JPH05111391A - ３α，７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法 - Google Patents
３α，７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 微生物を用いた３α，７α−ジヒドロキシ−
１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法を提供する。 【構成】 バチルス属に属し、３α，７α−ジヒドロキ
シ−１２−ケト−５β−コラン酸生産能を有するバチル
ス・エスピー TTUR 2-M4-124、又はバチルス・エスピー
TTUR 2-M4-336を３α，７α，１２α−トリヒドロキシ
−５β−コラン酸を含む栄養培地で培養して、培養物中
に３α，７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラ
ン酸を生成せしめ、これを採取する。
１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法を提供する。 【構成】 バチルス属に属し、３α，７α−ジヒドロキ
シ−１２−ケト−５β−コラン酸生産能を有するバチル
ス・エスピー TTUR 2-M4-124、又はバチルス・エスピー
TTUR 2-M4-336を３α，７α，１２α−トリヒドロキシ
−５β−コラン酸を含む栄養培地で培養して、培養物中
に３α，７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラ
ン酸を生成せしめ、これを採取する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、胆石溶解剤として、あ
るいは利胆剤ウルソデオキシコール酸の合成原料として
有用なケノデオキシコール酸の製造中間体である３α，
７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸（以
下、１２−ケト−コール酸と略称する）を３α，７α，
１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸（以下、コー
ル酸と略称する）から微生物を用いて製造する方法に関
する。
るいは利胆剤ウルソデオキシコール酸の合成原料として
有用なケノデオキシコール酸の製造中間体である３α，
７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸（以
下、１２−ケト−コール酸と略称する）を３α，７α，
１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸（以下、コー
ル酸と略称する）から微生物を用いて製造する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】従来、コール酸を原料として１２−ケト
−コール酸を化学的に製造する方法としては、コール酸
の１２位のヒドロキシル基を選択的に酸化する方法が知
られている。
−コール酸を化学的に製造する方法としては、コール酸
の１２位のヒドロキシル基を選択的に酸化する方法が知
られている。
【０００３】又、微生物を用いてコール酸から１２−ケ
ト−コール酸を製造する方法としては、ミクロコッカス
属の微生物を用いる方法（特公平１−５１９９８号公
報）、アルスロバクター属の微生物を用いる方法（特公
平１−２０８７３号公報、特公平２−６２２３４号公
報）等が知られている。
ト−コール酸を製造する方法としては、ミクロコッカス
属の微生物を用いる方法（特公平１−５１９９８号公
報）、アルスロバクター属の微生物を用いる方法（特公
平１−２０８７３号公報、特公平２−６２２３４号公
報）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
１２−ケト−コール酸の化学的製造法は、反応性、選択
性及び操作上の安全性に問題があり、かつ収率や得られ
る製品の純度の点で満足できるものではなかった。
１２−ケト−コール酸の化学的製造法は、反応性、選択
性及び操作上の安全性に問題があり、かつ収率や得られ
る製品の純度の点で満足できるものではなかった。
【０００５】又、従来の微生物を用いる方法は、本質的
にコール酸基質資化性を有し、かつ副生成物を生産する
等、収率や得られる製品の点で必ずしも満足できるもの
ではなかった。
にコール酸基質資化性を有し、かつ副生成物を生産する
等、収率や得られる製品の点で必ずしも満足できるもの
ではなかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、長年、１
２−ケト−コール酸生産能を有する微生物およびそれを
用いた１２−ケト−コール酸の製造方法について鋭意研
究を重ねてきたところ、高濃度のコール酸を塩として含
み、しかも通常の微生物が生育できない高アルカリ性の
培養液中で旺盛に生育するバチルス属に属する菌が、コ
ール酸を基質として、１２−ケト−コール酸、３α，１
２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸および
３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸
を主要な変換生成物として生産することを見出し、この
菌をバチルス・エスピー TTUR 2-2(Bacillus sp. TTUR
2-2)と命名した（微工研菌寄第１１８６１号）。なお、
この菌は、山形県米沢市内の土壌より分離されたもので
ある。
２−ケト−コール酸生産能を有する微生物およびそれを
用いた１２−ケト−コール酸の製造方法について鋭意研
究を重ねてきたところ、高濃度のコール酸を塩として含
み、しかも通常の微生物が生育できない高アルカリ性の
培養液中で旺盛に生育するバチルス属に属する菌が、コ
ール酸を基質として、１２−ケト−コール酸、３α，１
２α−ジヒドロキシ−７−ケト−５β−コラン酸および
３α−ヒドロキシ−７，１２−ジケト−５β−コラン酸
を主要な変換生成物として生産することを見出し、この
菌をバチルス・エスピー TTUR 2-2(Bacillus sp. TTUR
2-2)と命名した（微工研菌寄第１１８６１号）。なお、
この菌は、山形県米沢市内の土壌より分離されたもので
ある。
【０００７】上記の菌は、コール酸の主として７位及び
１２位の水酸基をケト基に酸化する能力を有し、併せて
弱いながらも３位の水酸基をケト基に酸化する能力を有
しているが、基質のコール酸を資化あるいは分解する性
質を示さない。
１２位の水酸基をケト基に酸化する能力を有し、併せて
弱いながらも３位の水酸基をケト基に酸化する能力を有
しているが、基質のコール酸を資化あるいは分解する性
質を示さない。
【０００８】又、上記の菌は、高アルカリ性の培地で生
育することから、高濃度のコール酸を含有した培地の調
製が可能である。又、このためこれを培養するにあたっ
ては、通常行われる培養液の滅菌操作を省略することが
できる。
育することから、高濃度のコール酸を含有した培地の調
製が可能である。又、このためこれを培養するにあたっ
ては、通常行われる培養液の滅菌操作を省略することが
できる。
【０００９】本発明者らは、上記の菌に突然変異処理、
例えば紫外線、Ｘ線、γ線等の照射、あるいはＮ−メチ
ル−Ｎ' −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、Ｎ
ＴＧと略称する）、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイ
ド、アクリフラビン、エチルメタンスルホネート等の突
然変異誘発剤との接触等を施すことにより、コール酸か
らほぼ１００％の変換率、かつほぼ１００％の収率で１
２−ケト−コール酸を生産する能力を有する新規な突然
変異菌株の分離に成功し、本発明を完成した。
例えば紫外線、Ｘ線、γ線等の照射、あるいはＮ−メチ
ル−Ｎ' −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、Ｎ
ＴＧと略称する）、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイ
ド、アクリフラビン、エチルメタンスルホネート等の突
然変異誘発剤との接触等を施すことにより、コール酸か
らほぼ１００％の変換率、かつほぼ１００％の収率で１
２−ケト−コール酸を生産する能力を有する新規な突然
変異菌株の分離に成功し、本発明を完成した。
【００１０】即ち、本発明によれば、バチルス属に属す
る１２−ケト−コール酸生産能を有する菌をコール酸を
含む栄養培地で培養し、培養物中に１２−ケト−コール
酸を生成させ、これを採取することからなる１２−ケト
−コール酸の製造方法が提供される。
る１２−ケト−コール酸生産能を有する菌をコール酸を
含む栄養培地で培養し、培養物中に１２−ケト−コール
酸を生成させ、これを採取することからなる１２−ケト
−コール酸の製造方法が提供される。
【００１１】本発明者らは、バチルス・エスピー TTUR
2-2 に由来する上記突然変異菌株をバチルス・エスピー
TTUR 2-M4-124(Bacillus sp. TTUR 2-M4-124;微工研条
寄第３３９４号）及びバチルス・エスピー TTUR 2-M4-3
36(Bacillus sp. TTUR 2-M4-336;微工研条寄第３３９７
号）と命名した。これらの菌の分離は次の方法によっ
た。
2-2 に由来する上記突然変異菌株をバチルス・エスピー
TTUR 2-M4-124(Bacillus sp. TTUR 2-M4-124;微工研条
寄第３３９４号）及びバチルス・エスピー TTUR 2-M4-3
36(Bacillus sp. TTUR 2-M4-336;微工研条寄第３３９７
号）と命名した。これらの菌の分離は次の方法によっ
た。
【００１２】(1) バチルス・エスピー TTUR 2-M4-124 アルカリ性ＮＡ培地（組成：普通ブイヨン‘栄研’（商
品名）1.８％、寒天1.８％、炭酸ナトリウム0.７５％、
ｐＨ１０）のスラントに生育させたバチルス・エスピー
TTUR 2-2 を一白金耳量取り、ホリコシ培地Ｉ（組成：
グルコース１％、ペプトン0.５％、イーストエキス0.５
％、リン酸一水素カリウム0.１％、硫酸マグネシウム・
７水和物0.０２％、炭酸ナトリウム１％、ｐＨ１０）２
０ml入りの試験管（３０φ×１９０mm) に接種し、３０
℃で１６時間振盪培養した。
品名）1.８％、寒天1.８％、炭酸ナトリウム0.７５％、
ｐＨ１０）のスラントに生育させたバチルス・エスピー
TTUR 2-2 を一白金耳量取り、ホリコシ培地Ｉ（組成：
グルコース１％、ペプトン0.５％、イーストエキス0.５
％、リン酸一水素カリウム0.１％、硫酸マグネシウム・
７水和物0.０２％、炭酸ナトリウム１％、ｐＨ１０）２
０ml入りの試験管（３０φ×１９０mm) に接種し、３０
℃で１６時間振盪培養した。
【００１３】次に、対数増殖期にある上記菌体を遠心分
離操作により無菌的に集菌し、0.１Ｍトリス−マレイン
酸緩衝液（ｐＨ8.０）１０mlで３回洗浄操作を行った。
洗浄後の菌体を同一緩衝液２５mlに懸濁し、これに終濃
度が６０μｇ／mlとなるようにＮＴＧを添加し、３０℃
で３０分間インキュベーションして突然変異処理を行っ
た。なお、この処理条件下でのバチルス・エスピー TTU
R 2-2 の死滅率は８５％であった。
離操作により無菌的に集菌し、0.１Ｍトリス−マレイン
酸緩衝液（ｐＨ8.０）１０mlで３回洗浄操作を行った。
洗浄後の菌体を同一緩衝液２５mlに懸濁し、これに終濃
度が６０μｇ／mlとなるようにＮＴＧを添加し、３０℃
で３０分間インキュベーションして突然変異処理を行っ
た。なお、この処理条件下でのバチルス・エスピー TTU
R 2-2 の死滅率は８５％であった。
【００１４】次に、この菌懸濁液１mlを採取し、直ちに
９mlの0.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ9.５）で希釈
して遠心分離操作により集菌し、さらに同一緩衝液によ
る洗浄操作を２回繰り返した後、アルカリ性ＮＢ培地
（組成：普通ブイヨン‘栄研’1.８％、炭酸ナトリウム
0.７５％、ｐＨ１０）１０mlに懸濁した。得られた菌懸
濁液をアルカリ性ＮＢ培地で適宜希釈し、これをアルカ
リ性ＮＡ平板培地上で１０〜１００個のコロニーを出現
させるように塗布した後、３０℃で２日間培養した。
９mlの0.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ9.５）で希釈
して遠心分離操作により集菌し、さらに同一緩衝液によ
る洗浄操作を２回繰り返した後、アルカリ性ＮＢ培地
（組成：普通ブイヨン‘栄研’1.８％、炭酸ナトリウム
0.７５％、ｐＨ１０）１０mlに懸濁した。得られた菌懸
濁液をアルカリ性ＮＢ培地で適宜希釈し、これをアルカ
リ性ＮＡ平板培地上で１０〜１００個のコロニーを出現
させるように塗布した後、３０℃で２日間培養した。
【００１５】出現したコロニーのうち、２日後に生育
し、かつコロニーサイズが中程度のものを単離し、５％
ＣＡ寒天培地（組成：ホリコシ培地Ｉにコール酸５％、
水酸化ナトリウム0.５％、寒天1.８％を添加したもの、
ｐＨ１０）のスラントに移植し、３０℃で３日間培養し
た。十分生育した菌株を選択し、その一白金耳量を５％
ＣＡ液体培地（組成：５％ＣＡ寒天培地より寒天を除い
たもの、ｐＨ１０）の入った試験管（培地量４ml、１6.
５φ×１６５mm) に接種し、３０℃で３日間振盪培養し
た。得られたそれぞれの培養液中の変換生成物を薄層ク
ロマトグラフィで検討し、３α−ヒドロキシ−７，１２
−ジケト−５β−コラン酸を特異的に生産する突然変異
株を見出し、これをバチルス・エスピー TTUR 2-M4（微
工研条寄第３３９３号）と命名した。以下、上述した突
然変異株取得方法を単にＮＴＧ処理と称する。
し、かつコロニーサイズが中程度のものを単離し、５％
ＣＡ寒天培地（組成：ホリコシ培地Ｉにコール酸５％、
水酸化ナトリウム0.５％、寒天1.８％を添加したもの、
ｐＨ１０）のスラントに移植し、３０℃で３日間培養し
た。十分生育した菌株を選択し、その一白金耳量を５％
ＣＡ液体培地（組成：５％ＣＡ寒天培地より寒天を除い
たもの、ｐＨ１０）の入った試験管（培地量４ml、１6.
５φ×１６５mm) に接種し、３０℃で３日間振盪培養し
た。得られたそれぞれの培養液中の変換生成物を薄層ク
ロマトグラフィで検討し、３α−ヒドロキシ−７，１２
−ジケト−５β−コラン酸を特異的に生産する突然変異
株を見出し、これをバチルス・エスピー TTUR 2-M4（微
工研条寄第３３９３号）と命名した。以下、上述した突
然変異株取得方法を単にＮＴＧ処理と称する。
【００１６】次に、上記ＮＴＧ処理で得られたバチルス
・エスピー TTUR2-M4を親株として、さらにＮＴＧ処理
を繰り返した。但し、初発菌体増殖培地として５％ＣＡ
液体培地を用い、ＮＴＧ濃度を６０μｇ／mlとした。そ
の結果、目的とする１２−ケト−コール酸を特異的に生
産する一菌株を見出し、これをバチルス・エスピー TTU
R 2-M4-124と命名した。なお、本操作におけるバチルス
・エスピー TTUR 2-M4の死滅率は１５％であった。
・エスピー TTUR2-M4を親株として、さらにＮＴＧ処理
を繰り返した。但し、初発菌体増殖培地として５％ＣＡ
液体培地を用い、ＮＴＧ濃度を６０μｇ／mlとした。そ
の結果、目的とする１２−ケト−コール酸を特異的に生
産する一菌株を見出し、これをバチルス・エスピー TTU
R 2-M4-124と命名した。なお、本操作におけるバチルス
・エスピー TTUR 2-M4の死滅率は１５％であった。
【００１７】(2) バチルス・エスピー TTUR 2-M4-336 (1) のＮＴＧ処理で得られたバチルス・エスピー TTUR
2-M4を親株として、ＮＴＧ処理を繰り返した。但し、初
発菌体増殖培地として５％ＣＡ液体培地を用い、ＮＴＧ
処理時のＮＴＧ濃度を１００μｇ／mlとした。その結
果、目的とする１２−ケト−コール酸を特異的に生産す
る一菌株を見出し、これをバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336と命名した。なお、本操作におけるバチルス・エ
スピー TTUR 2-M4の死滅率は４５％であった。
2-M4を親株として、ＮＴＧ処理を繰り返した。但し、初
発菌体増殖培地として５％ＣＡ液体培地を用い、ＮＴＧ
処理時のＮＴＧ濃度を１００μｇ／mlとした。その結
果、目的とする１２−ケト−コール酸を特異的に生産す
る一菌株を見出し、これをバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336と命名した。なお、本操作におけるバチルス・エ
スピー TTUR 2-M4の死滅率は４５％であった。
【００１８】これらの菌の菌学的性質を以下の表１〜表
４に示す。なお、表中の試験及び分類方法は、「バージ
ェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー(BERGEY's MANUAL OF Systematic Bacteriol
ogy)に準拠して行ったものであり、特に記載のない限
り、全て炭酸ナトリウムを添加し、ｐＨを１０に調整し
た培地を用いた。
４に示す。なお、表中の試験及び分類方法は、「バージ
ェーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー(BERGEY's MANUAL OF Systematic Bacteriol
ogy)に準拠して行ったものであり、特に記載のない限
り、全て炭酸ナトリウムを添加し、ｐＨを１０に調整し
た培地を用いた。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
【表４】
【００２３】以上の検索の結果、バチルス・エスピー T
TUR 2-2 は好気性の有胞子細菌であることから、バチル
ス(Bacillus)属に属する微生物であることは明らかであ
る。
TUR 2-2 は好気性の有胞子細菌であることから、バチル
ス(Bacillus)属に属する微生物であることは明らかであ
る。
【００２４】しかしながら、生育のための至適ｐＨが９
〜１０前後のアルカリ側に存在することから、一般のバ
チルス属微生物とは異なる。
〜１０前後のアルカリ側に存在することから、一般のバ
チルス属微生物とは異なる。
【００２５】又、この菌と、好アルカリ性バチルス属の
標準微生物として知られるバチルス・アルカロフィルス
(Bacillus alcalophylus) 及びバチルス・アルカロフィ
ルス・サブスピーシス・ハロデュランス(Bacillus alca
lophylus subsp. halodurans) とを比較したとき、コロ
ニーの形状、コロニー周辺の様子において顕著に異なっ
ていた。
標準微生物として知られるバチルス・アルカロフィルス
(Bacillus alcalophylus) 及びバチルス・アルカロフィ
ルス・サブスピーシス・ハロデュランス(Bacillus alca
lophylus subsp. halodurans) とを比較したとき、コロ
ニーの形状、コロニー周辺の様子において顕著に異なっ
ていた。
【００２６】好アルカリ性でコロニーが不規則、かつ周
辺が裂片状の菌株として、バチルス・セレウス8-1 菌(B
acillus cereus 8-1,FERM2885,特公昭53-13708号）及び
バチルス・アルカロフィルス202-1 菌(Bacillus alcalo
phylus 202-1, FERM2674, 特公昭53-27786号) が報告さ
れているが、これらの菌と比較してもその形状は異なっ
ていた。
辺が裂片状の菌株として、バチルス・セレウス8-1 菌(B
acillus cereus 8-1,FERM2885,特公昭53-13708号）及び
バチルス・アルカロフィルス202-1 菌(Bacillus alcalo
phylus 202-1, FERM2674, 特公昭53-27786号) が報告さ
れているが、これらの菌と比較してもその形状は異なっ
ていた。
【００２７】表５にバチルス・エスピー TTUR 2-2 、バ
チルス・エスピー TTUR 2-M4-124、バチルス・エスピー
TTUR2-M4-336及びバチルス・アルカロフィルス(Bacill
usalcalophylus) の主な性状を、表６にバチルス・アル
カロフィルス・サブスピーシス・ハロデュランス(Bacil
lus alcalophylus subsp. halodurans) 、バチルス・セ
レウス8-1 菌(Bacillus cereus 8-1,FERM2885,特公昭53
-13708号）及びバチルス・アルカロフィルス202-1 菌(B
acillus alcalophylus 202-1, FERM2674, 特公昭53-277
86号) の主な性状を示した。
チルス・エスピー TTUR 2-M4-124、バチルス・エスピー
TTUR2-M4-336及びバチルス・アルカロフィルス(Bacill
usalcalophylus) の主な性状を、表６にバチルス・アル
カロフィルス・サブスピーシス・ハロデュランス(Bacil
lus alcalophylus subsp. halodurans) 、バチルス・セ
レウス8-1 菌(Bacillus cereus 8-1,FERM2885,特公昭53
-13708号）及びバチルス・アルカロフィルス202-1 菌(B
acillus alcalophylus 202-1, FERM2674, 特公昭53-277
86号) の主な性状を示した。
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】TTUR 2-2は、好気性の有胞子細菌である
が、上記の通り種々の菌学的性質、特に生育のための至
適ｐＨが９〜１０付近のアルカリ性側に存在し、公知の
菌種とは区別されることから、これを新菌種として設定
することが適当である。
が、上記の通り種々の菌学的性質、特に生育のための至
適ｐＨが９〜１０付近のアルカリ性側に存在し、公知の
菌種とは区別されることから、これを新菌種として設定
することが適当である。
【００３１】又、一般に突然変異株は、その親株と同じ
種に属するものと考えられていることから、前記バチル
ス・エスピー TTUR 2-2(Bacillus sp. TTUR 2-2)の二次
変異株である TTUR 2-M4-124及び TTUR 2-M4-336は、い
ずれもその親株と同じ菌種に属するものと判定した。
種に属するものと考えられていることから、前記バチル
ス・エスピー TTUR 2-2(Bacillus sp. TTUR 2-2)の二次
変異株である TTUR 2-M4-124及び TTUR 2-M4-336は、い
ずれもその親株と同じ菌種に属するものと判定した。
【００３２】即ち、本発明で使用される菌は、 TTUR 2-
M4-124菌及び TTUR 2-M4-336菌に限定されるものではな
く、バチルス属に属し、コール酸を基質として１２−ケ
ト−コール酸を生産する菌であればいずれでもよい。
M4-124菌及び TTUR 2-M4-336菌に限定されるものではな
く、バチルス属に属し、コール酸を基質として１２−ケ
ト−コール酸を生産する菌であればいずれでもよい。
【００３３】本発明において使用することができる培地
としては、上記の菌が培養により増殖し得るものであれ
ば任意のものでよく、例えば炭素源としては、グルコー
ス、フラクトース、マルトース、シュクロース、グリセ
リン、澱粉、フスマ、廃糖蜜等の各種糖質原料を、窒素
源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
スティープリカー、大豆粉、菜種油粕、各種アミノ酸、
アミノ糖等の有機窒素や、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素を用いることが
できる。又、この他、微量の無機金属塩類、ビタミン
類、生長促進因子等を添加することが好ましい。
としては、上記の菌が培養により増殖し得るものであれ
ば任意のものでよく、例えば炭素源としては、グルコー
ス、フラクトース、マルトース、シュクロース、グリセ
リン、澱粉、フスマ、廃糖蜜等の各種糖質原料を、窒素
源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン
スティープリカー、大豆粉、菜種油粕、各種アミノ酸、
アミノ糖等の有機窒素や、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素を用いることが
できる。又、この他、微量の無機金属塩類、ビタミン
類、生長促進因子等を添加することが好ましい。
【００３４】培地中のコール酸濃度は、特に限定はない
が、目的とする１２−ケト−コール酸の収量、培養条件
から、１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは４０〜３００ｇ／
ｌの範囲とする。
が、目的とする１２−ケト−コール酸の収量、培養条件
から、１〜５００ｇ／ｌ、好ましくは４０〜３００ｇ／
ｌの範囲とする。
【００３５】本発明方法における培養は好気的条件下
に、例えば通気撹拌や往復振盪方法によって培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一般的に
いえば、温度２０〜４０℃、ｐＨ７〜１１、１〜６日程
度の条件で実施する。
に、例えば通気撹拌や往復振盪方法によって培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一般的に
いえば、温度２０〜４０℃、ｐＨ７〜１１、１〜６日程
度の条件で実施する。
【００３６】上記培地から目的とする１２−ケト−コー
ル酸を採取するには、まず培地中の菌及び不要成分を濾
過又は遠心分離等により分離除去し、得られた濾液又は
上清に塩酸又は硫酸を加えて酸性とする。これにより、
生成した１２−ケト−コール酸が収率良く沈澱する。次
に、この沈澱物を濾別し、再結晶操作を行うことによ
り、高純度の１２−ケト−コール酸を回収することがで
きる。
ル酸を採取するには、まず培地中の菌及び不要成分を濾
過又は遠心分離等により分離除去し、得られた濾液又は
上清に塩酸又は硫酸を加えて酸性とする。これにより、
生成した１２−ケト−コール酸が収率良く沈澱する。次
に、この沈澱物を濾別し、再結晶操作を行うことによ
り、高純度の１２−ケト−コール酸を回収することがで
きる。
【００３７】本発明方法により得られる１２−ケト−コ
ール酸は、ウォルフ・キシュナー還元反応に供すること
により、胆石溶解剤として有用なケノデオキシコール酸
に容易に変換することができる。
ール酸は、ウォルフ・キシュナー還元反応に供すること
により、胆石溶解剤として有用なケノデオキシコール酸
に容易に変換することができる。
【００３８】以下、本発明を実施例をもって説明する
が、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるもので
ないことはいうまでもない。
が、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるもので
ないことはいうまでもない。
【００３９】各実施例において、生成物の同定は、以下
の条件による薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロ
マトグラフィーにより行った。
の条件による薄層クロマトグラフィー又は高速液体クロ
マトグラフィーにより行った。
【００４０】(1) 薄層クロマトグラフィー 担体；Kieselgel 60（0.25mm厚、メルク社製） 展開溶媒；ベンゼン／イソプロパノール／酢酸(40/10/1
体積比） 発色；リンモリブデン酸−硫酸試薬（リンモリブデン酸
１ｇをメタノール20mlに溶解し、濃硫酸１mlを添加した
もの）を噴霧し、胆汁酸スポットが濃青色となるまで加
熱発色 (2) 高速液体クロマトグラフィー カラム；イナートシルＯＤＳカラム（カラムサイズ 4.6
φ×250mm 、ジーエルサイエンス製） 移動相；メタノール／精製水／リン酸(70/30/0.02M 重
量比） 流速；1.０ml／min 検出；ＲＩ
体積比） 発色；リンモリブデン酸−硫酸試薬（リンモリブデン酸
１ｇをメタノール20mlに溶解し、濃硫酸１mlを添加した
もの）を噴霧し、胆汁酸スポットが濃青色となるまで加
熱発色 (2) 高速液体クロマトグラフィー カラム；イナートシルＯＤＳカラム（カラムサイズ 4.6
φ×250mm 、ジーエルサイエンス製） 移動相；メタノール／精製水／リン酸(70/30/0.02M 重
量比） 流速；1.０ml／min 検出；ＲＩ
【００４１】
【実施例１】バチルス・エスピー TTUR 2-M4-124(Bacil
lus sp. TTUR 2-M4-124;微工研条寄第３３９４号）を以
下に示す方法で培養した。グルコース１０ｇ、ペプトン
５ｇ、イーストエキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１
ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００
mlに溶解し、又コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウム５
ｇ、炭酸ナトリウム１０ｇを精製水５００mlに溶解し、
それぞれ１２１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、
培地とした（ｐＨ１０）。
lus sp. TTUR 2-M4-124;微工研条寄第３３９４号）を以
下に示す方法で培養した。グルコース１０ｇ、ペプトン
５ｇ、イーストエキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１
ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００
mlに溶解し、又コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウム５
ｇ、炭酸ナトリウム１０ｇを精製水５００mlに溶解し、
それぞれ１２１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、
培地とした（ｐＨ１０）。
【００４２】この培地２０mlを試験管（３０φ×１９０
mm) に分注後、あらかじめ上記培地からコール酸及び水
酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地２０ml入りの試
験管で３０℃、２０時間振盪培養して増殖させた菌液0.
１mlを無菌的に接種した。その後３０℃で３日間振盪培
養した。
mm) に分注後、あらかじめ上記培地からコール酸及び水
酸化ナトリウムを除いた同一組成の培地２０ml入りの試
験管で３０℃、２０時間振盪培養して増殖させた菌液0.
１mlを無菌的に接種した。その後３０℃で３日間振盪培
養した。
【００４３】培養後、遠心分離で菌体を除去し、得られ
た培養上清に希硫酸を加えて酸性にすると、１２−ケト
−コール酸及び未変換のコール酸が沈澱した。この沈澱
物を採取し、乾燥して白色粉末0.９９９ｇを得た。この
一部をとり、高速液体クロマトグラフィーにより、コー
ル酸、１２−ケト−コール酸の生成比率を求めたとこ
ろ、コール酸1.７％、１２−ケト−コール酸９8.３％
（回収率９9.９％）であった。混合物をメタノールから
再結晶し、純粋な１２−ケト−コール酸を得た。
た培養上清に希硫酸を加えて酸性にすると、１２−ケト
−コール酸及び未変換のコール酸が沈澱した。この沈澱
物を採取し、乾燥して白色粉末0.９９９ｇを得た。この
一部をとり、高速液体クロマトグラフィーにより、コー
ル酸、１２−ケト−コール酸の生成比率を求めたとこ
ろ、コール酸1.７％、１２−ケト−コール酸９8.３％
（回収率９9.９％）であった。混合物をメタノールから
再結晶し、純粋な１２−ケト−コール酸を得た。
【００４４】
【実施例２】実施例１の菌株をバチルス・エスピー TTU
R 2-M4-336(Bacillus sp. TTUR 2-M4-336;微工研条寄第
３３９７号）とした以外は、実施例１と同様に操作し
た。生成比率は、コール酸1.８％、１２−ケト−コール
酸９8.２％（回収率９9.９％）であった。
R 2-M4-336(Bacillus sp. TTUR 2-M4-336;微工研条寄第
３３９７号）とした以外は、実施例１と同様に操作し
た。生成比率は、コール酸1.８％、１２−ケト−コール
酸９8.２％（回収率９9.９％）であった。
【００４５】
【実施例３】実施例１の培地からグルコースを除いた培
地（ｐＨ１０）を用いた以外は、実施例１と同様に操作
した。生成比率は、コール酸1.９％、１２−ケト−コー
ル酸９8.１％であった。
地（ｐＨ１０）を用いた以外は、実施例１と同様に操作
した。生成比率は、コール酸1.９％、１２−ケト−コー
ル酸９8.１％であった。
【００４６】
【実施例４】実施例２の培地からグルコースを除いた培
地（ｐＨ１０）を用いた以外は、実施例２と同様に操作
した。生成比率は、コール酸０％、１２−ケト−コール
酸１００％であった。
地（ｐＨ１０）を用いた以外は、実施例２と同様に操作
した。生成比率は、コール酸０％、１２−ケト−コール
酸１００％であった。
【００４７】
【実施例５】大豆蛋白（エスサンミート；商品名；味の
素社製）１０ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウム５ｇ、炭酸ナトリ
ウム２ｇを精製水５００mlに溶解し、それぞれ１２１
℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした（ｐ
Ｈ１0.２）。以下、実施例１と同様に操作して１２−ケ
ト−コール酸を得た。生成比率は、コール酸0.５％、１
２−ケト−コール酸９9.５％であった。
素社製）１０ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウム５ｇ、炭酸ナトリ
ウム２ｇを精製水５００mlに溶解し、それぞれ１２１
℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした（ｐ
Ｈ１0.２）。以下、実施例１と同様に操作して１２−ケ
ト−コール酸を得た。生成比率は、コール酸0.５％、１
２−ケト−コール酸９9.５％であった。
【００４８】
【実施例６】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-M4
-336を用いた以外は、実施例５と同様に操作した。生成
比率は、コール酸1.２％、１２−ケト−コール酸９8.８
％であった。
-336を用いた以外は、実施例５と同様に操作した。生成
比率は、コール酸1.２％、１２−ケト−コール酸９8.８
％であった。
【００４９】
【実施例７】実施例５の培地からリン酸一水素カリウム
及び硫酸マグネシウム・７水和物を除き、かつ炭酸ナト
リウムを３ｇとした培地（ｐＨ１0.３）を用いた以外
は、実施例５と同様に操作した。生成比率は、コール酸
０％、１２−ケト−コール酸１００％であった。
及び硫酸マグネシウム・７水和物を除き、かつ炭酸ナト
リウムを３ｇとした培地（ｐＨ１0.３）を用いた以外
は、実施例５と同様に操作した。生成比率は、コール酸
０％、１２−ケト−コール酸１００％であった。
【００５０】
【実施例８】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-M4
-336を用いた以外は、実施例７と同様に操作した。生成
比率は、コール酸0.７％、１２−ケト−コール酸９9.３
％であった。
-336を用いた以外は、実施例７と同様に操作した。生成
比率は、コール酸0.７％、１２−ケト−コール酸９9.３
％であった。
【００５１】
【実施例９】大豆蛋白（エスサンミート）１０ｇ、イー
ストエキス１ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又、コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウム５ｇ、炭酸ナト
リウム４ｇを精製水５００ｍｌに溶解し、それぞれ１２
１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした
（ｐＨ１０．２）。以下、菌株としてバチルス・エスピ
ー TTUR 2-M4-336を用いた以外は、実施例５と同様に操
作した。生成比率は、コール酸0.１％、１２−ケト−コ
ール酸９9.９％であった。
ストエキス１ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又、コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウム５ｇ、炭酸ナト
リウム４ｇを精製水５００ｍｌに溶解し、それぞれ１２
１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした
（ｐＨ１０．２）。以下、菌株としてバチルス・エスピ
ー TTUR 2-M4-336を用いた以外は、実施例５と同様に操
作した。生成比率は、コール酸0.１％、１２−ケト−コ
ール酸９9.９％であった。
【００５２】
【実施例１０】実施例９の培地から大豆蛋白（エスサン
ミート）を除き、これに代えてコーンスティープリカー
２０ｇを加え、かつ炭酸ナトリウムを１２ｇとした培地
（ｐＨ9.８）を用いた以外は、実施例９と同様に操作し
た。生成比率は、コール酸0.１％、１２−ケト−コール
酸９9.９％であった。
ミート）を除き、これに代えてコーンスティープリカー
２０ｇを加え、かつ炭酸ナトリウムを１２ｇとした培地
（ｐＨ9.８）を用いた以外は、実施例９と同様に操作し
た。生成比率は、コール酸0.１％、１２−ケト−コール
酸９9.９％であった。
【００５３】
【実施例１１】実施例５の培地から大豆蛋白（エスサン
ミート）を除き、これに代えて大豆蛋白（アジプロン E
3;商品名; 味の素社製) １０ｇを加え、かつ炭酸ナトリ
ウムを２ｇとした培地（ｐＨ１0.０）を用い、培養日数
を２日間とした以外は、実施例５と同様に操作した。生
成比率は、コール酸0.２％、１２−ケト−コール酸９9.
８％であった。
ミート）を除き、これに代えて大豆蛋白（アジプロン E
3;商品名; 味の素社製) １０ｇを加え、かつ炭酸ナトリ
ウムを２ｇとした培地（ｐＨ１0.０）を用い、培養日数
を２日間とした以外は、実施例５と同様に操作した。生
成比率は、コール酸0.２％、１２−ケト−コール酸９9.
８％であった。
【００５４】
【実施例１２】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336を用い、培養日数を３日間とした以外は、実施例
１１と同様に操作した。生成比率は、コール酸0.４％、
１２−ケト−コール酸９9.６％であった。
M4-336を用い、培養日数を３日間とした以外は、実施例
１１と同様に操作した。生成比率は、コール酸0.４％、
１２−ケト−コール酸９9.６％であった。
【００５５】
【実施例１３】イーストエキス５ｇ、リン酸一水素カリ
ウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.２ｇを精製水
５００mlに溶解し、又コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウ
ム５ｇ、炭酸ナトリウム４ｇを精製水５００mlに溶解
し、それぞれ１２１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合
し、培地とした（ｐＨ9.７）。以下、実施例１と同様に
操作して１２−ケト−コール酸を得た。生成比率は、コ
ール酸0.４％、１２−ケト−コール酸９9.６％であっ
た。
ウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.２ｇを精製水
５００mlに溶解し、又コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウ
ム５ｇ、炭酸ナトリウム４ｇを精製水５００mlに溶解
し、それぞれ１２１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合
し、培地とした（ｐＨ9.７）。以下、実施例１と同様に
操作して１２−ケト−コール酸を得た。生成比率は、コ
ール酸0.４％、１２−ケト−コール酸９9.６％であっ
た。
【００５６】
【実施例１４】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336を用いた以外は、実施例１３と同様に操作した。
生成比率は、コール酸0.１％、１２−ケト−コール酸９
9.９％であった。
M4-336を用いた以外は、実施例１３と同様に操作した。
生成比率は、コール酸0.１％、１２−ケト−コール酸９
9.９％であった。
【００５７】
【実施例１５】実施例１４の培地からイーストエキスを
除き、これに代えて大豆ペプチド(D-4; 商品名; 富士製
油社製) ５ｇを加えた培地（ｐＨ9.８）を用いた以外
は、実施例１４と同様に操作した。生成比率は、コール
酸0.８％、１２−ケト−コール酸９9.２％であった。
除き、これに代えて大豆ペプチド(D-4; 商品名; 富士製
油社製) ５ｇを加えた培地（ｐＨ9.８）を用いた以外
は、実施例１４と同様に操作した。生成比率は、コール
酸0.８％、１２−ケト−コール酸９9.２％であった。
【００５８】
【実施例１６】実施例１３の培地からイーストエキスを
除き、これに代えて大豆ペプチド(D-2; 商品名; 富士製
油社製) ５ｇを加え、かつ炭酸ナトリウムを２ｇとした
培地（ｐＨ9.２）を用いた以外は、実施例１３と同様に
操作した。生成比率は、コール酸0.１％、１２−ケト−
コール酸９9.９％であった。
除き、これに代えて大豆ペプチド(D-2; 商品名; 富士製
油社製) ５ｇを加え、かつ炭酸ナトリウムを２ｇとした
培地（ｐＨ9.２）を用いた以外は、実施例１３と同様に
操作した。生成比率は、コール酸0.１％、１２−ケト−
コール酸９9.９％であった。
【００５９】
【実施例１７】グルコース１０ｇ、ペプトン５ｇ、イー
ストエキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又コール酸１００ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭酸ナ
トリウム１０ｇを精製水５００mlに溶解し、それぞれ１
２１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした
（ｐＨ１０）。
ストエキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又コール酸１００ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭酸ナ
トリウム１０ｇを精製水５００mlに溶解し、それぞれ１
２１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした
（ｐＨ１０）。
【００６０】この培地２０mlを試験管（３０φ×１９０
mm) に分注後、あらかじめ同一組成の培地２０ml入りの
試験管で３０℃、２４時間振盪培養して増殖させたバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M4-124菌液0.２mlを無菌的に接
種した。その後３０℃で４日間振盪培養した。
mm) に分注後、あらかじめ同一組成の培地２０ml入りの
試験管で３０℃、２４時間振盪培養して増殖させたバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M4-124菌液0.２mlを無菌的に接
種した。その後３０℃で４日間振盪培養した。
【００６１】以下実施例１と同様に操作して１２−ケト
−コール酸を得た。生成比率は、コール酸3.３％、１２
−ケト−コール酸９6.７％であった。
−コール酸を得た。生成比率は、コール酸3.３％、１２
−ケト−コール酸９6.７％であった。
【００６２】
【実施例１８】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336を用いた以外は、実施例１７と同様に操作した。
生成比率は、コール酸2.７％、１２−ケト−コール酸９
7.３％であった。
M4-336を用いた以外は、実施例１７と同様に操作した。
生成比率は、コール酸2.７％、１２−ケト−コール酸９
7.３％であった。
【００６３】
【実施例１９】グルコース１０ｇ、ペプトン５ｇ、イー
ストエキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウム５ｇ、炭酸ナトリ
ウム１０ｇを精製水５００mlに溶解し、それぞれ１２１
℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした（ｐ
Ｈ１０）。
ストエキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又コール酸５０ｇ、水酸化ナトリウム５ｇ、炭酸ナトリ
ウム１０ｇを精製水５００mlに溶解し、それぞれ１２１
℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした（ｐ
Ｈ１０）。
【００６４】この培地２０mlを試験管（３０φ×１９０
mm) に分注後、あらかじめ同一組成の培地２０ml入りの
試験管で３０℃、２４時間間振盪培養して増殖させたバ
チルス・エスピー TTUR 2-M4-124菌液0.２mlを無菌的に
接種し、３０℃で２日間振盪培養した。以下、実施例１
と同様に操作して１２−ケト−コール酸を得た。生成比
率は、コール酸0.７％、１２−ケト−コール酸９9.３％
であった。
mm) に分注後、あらかじめ同一組成の培地２０ml入りの
試験管で３０℃、２４時間間振盪培養して増殖させたバ
チルス・エスピー TTUR 2-M4-124菌液0.２mlを無菌的に
接種し、３０℃で２日間振盪培養した。以下、実施例１
と同様に操作して１２−ケト−コール酸を得た。生成比
率は、コール酸0.７％、１２−ケト−コール酸９9.３％
であった。
【００６５】
【実施例２０】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336を用いた以外は、実施例１９と同様に操作した。
生成比率は、コール酸0.８％、１２−ケト−コール酸９
9.２％であった。
M4-336を用いた以外は、実施例１９と同様に操作した。
生成比率は、コール酸0.８％、１２−ケト−コール酸９
9.２％であった。
【００６６】
【実施例２１】グルコース１０ｇ、ペプトン５ｇ、イー
ストエキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又コール酸１５０ｇ、水酸化ナトリウム１５ｇ、炭酸ナ
トリウム１０ｇを精製水５００mlに溶解し、それぞれ１
２１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした
（ｐＨ１０）。
ストエキス５ｇ、リン酸一水素カリウム１ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.２ｇを精製水５００mlに溶解し、
又コール酸１５０ｇ、水酸化ナトリウム１５ｇ、炭酸ナ
トリウム１０ｇを精製水５００mlに溶解し、それぞれ１
２１℃、１５分間滅菌した。冷却後混合し、培地とした
（ｐＨ１０）。
【００６７】この培地２０mlを試験管（３０φ×１９０
mm) に分注後、あらかじめ同一組成の培地２０ml入りの
試験管で３０℃、２４時間振盪培養して増殖させたバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M4-124菌液0.２mlを無菌的に接
種した。その後３０℃で６日間振盪培養した。以下、実
施例１と同様に操作して１２−ケト−コール酸を得た。
生成比率は、コール酸１7.３％、１２−ケト−コール酸
８2.７％であった。
mm) に分注後、あらかじめ同一組成の培地２０ml入りの
試験管で３０℃、２４時間振盪培養して増殖させたバチ
ルス・エスピー TTUR 2-M4-124菌液0.２mlを無菌的に接
種した。その後３０℃で６日間振盪培養した。以下、実
施例１と同様に操作して１２−ケト−コール酸を得た。
生成比率は、コール酸１7.３％、１２−ケト−コール酸
８2.７％であった。
【００６８】
【実施例２２】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336を用いた以外は、実施例２１と同様に操作した。
生成比率は、コール酸１5.２％、１２−ケト−コール酸
８4.８％であった。
M4-336を用いた以外は、実施例２１と同様に操作した。
生成比率は、コール酸１5.２％、１２−ケト−コール酸
８4.８％であった。
【００６９】
【実施例２３】グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、イ
ーストエキス１０ｇ、リン酸一水素カリウム２ｇ、硫酸
マグネシウム・７水和物0.４ｇを精製水１０００mlに溶
解し、又コール酸１００ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、
炭酸ナトリウム２０ｇを精製水１０００mlに溶解し、そ
れぞれ１２１℃、１５分間滅菌した。冷却後、５ｌ容の
卓上型ジャーファーメンター装置内で混合し、培地とし
た（ｐＨ１０）。
ーストエキス１０ｇ、リン酸一水素カリウム２ｇ、硫酸
マグネシウム・７水和物0.４ｇを精製水１０００mlに溶
解し、又コール酸１００ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、
炭酸ナトリウム２０ｇを精製水１０００mlに溶解し、そ
れぞれ１２１℃、１５分間滅菌した。冷却後、５ｌ容の
卓上型ジャーファーメンター装置内で混合し、培地とし
た（ｐＨ１０）。
【００７０】あらかじめ上記培地からコール酸及び水酸
化ナトリウムを除いた同一組成の培地２０ml入りの試験
管で３０℃、２４時間振盪培養して増殖させたバチルス
・エスピー TTUR 2-M4-124菌液４０mlをこの培地に無菌
的に接種した。その後、通気量２ｌ／min 、３０℃で３
日間撹拌(300rpm)培養した。
化ナトリウムを除いた同一組成の培地２０ml入りの試験
管で３０℃、２４時間振盪培養して増殖させたバチルス
・エスピー TTUR 2-M4-124菌液４０mlをこの培地に無菌
的に接種した。その後、通気量２ｌ／min 、３０℃で３
日間撹拌(300rpm)培養した。
【００７１】培養後、遠心分離(3500rpm×15min)で菌体
を除去し、得られた培養上清に希硫酸を加えてｐＨ2.５
にすると、１２−ケト−コール酸及び未変換のコール酸
が沈澱した。この沈澱物を濾別、水洗し、得られた結晶
を５０℃で乾燥して白色粉末９9.２ｇを得た。この一部
をとり、高速液体クロマトグラフィーにより、コール
酸、１２−ケト−コール酸の生成比率を求めたところ、
コール酸1.１％、１２−ケト−コール酸９8.９％（回収
率９9.２％）であった。
を除去し、得られた培養上清に希硫酸を加えてｐＨ2.５
にすると、１２−ケト−コール酸及び未変換のコール酸
が沈澱した。この沈澱物を濾別、水洗し、得られた結晶
を５０℃で乾燥して白色粉末９9.２ｇを得た。この一部
をとり、高速液体クロマトグラフィーにより、コール
酸、１２−ケト−コール酸の生成比率を求めたところ、
コール酸1.１％、１２−ケト−コール酸９8.９％（回収
率９9.２％）であった。
【００７２】
【実施例２４】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336を用いた以外は、実施例２３と同様に操作した。
生成比率は、コール酸0.４％、１２−ケト−コール酸９
9.６％（回収率９8.９％）であった。
M4-336を用いた以外は、実施例２３と同様に操作した。
生成比率は、コール酸0.４％、１２−ケト−コール酸９
9.６％（回収率９8.９％）であった。
【００７３】
【実施例２５】大豆蛋白（エスサンミート）２０ｇを精
製水１０００mlに溶解し、又コール酸１００ｇ、水酸化
ナトリウム１０ｇ、炭酸ナトリウム６ｇを精製水１００
０mlに溶解し、それぞれ１２１℃、１５分間滅菌した。
冷却後、５ｌ容の卓上型ジャーファーメンター装置内で
混合し、培地とした（ｐＨ１0.４）。
製水１０００mlに溶解し、又コール酸１００ｇ、水酸化
ナトリウム１０ｇ、炭酸ナトリウム６ｇを精製水１００
０mlに溶解し、それぞれ１２１℃、１５分間滅菌した。
冷却後、５ｌ容の卓上型ジャーファーメンター装置内で
混合し、培地とした（ｐＨ１0.４）。
【００７４】あらかじめ上記培地からコール酸及び水酸
化ナトリウムを除いた同一組成の培地２０ml入りの試験
管で３０℃、２４時間振盪培養して増殖させたバチルス
・エスピー TTUR 2-M4-336菌液４０mlをこの培地に無菌
的に接種した。その後、通気量２ｌ／min 、３０℃で３
日間撹拌(300rpm)培養した。途中、消泡剤（エイノー
ル；商品名；バイオット社製）を微量添加した。以下、
実施例２３と同様に操作して１２−ケト−コール酸を得
た。生成比率は、コール酸0.７％、１２−ケト−コール
酸９9.３％（回収率９9.２％）であった。
化ナトリウムを除いた同一組成の培地２０ml入りの試験
管で３０℃、２４時間振盪培養して増殖させたバチルス
・エスピー TTUR 2-M4-336菌液４０mlをこの培地に無菌
的に接種した。その後、通気量２ｌ／min 、３０℃で３
日間撹拌(300rpm)培養した。途中、消泡剤（エイノー
ル；商品名；バイオット社製）を微量添加した。以下、
実施例２３と同様に操作して１２−ケト−コール酸を得
た。生成比率は、コール酸0.７％、１２−ケト−コール
酸９9.３％（回収率９9.２％）であった。
【００７５】
【実施例２６】大豆蛋白（アジプロン E3)２０ｇ、リン
酸一水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.
４ｇを精製水１０００mlに溶解し、又コール酸１００
ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭酸ナトリウム５ｇを精
製水１０００mlに溶解し、それぞれ１２１℃、１５分間
滅菌した。冷却後、５ｌ容の卓上型ジャーファーメンタ
ー装置内で混合し、培地とした（ｐＨ１0.５）。以下、
培養日数を２日間とした以外は実施例２３と同様に操作
して１２−ケト−コール酸を得た。生成比率は、コール
酸0.４％、１２−ケト−コール酸９9.６％（回収率９9.
８％）であった。
酸一水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.
４ｇを精製水１０００mlに溶解し、又コール酸１００
ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭酸ナトリウム５ｇを精
製水１０００mlに溶解し、それぞれ１２１℃、１５分間
滅菌した。冷却後、５ｌ容の卓上型ジャーファーメンタ
ー装置内で混合し、培地とした（ｐＨ１0.５）。以下、
培養日数を２日間とした以外は実施例２３と同様に操作
して１２−ケト−コール酸を得た。生成比率は、コール
酸0.４％、１２−ケト−コール酸９9.６％（回収率９9.
８％）であった。
【００７６】
【実施例２７】培養途中、消泡剤（エイノール）を微量
添加し、菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-M4-336
を用い、培養日数を３日間とした以外は、実施例２６と
同様に操作した。生成比率は、コール酸0.４％、１２−
ケト−コール酸９9.６％（回収率９9.２％）であった。
添加し、菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-M4-336
を用い、培養日数を３日間とした以外は、実施例２６と
同様に操作した。生成比率は、コール酸0.４％、１２−
ケト−コール酸９9.６％（回収率９9.２％）であった。
【００７７】
【実施例２８】大豆蛋白（アジプロン E3)１０ｇ、イー
ストエキス１ｇ、リン酸一水素カリウム２ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.４ｇを精製水１０００mlに溶解
し、又コール酸１００ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭
酸ナトリウム６ｇを精製水１０００mlに溶解し、それぞ
れ１２１℃、１５分間滅菌した。冷却後、５ｌ容の卓上
型ジャーファーメンター装置内で混合し、培地とした
（ｐＨ１0.７）。以下、実施例２６と同様に操作した。
生成比率は、コール酸0.６％、１２−ケト−コール酸９
9.４％（回収率９8.９％）であった。
ストエキス１ｇ、リン酸一水素カリウム２ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.４ｇを精製水１０００mlに溶解
し、又コール酸１００ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭
酸ナトリウム６ｇを精製水１０００mlに溶解し、それぞ
れ１２１℃、１５分間滅菌した。冷却後、５ｌ容の卓上
型ジャーファーメンター装置内で混合し、培地とした
（ｐＨ１0.７）。以下、実施例２６と同様に操作した。
生成比率は、コール酸0.６％、１２−ケト−コール酸９
9.４％（回収率９8.９％）であった。
【００７８】
【実施例２９】培養途中、消泡剤（エイノール）を微量
添加し、菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-M4-336
を用い、培養日数を３日間とした以外は、実施例２８と
同様に操作した。生成比率は、コール酸0.６％、１２−
ケト−コール酸９9.４％（回収率９9.４％）であった。
添加し、菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-M4-336
を用い、培養日数を３日間とした以外は、実施例２８と
同様に操作した。生成比率は、コール酸0.６％、１２−
ケト−コール酸９9.４％（回収率９9.４％）であった。
【００７９】
【実施例３０】大豆蛋白（アジプロン E3)１０ｇ、イー
ストエキス１ｇ、リン酸一水素カリウム２ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.４ｇを精製水１０００mlに溶解
し、又コール酸１００ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭
酸ナトリウム５ｇを精製水１０００mlに溶解した。これ
らを滅菌することなく、５ｌ容の卓上型ジャーファーメ
ンター装置内で混合し、培地とした（ｐＨ１0.４）。
ストエキス１ｇ、リン酸一水素カリウム２ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.４ｇを精製水１０００mlに溶解
し、又コール酸１００ｇ、水酸化ナトリウム１０ｇ、炭
酸ナトリウム５ｇを精製水１０００mlに溶解した。これ
らを滅菌することなく、５ｌ容の卓上型ジャーファーメ
ンター装置内で混合し、培地とした（ｐＨ１0.４）。
【００８０】あらかじめ上記培地からコール酸及び水酸
化ナトリウムを除いた同一組成の培地２０ml入りの試験
管で３０℃、２０時間振盪培養して増殖させたバチルス
・エスピー TTUR 2-M4-124菌液４０mlをこの培地に接種
した。その後、通気量２ｌ／min 、３０℃で３日間撹拌
(300rpm)培養した。
化ナトリウムを除いた同一組成の培地２０ml入りの試験
管で３０℃、２０時間振盪培養して増殖させたバチルス
・エスピー TTUR 2-M4-124菌液４０mlをこの培地に接種
した。その後、通気量２ｌ／min 、３０℃で３日間撹拌
(300rpm)培養した。
【００８１】以下、実施例２３と同様に操作した。生成
比率は、コール酸０％、１２−ケト−コール酸１０0.０
％（回収率９9.１％）であった。
比率は、コール酸０％、１２−ケト−コール酸１０0.０
％（回収率９9.１％）であった。
【００８２】
【実施例３１】菌株としてバチルス・エスピー TTUR 2-
M4-336を用いた以外は、実施例３０と同様に操作した。
生成比率は、コール酸1.５％、１２−ケト−コール酸９
8.５％（回収率９8.８％）であった。
M4-336を用いた以外は、実施例３０と同様に操作した。
生成比率は、コール酸1.５％、１２−ケト−コール酸９
8.５％（回収率９8.８％）であった。
Claims (4)
- 【請求項１】 バチルス属に属し、３α，７α−ジヒド
ロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸生産能を有するバ
チルス・エスピー TTUR 2-M4-124。 - 【請求項２】 バチルス属に属し、３α，７α−ジヒド
ロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸生産能を有するバ
チルス・エスピー TTUR 2-M4-336。 - 【請求項３】 バチルス属に属し、３α，７α−ジヒド
ロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸生産能を有する微
生物を３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コ
ラン酸を含む栄養培地で培養して培養物中に３α，７α
−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸を生成せ
しめ、これを採取することを特徴とする３α，７α−ジ
ヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法。 - 【請求項４】 栄養培地のｐＨが７〜１１であることを
特徴とする請求項３記載の３α，７α−ジヒドロキシ−
１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法。
Priority Applications (9)
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|---|---|---|---|
| JP03277799A JP3082973B2 (ja) | 1991-10-24 | 1991-10-24 | ３α，７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法 |
| AU27144/92A AU662359B2 (en) | 1991-10-24 | 1992-10-20 | Novel microorganisms and a process for preparing 3alpha, 7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid |
| US07/964,192 US5451510A (en) | 1991-10-24 | 1992-10-21 | Process for preparing 3α, 7α-dihydroxy-12-keto-5β-cholanic acid using bacillus spp. FERM BP-3394 and FERM BP-3397 |
| CA002081057A CA2081057A1 (en) | 1991-10-24 | 1992-10-21 | Novel microorganisms and a process for preparing 3.alpha., 7.alpha.-dihydroxy-12keto-5.beta.-cholanic acid |
| ES92309730T ES2113928T3 (es) | 1991-10-24 | 1992-10-23 | Nuevos microorganismos y un procedimiento para preparar acido 3-alfa,7-alfa-dihidroxi-12-ceto-5-beta-colanico. |
| DE69225039T DE69225039T2 (de) | 1991-10-24 | 1992-10-23 | Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von 3-Alpha, 7-Alpha-Dihydroxy-12-Keto-Cholansäure |
| KR1019920019605A KR0169498B1 (ko) | 1991-10-24 | 1992-10-23 | 신규 미생물 및 3알파, 7알파-디히드록시-12-케토-5베타-콜란산의 제조방법 |
| EP92309730A EP0539216B1 (en) | 1991-10-24 | 1992-10-23 | Novel microorganisms and a process for preparing 3alpha, 7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid |
| AT92309730T ATE164881T1 (de) | 1991-10-24 | 1992-10-23 | Mikroorganismen und verfahren zur herstellung von 3-alpha, 7-alpha-dihydroxy-12-keto-cholansäure |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03277799A JP3082973B2 (ja) | 1991-10-24 | 1991-10-24 | ３α，７α−ジヒドロキシ−１２−ケト−５β−コラン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05111391A true JPH05111391A (ja) | 1993-05-07 |
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Country Status (9)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0539216B1 (ja) |
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| KR (1) | KR0169498B1 (ja) |
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| AU (1) | AU662359B2 (ja) |
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| US2341110A (en) * | 1939-05-12 | 1944-02-08 | Schering Corp | Process for the manufacture of ketosteroids |
| US2905592A (en) * | 1955-07-27 | 1959-09-22 | Pfizer & Co C | Oxidation of steroids by mycobacteria |
| US2992973A (en) * | 1958-08-12 | 1961-07-18 | Takeda Pharmaceutical | Dehydrogenation of steroids by azotobacter microorganisms |
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| DE1904544C3 (de) * | 1969-01-27 | 1978-05-18 | Schering Ag, 1000 Berlin Und 4619 Bergkamen | Verfahren zur mikrobiologischen Umwandlung von 3 ß-Hydroxy-5,6- epoxysteroiden in 6-Hydroxy-3-KetoA<·4 -Steroide |
| US3801460A (en) * | 1970-12-18 | 1974-04-02 | Merck & Co Inc | Simultaneous steroid oxygenation and 1-dehydrogenation with bacillus cereus |
| JPS578796A (en) * | 1980-06-17 | 1982-01-18 | Kuraray Co Ltd | Preparation of 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid and/or its salt |
| JPS578781A (en) * | 1980-12-29 | 1982-01-18 | Kuraray Co Ltd | Microorganism producing 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-keto-5beta-cholanic acid |
| DE3241829A1 (de) * | 1982-11-09 | 1984-05-10 | Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen | Biokatalysator |
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| JPS61282099A (ja) * | 1985-06-07 | 1986-12-12 | Showa Denko Kk | １２−ケト−３α，７α−ジヒドロキシコラン酸の製造方法 |
| CA2070720A1 (en) * | 1991-06-12 | 1992-12-13 | Hiromi Kimura | Microorganisms having a conversion ability to bile acids and method for preparing bile acids |
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-
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