagenummer FERN BP-3393 gelagert worden) . Dieses Verfahren zum Erhalten eines solchen Mutantenstammes wird im weiteren als NTG-Behandlung bezeichnet.
  • Anschließend wird die NTG-Behandlung mit dem Bacillus sp. TTUR 2-M4 wiederholt, der mit der obigen NTG-Behandlung als Elternstamm erhalten worden ist, mit der Ausnahme, daß das 5%-ige CA- Flüssigmedium als Medium für die Anfangskultur verwendet worden ist, und daß die NTG-Konzentration bei der NTG-Behandlung 60 ug/ml beträgt. Als Ergebnis haben wir einen Stamm gefunden, der spezifisch 12-Ketocholsäure produziert. Wir haben den Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 genannt. Die Sterberate von Bacillus sp. TTUR 2-M4 während der obigen Behandlung beträgt 15%.
    • 2) Bacillus sp. TTUR 2-M4-336
  • Die NTG-Behandlung wird mit dem Bacillus sp. TTUR 2-M4 wiederholt, der mit der obigen NTG-Behandlung von 1) als Elternstrang erhalten wird, mit der Ausnahme, daß ein 5%-iges CA-Flüssigmedium als Medium für die Anfangskultur verwendet wird, und daß die NTG-Konzentration bei der NTG-Behandlung 100 ug/ml beträgt. Als ein Ergebnis haben wir einen Stamm gefunden, der spezifisch 12-Ketocholsäure herstellt. Wir haben den Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-336 genannt. Die Absterberate von Bacillus sp. TTUR 2-M4 während der Behandlung war 45%.
  • Die bakteriologischen Eigenschaften der Bakterien sind in den folgenden Tabellen 1-4 aufgelistet. Die Verfahren für die Tests und die Klassifizierungen sind gemäß dem BERGEY's MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY angewandt worden, und solange nichts anderes definiert ist, ist zu allen hier verwendeten Medium Natriumcarbonat zum Einstellen des pH-Wertes auf pH 10 hinzugefügt worden. TABELLE 1 Morphologie von verschiedenen Bacillus sp. TTUR TABELLE 2 Wachstum der Bakterien in verschiedenen Medien (TTUR 2-2, TTUR 2-M4, TTUR 2-M4-124 und TTUR 2-M4-336 zeigen die folgenden Wachstumsbedingungen.) TABELLE 3 Physiologische Eigenschaften von TTUR 2-2, TTUR 2-M4, TTUR 2- M4-124 und TTUR 2-M4-336 TABELLE 4 Säure- und Gas-Bildung aus verschiedenen Zuckern (pH 9)
  • Gemäß den obigen Beobachtungen ist es offensichtlich, daß der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-2 ein Mikroorganismus ist, der zu der Gattung Bacillus gehört, weil der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-2 ein sporenbildendes und aerobes Bakterium ist. Da der für das Wachstum optimale pH-Wert jedoch im alkalischen Milieu, im pH- Wert-Bereich von 9-10 liegt, ist der Stamm Bacillus sp. TTUR 2- 2 kein typischer Mikroorganismus der Gattung Bacillus.
  • Wenn der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-2 mit dem Stamm Bacillus Alcalophilus subsp. Halordurans verglichen wird, der als alkalophiles Standardbakterium der Gattung Bacillus bekannt ist, gibt es bemerkenswerte Unterschiede zwischen ihnen in Bezug auf die Eüscheinungsform und den Umfang der Kolonie.
  • Als alkalophile Stämme mit einer unregelmäßigen Kolonie-Form und mit einem gelappten Kolonie-Umfang wurden die Stämme Bacillus Cereus 8-1 (FERN 2885, japanische Patentveröffentlichungsnummer Sho 53-13708) und der Stamm Bacillus Alcalophylus 202-1 (FERN 2674, japanische Patentveröffentlichungsnummer Sho 53-27786) beschrieben, deren Kolonie-Formen sind jedoch unterschiedlich zu denen des Stammes Bacillus sp. TTUR 2-2.
  • In Tabelle 5 sind die Hauptkennzeichen der Stämme Bacillus sp. TTUR 2-2, Bacillus sp. TTUR 2-M4-124, Bacillus sp. TTUR 2-M4- 336 und Bacillus Alcalophilus gezeigt, und in Tabelle 6 sind die Hauptkennzeichen der Stämme Bacillus Alcalophilus subsp. Halodurans, Bacillus Cereus 8-1 (FERN 2885, japanische Patentveröffentlichungsnummer Sho 53-13708) und Bacillus Alcalophilus 202-1, (FERN 2674, japanische Patentveröffentlichungsnummer Sho 53-27786) gezeigt. TABELLE 5 Hauptkennzeichen der Bakterien (Nr. 1) TABELLE 6 Hauptkennzeichen der Bakterien (No. 2)
  • Es ist vernünftig TTUR 2-2 als eine neue Spezies von Bakterien zu klassifizieren, da TTUR 2-2 von bekannten Spezies im Hinblick auf die bakteriologischen Eigenschaften, insbesondere den für das Wachstum optimalen pH-Wertbereich, der in Richtung des alkalischen Milieus bei einem pH-Wert von etwa 9-10 liegt, unterscheidbar ist, obwohl TTUR 2-2 ein sporenbildendes aerobes Bakterium ist.
  • Da es allgemeine Ansicht ist, daß Mutantenstämme gewöhnlich zu derselben Spezies wie ihr Elternstamm gehören, schließen wir, daß die Stämme Bacillus TTUR 2-M4-124 und TTUR 2-M4-336, die sekundäre Mutanten von Bacillus sp. 2-2 sind, zu der gleichen Spezies von Bakterien wie der Elternstamm gehören.
  • Insbesondere die Bakterien der vorliegenden Erfindung sind nicht auf den Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 und TTUR 2-M4- 336 begrenzt, sondern umfassen jedes Bakterium, das zu der Gattung Bacillus gehört und in der Lage ist, 12-Ketocholsäure aus Cholsäuresubstrat herzustellen.
  • Die Kulturmedien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können alle Medien sein, in denen die Bakterien der Erfindung wachsen können, so sind zum Beispiel als Kohlenstoffquellen Saccharide, wie zum Beispiel Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Glyzerin, Stärke, Kleie, schwarzer Melasseabfall und dergleichen und als Stickstoffquellen organische Stickstoffverbindungen, wie zum Beispiel Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt, eine Mais-Einweichflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Rapsölkuchen, verschiedene Aminosäuren, Aminozucker und dergleichen und anorganische Stickstoffverbindungen, wie zum Beispiel Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat und dergleichen zu nennen. Weiterhin ist es bevorzugt, eine Spurenmenge von anorganischen Metallsalzen, Vitaminen, wachstumsfördernden Faktoren und dergleichen hinzuzugeben.
  • Obwohl die Cholsäurekonzentration in dem Kulturmedium nicht speziell begrenzt ist, kann sie im Hinblick auf die Ausbeute von 12-Ketocholsäure und die Züchtungsbedingungen geeigneterweise in dem Bereich von 1 bis 500 gil, vorzugsweise 40-300 g/l sein.
  • Die Züchtung der vorliegenden Erfindung kann in einer aeroben Atmosphäre, wie Beispiel belüftetem Rühren oder Hin- und Herschütteln durchgeführt werden. Die Züchtungsbedingungen sind gewöhnlich auf eine Temperatur von 20ºC bis 40ºC, einen pH-Wert von 7 bis 11 für 1 bis 6 Tage eingestellt.
  • Das gewünschte Produkt 12-Ketocholsäure kann aus dem Kulturmedium wie folgt isoliert werden: Als erstes werden Bakterien und nicht benötigte Komponenten in dem Kulturmedium mittels Filtration, Zentrifugentrennung usw. entfernt, und das resultierende Filtrat oder der flüssige Überstand wird durch Hinzugeben von Salzsäure oder Schwefelsäure angesäuert. Durch diese Tätigkeit fällt 12-Ketocholsäure in einer hohen Ausbeute aus. Anschließend wird der Niederschlag gefiltert und nach der Umkristallisation wird hoch saubere 12-Ketocholsäure erhalten.
  • Die 12-Ketocholsäure, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, kann leicht mit der Wolff-Kishner-Reduktion in die Chenodesoxycholsäure umgewandelt werden, die als Agens zum Auflösen eines Gallensteines nützlich ist.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiterhin mit Bezug auf die folgenden Beispiele erklärt, wobei verstanden werden soll, daß die Beispiele nicht als Einschränkung für den Bereich der vorliegenden Erfindung gedacht sind.
  • In jedem Beispiel wird die Identifizierung der Produkte mittels Dünnschichtchromatographie oder mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt, wobei die Bedingungen wie folgt sind:
    • 1) Dünnschichtchromatographie
  • Träger: Kieselgel 60 (0,25 mm Dicke, Merck),
  • Entwicklerlösung Benzol/Isopropanol/Essigsäure (40/10/1 Volumenverhältnis)
  • Farbwechseltest: Aufsprühen eines Phosphormolybdensäure-Schwefelsäure-Reagenz (Auflösen von 1 g Phosphormolybdensäure in 20 ml Methanol und Hinzugeben von 1 ml konzentrierte Schwefelsäure) und Erwärmen, bis ein Gallensäurefleck nach tiefblau umschlägt.
    • 2) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
  • Säule: INERTOSIL ODS Säule (Säulengröße 4,6 250 mm, Gl science)
  • Mobile Phase: Methanol/gereinigtes Wasser/Phosphorsäure (70/30/0,02 Mol Gewichtsverhältnis)
  • Flußrate 1,0 mm/Minute
  • Detektor: RI
    • Beispiel 1
  • Der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 (FERN 3394) wird gemäß dem folgenden Verfahren gezüchtet:
  • 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst und getrennt davon werden 50 g Cholsäure, 5 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat in 500 g gereinigtem Wasser aufgelöst. Die beiden Lösungen werden bei einer Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die zwei Lösungen gemischt, und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10) verwendet.
  • Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 (FERN 3394) wird für 20 Stunden un ter Schütteln bei einer Temperatur von 30ºC in einem Teströhrchen gezüchtet, das 20 ml von dem Kulturmedium mit der obigen Zusammensetzung enthält, mit der Ausnahme, daß Cholsäure und Natriumhydroxid nicht enthalten sind. Auf diese Weise wird eine Bakterienlösung hergestellt.
  • 20 ml des obigen Kulturmediums werden in ein Teströhrchen (30 x190mm) gegeben und 0,1 ml der Bakterienlösung wird keimfrei darin eingeimpft. Das Bakterium wird für 3 Tage unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet.
  • Nach dieser Züchtung wird das Bakterium mittels Zentrifugation entfernt, die 12-Ketocholsäure und die umgewandelte Cholsäure werden niedergeschlagen, indem zu dem flüssigen Überstand, der bei dem Trennverfahren gebildet wird, verdünnte Schwefelsäure hinzugegeben wird und indem der flüssige Überstand angesäuert wird. Anschließend wird der gebildete Niederschlag gesammelt und nach dem Trocknen werden 0,999 g eines weißen Pulvers erhalten. Ein Teil des Pulvers wird genommen, und der Anteil von Cholsäure und 12-Ketocholsäure in dem Produkt wird mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind: Cholsäure 1,7%, 12-Ketocholsäure 98,3% (Wiederfindungsrate: 99,9%): Durch eine Umkrisallisation der Mischung in einer Methanollösung wird reine 12-Ketocholsäure erhalten.
    • Beispiel 2
  • Das Verfahren von Beispiel 1 wird mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-336 (FERM 3397) durchgeführt. Der Anteil in dem Produkt beträgt 1,8% Cholsäure und 98,2% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate: 99,9%).
    • Beispiel 3
  • Das Verfahren von Beispiel 1 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in dem Kulturmedium (pH 10) keine Glucose enthalten ist, wobei der Produktionsanteil von Cholsäure 1,9% und von 12- Ketocholsäure 98,1% beträgt.
    • Beispiel 4
  • Das Verfahren von Beispiel 2 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in dem Kulturmedium (pH 10) keine Glucose enthalten ist, wobei der Anteil in dem Produkt 0% Cholsäure und 100% 12- Ketocholsäure beträgt.
    • Beispiel 5
  • 10 g Sojabohnenprotein (ESUSAN-MEAT; Handelsname; AJINOMOTO Inc.); 1 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat- 7-hydrat werden in 500 ml gereinigtem Wassers aufgelöst und 50 g Cholsäure, 5 Natriumhydroxid und 2 g Natriumcarbonat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst. Anschießend werden beide Lösungen bei einer Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die beiden Lösungen gemischt und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10,2) verwendet. Anschließend wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt und 12-Ketocholsäure wird erhalten. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,5 % Cholsäure und 99,5% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 6
  • Das Verfahren von Beispiel 5 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch dem Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 1,2% Cholsäure und 98,8% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 7
  • Das Verfahren von Beispiel 5 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß Dikaliumhydrogenphosphat und Magnesiumsulfat-7-hydrat nicht in dem Medium vorhanden sind und die Menge von Natriumcarbonat auf 3 g (pH 10,3) geändert ist. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0% Cholsäure und 100% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 8
  • Das Verfahren von Beispiel 7 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,7% Cholsäure und 99,3% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 9
  • 10 g Sojabohnenprotein (ESUSAN MEAT), 1 g Hefeextrakt, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst und 50 g Cholsäure, 5 g Natriumhydroxid und 4 g Natriumcarbonat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst. Anschließend werden beide Lösungen bei einer Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die beiden Lösungen gemischt und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10,2) verwendet. Anschließend wird das Verfahren von Beispiel 5 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-226 ersetzt wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,1% Cholsäure und 99,9% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 10
  • Das Verfahren von Beispiel 9 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in dem Medium anstelle von Sojabohnenprotein (ESUSAN-MEAT) 20 g Mais-Einweichflüssigkeit verwendet werden, und die Menge von Natriumcarbonat auf 12 g (pH 9,8) geändert wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,1 % Cholsure und 99,9% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 11
  • Das Verfahren von Beispiel 5 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in dem Kulturmedium anstelle von Sojabohnenprotein (ESUSAN-MEAT) 10 g Sojabohnenprotein (AJIPRON E3; Handelsname; AJINOMOTO Inc.) verwendet werden, die Menge von Natriumcarbonat auf 2 g (pH 10,0) geändert wird, und die Züchtungszeit auf 2 Tage verkürzt wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,2 % Cholsäure und 99,8% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 12
  • Das Verfahren von Beispiel 11 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird, und daß die Züchtungszeit auf 3 Tage ausgedehnt wird&sub4; Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,4% Cholsäure und 99,6% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 13
  • 5 g Hefeextrakt, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst, und 50 g Cholsäure, 5 g Natriumhydroxid und 4 g Natriumcarbonat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst. Anschließend werden die beiden Lösungen bei einer Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die zwei Lösungen gemischt und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 9,7) verwendet. Anschließend wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,4% Cholsäure und 99,6% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 14
  • Das Verfahren von Beispiel 13 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,1% Cholsäure und 99,9% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 15
  • Das Verfahren von Beispiel 14 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in dem Kulturmedium anstelle von Hefeextrakt 5 g Sojabohnenpeptid (D-4; Handelsname:FUJISEIYU Inc.) (pH 9,8) verwendet wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,8% Cholsäure und 99,2% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 16
  • Das Verfahren aus Beispiel 13 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in dem Kulturmedium anstelle von Hefeextrakt 5 g Sojabohnenpeptid (D-2; Handelsname: FUJISEIYU Inc.) verwendet werden und die Menge von Natriumcarbonat auf 2 g (pH des Mediums ist 9,2) geändert wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,1% Cholsäure und 99,9 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 17
  • 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Kaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst. 100 g Cholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat werden in 500 g gereinigten Wassers aufgelöst. Anschließend werden beide Lösungen bei der Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die zwei Lösungen gemischt und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10) verwendet.
  • Der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 wird unter Schütteln für 24 Stunden bei der Temperatur von 30ºC in einem Teströhrchen gezüchtet, das 20 ml des Kulturmediums mit der obigen Zusammensetzung enthält und eine Bakterienlösung wird hergestellt. 20 ml des Kulturmediums werden in ein Teströhrchen (30 x190mm) gegeben, 0,2 ml der Bakterienlösung werden keimfrei darin eingeimpft, und das Bakterium in dem Teströhrchen wird für 4 Tagen unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet.
  • Im Anschluß daran wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt und 12-Ketocholsäure wird erhalten. Der Anteil in dem Produkt beträgt 3,3% Cholsäure und 96,7% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 18
  • Das Verfahren von Beispiel 17 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 2,7% Cholsäure und 97,3% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 19
  • 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst, und 50 g Cholsäure, 5 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat werden in 500 g gereinigten Wassers aufgelöst. Anschließend werden beide Lösungen bei der Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die zwei Lösungen gemischt und die Mischung wird für ein Medium (pH 10) verwendet.
  • Der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 wird für 24 Stunden unter Schütteln bei der Temperatur von 30ºC in einem Teströhrchen gezüchtet, das 20 ml des obigen Kulturmediums enthält, und eine Bakterienlösung wird hergestellt. 20 ml des obigen Kulturmediums wird in ein Teströhrchen (30 x190ml) gegeben und 0,2 ml der Bakterienlösung werden keimfrei darin eingeimpft. Das Bakterium in dem Teströhrchen wird für 2 Tage unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet. Im Anschluß wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt und es wird 12-Ketocholsäure erhalten. Der Produktionsanteil beträgt 0,7% Cholsäure und 99,3% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 20
  • Das Verfahren von Beispiel 19 wird durchgeführt mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird. Der Produktionsanteil beträgt 0,8% Cholsäure und 99,2% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 21
  • 10 g Glucose, 5 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 500 ml gereinigten Wassers aufgelöst. 150 g Cholsäure, 15 g Natriumhydroxid und 10 g Natriumcarbonat werden in 500 g gereinigten Wassers aufgelöst. Die zwei Lösungen werden bei der Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die Lösungen gemischt und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10) verwendet.
  • Der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 wird für 24 Stunden unter Schütteln bei der Temperatur von 30ºC in einem Teströhrchen gezüchtet, das 20 ml des obigen Kulturmediums enthält, und auf diese Weise wird eine Bakterienlösung hergestellt. 20 ml des obigen Kulturmediums werden in ein Teströhrchen (30 x190mm) gegeben, 0,2 ml der Bakterienlösung werden keimfrei darin eingeimpft und das Bakterium in dem Teströhrchen wird für 6 Tage unter Schütteln bei 30ºC gezüchtet. Im Anschluß wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt und es wird 12-Ketocholsäure erhalten. Der Produktionsanteil beträgt 17,3% Cholsäure und 82,7% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 22
  • Das Verfahren von Beispiel 21 wird durchgeführt mit der Ausnahme, daß das Bakterium Bacillus sp. TTUR 2-M4-336 ersetzt wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 15,2% Cholsäure und 84,8% 12-Ketocholsäure.
    • Beispiel 23
  • 20 g Glucose, 10 g Pepton, 10 g Hefeextrakt, 2 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,4 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 1000 mal gereinigten Wassers aufgelöst. 100 g Cholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 20 g Natriumcarbonat werden in 1000 g gereinigten Wassers aufgelöst. Die zwei Lösungen werden bei der Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die Lösungen in einer Tisch-Rüttelfermenter-Vorrichtung (5 l Größe) gemischt und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10) verwendet.
  • Der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 wird für 24 Stunden unter Schütteln bei der Temperatur von 30ºC in einem Teströhrchen gezüchtet, das 20 ml des Kulturmediums der obigen Zusammensetzung enthält, mit der Ausnahme, daß Cholsäure und Natriumhydroxid nicht enthalten sind. Auf diese Weise wird eine Bakterienlösung hergestellt. 20 ml des obigen Kulturmediums werden in ein Teströhrchen (30 x190mm) gegeben, 40 ml der Bakterienlösung werden keimfrei darin eingeimpft, und die Bakterien in dem Rüttel-Fermenter werden unter Schütteln (300Upm) bei der Belüftungsrate von 2 l/Minute bei 30ºC für 3 Tage gezüchtet.
  • Nach der obigen Züchtung werden die Bakterien mittels Zentrifugaltrennung entfernt und durch das Hinzugeben von verdünnter Schwefelsäure zu dem flüssigen Überstand, der durch die Zentrifugation gebildet worden ist, wird der pH-Wert auf 2,5 eingestellt, so daß die 12-Ketocholsäure und die umgewandelte Cholsäure ausgefällt werden. Die Niederschläge werden gefiltert, mit Wasser gewaschen und Kristalle werden erhalten. Nach dem Trocknen bei der Temperatur von 50ºC werden 99,2 g eines weißen Pulvers erhalten. Ein Teil des Pulvers wird für die Charakterisierung entnommen und der Anteil von Cholsäure und 12-Ketocholsäure in dem Produkt wird mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Die Ergebnisse sind 1,1% Cholsäure und 98,9% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate: 99,2%).
    • Beispiel 24
  • Das Verfahren von Beispiel 23 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird. Der Anteil in den Produkten beträgt 0,4 % Cholsäure und 99,6% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate: 98,9%).
    • Beispiel 25
  • 20 g Sojabohnenprotein (ESUSAN MEAT) werden in 1000 ml gereinigten Wassers aufgelöst, und 100 g Cholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 6 g Natriumcarbonat werden in 1000 g gereinigten Wassers aufgelöst. Die zwei Lösungen werden bei der Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die Lösungen in einer Tisch-Rüttelfermenter-Vorrichtung (5 l Größe) gemischt, und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10,4) verwendet.
  • Der Stamm Bacillus sp. TTUR 2-M4-336 wird für 24 Stunden unter Rütteln bei einer Temperatur von 30ºC in einem Teströhrchen ge züchtet, das 20 ml des Kulturmediums mit der obigen Zusammensetzung aufweist, mit der Ausnahme, daß Cholsäure und Natriumhydroxid nicht enthalten sind. Auf diese Weise wird eine Bakterienlösung hergestellt. 20 ml des obigen Kulturmediums werden in ein Teströhrchen (30 x190mm) gegeben, 40 ml der Bakterienlösung werden keimfrei darin eingeimpft, und das Bakterium in dem Teströhrchen wird für 3 Tage unter Schütteln (300 U/min.) bei der Belüftungsrate von 2 l/min. bei 30ºC gezüchtet. Eine Spurenmenge eines Schaumverhütungsmittels (EINOL; Handelsname; BIOTT Co. LTD) wird während dieser Tätigkeit hinzugegeben. Anschließend wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 23 durchgeführt und 12-Ketocholsäure wird erhalten. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,7% Cholsäure und 99,3% Ketocholsäure (Wiederfindungsrate 99,2%).
    • Beispiel 26
  • 20 g Sojabohnenprotein (AJIPRON E3), 12 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,4 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 1000 ml gereinigten Wassers aufgelöst, und 100 g Cholsäure, 10 g Natrium hydroxid und 5 g Natriumcarbonat werden in 1000 ml gereinigten Wassers aufgelöst. Anschließend werden beide Lösungen bei der Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die zwei Lösungen in einer Tisch-Rüttelfermenter- Vorrichtung (5 l Größe) gemischt und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10,5) verwendet. Im Anschluß daran wird das Verfahren von Beispiel 23 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Züchtungszeit auf 2 Tage geändert wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,4% Cholsäure und 99,6% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate: 99,8%).
    • Beispiel 27
  • Das Verfahren von Beispiel 26 wird durchgeführt, mit der Ausnahme; daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzü wird, daß die Züchtungszeit auf 3 Tage geändert wird, und daß eine Spurenmenge eines Schaumverhütungsmittels (EINOL) während der Züchtung hinzugegeben wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,4% Cholsäure und 99,6% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate: 99,2%).
    • Beispiel 28
  • 10 g Sojabohnenprotein (AJIPRON E3), 1 g Hefeextrakt, 2 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,4 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 1000 ml gereinigten Wassers aufgelöst, und 100 g Cholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 6 g Natriumcarbonat werden in 1000 ml gereinigten Wassers aufgelöst. Anschließend werden beiden Lösungen bei der Temperatur von 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden die zwei Lösungen in einer Tisch-Rüttelfermenter (5 l Größe) gemischt, und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10,7) verwendet. Im Anschluß daran wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 26 durchgeführt. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,6% Cholsäure und 99,4% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate 98,9%).
    • Beispiel 29
  • Das Verfahren von Beispiel 28 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird&sub1; daß die Züchtungszeit auf 3 Tage geändert wird und daß eine Spurenmenge eines Schaumverhütungsmittels (EINOL) während der Züchtung hinzugegeben wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0,6% Cholsäure und 99,4% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate: 99,4%)
    • Beispiel 30
  • 10 g Sojabohnenprotein (AJIPRON E3), 1 g Hefeextrakt, 2 g Dikaliumhydrogenphosphat und 0,4 g Magnesiumsulfat-7-hydrat werden in 1000 ml gereinigten Wassers aufgelöst, und 100 g Cholsäure, 10 g Natriumhydroxid und 5 g Natriumcarbonat werden in 1000 ml gereinigten Wassers aufgelöst. Die zwei Lösungen werden ohne Sterilisation in einer Tisch-Rüttelfermenter-Vorrichtung (5 l Größe) gemischt, und die Mischung wird für ein Kulturmedium (pH 10,4) verwendet.
  • Der Stamm Bachlus sp. TTUR 2-M4-124 wird für 20 Stunden unter Schütteln bei der Temperatur von 30ºC in einem Teströhrchen gezüchtet, das 20 ml des obigen Kulturmediums enthält und auf diese Weise wird eine Bakterienlösung hergestellt. 40 ml der Bakterienlösung werden keimfrei darin eingeimpft, und das Bakterium in dem Rüttel-Fermenter wird für 3 Tage unter Rühren (300 Upm) bei einer Belüftungsrate von 2 l/Minute bei 30ºC gezüchtet. Im Anschluß daran wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 23 durchgeführt. Der Anteil in dem Produkt beträgt 0% Cholsäure und 100% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate: 99,1%).
    • Beispiel 31
  • Das Verfahren von Beispiel 30 wird durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Bakterium durch den Stamm Bacillus sp. TTUR 2- M4-336 ersetzt wird. Der Anteil in dem Produkt beträgt 1,5% Cholsäure und 98,5% 12-Ketocholsäure (Wiederfindungsrate: 98,8%).

Claims (9)

1. Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der in der Lage ist&sub1; hauptsächlich 3α,7α-Dihydoxy-12-keto-5β-cholansäure aus 3α,7α, 12α-Trihydroxy-5β-cholansäure (Cholsäure) herzustellen und Mutantenstämme davon mit der Aktivität die 12α- Hydroxygruppe von Cholsäure zu oxidieren, um hauptsächlich 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure herzustellen.
2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, der ein Bacillus sp. TTUR 2-M4-124 (gelagert am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugriffsnummer FERN BP-3394) ist und Mutantenstämme davon, die die Aktivität haben die 12α-Hydroxygruppe von Cholsäure zu oxidieren, um hauptsächlich 3α,7α-Dihydroxy-12- keto-5β-cholansäure herzustellen.
3. Mikroorganismus nach Anspruch 1, der ein Bacillus sp. TTUR 2-M4-336 (gelagert am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugriffsnummer FERN BP-3397) ist und Mutantenstämme davon, die die Aktivität haben, die 12α-Hydroxygruppe von Cholsäure zu oxidieren, um hauptsächlich 3α,7α-Dihydroxy-12- keto-5β-cholansäure herzustellen.
4. Verfahren zum Herstellen von 3α,7α-Dihydroxy-12-keto-5β- cholansäure, das die Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus umfaßt, der in der Lage ist, 3α,7α- Dihydroxy-12-keto-5β-cholansäure in einem Kulturmedium herzustellen, das 3α, 7α, 12α-Trihydroxy-5β-cholansäure enthält, um ein korrespondierendes 12-Keto-Derivat herzustellen.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
wobei der pH-Wert des Kulturmediums pH 7 bis pH 11 ist.
6. Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der in der Lage ist, spezifisch 3α-Hydroxy-7, 12-diketo-5β-cholansäure aus 3α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cholansäure herzustellen.
7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, der ein Bacillus sp. TTUR 2-M4 (gelagert am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugriffsnummer FERN BP-3393) ist.
8. Verfahren zum Herstellen von 3α-Hydroxy-7,12-diketo-5β- cholansäure, das das Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus umfaßt, der in der Lage ist, 3(1-Hydroxy-7,12-diketo-5β-cholansäure in einem Kulturmedium herzustellen, das 3α,7α,12α-Trihydroxy-5β-cholansäure enthält, um ein korrespondierendes 7,12-Diketo-Derivat herzustellen.
9. Verfahren zum Herstellen von 3α,12α-Dihydroxy-7-keto-5β- cholansäure, das das Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus umfaßt, der in der Lage ist, 3α,12α- Dihydroxy-7-keto-5β-cholansäure in einem Kulturmedium herzustellen, das 3α, 7α, 12α-Trihydroxy-5β-cholansäure enthält, um das korrespondierende 7-Keto-Derivat herzustellen.
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