DE69228438T2

DE69228438T2 - Mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Trans-4-hydroxy-L-Prolin

Info

Publication number: DE69228438T2
Application number: DE69228438T
Authority: DE
Inventors: Kouhei Furuya; Tsuyoshi Hosoya; Tatsuji Matsuoka; Nobufusa Serizawa
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1991-12-17
Filing date: 1992-12-17
Publication date: 1999-09-02
Anticipated expiration: 2012-12-18
Also published as: GR3030112T3; ES2129438T3; IL104111A; DK0547898T3; IL104111A0; EP0547898B1; CA2085522A1; KR930013124A; KR960016874B1; DE69228438D1; EP0547898A3; ATE176803T1; US5334517A; JPH05236980A; TW223660B; US5407826A; EP0547898A2; HK1010740A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin, insbesondere durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Clonostachys, Gliocladium oder Nectria.
Der systematische Name für trans-4-Hydroxy-L-prolin ist (2S, 4R)- (-)-4-Hydroxypyrrolidin-2-carbonsäure; diese Verbindung wird jedoch, wie es auf diesem Gebiet üblich ist, hier durch ihren Trivialnamen »trans-4- Hydroxy-L-prolin« bezeichnet. Es handelt es sich um eine bekannte Verbindung, die kommerziell für die Synthese einer Anzahl von Verbindungen, insbesondere Carbapenem-Antibiotika, verwendet wird, und sie wird durch die Formel (I) dargestellt:
Ausgehend von trans-4-Hydroxy-L-prolin ist es beispielsweise möglich, N-p-Nitrobenzyloxycarbonyl-3-mercaptopyrrolidin oder andere synthetische Zwischenprodukte zu synthetisieren [Heterocycles, 24, Nr. 5 (1986)], und diese Verbindungen können wiederum zur Herstellung nützlicher Carbapenem-Antibiotika, wie (5R, 6S, 8R)-6-(1-Hydroxyethyl)-2- (pyrrolidin-3-ylthio)-2-carbapenem-3-carbonsäure verwendet werden (japanische Patentveröffentlichung Sho 61-29357).
trans-4-Hydroxy-L-prolin ist einer der Proteinbestandteile von Collagen und Elastin, wobei beide Proteine sind, die im Bindegewebe von Tieren vorkommen. Es kommt auch im epidermalen Gewebe des Regenwurms vor, und zwar in einer Menge, die bis zum zehnfachen des Gehalts an Prolin betragen kann. Da es in einer derartig großen Menge in Collagen vorkommt, wird es üblicherweise aus einem Gelatinehydrolysat durch Extraktions- und Reinigungsverfahren hergestellt. Es ist auch berichtet worden, daß es in bestimmten höheren Pflanzen, wie den Blättern von Sandelholzbäumen der Gattung Santalum, vorkommt [Biochem. J. 117, 1013 (1970)]. Das Vorhandensein von freiem trans-4-Hydroxy-L-prolin in Mikroorganismen ist bisher jedoch nicht festgestellt worden.
JP-A-3266995 beschreibt die Synthese von 4-Hydroxy-L-prolin durch Kultivieren eines gentechnisch veränderten Stamms von E. coli, der eine rekombinante DNA enthält, die ein Gen umfaßt, das aus einem Stamm von E. coli abgeleitet ist und für γ-Glutamylkinase codiert, die von der Rückkopplungshemmung durch L-Prolin befreit ist. Die Kultivierung eines natürlich vorkommenden E. coli-Stamms ergibt jedoch nur vernachlässigbare Mengen an 4-Hydroxy-L-prolin.
Wir haben nun festgestellt, daß Mikroorganismen der Gattungen Clonostachys, Gliocladium und Nectria trans-4-Hydroxy-L-prolin bilden können, das aus dem Kulturmedium in nützlichen Mengen gewonnen werden kann.
Die vorliegende Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin durch Kultivierung eines trans-4-Hydroxy-L- prolin bildenden Mikroorganismus, vorzugsweise der Gattung Clonostachys, der Gattung Gliocladium oder der Gattung Nectria, und Abtrennung des resultierenden trans-4-Hydroxy-L-prolins aus der Kulturbrühe, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß der trans-4-Hydroxy-L-prolin bildende Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, bei dem es sich um eine Spezies der Gattung Clonostachys, der Gattung Gliocladium oder der Gattung Nectria handelt.
Die Technologie, die die Herstellung von wertvollen Materialien unter Verwendung von Mikroorganismen betrifft, ist seit einiger Zeit bekannt und gut eingeführt. Es ist daher von erheblichem kommerziellem Wert, eine mikrobielle Quelle für trans-4-Hydroxy-L-prolin aufzufinden, was bisher nicht gelungen ist.
Die Mikroorganismen, von denen wir bis jetzt festgestellt haben, daß sie nützliche Mengen des gewünschten trans-4-Hydroxy-L-prolins herstellen, sind Mitglieder der Gattungen Clonostachys, Gliocladium und Nectria und insbesondere die Stämme, die wir als Clonostachys cylindrospora SANK 14591, Clonostachys sp. SANK 18192, Gliocladium sp. SANK 18092 und Nectria gliocladioides Smalley et Hansen SANK 17992 identifiziert haben.
Wir bevorzugen es insbesondere, als Mikroorganismus für die Herstellung des gewünschten trans-4-Hydroxy-L-prolins einen Stamm der Spezies Clonostachys cylindrospora und vorzugsweise den neu isolierten Stamm, der als Clonostachys cylindrospora SANK 14591 identifiziert wurde, einzusetzen. Dieser Stamm wurde aus gefallenen Blättern isoliert, die im April 1991 in der City of Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan, gesammelt wurden.
Clonostachys cylindrospora SANK 14591 wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 25. November 1991 unter der Zugangsnummer FERM BP-3661 hinterlegt.
Einzelheiten der mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stamms sind wie folgt:
Kolonien auf modifiziertem Weitzman und Silva-Hunter-Agarmedium, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist, erzielten einen Durchmesser von 29 mm nach Wachstum für 7 Tage bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie war flach und pulvrig, teilweise aufgrund der spärlichen Bildung von aerialen Hyphae. Die gesamte Oberfläche zeigte eine nahezu weiße Färbung. Die hervorragende Bildung von Conidien wurde auf fast der gesamten Oberfläche beobachtet. Nach zusätzlicher Kultivierung für 1 Woche oder länger änderte sich die gesamte Oberfläche, so daß sie eine blasse Cremefarbe zeigte, und die Teile, die große Zahlen an Conidien bildeten, zeigten eine blasse orange Farbe.
Kolonien auf Malz-Agarmedium, dessen Zusammensetzung nachstehend angeben ist, erzielten einen Durchmesser von 30 mm nach Wachstum für 7 Tage bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie war flach und pulvrig, und zwar teilweise aufgrund der spärlichen Bildung von aerialen Hyphae. Die gesamte Oberfläche zeigte eine nahezu weiße Färbung.
Kolonien auf Kartoffel-Dextrose-Agarmedium, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist, erzielten einen Durchmesser von 29 mm nach Wachstum für 7 Tage bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie war leicht hervorstehend, und zwar aufgrund der reichen und dichten Bildung von Hyphae, und die Oberfläche war flaumig. Der zentrale Teil der Kolonie erschien pulvrig, und zwar aufgrund der Bildung von Conidiophoren. Fast die gesamte Oberfläche wies eine weiße Farbe auf, und die rückseitige Oberfläche war blaßgelb. Die Farbe war jedoch tief und dunkel-gelblich in den zentralen Bereichen.
Kolonien auf Lignin-Zellulose-Agarmedium, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist, erzielten einen Durchmesser von 28 mm nach Wachstum für 7 Tage bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie war flach. Die gesamte Oberfläche mit Ausnahme des zentralen Bereiches war pulvrig, und zwar aufgrund der Bildung von aerialen Hyphae. Der zentrale Bereich wurde bei weiterer Kultivierung flaumig. Die gesamte Oberfläche war von weißer Farbe, und die rückseitige Oberfläche war leicht gelblich.
Die Conidienbildung war auf Lignin-Zellulose-Agarmedium nach Kultivierung für 10 Tage bei 25ºC besonders gut. Die mikroskopische Morphologie auf Lignin-Zellulose-Agarmedium nach Kultivierung für 14 Tage bei 25ºC war wie folgt.
Die Conidienbildung war dicht im zentralen Bereich der Kolonie, wurde jedoch spärlich hin zum Rand. Die Art der Bildung war phialidisch. Es wurden zwei Arten von Conidiophoren gebildet, wobei eine an die von Verticillium spp. erinnerte und die andere an die von Penicillium spp. erinnerte. Beide Arten von Conidiophoren waren dünn, und die Oberflächen waren glatt und hyalin. Bei den Conidiophoren vom Verticillium-Typ verzweigten sich die Phialiden in drei oder vier Richtungen. Die Phialiden waren nadelartig und variierten in der Größe von 18,5 bis 45 · 1,5 bis 3,5 um. Die Conidien waren in der Form elliptisch bis oval, monozellulär und hyalin, und variierten in der Größe von 4 bis 8,5 · 1,5 bis 3,5 um. Die Bildung der Conidien war auf die Phialiden unter Bildung von Tropfen konzentriert. In den Conidiophoren vom Penicillium-Typ verzweigten sich Conidiophoren in mehrere Richtungen am oberen Ende, waren hinsichtlich der Form flaschenartig und hatten Phialiden am Ende. Die Phialiden waren hinsichtlich der Form flaschenartig, waren nahe dem basalen Bereich leicht geschwollen und hatten eine Größe von 8,5 bis 12,5 · 2,5 um. Die Conidien waren monozellulär, hyalin, gerade oder leicht gebogen-zylindrisch hinsichtlich der Form und hatten eine Größe von 6 oder 6,5 bis 8,0 oder 10 · 1,5 bis 2,5 um. Die Conidien wurden schräg und verbunden zu Stapeln am oberen Ende der Phialiden gebildet, und zylindrische Ketten wurden auf den Conidiophoren gebildet.
Diese charakteristischen Eigenschaften wurden mit denen von bekannten Stämmen verglichen, und es wurde festgestellt, daß die charakteristischen Eigenschaften dieses neuen Stamms gut mit denen von Clonostachys cylindrospora Arnaud übereinstimmten, wie sie von K. Tsubaki in Transactions of the Microbiological Society of Japan, 4 (4), 84 (1963) angegeben wurden. Dementsprechend wird der vorliegende Stamm als identisch mit dem bekannten Stamm Clonostachys cylindrospora Arnaud angesehen.
Ein weiterer Stamm der Gattung Clonostachys, nämlich Clonostachys sp. SANK 18192, ist ebenfalls ein bevorzugter Mikroorganismus für die Herstellung des gewünschten trans-4-Hydroxy-L-prolins. Dieser Mikroorganismus wurde aus verrotteten Früchten der Spezies Aesculus isoliert, die im September 1991 in Sugadaira, Nagano Prefecture, gesammelt wurden.
Clonostachys sp. SANK 18192 wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 3. Dezember 1992 unter der Zugangsnummer FERM BP-4096 hinterlegt.
Dieser Stamm weist die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften auf.
Kolonien auf modifiziertem Weitzman und Silva-Hunter-Agarmedium, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist, erreichten einen Durchmesser von 2,5 cm nach 7 Tagen Wachstum bei 25ºC. Die Kolonie entwickelte geringes aeriales Mycelium, und myceliale Büschel entwickelten sich hin zum Rand der Kolonie, die dünn und vollständig war, was zu einer pulvrigen Oberfläche führte. Sowohl die obere Oberfläche als auch die Rückseite der Kolonie waren von weißer Farbe, und die Kolonie war dünn.
Auf Kartoffel-Dextrose-Agarmedium mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung erreichten die Kolonien einen Durchmesser von 3,2 cm nach Wachstum für 7 Tage bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie war flockig, und die gesamte Kolonie war recht dünn bei geringer Bildung von mycelialen Büscheln. Der Rand der Kolonie war ebenfalls dünn, jedoch vollständig. Die obere Oberfläche der Kolonie zeigte eine weiße Farbe, wobei jedoch die rückseitige Oberfläche eine hellgelbe Farbe zeigte.
Teleomorphe dieses Stamms wurden auf keinem Medium beobachtet.
Die Bildung von Conidien auf der Kolonie erfolgte auf eine phialidische Art, wobei zwei Arten von Conidiophoren gebildet wurden. Die erste Art erinnerte an die Conidiophoren von Verticillium spp., und die zweite Art erinnerte an die Conidiophoren von Penicillium spp. Die Wände beider Arten von Conidiophoren waren dünn, und die Oberfläche beider Arten war glatt und hyalin. In den Conidiophoren vom Verticillium-Typ verzweigten die Phialiden in drei oder vier Richtungen. Die Phialiden waren nadelartig und variierten in der Größe von 16,5 bis 30 · 2,5 bis 3,5 um. Die Bildung der Conidien war auf die Phialiden unter Bildung von Tropfen konzentriert. Bei den Conidiophoren vom Penicillium-Typ verzweigten die Conidiphoren in mehreren Richtungen am oberen Ende, wiesen eine besenartige Form auf und hatten Phialiden am Ende. Die Phialiden waren hinsichtlich der Form flaschenartig und hatten eine Größe von 7,5 bis 12,5 · 1,5 bis 3,5 um. Die Conidien wurden schräg in einer Gruppe an der Spitze der Phialiden gebildet und zu Stapeln unter Bildung von Ketten auf den Conidiophoren verbunden. Die Conidien waren zylindrisch, monozellulär und hyalin und hatten eine Größe von 5 bis 6,5 · 1,5 bis 2,5 um.
Diese charakteristischen Eigenschaften wurden mit denen bekannter Stämme verglichen, und es wurde festgestellt, daß die charakteristischen Eigenschaften dieses neuen Stamms stark denen von Clonostachys cylindrospora Arnaud ähnelten, wie sie von K. Tsubaki in Transactions of the Microbiological Society of Japan 4 (4), 83-90 (1963) angegeben wurden. Es zeigten sich alle charakteristischen Eigenschaften der Gattung Clono stachys. Dementsprechend wurde dieser Stamm als Clonostachys sp. identifiziert.
Die Stämme Gliocladium sp. SANK 18092 und Nectria gliocladioides Smalley et Hansen SANK 17992 sind ebenfalls nützliche Produzenten des gewünschten trans-4-Hydroxy-L-prolins.
Gliocladium sp. SANK 18092 wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die im Februar 1992 in Isumi-gun, Chiba Prefecture, Japan, gesammelt wurde. Der Stamm wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 3. Dezember 1992 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-4097.
Nectria gliocladioides Smalley et Hansen SANK 17992 wurde aus einer Probe von verrottetem Holz isoliert, die im Februar 1992 in Awa-gun, Chiba Prefecture, Japan, gesammelt wurde. Dieser Stamm wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, am 3. Dezember 1992 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-4098.
Gliocladium sp. SANK 18092 hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.
Kolonien auf modifiziertem Weitzman und Silva-Hunter-Agarmedium, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist, erreichten einen Durchmesser von 4,2 cm nach 7 Tagen Wachstum bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonien war flockig und dicht mit aerialen Hyphae. Viele myceliale Büschel entwickelten sich hin zum Rand der Kolonie, die recht dick und unregelmäßig gebuchtet war. Die obere Oberfläche der Kolonie hatte eine weiße Farbe, und die rückseitige Oberfläche hatte eine blaßgelbe Farbe.
Auf Kartoffel-Dextrose-Agarmedium, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist, erreichten die Kolonien einen Durchmesser von 4,4 cm nach Wachstum für 7 Tage bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie war flockig und dicht mit einer reichen Entwicklung von aerialen Hyphae. Der Rand der Kolonie war recht dick und unregelmäßig gebuchtet. Die Kolonie zeigte eine weiße Farbe auf ihrer oberen Oberfläche, wobei jedoch die rückseitige Oberfläche eine hellgelbe Farbe hatte.
Teleomorphe dieses Stamms wurden auf keinem Medium beobachtet.
Die Bildung von Conidien auf der Kolonie erfolgte auf phialidische Art, wobei zwei Arten von Conidiophoren gebildet wurden. Die erste Art erinnerte an die Conidiophoren von Verticillium spp., und die zweite Art erinnerte an die Conidiophoren von Penicillium spp. Die Wände beider Arten von Conidiophoren waren dünn, und die Oberfläche der beiden Arten war glatt und hyalin. Bei den Conidiophoren vom Verticillium-Typ verzweigten die Phialiden in drei oder vier Richtungen. Die Phialiden waren nadelartig und variierten hinsichtlich der Größe von 23 bis 31,5 · 1,5 bis 3,5 um. Die Bildung der Conidien war auf die Phialiden unter Bildung von Tropfen konzentriert. Bei den Conidiophoren vom Penicillium-Typ verzweigten die Conidiophoren in mehrere Richtungen am oberen Ende, waren von besenartiger Form und hatten Phialiden am Ende. Die Phialiden waren von flaschenartiger Form und hatten eine Größe von 11,5 bis 15 · 2,5 bis 3,5 um. Die Conidien wurden in einer Gruppe an der Spitze der Phialiden in Form eines säulenartigen Haufens gebildet. Die Conidien waren elliptisch, monozellulär und hyalin und hatten eine Größe von 5 bis 6,5 · 1,5 bis 3,5 um.
Diese charakteristischen Eigenschaften wurden mit denen bekannter Stämme verglichen, und es wurde festgestellt, daß die charakteristischen Eigenschaften dieses neuen Stamms stark denen eines Anamorphs vom Gliocladium-Typ von Nectria gliocladioides Smalley et Hansen ähnelten, wie sie von S. Udagawa und Y. Horie in Journal of General and Applied Microbiology, 17, 141-159 (1971) angegeben wurden, und dieser Stamm zeigte die charakteristischen Eigenschaften der Gattung Gliocladium. Der Stamm wurde daher als Gliocladium sp. identifiziert.
Nectria gliocladioides Smalley et Hansen SANK 17992 weist die mikrobiologischen Eigenschaften auf, die nachstehend im einzelnen angegeben sind.
Kolonien auf modifiziertem Weitzman und Silva-Hunter-Agarmedium, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist, erreichten einen Durchmesser von 4,3 cm nach 7 Tagen Wachstum bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie war flockig und dicht mit aerialen Hyphae. Myceliale Büschel entwickelten sich hin zum Rand der Kolonie, der recht dick und unregelmäßig gebuchtet war. Sowohl die obere Oberfläche als auch die rückseitige Oberfläche der Kolonie waren von weißer Farbe.
Auf Kartoffel-Dextrose-Agarmedium mit der nachstehend angebenen Zusammensetzung erzielten die Kolonien einen Durchmesser von 4,2 cm nach Wachstum für 7 Tage bei 25ºC. Die Oberfläche der Kolonie war flockig und dicht mit einer reichen Entwicklung an aerialen Hyphae. Der Rand der Kolonie war recht dick und unregelmäßig gebuchtet. Die Kolonie zeigte eine weiße Farbe auf ihrer oberen Oberfläche, wobei die rückseitige Oberfläche jedoch von hellgelber Farbe war.
Auf Nelkenblätteragar, dessen Zusammensetzung nachstehend angegeben ist, bildete dieser Stamm einen Teleomorph vom Nectria-Typ. Das Perithe cium war von hellgelblich-oranger Farbe, wurde in Haufen auf einem Nelkenblatt gebildet und hatte einen Durchmesser von 200 bis 300 um. Das Peridium war warzig, durchscheinend und membranartig. Der Ascus war "clavate", enthielt acht Ascosporen und wies eine Größe von 50 bis 60 · 6 bis 8 um auf. Die Ascosporen waren zweizellig, hyalin und hatten eine Größe von 10 bis 12 · 3,5 bis 4 um.
Ein Anamorph wurde gebildet.
Die Bildung von Conidien auf der Kolonie erfolgte auf phialidische Art, wobei zwei Arten von Conidiophoren gebildet wurden. Die erste Art erinnerte an die Conidiophoren von Verticillium spp., und die zweite Art erinnerte an die Conidiophoren von Penicillium spp. Die Wände der beiden Arten von Conidiophoren waren dünn, und die Oberfläche der beiden Arten war glatt und hyalin. Bei den Conidiophoren vom Verticillium-Typ verzweigten die Phialiden in drei oder vier Richtungen. Die Phialiden waren nadelartig und variierten in der Größe von 20 bis 30 · 2,5 bis 3,5 um. Die Bildung der Conidien war auf die Phialiden unter Bildung von Tropfen konzentriert. In den Conidiophoren vom Penicillium-Typ verzweigten die Conidiophoren in mehrere Richtungen am oberen Ende, waren von besenartiger Form und hatten Phialiden am Ende. Die Phialiden waren von flaschenartiger Form und hatten eine Größe von 10 bis 13,5 · 1,5 bis 2 um. Die Conidien wurden in einer Gruppe an der Spitze der Phialiden in Form eines säulenartigen Haufens gebildet. Die Conidien waren elliptisch, monozellulär und hyalin und hatten eine Größe von 5 bis 6,5 · 1,5 bis 3,5 um.
Diese charakteristischen Eigenschaften wurden mit denen bekannter Stämme verglichen, und es wurde festgestellt, daß die charakteristischen Eigenschaften dieses neuen Stamms gut mit denen von Nectria gliocladioides Smalley et Hansen übereinstimmten, wie sie von S. Udagawa und Y. Horie in Journal of General and Applied Microbiology, 17, 141-159 (1971) angegeben wurden. Dieser Stamm wird daher als identisch mit dem bekannten Stamm Nectria gliocladioides Smalley et Hansen angesehen.
Die Zusammensetzungen der vorstehend eingesetzten Medien sind nachstehend angegeben.

Kartoffel-Dextrose-Agarmedium:

Kartoffel-Dextrose-Agar (Produkt von Nissiu) 39 g
Destilliertes Wasser auf 1000 ml

Lignin-Zellulose-Agarmedium:

Glucose 1g
KH&sub2;PO&sub4; 1g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,2 g
KCl 0,2 g
NaNO&sub3; 2 g
Hefe-Extrakt 0,2 g
Agar 20 g
Destilliertes Wasser auf 1000 ml
pH-Wert: 6,5-7,0 (eingestellt mit KOH)

Modifiziertes Weitzman und Silva-Hunter-Agarmedium:

Hafermehl 10 g
KH&sub2;PO&sub4; 1g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 1 g
NaNO&sub3; 1g
Agar 20 g
Destilliertes Wasser auf 1000 ml

Malz-Agarmedium:

Malz-Extrakt 2 g
Agar 20 g
Destilliertes Wasser auf 1000 ml

Nelkenblätteragar:

Die Blätter einer Nelke wurden in Stücke von etwa 5 · 5 mm geschnitten, bei etwa 50ºC für mehrere Stunden getrocknet und dann durch Behandlung mit Ethylenoxidgas für 2 Stunden sterilisiert. Die erhaltenen Blätterstücke wurden auf 2% normalen Agar übertragen.
Es ist darauf hinzuweisen, daß diese Stämme oder beliebige weitere Stämme, die zur Bildung von trans-4-Hydroxy-L-prolin imstande sind, subkultiviert oder biotechnologisch verändert oder modifiziert werden können, so daß ein Organismus mit anderen charakteristischen Eigenschaften gebildet wird. Die einzige Anforderung besteht darin, daß der resultierende Organismus imstande ist, die erforderliche Verbindung zu bilden. Änderungen können natürlich oder künstlich durch Induktion auftreten.
Derartige Änderungen und Modifikationen können eine beliebige Form annehmen, oder sie können eine Folge von Überlegungen zum Beispiel hinsichtlich der Kulturbedingungen sein. Stämme können durch Kultur modifi ziert und so selektiert werden, daß sie solche charakteristischen Eigenschaften, wie verstärktes Wachstum oder Wachstum bei niedrigeren/höheren Temperaturen, zeigen.
Biotechnologische Modifikationen erfolgen im allgemeinen zielgerichtet und können selektierbare charakteristische Eigenschaften, wie Resistenz oder Empfindlichkeit gegenüber einem Bakteriostatikum oder Kombinationen daraus, einführen, um die Reinheit zu erhalten oder die Reinigung von Kulturen, insbesondere von Impfkulturen, von Zeit zu Zeit zu ermöglichen.
Weitere charakteristische Eigenschaften, die durch genetische Manipulation eingeführt werden können, sind beliebige Eigenschaften, die in Clonostachys, Gliocladium und Nectria spp. zulässig sind. Zum Beispiel können Plasmide, die Resistenzen kodieren, eingeführt werden, oder es können beliebige natürlich auftretende Plasmide entfernt werden. Vorteilhafte Plasmide umfassen die, die Auxotrophie verleihen. Plasmide können aus einer beliebigen geeigneten Quelle erhalten werden, oder sie können durch Isolierung eines natürlich auftretenden Clonostachys-, Gliocladium- oder Nectria-Plasmids und Inserieren eines gewünschten Gens oder gewünschter Gene aus einer anderen Quelle hergestellt werden. Natürliche Plasmide können auch auf beliebige Weise, die als günstig angesehen wird, modifiziert werden.
Es ist auch bekannt, daß Schimmelpilze leicht unter natürlichen Bedingungen oder durch künstliche Manipulation (zum Beispiel Ultraviolettbestrahlung, ionisierende Bestrahlung oder chemische Behandlung) mutieren. Dies trifft auch für die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen zu. Dementsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung derartiger mutierter Stämme, sofern sie mit den vorstehend beschriebenen Stämmen die charakteristische Fähigkeit teilen, trans-4-Hydroxy-L- prolin zu bilden.
Beliebige derartige modifizierte Stämme können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, sofern der Stamm nur imstande ist, trans-4-Hydroxy-L-prolin zu bilden, wobei diese Tatsache ohne weiteres durch einfache Routineexperimente festgestellt werden kann.
Um trans-4-Hydroxy-L-prolin aus einer Kultur eines geeigneten Mikroorganismus zu erhalten, sollte der Mikroorganismus in einem geeigneten Medium fermentiert werden. Derartige Medien sind auf diesem Gebiet allgemein bekannt und werden häufig von einer Art sein, die üblicherweise für die Herstellung anderer Fermentationsprodukte verwendet wird.
Typischerweise ist es erforderlich, daß das Medium eine Kombination aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einem oder mehreren anorganischen Salzen, die von dem betreffenden Mikroorganismus assimiliert werden können, enthält. Die minimale Anforderung für das Medium ist die, daß es die Bestandteile enthält, die essentiell für das Wachstum des Mikroorganismus sind, wobei diese Tatsache leicht durch Routineexperimente festgestellt werden kann.
Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen zum Beispiel: Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannit, Glycerin, Dextrin, Hafermehl, Roggen, Maisstärke, Kartoffel, Kartoffelstärke, Maismehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenöl, Melasse, Zitronensäure und Weinsäure, wobei beliebige davon allein oder in Kombination mit einer oder mehreren anderen eingesetzt werden können. Typische Mengen liegen im Bereich von etwa 1 bis 10% (Gew./Vol.) der Menge des Mediums, wobei die Menge jedoch beliebig und abhängig vom gewünschten Ergebnis variieren kann.
Geeignete Stickstoffquellen umfassen beliebige Substanzen, die zum Beispiel ein Protein enthalten, oder andere, ohne weiteres assimilierbare Quellen für Stickstoff. Repräsentative Beispiele für Stickstoffquellen sind organische Stickstoffquellen aus Tieren und Pflanzen, und es kann sich um Extrakte aus natürlichen Quellen, wie Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Baumwollsamenöl, Caseinhydrolysat, Fermamin, Fischmehl, Maiseinweichflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt und Malzextrakt handeln; und solche anorganischen Stickstoffquellen, wie Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und Ammoniumsulfat. Wie bei der Kohlenstoffquelle können diese Quellen allein oder in beliebiger Kombination eingesetzt werden. Geeignete Mengen liegen typischerweise im Bereich von etwa 0,2 bis 6% (Gew./Vol.) der Menge des Mediums, wobei die Menge jedoch nach Wunsch und gemäß dem gewünschten Ergebnis variiert werden kann.
Geeignete anorganische Nährstoffsalze sind die, die Spurenelemente sowie den Hauptbestandteil des Salzes bereitstellen. Vorzugsweise sollten die Salze Ionen, wie Natrium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Chlorid und Carbonat, bereitstellen. Spurenmetalle wie Kalium, Calcium, Kobalt, Mangan, Eisen, Magnesium und Strontium, oder Salze, die Ionen, wie Bromid-, Fluorid-, Borat- oder Silikationen bereitstellen, können ebenfalls vorhanden sein.
Wenn der Mikroorganismus als Flüssigkultur fermentiert wird, dann ist es bevorzugt, wenn ein schaumhemmendes Mittel, wie ein Silikonöl oder Pflanzenöl, oder ein anderes geeignetes oberflächenaktives Mittel eingesetzt wird.
Es ist bevorzugt, wenn der pH-Wert des Kulturmediums für die Kultivierung der vorstehenden Stämme von Clonostachys, Gliocladium oder Nectria bei Verwendung zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin im Bereich von pH 5,0 bis pH 7,0 gehalten wird, wobei die einzige wesentliche Anforderung jedoch darin besteht, daß der pH-Wert nicht das Wachstum des Mikroorganismus verhindern oder in irreversibler Weise die Qualität des Endprodukts beeinflussen sollte.
Clonostachys, Gliocladium und Nectria wachsen im allgemeinen bei Temperaturen im Bereich von 5ºC bis 30ºC, und sie wachsen gut bei Temperaturen im Bereich von 15ºC bis 28ºC. Andere Temperaturen, die nicht in diese Bereiche fällen, mögen anwendbar sein, wenn ein Stamm entwickelt worden ist, der bei niedrigeren oder höheren Temperaturen wachsen kann, oder für andere spezielle Zwecke, wie es auf diesem Gebiet bekannt ist. Für die Herstellung von trans-4-Hydroxy-L-prolin liegt ein bevorzugte Temperatur zwischen 23ºC und 28ºC.
trans-4-Hydroxy-L-prolin wird idealerweise durch aerobe Kultur erhalten, und beliebige aerobe Kulturtechniken, wie zum Beispiel Festkultur, Schüttelkultur oder Belüftungsrührkultur, können angewandt werden.
Wenn die Kultur in einem kleinen Maßstab durchgeführt wird, dann wird eine Schüttelkultur, die für mehrere Tage bei 23ºC bis 28ºC und insbesondere bei etwa 26ºC fermentiert wird, im allgemeinen bevorzugt.
Um eine fermantative Kultur zu starten, wird gemäß einer bevorzugten Technik ein Anfangsinoculum verwendet, das in einer oder zwei Stufen zum Beispiel in einem Erlenmeyer-Kolben hergestellt wird, der vorzugsweise mit Prallflächen (einer Wasserfluß-Kontrollwand) ausgestattet ist. Eine Kohlenstoffguelle und eine Stickstoffquelle können in Kombination für das Kulturmedium verwendet werden. Der Impfkolben wird vorzugsweise in einem thermostatischen Inkubator bei 26ºC für eine Zeitspanne von 3 oder 4 Tagen, oder bis ein ausreichendes Wachstum beobachtet wird, geschüttelt. Die resultierende Impfkultur kann dann verwendet werden, um eine zweite Impfkultur oder eine Produktionskultur anzuimpfen. Wenn eine zweite Impfkultur durchgeführt wird, dann kann dies auf ähnliche Weise geschehen, und sie kann teilweise zur Animpfung des Produktionsmediums verwendet werden. Der Kolben, in den die Impfkultur überimpft wird, wird für eine geeignete Zeitspanne, zum Beispiel von 3 bis 12 Tagen und vorzugsweise von 9 oder 10 Tagen, oder bis eine maximale Produktion erzielt wird, bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel 26ºC, geschüttelt. Wenn die In kubation abgeschlossen ist, wird der Inhalt des Kolbens durch geeignete herkömmliche Maßnahmen, zum Beispiel Zentrifugation oder Filtration, aufgefangen.
Wenn die Kultur in einem großen Maßstab durchgeführt werden kann, dann ist die Kultivierung in einem geeigneten Belüftungsrührfermenter bevorzugt. Bei diesem Verfahren kann das Nährmedium in dem Fermenter hergestellt werden. Das Medium wird zuerst durch Erhitzen auf eine geeignet hohe Temperatur, zum Beispiel 125ºC, sterilisiert. Anschließend wird es abgekühlt und mit einem Inoculum, das zuvor in einem sterilisierten Medium gezüchtet wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, angeimpft. Die Kultur wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 23ºC bis 26ºC und insbesondere von etwa 26ºC unter Rühren und Belüftung durchgeführt. Dieses Verfahren eignet sich, um eine große Menge der Verbindung zu erhalten.
Die Menge an trans-4-Hydroxy-L-prolin, die durch die Kultur im Verlauf der Zeit gebildet wird, kann durch Probennahme und Untersuchung durch herkömmliche Maßnahmen überwacht werden. Im allgemeinen erreicht die gebildete Menge an trans-4-Hydroxy-L-prolin ein Maximum nach einer Zeitspanne zwischen 72 Stunden und 240 Stunden.
Wenn ein Mikroorganismus kultiviert werden soll, um festzustellen, ob der Mikroorganismus selbst trans-4-Hydroxy-L-prolin bildet oder nicht, ist es wichtig, daß das für diese Kultivierung verwendete Medium kein Pepton oder Malzextrakt tierischen Ursprungs enthält, da diese bereits trans-4-Hydroxy-L-prolin als einen Bestandteil enthalten.
Nach Abschluß der Kultivierung kann die gewünschte Verbindung durch beliebige herkömmliche Maßnahmen gewonnen, quantitativ analysiert, abgetrennt und gereinigt werden.
Ausführlicher gesagt wird zum Beispiel nach Kultivierung das im flüssigen Anteil (und möglicherweise im Zellanteil) der Kulturflüssigkeit enthaltene trans-4-Hydroxy-L-prolin wie folgt abgetrennt: die Kulturbrühe wird mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, gemischt, und die Flüssigkeit wird vom zellulären Anteil und von anderen Feststoffen zum Beispiel durch Filtration, wahlweise unter Verwendung von Diatomit als Filterhilfe, oder durch Zentrifugation abgetrennt, und dann wird das trans-4-Hydroxy-L-prolin aus dem resultierenden Filtrat oder Überstand extrahiert und gereinigt, wobei dessen physikochemische Eigenschaften genutzt werden.
Zum Beispiel kann trans-4-Hydroxy-L-prolin erhalten werden, indem das Filtrat oder der Überstand durch eine Säule mit einem Anionenaustauschharz, wie DEAE-Toyopearl (Toyopearl ist eine Handelsbezeichnung für ein Produkt von Toso) zur Entfernung von Verunreinigungen durch Adsorption geleitet wird. trans-4-Hydroxy-L-prolin kann auch durch Adsorption des Filtrats oder Überstands an eine Kationenaustauschsäule, wie Dowex 50W · 4 (Dowex ist eine Handelsbezeichnung für ein Produkt von Dow Chemical Co.), und anschließende Elution des gewünschten trans-4-Hydroxy-L- prolins mit wäßrigem Ammoniak erhalten werden. Amberlite IRC-50, CG-50 (Amberlite ist eine Handelsbezeichnung für ein Produkt von Rohm & Haas), Dowex SBR-P (Dow Chemicals Co.) und andere Ionenaustauschharze können ebenfalls eingesetzt werden, um trans-4-Hydroxy-L-prolin zu erhalten. Alternativ dazu können Aktivkohle oder Adsorbensharz, wie Amberlite XAD-2, XAD-4 (Rohm & Haas) oder Diaion HP-10, HP-20, CHP-20,. HP-50 (Diaion ist eine Handelsbezeichnung für ein Produkt von Mitsubishi Kasei), eingesetzt werden, um das ttans-4-Hydroxy-L-prolin zu reinigen. trans-4-Hydroxy-L- prolin kann erhalten werden, indem die Flüssigkeit, die die gewünschte Verbindung enthält, durch eine Säule eines Adsorptionsmittels, wie eines der vorstehend genannten Mittel, geleitet werden, um beliebige Verunreinigungen durch Adsorption zu entfernen; oder das trans-4-Hydroxy-L-prolin kann adsorbiert und dann mit einem Mischlösungsmittel, das Wasser und ein organisches Lösungsmittel enthält, wie wäßrigem Methanol oder wäßrigem Aceton, eluiert werden.
Das auf diese Weise erhaltene trans-4-Hydroxy-L-prolin kann weiter durch verschiedene herkömmliche Maßnahmen, zum Beispiel Adsorptionssäulenchromatographie unter Verwendung eines Trägers, wie Silicagel oder Floridil (Handelsbezeichnung), durch Verteilungs- oder Molekularsiebsäulenchromatographie unter Verwendung von Apisel (Apisel ist eine Handelsbezeichnung für ein Produkt von Asahi Kasei) oder Sephadex G-10 (Sephadex ist eine Handelsbezeichnung für ein Produkt von Pharmacia Co.) oder durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Normalphasen- oder Umkehrphasensäule oder einer Ionenaustauschsäule gereinigt werden.
Die Zielverbindung kann quantitativ nach folgendem Verfahren analysiert werden.
Zuerst werden die primären Aminosäuren in ihre Derivate durch Behandlung mit ortho-Phthalaldehyd in Gegenwart von Mercaptopropionsäure umgewandelt, und dann werden die verbleibenden sekundären Aminosäuren (Prolin und Hydroxyprolin) in ihre FMOC-Derivate (9-Fluorenylmethylchlorformiat-Derivate) durch Behandlung mit FMOC umgewandelt. Nur sekundäre Aminosäuren (Prolin und Hydroxyprolin) können quantitativ mit hoher Empfindlichkeit durch Fluorometrie bei 266 nm für die Anregung und 305 nm für die Detektion, wobei beide für FMOC spezifisch sind, analysiert werden. Diese Verfahren wurden unter Verwendung eines Aminosäureanalysesystems, das von Hewlett Packard als > > AminoQuant< < verkauft wird, durchgeführt.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Clonostachys cylindrospora SANK 14591 wurde in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, der mit einer Prallplatte ausgestattet war und 100 ml GPMY- Medium enthielt, dessen Komponenten nachstehend angegeben sind, überimpft, und der Mikroorganismus wurde bei 26ºC unter Schütteln bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 200 U/min kultiviert.

Komponenten des GPZM-Mediums:

Glycerin 50 g
Rohe Kartoffeln 50 g
Malz-Extrakt 5 g
Hefe-Extrakt 5 g
Leitungswasser 1000 ml
Sechs Tage nach dem Beginn der Kultivierung wurde die Menge an trans-4-Hydroxy-L-prolin, die in der Kulturflüssigkeit, die die mikrobiellen Zellen enthielt, vorhanden war, bestimmt.
Die quantitative Bestimmung wurde unter Vewendung des vorstehend allgemein beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Ausführlicher gesagt wurden 5 ul einer Boratpufferlösung, die von Hewlett Packard hergestellt wurde (Nr. 5061-3339), 1 ul OPA-Reagents, das von Hewlett Packard hergestellt wurde (Nr. 5061-3335), und 1 ul des durch Filtration einer fünffach verdünnten Kulturflüssigkeit durch Sephpak Plus (Waters Millipore) erhaltenen Filtrats miteinander gemischt und gerührt. 1 ul FMOC-Reagens, das von Hewlett Packard hergestellt wurde (Nr. 5061-3337), wurden zu diesem Gemisch gegeben, und anschließend erfolgte eine Trennung mittels einer AminoQuant-Säule (Hewlett Packard). Durch Fluorometrie der eluierten Lösung bei Wellenlängen von 266 nm für die Anregung und 305 nm für die Detektion konnten die sekundären Aminosäuren (Prolin und Hydroxyprolin) allein bestimmt werden. Die Retentionszeit des FMOC-Derivats von trans-4- Hydroxy-L-prolin wurde zu 11,20 Minuten bestimmt.
Die quantitative Analyse wurde unter Verwendung von AmminoQuant HP1090M und eines Fluorometers HP1046A (beide hergestellt von Hewlett Packard) durchgeführt.
Die Analyse zeigte das Vorhandensein von 12,9 ug/ml trans-4-Hydroxy- L-prolin in der Kulturflüssigkeit.

Beispiel 2

Auf ähnliche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde Clonostachys cylindrospora SANK 14591 bei 26ºC unter Schütteln mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 200 U/min kultiviert. 1,8 l Kulturflüssigkeit, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden mit 2 l Aceton gemischt und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Das Gemisch wurde dann unter Verwendung einer Celite-Filterhilfe (Marke) filtriert, und das Filtrat wurde durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. Auf diese Weise wurden 500 ml eines Rohextrakts erhalten, der an einer Dowex 50W-Säule adsorbiert und mit 0,5 N wäßrigem Ammoniak eluiert wurde. Das Eluat wurde durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt.
Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/Std. und unter Verwendung eines Mischlösungsmittels, das aus Butanol, Essigsäure und Wasser in Anteilen von 4 : 1 : 2, bezogen auf das Volumen, bestand, als mobiler Phase unterzogen. Die Fraktionen, die das gewünschte trans-4-Hydroxy-L-prolin enthielten, wurden aufgefangen und durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 15 ml/Std. und unter Verwendung eines Mischlösungsmittels, das aus Butanol, Essigsäure und Wasser in Anteilen von 5,5 : 1 : 2, bezogen auf das Volumen, bestand, als mobiler Phase unterzogen. Die Fraktionen, die trans-4-Hydroxy-L-prolin enthielten, wurden aufgefangen und durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 15 ml/Std. unter Verwendung eines Mischlösungsmittels, das aus Butanol, Essigsäure und Wasser in Anteilen von 6 : 1 : 2, bezogen auf das Volumen, bestand, als mobiler Phase unterzogen. Die Fraktionen, die trans-4-Hydroxy-L-prolin enthielten, wurden aufgefangen, durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt und durch eine DEAE-Toyopearl 6505-Säure geleitet. Nicht adsorbierte Fraktionen wurden aufgefangen und durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10 bei einer Strömungs geschwindigkeit von 15 ml/Std. und unter Verwendung eines Mischlösungsmittels, das aus Butanol, Essigsäure und Wasser in Anteilen von 6 : 1 : 2, bezogen auf das Volumen, bestand, als mobiler Phase unterzogen. Schließlich wurden Fraktionen, die trans-4-Hydroxy-L-prolin enthielten, aufgefangen, durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt und durch eine DEAE-Toyopearl 650S-Säule geleitet. Nicht absorbierte Fraktionen wurden aufgefangen und durch Verdampfen unter verringertem Druck eingeengt, wobei man 1,0 mg der Titelverbindung in reiner Form erhielt.
Kernmagnetisches Resonanzspektrum (Deuteriumoxid unter Verwendung von tetradeuteriertem Natriumtrimethylsilylpropionat als innerem Standard), δ:
2,17 (1H, verdoppeltes Dublett von Dubletts, J = 14,2, 10,2 und 4,4 Hz);
2,43 (1H, verdoppeltes Dublett von Multipletts, J = 14,2 und 7,8 Hz);
3,37 (1H, Dublett von Multipletts, J = 12,7 Hz);
3,49 (1H, Dublett von Dubletts, J = 12,7 und 3,9 Hz);
4,35 (1H, Dublett von Dubletts, J = 10,1 und 7,8 Hz);
4,67 (1H, Multiplet).
Das kernmagnetische Resonanzspektrum stimmte gut mit dem bekannten Spektrum von trans-4-Hydroxy-L-prolin überein.

Beispiel 3

Sporen von Nectria gliocladioides SANK 17992 wurden in einen 500 ml- Erlenmeyer-Kolben, der mit einer Prallplatte ausgestattet war und 100 ml GPMY-1-Medium enthielt, dessen Komponenten nachstehend angegeben sind, überimpft, und der Mikroorganismus wurde bei 23ºC unter Schütteln mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 200 U/min kultiviert.

Zusammensetzung des GPMY-1-Mediums:

Glycerin 75 g
Rohe Kartoffeln 75 g
Malzextrakt 7,5 g
Hefeextrakt 7,5 g
Leitungswasser 1000 ml
9 Tage nach dem Beginn der Kultivierung wurde die Menge an trans-4- Hydroxy-L-prolin, die in der Kulturflüssigkeit, die die mikrobiellen Zellen enthielt, vorlag, bestimmt.
Die quantitative Analyse des trans-4-Hydroxy-L-prolins wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. In diesem Fall wurde die Retentionszeit des FMOC-Derivats von trans-4-Hydroxy-L-prolin zu 11,20 Minuten bestimmt.
Die Analyse zeigte das Vorhandensein von 9,35 ug/ml trans-4-Hydroxy- L-prolin im Kulturmedium von Nectria gliocladioides SANK 17992.

Beispiel 4

Nach einem Verfahren ähnlich dem, das in Beispiel 3 beschrieben wurde, würde Gliocladium sp. SANK 18092 in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, der mit einer Prallplatte ausgestattet war und 100 ml GPMY-1-Medium, dessen Zusammensetzung in Beispiel 3 angegeben ist, enthielt, überimpft, und der Mikroorganismus wurde bei 23ºC unter Schütteln mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 200 U/min kultiviert.
Neun Tage nach dem Beginn der Kultivierung wurde die Menge an trans- 4-Hydroxy-L-prolin, die in der Kulturflüssigkeit, die die mikrobiellen Zellen enthielt, vorhanden war, bestimmt.
Die quantitative Analyse von trans-4-Hydroxy-L-prolin wurde unter Verwendung des Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben wird, durchgeführt. In diesem Fall wurde die Retentionszeit des FMOC-Derivats von trans-4-Hydroxy-L-prolin zu 11,20 Minuten bestimmt.
Die Analyse zeigte das Vorhandensein von 8,12 ug/ml trans-4-Hydroxy- L-prolin im Kulturmedium von Gliocladium sp. SANK 18092.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von trans-4-Hydroxy-L- prolin, das das Kultivieren eines trans-4-Hydroxy-L-prolin bildenden Mikroorganismus und die Abtrennung des resultierenden trans-4-Hydroxy-L-prolin aus der Kulturbrühe umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der trans-4-Hydroxy-L-prolin bildende Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der eine Spezies der Gattung Clonostachys, der Gattung Gliocladium oder der Gattung Nectria ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Mikroorganismus eine Spezies der Gattung Clonostachys ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Mikroorganismus ein Stamm der Spezies Clonostachys cylindrospora ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Mikroorganismus Clonostachys cylindrospora FERM BP-3661 ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Mikroorganismus Clonostachys sp. FERM BP-4096 ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Mikroorganismus eine Spezies der Gattung Gliocladium ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Mikroorganismus Gliocladium sp. FERM BP-4097 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Mikroorganismus eine Spezies der Gattung Nectria ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Mikroorganismus ein Stamm der Spezies Nectria gliocladioides ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der Mikroorganismus Nectria gliocladioides Smalley et Hansen FERN BP-4098 ist.

11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der pH-Wert des Kulturmediums für die Kultivierung der Stämme von Clonostachys, Gliocladium oder Nectria 5,0 bis 7,0 beträgt.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Kultivierung bei einer Temperatur im Bereich von 5ºC bis 30ºC durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Temperatur im Bereich von 15ºC bis 28ºC liegt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Temperatur im Bereich von 23ºC bis 28ºC liegt.