KR100356926B1 - 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의제조법 - Google Patents
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Abstract
L - 프롤린의 4 위치에 위치에서 L - 프롤린을 수산화하는 반응을 촉매하는 효소원, 이가 철이온, 2 - 케토글루타르산 및 L - 프롤린을 수성매체 중에 존재시키고, L - 프롤린을 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린으로 변환시키고, 생성된 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 이 수성매체중으로 부터 채취하는 것을 특징으로 하는 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 제조법.
Description
본 발명은 의약품의 합성원료 또는 식품 첨가물로서 유용한 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 공업적으로 제조하는 방법 및 이 방법에 유용한 신규 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소에 관한 것이다.
미생물을 사용하여 트랜스 - 4 -히드록시 - L - 프롤린을 제조하는 방법으로서,
1) 에스케리키아속에 속하는 미생물을 사용하여, 4 - 히드록시 - 2 - 옥소글루타르산으로 부터 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 제조하는 방법 (일본국 특개평 3-266995)
2) 곰팡이류를 사용하여 직접 발효 생산하는 방법 (유럽 특허 출원 EP 05 47 898 A2)
3) 스트렙토 마이세스 속에 속하는 미생물을 사용하여, L - 프롤린으로 부터 제조하는 방법 [저널 오브 바이올로지칼 케미스트리 (J. Biol. Chem.), 254 권, 6684 ∼ 6690 면 (1979 년), 바이오 케미칼 앤드 바이오피지칼 리서치 커뮤니케이션 (Biochem. Biophys. Res. Comm.), 120 권, 45 ∼ 51 면 (1984 년)] 이 알려져 있다.
1) 의 방법에 있어서는 4 - 히드록시 - 2 - 옥소 글루타르산이 고가이고, 또한 입수가 곤란하며, 생산성이 낮고, 2) 의 방법에 있어서도 생산성이 낮고, 3) 의 방법에 있어서는 트랜스- 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 제조에 관여하는 효소의 활성이 극히 미약하기 때문에, 반응 생성물이 방사성 화합물을 사용하지 않으면 검출할수 없을 정도로 미량이며, 어느 방법을 사용하더라도 공업화는 곤란하다.
트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린으로의 수산화 반응을 촉매하는 효소는 단리되어 있지 않으며, 다크틸로스포란지움 (Dactylosporangium) 속 또는 아미콜라톱시스 (Amycolatopsis) 속에 속하는 미생물 유래이며, 또한 L - 프롤린으로 부터 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린으로의 수산화 반응을 촉매하는 효소원을 사용하여 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 제조하는 방법에 관해서는 알려져 있지 않다. 또 상기한 스트렙토 마이세스 속에 속하는 미생물로 부터 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 정제하였다는 기재가 있으나 [테트라헤드론 레터스 (Tetrahedron Letters), 34 권, 7489 ∼ 7492 면 (1993 년)], 효소를 정제하는 방법, 정제된 효소의 순도 및 그 효소의 이화학적 성질 등에 대한 기재는 없다. 여하튼 유리(遊離)의 L - 프롤린을 수산화하여 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성하는 반응을 촉매하는 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소는 지금까지에 단리된 일이 없고, 또 그의 이화학적 성질도 명백히 되어있지 않은 효소이다.
종래의 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 제조방법은 (1) 원료가 고가이다. (2) 반응공정이 많다. (3) 분리정제 공정이 복잡하다. (4) 생산성이 낮다는 등의 점에서 공업적 제조방법으로서는 반드시 만족할 수 있는 방법은 아니고, 공업적으로 유리한 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 제조법이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 발효법에 의해서 당원으로부터 공업적으로 생산되고있는 L - 프롤린을 직접 미생물적 또는 효소적으로 수산화함으로써, 공업적으로 유리하게 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 제조하는 방법 및 이 방법에 유용한 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 제공하는데 있다.
본 발명에 의하면 다크틸로스포란지움 속 또는 아미콜라톱시스 속에 속하는 미생물 유래이며 또한 L - 프롤린의 4 위치의 위치에서 L - 프롤린을 수산화하는 반응을 촉매하는 효소원, 2 가 철이온, 2 - 케토 글루타르산 및 L - 프롤린을 수성 매체중에 존재시키고, L - 프롤린을 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린으로 변환시키고, 생성된 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 이 수성매체로부터 채취하는 것을 특징으로 하는 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 제조법 및 L - 프롤린 4위치 수산화 효소를 제공할 수가 있다.
본 발명에서 사용되는 효소원(酵素源)은 다크틸로스포란지움속 혹은 아미콜라톱시스 속에 속하는 미냉물 유래이며, 또한 L - 프롤린을 수산화하여 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성하는 반응을 촉매하는 활성을 갖고 있으면, 미생물의 배양물, 균체, 균체 처리물, 정제 효소 또는 조효소의 어느 것이라도 좋다. 미생물의 적합한 예로서는 다크틸로스포란지움 종(Dactylosporangium sp.) RH 1, 아미콜라톱시스 종(Amycolatopsis sp.) RH 2 또는 이들 균주의 계대(繼代) 배양물,돌연변이체 또는 유도체 등을 들 수 있다.
RH 1 균주는 일본국 도오꾜또의 수목으로부터, RH 2 균주는 일본국의 사이따마껭의 토양으로부터, 본 발명자가 새로이 분리한 미생물이다. 이하에 RH 1 및 RH 2 의 균학적 성질을 나타낸다.
1. 형태적 성질
RH 1 및 RH 2 를 각종 배지상에서 28 ℃, 14 일간 배양하였을때의 형태적 성질을 제 1 표에 종합하였다.
2. 배양적 성질
RH 1 균주는 일반적으로 사용되고 있는 합성 및 천연 배지에서 보통 또는 왕성한 생육을 나타내고 기생균사는 주황색계를 나타낸다. 배지에 의해 황토색 혹은 담적색 계통의 가용성 색소가 생산되는 일도 있다.
RH 2 균주는 일반적으로 사용되고 있는 합성 및 천연 배지에서 보통 또는 왕성한 생육을 나타내고, 기생균사는 담황색 혹은 갈색계를, 기균사는 백색 혹은 회색계를 나타낸다. 배지에 따라 갈색계통의 가용성 색소가 생산되는 일도 있다.
RH 1 균주 및 RH 2 균주를 각종 배지 상에서 28 ℃ , 14 일간 배양하였을때의 생육 및 색의 특징을 제 2 - (1) 표 및 제 2 - (2) 표에 종합하였다. 그리고 색의 표시는 Color Harmony Manual (Container Corporation of America) 에 의한 색의 분류에 따랐다.
3. 생리학적 성질
RH 1 균주 및 RH 2 균주의 생리학적 성질을 제 3 표에 종합하였다. 생육온도범위는 액체 진탕 배양 7 일 후의, 그 외는 28 ℃, 2 ∼ 3 주간 후의 결과를 종합한 것이다.
4. 화학분류학적 성질
RH 1 균주 및 RH 2 균주의 화학분류학적 성질을 제 4 표에 중합하였다.
이상 RH 1 균주는 형태적으로는 기균사를 형성하지 않는다는 것, 기생균사상에 막대상의 포자낭을 형성한다는 것, 포자낭에는 운동성을 갖는 포자가 2 ∼ 4 개 함유된다는 것, 화학분류적으로는 세포벽에 함유되는 디아미노피멜산이 3 - 히드록시 - 디아미노피린산이라는 것, 전균체 가수분해물 중의 환원당으로서 아라비노오스 및 크실로오스가 함유된다는 것으로 부터, 방선균 중에서 다크틸로스포란지움 (Dactylosporangium) 속으로 분류된다.
RH 2 균주는 형태적으로는 기균사를 형성한다는것, 기균사 및 기생균사가 분단한다는 것, 화학 분류적으로는 세포벽의 디아미노피멜산으로서 메소디아미노피멜산이 환원당으로서 갈락토오스 및 미량의 아라비노오스가 함유된다는 것, 전균체 가수분해물 중의 환원당으로서 아라비노오스 및 갈락토오스가 함유된다는것, 균체성분으로서 미콜산이 함유되지 않는다는 것, 인지질로서 포스파티딜에탄올아민을 함유하지만 포스파티딜콜린 및 미지의 글루코사민 함유 인지질이 함유되지 않는다는 것, 메나퀴논의 주요성분이 MK - 9 (H4)이라는 것으로 부터, 방선균 중에서 아미콜라톱시스 (Amycolatopsis) 속으로 분류된다.
RH 1 균주를 다크틸로스포란지움 종 (Dactylosporangium sp.) RH 1, RH 2 균주를 아미콜라톱시스 종 (Amycolatopsis sp.) RH 2 라고 명명하고 부다페스트 조약에 의거하여 RH 1 균주는 1993년 9월 1일자로 FERM BP-4400 으로서, RH 2 균주는 1994년 2월 22일자로 FERM BP-4581 로서 일본국 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에 기탁하였다.
이것들의 미생물을 배양하는 배지는 미생물이 동화(assimilate)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, L - 프롤린을 수산화하여 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 미생물의 배양을 효율적으로 할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지의 어느 것이라도 좋다.
탄소원으로서는 각각의 미생물이 동화할 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 이것들을 함유하는 당밀, 전분 혹은 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류가 사용된다.
질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄등의 각종 무기산이나 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소함유 화합물 및 펩톤, 고기추출물, 효모추출물, 콘스팁리커(corn steep liquor), 카세인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물 등이 사용된다.
무기물로서는 인산 제 1 칼륨, 인산 제 2 칼륨, 인산마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등이 사용된다.
배양은 진탕배양 또는 심부통기교반 배양 등의 호기적 조건하에서 수행된다. 배양온도는 15 ∼ 37 ℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 15 ∼ 96 시간이다. 배양중 pH 는 5.0 ∼ 9.0 로 유지한다. pH 의 조정은 무기 혹은 유기의 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 수행한다.
균체 처리물로서는 균체의 건조물, 동결 건조물, 계면활성제 처리물, 효소 처리물, 초음파 처리물, 기계적 마쇄 처리물, 기계적 압력 처리물, 용매 처리물, 균체의 단백분획, 균체 및 균체 처리물의 고정화물 등을 들 수 있다.
또 효소원으로서 이 균체로부터 추출하여 얻어지는 L - 프롤린으로 부터 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린에의 수산화반응을 촉매하는 활성을 갖는 효소, 그것들의 효소의 정제 표품, 고정화물 등도 사용된다. 이 활성을 갖는 효소원으로서는 하기 (1) 로 부터 (10) 의 이화학적 성질을 나타내는 신규인 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 들 수가 있다.
(1) 작용 및 기질 특이성
2 - 케토 글루타르산 및 2 가 철이온의 존재하에, 유리의 L - 프롤린에 작용하여, 트랜스- 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성한다.
(2) 적정 pH
30 ℃, 20 분간의 반응에 있어서, pH 6.0 ∼ 7.0 에 적정 pH 를 갖는다.
(3) pH 안정성
4 ℃, 24 시간의 처리에서 pH 6.5 ∼ 10.0 의 범위에서 안정적으로 유지된다.
(4) 적정 온도
pH 6.5, 15 분간의 반응에서 30 ∼ 40 ℃ 에 적정온도를 갖는다.
(5) 온도 안정성
pH 9.0 , 50 ℃, 30 분간의 처리에서 완전히 실활한다.
(6) 저해제
Zn++및 Cu++의 금속이온 및 에틸렌디아민테트라아세트산에 의해 저해를 받는다.
(7) 활성화
활성화에는 보효소를 필요로 하지 않는다.
반응액에의 L - 아스코르브산의 첨가는 반응을 촉진한다.
(8) Km 치
80 mM 의 2 - (N - 모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충액 (pH 6.5) 중에 4 mM L - 아스코르브산, 2 mM 황산 제 1 철 및 효소표품을 함유하는 반응액 중에서 측정한 L - 프롤린에 대한 Km 치는 0.27 mM 이며, 2 - 케토글루타르산에 대한 Km 치는 0.55 mM 이다.
(9) 분자량
도데실황산 나트륨 - 폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의한 측정으로, 32,000 ±5,000 달톤이며, 겔여과법에 의해서 측정한 분자량이 43,800 ±5,000 달톤이다.
(10) N 말단 아미노산 배열
배열번호 1 로 표시되는 N 말단 아미노산 배열을 갖는다.
이것들의 효소원의 반응액중에 있어서의 효소활성량은 사용하는 기질의 양 등에 의해 결정되나, 1.0 ∼ 10,000,000 U/l, 바람직하기는 1,000 ∼ 2,000,000 U/l 이다.
반응에 사용되는 L - 프롤린의 농도는 1 mM ∼ 2 M 이다.
반응에는 이가 철이온이 필요로 되고, 통상 1 ∼ 100 mM 이 사용된다. 이가 철이온으로서는 이가철을 포함하고, 반응을 저해하지 않는 것이면, 어느것이라도 사용할 수가 있다. 예를 들면 황산 제 1 철 등의 황화물, 염화제 1 철 등의 염화물, 탄산 제 1 철 등 외에, 시트르산염, 락트산염, 푸마르산염 등과 같은 유기산염 등을 들 수가 있다.
또 반응에는 2 -케토글루타르산이 필요로되나, 반응액에 2 - 케토글루타르산을 첨가하여도 좋고, 혹은 사용하는 균체 및 균체 처리물이 갖는 대사활성에 의해서 2 - 케토글루타르산으로 전환할 수 있는 화합물을 사용하여도 좋다. 이와 같은 화합물로서는 글루코오스와 같은 당질, 글루탐산, 숙신산 등을 들 수 있다. 이것들의 화합물은 단독으로 사용하여 좋고, 혹은 복수를 병용하여도 좋다.
수성매체로서는 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 메탄올등의 알콜류, 에틸아세테이트 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드류를 들 수 있다.
반응은 L - 프롤린을 수산화하여 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성하는 반응을 촉매하는 활성을 갖고 있는 상기 미생물의 배양물 중에서 수행하여도 좋고, 이 배양물로부터 분리한 균체, 이 균체의 처리물 혹은 정제효소나 조(粗)효소를 사용하여 수성매체 중에서 실시하여도 좋다.
반응은 통상 15 ∼ 50 ℃, pH 6.0 ∼ 9.0 에서 1 ∼ 96 시간 실시한다. 필요에 따라, 균체처리 혹은 반응시에 계면활성제나 유기용제를 첨가한다.
계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌ㆍ 스테아릴아민 (예컨대 : 나이민 S-215,일본유지사제 등), 세틸트리메틸암모늄ㆍ브로마이드, 카티온 FB, 카티온 F2-40E 등의 양이온성 계면활성제, 나트륨올레일아미드황산, 뉴렉스 TAB, 라비졸 80 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌소르비탄 ㆍ 모노스테아레이트 (예를 들면, 노니온 ST 221) 등의 양성 계면활성제, 기타 3차아민 PB, 헥사데실디메틸아민 등을 들 수 있고, 반응을 촉진하는 것이면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 이것들은 통상 0.1 ∼ 50 mg/ml, 바람직하기는 1 ∼ 20 mg/ml 의 농도로 사용된다.
유기용제로서는, 톨루엔, 크실렌, 지방족 알콜, 벤젠, 에틸 아세테이트 등이 사용된다. 통상 0.1 ∼ 50, 바람직하기는 1 ∼ 20의 농도로 사용된다.
수성매체 중에서 트랜스- 4 - 히드록시 - t - 프롤린을 회수하는 방법으로서는, 이온교환수지 등을 사용하는 칼럼 크로마토그래피 혹은 정출법(晶出法) 등, 통상의 분리방법이 사용된다. 회수된 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린은13C-NMR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼, 매스 스펙트럼, 비선광도(比旋光度) 등의 통상의 분석수단에 의해서 그의 구조를 확인할 수가 있다.
다음에 본 발명의 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소의 취득방법을 표시한다.
이 효소는 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 배양물 중에 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 생성 축적시키고, 이 배양물로부터 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 채취함으로써 수득된다.
L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 생산하는 능력을 갖는 미생물이면, 야생균주라도, 그의 계대 배양물, 돌연변이체, 유도체 등 어느 미생물이라도 사용할 수가 있다. 적합한 예로서는, 다크틸로스포란지움(Dactylosporangium) 속에 속하고, 또한 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 생산하는 미생물을 들 수 있다. 구체적으로는 상술한 다크틸로스포란지움 종 (Dactylosporangium sp.) RH 1 (FERM BP-4400), 혹은 이것들의 균주의 계대 배양물, 돌연변이체, 유도체 등을 들 수 있다.
이와 같은 미생물을 배양하는 배지는 미생물이 동화할수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양을 효율적으로 수행할수 있는 배지라면 천연배지, 합성배지의 어느 것이라도 좋다. 탄소원으로서는 각각의 미생물이 동화할 수 있는 것이면 좋고, 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 이것들을 함유하는 당밀, 전분 혹은 전분가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류가 사용된다.
질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기산이나 유기산의 암모늄염, 기타 질소함유 화합물, 및 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 콘스팁리커, 카세인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물 등이 사용된다.
무기물로서는 인산제 1 칼륨, 인산제 2 칼륨, 인산마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼륨 등이 사용된다.
배양은 진탕 배양 또는 심부통기교반 배양 등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양온도는 15 ∼ 37 ℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 16 ∼ 96 시간이다.
배양중 pH 는 5.0 ∼ 9.0 로 유지한다. pH 의 조정은 무기 혹은 유기의 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼륨, 암모니아 등을 사용하여 실시한다. 배양시, 필요에 따라 L - 프롤린을 첨가하여도 좋다.
이와 같이 배양하여 수득된 균체 중에 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소가 생성되고 있는 것은, 배양물 중 혹은 이 균체 혹은 균체 처리물을 함유하는 효소 반응에 적합한 수성 매체중에 L - 프롤린, 이가 철이온, 2 - 케토글루타르산과 함께 가하고, 또 필요에 따라 계면활성제나 유기용제를 첨가함으로써, L - 프롤린을 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린으로 변환시킴으로써 알 수가 있다.
이 반응에 의해서 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 생성이 확인됨으로써, 균체 중에 생성이 확인되는 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소의 활성은 이하와 같은 방법에 의해 측정할 수가 있다. 효소활성은 하기 측정 조건하, 1 분간에 1 nmol 의 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성하는 활성을 1 단위 (U) 로서 표시한다.
4 mM L - 프롤린, 8 mM 2 - 케토글루타르산, 2 mM 황산 제 1 철 및 4 mM L - 아스코르브산을 함유하는 80 mM 의 MES 완충액 (pH 6.5) 에 효소 표품을 첨가하여 합계 250로 하고, 30 ℃, 20 분간 반응시킨다. 반응액을 100 ℃, 2 분간 가열하여 반응을 정지시킨 후에, 반응액 중에 생성된 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 정량한다.
정량에는 트랜스- 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 정량할 수 있는 방법이면 어느 방법을 사용하여도 좋으나, 예컨대 통상 고속 액체 크로마토그래피를 사용한 포스트 칼럼 유도체화법 혹은 반응액 중의 목적화합물을 미리 NBD 유도체화해 두고, 이것을 고속 액체 크로마토그래피를 사용한 역상 크로마토그래피에 걸어서 NBD 유도체화물을 분리후, 그의 형광(여기(勵起) 파장 503 nm, 형광 파장 541 nm)을 사용하여 정량하는 방법(예비 칼럼 유도체화법) 등을 들 수 있다. 그리고, 예비 칼럼 유도체화법에 의한 검출은 윌리암 제이 린드블래드 및 로버트 에프 디겔만 등의 방법 [William J. Lindblad and Robert F. Diegelmann, 아날리티칼 바이오케미스트리 (Analytisal Biochemistry), 138 권, 390 ∼ 395 면, 1984 년] 에 따라 실시한다.
배양액으로부터 효소를 단리 정제하는데는, 통상의 효소의 단리, 정제법을 사용하면 좋다. 예컨대 배양액을 원심분리하여 집균하여 충분히 세정한 후에, 초음파 균체 파쇄기, 프렌치ㆍ 프레스, 만톤ㆍ 가울린ㆍ 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 균체를 파쇄하고, 무세포 추출액을 수득한다. 원심분리후의 상청액을 황산 암모늄 등에 의한 염석, 디에틸아미노에틸 (DEAE) - 세파로스 등의 음이온 교환 크로마토그래피, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 소수성 크로마토그래피, 레드아가로오스 등의 색소 어피니티 크로마토그래피, 분자체(molecular sieve)를 사용한 겔 여과법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등을 실시하여 정제 효소표품을 수득하였다.
수득된 효소표품의 이화학적 특징은, 통상의 효소학적 수법에 의해 특정할 수 있다.
이와같이 하여 수득된 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소는 하기 (1) ∼ (10) 의 이화학적 성질을 갖는다.
(1) 작용 및 기질 특이성
2 - 케토글루타르산 및 2 가 철이온의 존재하, 유리인 L - 프롤린에 작용하여, 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성한다.
(2) 최적 pH
상기 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소의 활성 측정법에 있어서, 반응액 성분중의 완충액 성분을, pH 3.5 ∼ 5.5 는 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.5 ∼ 6.5 는 MES 완충액, pH 7.0 ∼ 7.5 는 TES 완충액 [N - 트리스 (히드록시메틸) 메틸 - 2 - 아미노에탄술폰산], pH 8.0 ∼ 9.0 은 TAPS 완충액 [N - 트리스 (히드록시메틸) 메틸 - 3 - 아미노프로판술폰산], pH 9.5 ∼ 11.0 은 CAPSO 완충액 (3 - N - 시클로헥실아미노 - 2 - 히드록시프로판 - 술폰산) 으로 치환하여 반응을 실시한 결과 최적 pH 는 pH 6.0 ∼ 7.0 였다.
(3) pH 안정성
본 효소를 50 mM 완충액 [pH 3.5 ∼ 5.5 는 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.5 ∼ 6.5 는 MES 완충액, pH 7.0 ∼ 7.5 는 TES 완충액, pH 8.0 ∼ 9.0 는 TAPS 완충액, pH 9.5 ∼ 11.0 는 CAPSO 완충액], 2 mM 디티오트레이톨 (DTT) 및 20 % (V/V) 글리세롤 존재하, 4℃, 24 시간 유지한다. 유지후, 활성을 측정한다. pH 6.5 ∼ 10.0 의 범위에서 유지한 효소는 유지전의 활성의 90 % 이상의 활성을 갖고 있으며, pH 6.5 ∼ 10.0 의 범위에서 활성은 안정적으로 유지된다.
(4) 최적온도
상기 L- 프롤린 4 위치 수산화 효소 활성 측정법에 있어서, 여러가지로 온도를 바꾸어서 활성을 측정한 결과, pH 6.5, 15 분간의 반응에 있어서, 30 ∼ 40 ℃ 에 최적온도를 갖는다.
(5) 온도 안정성
본 효소를 pH 9.0, 50 ℃, 30 분간 처리함으로써, 안전하게 실활한다.
(6) 저해제
본 효소활성은 Zn++및 Cu++의 금속이온 및 EDTA 에 의해서 저해된다. 상기 L -프롤린 4 위치 수산화 효소 활성 측정법에 있어서, Cu++및 Zn++이온을 각각 1 mM 의 농도로 가하여 활성을 측정한 바, 활성은 각각 무첨가시의 13 % 및 6 % 로 저하하였다. 또 동일하게 EDTA 를 5 mM 첨가하여 활성을 측정한 바, 활성은 검출할 수 없었다.
(7) 활성화
본 효소에 관하여 각종 금속이온 및 보효소류에 의한 활성화는 관찰 되지 않으며, 본 효소의 활성화에는 보효소를 필요로하지 않는다. 반응액에의 아스코르브산의 첨가는 반응을 촉진한다.
(8) Km 치
80 mM 의 MES 완충액, pH 6.5, 4 mM L - 아스코르브산, 2 mM 황산 제 1 철 및 효소표품을 함유하는 반응액 중에서 측정한 L - 프롤린에 대한 Km 치는 0.27 mM, 2 - 케토글루타르산에 대한 Km 치는 0.55 mM 였다.
(9) 분자량
분자량은 도데실 황산나트륨 - 폴리아크릴 아미드 전기 영동법 (ATTO 사제, 폴리아크릴 아미드겔 PAGEL NPU-12.5 L 및 바이오래드사제 분자량 스탠더드 SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range 를 사용) 에 의한 측정에서, 32,000 ±5,000 달톤으로 계산되었다. 또 고속액체 크로마토그래피를 사용한 겔 열과법 (칼럼 G-3000SW, 21.5 mm ×60 cm, 오리엔탈이스트사제 HPLC 용 분자량 마커를 표준으로서 사용) 에 의한 측정에서 43,800 ±5,000 달톤으로 산출되었다.
(10) N 말단 아미노산 배열
시마쓰 제작소사제 Protein sequencer model PPSQ-10 을 사용하여 분석한 결과, 본 효소 단백의 N 말단 아미노산 배열은 이하와 같이 결정되었다.
이하에 본 발명의 실시예를 기술한다.
실시예
실시예 1
트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 생성
SR3 배지 [글루코오스 1.0 %, 가용성 전분 1.0 %, 효모 추출액 0.5 %, 트립톤 0.5 %, 고기의 추출물 0.3 % 및 인산마그네슘 0.05 % 을 함유하고, 6N NaOH 로 pH 7.2 로 조정한 배지] 를 시험관 (지름 25 mm ×200 mm) 에 10 ml 씩 분주(分注)하고, 120 ℃, 20 분간 살균하였다. 이 배지에 HT 한천 평판 배지[가용성 전분 1 %, NZ 아민 0.2 %, 효모추출물 0.1 %, 고기 추출물 0.1 % 및 한천 1.5 % 를 함유하고 6N NaOH 로 pH 7.2 로 조정후, 120 ℃, 20 분간 살균 처리한 배지] 에 생육한 다크틸로스포란지움 종 (Dactylosporangium sp.) RH 1 을 1 백금이(白金耳) 식균하고, 28 ℃, 2 일간 진탕 배양하여, 종 배양액으로서 사용한다.
한편, Df1 배지 [가용성 전분 5 %, 소이빈밀 1.5 %, 인산 1 칼륨 0.05 %, 황산 마그네슘 7 수염 0.05 % 및 탄산칼슘 0.5 % 를 함유하고, 6N NaOH 로 pH 7.0 로 조정한 배지] 를 시험관 (지름 25 mm ×200 mm) 에 10 ml 씩 분주하고, 120 ℃, 20 분간 살균하였다. 이 배지에 종배양액 1 ml 를 무균적으로 접종하고, 28 ℃, 2 일간 진탕 배양하였다. 수득된 배양액을 7,000 ×g, 10 분간, 4 ℃ 에서 원심분리하였다. 수득된 균체를 80 mM TES 완충액 (pH 7.5) 으로 세정후, 원심분리하였다. 수득된 습균체 150 mg 을 1.5 ml 의 반응액 [4mM L - 프롤린, 8 mM α- 케토글루타르산, 4 mM L - 아스코르브산 및 2 mM 황산 제 1 철을 함유하는 8.0 mM TES 완충액 (pH 7.5) 에 나이민(Nymeen) 용액 (나이민 S-215 (일본유지 (주) 제) 4 g 을 크실렌 10 ml 에 용해) 을 1.4 % (v/v) 첨가한 액] 에 현탁하고, 30 ℃, 2 시간 반응을 실시하였다.
반응후, 균체 반응액으로 부터 균체를 원심분리에 의해 제거한 상청액 중에 생성된 히드록시프롤린에 관하여 분석을 하였다.
분석은 고속 액체 크로마토그래피로 이하의 조건으로 분석하였다. 검출은 목적화합물을 칼럼 용출후, 송액 라인상에서 NBD 유도체화하고, NBD 유도체화물의 형광을 측정함으로써 실시하였다.
고속 액체 크로마토그래피 분석조건
[1] 장치 :
시마쓰제작소제 고속 액체 크로마토그래피
[2] 사용 칼럼 : (주) 주화분석센타 제 SUMCHIRAL OA 5000
[3] 분석 조건 :
그 결과, 반응액 중에 249(32.6 mg/l) 의 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린이 생성되고 있는 것이 확인되었다.
실시예 2
트랜스 - 4 - 히드록시 - l - 프롤린의 정제
실시예 1 에 있어서의 종 배양을, SR 3 배지 200 ml 을 분주한 2 l 삼각 플라스크를 사용하여 실시하였다. 미리 5 l 자(jar)-발효조에 분주후, 120 ℃, 20 분간 살균한 2 l 의 Df 1 배지에, 이의 종배양을 무균적으로 접종하고, 700 rpm, 1 vvm 의 조건으로 28 ℃, 2 일간 배양하였다. 배양중의 pH 는 조정하지 않았다. 수득된 배양액을 7,000 ×g, 10 분간, 4 ℃ 에서 원심분리하고, 습균체를 배양액 1 l 당 75 g 을 수득하였다. 습균체는 4 ℃ 에서 생리식염수로 세정하고, 원심후 사용시까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다. 본 습균체 400 g 을 2 l 의 실시예 1 에 기재된 반응액에 현탁하고, 3 l 비커 중, 교반하면서, 30 ℃, 4 시간, 반응을 실시하였다.
반응후, 균체 반응액으로 부터 균체를 원심분리 제거한 상청액 중에 생성된 히드록시 프롤린에 관하여 분석을 하였다. 그 결과, 반응액 중에 480(63.0 mg/l) 의 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린이 생성되고 있는 것이 확인되었다.
반응액 상청액을 pH 4.5 로 조정한 후에, 이온 교환수지 다이아이온 SK1B (NH4 +형, 미쓰비시가세이사제) 200 ml 을 충전한 칼럼을 통과시켰다. 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 함유하는 분획을 감압하 농축후, 이온교환수지 다이아이온 PA 412 (OH+형, 미쓰비시가세이사제) 20 ml을 충전한 칼럼에 통과시켰다. 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 함유하는 분획을 감압 농축후 pH 를 9.6 으로 한 후에, 10 % 용량의 o - 프탈알데히드 용액 (0.075 g/ml 에탄올 용액) 및 2 % 용량의 β- 메르캅토에탄올용액 (10 % v/v 수용액) 을 가하여, 60 ℃, 5 분간 유지하고, 1차 아미노산의 불순물을 o - 프탈알데히드화하였다. 이 혼합액을 세파비이즈 SP207 (미쓰비시가세이사제) 10 ml 을 충전한 칼럼을 통과시키고, o - 프탈알데히드화한 1차 아미노산의 불순물과, 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 분리하였다. 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 함유하는 분획을 감압농축후, 재차 이온 교환수지 다이아이온 PA412 (OH-형, 미쓰비시가세이사제) 20 ml 을 충전한 칼럼에 통과시키고, 트랜스- 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 함유하는 분획을 수득하였다. 본 분획을 농축 건조시켜서 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 백색결정 78 mg 을 수득하였다 (수율 62 %). 본 백색결정을 분석한 결과,13C-NMR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼, 매스 스펙트럼, 비선광도 등이, 트랜스- 4 - 히드록시 - L - 프롤린 표준품 (나칼라이테스크 (주)) 과 일치하였다.
실시예 3
트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 생성
SR 3 배지를 시험관 (지름 25 mm ×200 mm) 에 10 ml 씩 분주하여, 120 ℃, 20 분간 살균하였다. 이 배지에 HT 한천 평판 배지에 생육한 아미콜라톱시스종 (Amycolatopsis sp.) RH 2 를 1 백금이 식균하고, 28 ℃, 2 일간 진탕 배양하고, 종배양액으로서 사용하였다.
한편, Df 1 배지를 시험관 (지름 25 mm ×200 mm) 에 10 ml 분주하고, 120 ℃, 20 분간 살균하였다. 이 배지에 종배양액 1 ml 을 무균적으로 접종하고, 28 ℃, 2 일간 진탕 배양하였다. 수득된 배양액을 7,000 ×g, 10 분간, 4 ℃ 에서 원심 분리하였다. 수득된 균체를 100 mM TES 완충액 (pH 7.5) 으로 세정후, 원심분리하였다. 수득된 습균체 100 mg 을 1 ml 의 반응액 [ 5 mM L - 프롤린, 5 mM α- 케토 - 글루타르산, 5 mM L - 아스코르브산 및 1 mM 황산 제 1 철을 함유하는 100 mM TES 완충액 (pH 7.5) 에 나이민 용액 (나이민 S-215 (일본유지 (주) 제) 4 g 을 크실렌 10 ml 에 용해) 을 1.4 % (v/v) 첨가] 에 현탁하고, 30 ℃, 3 시간반응을 실시하였다.
반응 후, 균체 반응액으로 부터 균체를 원심분리에 의해 제거한 상청액 중에 생성된 히드록시 프롤린에 관하여 분석을 하였다.
분석 및 검출은 실시예 1 에 준하여 실시하였다.
그 결과, 반응액 중에 25(3.3 mg/l) 의 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린이 생성되고 있는 것이 확인되었다.
실시예 4
트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 정제
실시예 3 에 있어서 종배양을 SR 3 배지 200 ml 을 분주한 2 l 삼각 플라스크를 사용하여 실시하였다, 미리 5 l 자-발효조에 분주후, 120 ℃, 20 분간 살균한 2 l 의 Df 1 배지에 이 종배양을 무균적으로 접종하고, 700 rpm, 1 vvm 의 조건으로 28 ℃, 2 일간 배양하였다. 배양중의 pH 는 조정하지 않았다. 수득된 배양액을 7,000 ×g, 10 분간, 4 ℃ 에서 원심분리하고, 습균체를 배양액 1 l 당 75 g 을 수득하였다. 본 습균체 400 g 을 2 l 의 실시예 3 에 기재된 반응액에 현탁하고, 3 l 비커중, 교반하면서, 30 ℃, 4 시간 반응을 실시하였다.
반응액의 상청액을 pH 4.5 로 조정한 후에, 이온 교환수지 다이아이온 SK1B (NH4 +형, 미쓰비시가세이사제) 200 ml 을 충전한 칼럼에 통과시켰다. 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 함유하는 분획을 감압 농축후, 이온교환수지 다이아이온 PA 412 (OH-형, 미쓰비시가세이사제) 20 ml 를 충전한 칼럼에 통과시켰다. 트랜스 - 4 -히드록시 - L - 프롤린을 함유하는 분획을 감압 농축한후, pH 9.6 로 한 후에, 10 % 용량의 o -프탈 알데히드 용액 (0.075 g/ml 에탄올 용액) 및 2 % 용량의 β- 메르캅토에탄올 용액 (10 %, v/v 수용액) 을 가하여, 60 ℃, 5 분간 유지하고, 1차 아미노산의 불순물을 o -프탈알데히드화하였다. 이 혼합액을 세파비이즈 SP207 (미쓰비시가세이사제) 10 ml 를 충전한 칼럼에 통과시키고, o - 프탈알데히드화한 1차 아미노산의 불순물과 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 분리하였다. 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 함유하는 분획을 감압농축후, 재차 이온 교환수지 다이아이온 PA412 (OH-형, 미쓰비시가세이사제) 20 ml 을 충전한 칼럼에 통과시키고, 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 함유하는 분획을 수득하였다. 본 분획을 농축건조시켜, 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린의 백색결정 4.8 ml 을 수득하였다 (수율 62 %).
본 백색결정을 분석한 결과,13C-NMR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼, 매스 스펙트럼 비선광도 등이 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린 표준품(나칼라이테스크 (주)) 과 일치하였다.
실시예 5
L - 프롤린 4 위치 수산화 효소의 단리 및 정제
(1) 무세포 추출액의 조제
실시예 2 에서 수득한 동결균체 600 g 을 융해후, 3 l 의 완충액 A [2 mM DTT, 0.2 mM EDTA 및 20 % (v/v) 글리세롤을 함유하는 50 mM TAPS 완충액 (pH 9.0)] 에 빙냉하에서 현탁하였다. 현탁액을 다이노밀(DYN0- MILL, WILLY A BACHOFEN MASCHINENFABRIK, BASEL, 스위스) 로 처리하고, 균체를 파쇄하였다. 이 처리액을 4 ℃, 6,500 ×g, 30 분간 원심분리하고 상청액을 취득하였다.
이 이후의 조작은 모두 빙냉하 내지는 4 ℃ 에서 수행하였다.
(2) 칼럼 크로마토그래피에 의한 단리 및 정제
(2) - 1 스트림라인
상기 공정에서 수득한 상청액을 완충액 A 로 평형화하여둔 DEAE 흡착체 300 ml 을 충전한 파르마시아사제 스트림라인 (STREAMLINETM) 에 통과시키고, L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 함유하는 분획을 0.3 M 의 식염을 함유하는 완충액 A 로 용출하였다.
(2) - 2 DEAE 세파로스 칼럼 크로마토그래피
상기 공정에서 수득한 활성분획을 완충액 A 로 3 배로 희석 후, 미리 완충액 A 로 평형화해둔 DEAE 세파로스칼럼 (5 cm ×15 cm) 에 통과시켰다. 칼럼을 완충액 A 로 세정후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 A 중에 작성한 0 에서 0.3 M 까지의 식염의 직선농도 구배를 사용하여 용출하였다.
(2) - 3 부틸 세파로스 칼럼 크로마토그래피
상기 공정에서 수득한 활성분획에 3 M 농도로 되도록 식염을 첨가 용해시키고, 미리 3 M 식염을 함유하는 완충액 A 로 평형화해둔 부틸세파로스 칼럼 (Butyl Sepharose 4 Fast Flow, 2.6 cm ×13 cm) 에 걸었다. 효소를 3 M 식염을 함유하는 완충액 A, 1.98 M 식염을 함유하는 완충액 A, 0.99 M 식염을 함유하는 완충액 A 및 완충액 A 만의, 식염농도가 다른 4 종류의 완충액으로 식염농도가 높은 쪽부터 낮은 쪽으로 단계적으로 용출시켰다.
(2) - 4 페닐세파로스 칼럼 크로마토그래피
상기 공정에서 수득한 활성분획에 3 M 농도로 되도록 식염을 첨가 용해시키고, 미리 3 M 식염을 함유하는 완충액 A 로 평형화 해둔 페닐세파로스 칼럼 (Phenyl Sepharose HP Hiload 16/10, 1.6 cm ×10 cm) 에 통과시켰다. 3 M 식염을 함유하는 완충액 A 로 세정후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 A 로 용출시켰다.
(2) - 5 색소 어피니티 칼럼 크로마토그래피
상기 공정에서 수득한 활성분획을 파르마시아사제 PD-10 칼럼을 사용하여 탈염후, 미리 완충액 A 로 평형화하여둔 리액티브 레드 120 칼럼 (시그마사제 Reactive red 120, 1 cm ×12.7 cm) 에 통과시켰다. 완충액 A 로 세정후, 이 효소를 함유하는 분획을 완충액 A 중에 작성한 0 에서 1.5 M 까지의 식염의 직선농도 구배를 사용하여 용출하였다.
(2) - 6 리소스 Q 칼럼 크로마토그래피
상기 공정에서 수득한 활성분획을 완충액 B [2mM DTT, 0.1 % (v/v) Tween 20 및 20 % (v/v) 글리세롤을 함유하는 50 mM TAPS 완충액 (pH 8.0)] 으로 평형화한 파르마시아사제 PD-10 칼럼을 사용하여 탈염후, 미리 완충액 B 로 평형화해둔 리소스 Q 칼럼 (파르마시아사제 RESOURCETMQ, 1ml)에 통과시켰다. 완충액 B 중에 작성한 0 으로 부터 0.2 M 까지의 식염의 직선농도 구배를 사용하여 용출시켰다.
L - 프롤린 4 위치 수산화 효소의 단리 및 정제의 개요를 제 5 표에 종합하였다.
실시예 6
L - 프롤린 4 위치 수산화 효소의 성질
(1) 전기 영동에 의한 분석
실시예 5 에서 수득된 정제표품을 도데실황산나트륨 - 폴리아크릴아미드 전기 영동법 (ATTO 사제 폴리아크릴아미드겔 PAGEL NPU-12.5L 및 바이오 래드사제 분자량 스탠더드 SDS-PAGE Molecular Weight Standard, Broad Range 를 사용) 에 의해서 분석하였다. 그 결과 본 효소는 분자량 약 32,000 ±5,000 달톤의 대략 균일한 서브유닛으로 구성되는 것이 명백히 되었다.
(2) 효소반응에 관한 성질
이하의 반응액을 사용하여 반응성분의 기질생략 시험 (오미션 시험) 및 첨가물 시험을 한 바, L - 프롤린 4 위치 수산화 효소반응의 필수화합물, 촉진화합물, 저해화합물을 검토하였다.
기본으로 되는 반응액 조성은 4 mM L - 프롤린, 8 mM 2 - 케토글루타르산, 2 mM 황산 제 1 철, 4 mM L - 아스코르브산, 카탈라아제 2 mg/ml 및 효소표품을 함유하는 80 mM TES 완충액 (pH 9.5) 으로 액량은 계 500로 하였다. 반응은 효소의 첨가에 의해서 개시하고, 30 ℃, 15 분간 수행하였다. 반응액을 100 ℃ , 2 분간 가열함으로써, 반응을 정지하였다. 반응액 중에 생성된 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린 량을 예비 칼럼 유도체화법에 의해서 정량하였다. 반응액 100에, 0.3 M 붕산 완충액 (pH 10.7) 100, 10 % (v/v) 메르캅토에탄올 수용액 4및 5 % (w/v) o - 프탈알데히드의 에탄올 용액 16을 첨가하여 60 ℃, 30 초 방치하였다. 또 2 % (w/v) NBD 클로라이드의 에탄올 용액 50을 가하여, 60 ℃, 40 분간 반응시켰다. 1 N 염산 30을 가하여 반응을 정지후, 침전을 원심 및 필터여과에 의해 제거한후, 고속액체 크로마토그래피에 의해 분석을 하고, 생성된 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 정량하였다.
고속 액체 크로마토그래피는 이하의 조건으로 실시하였다.
이동상 : 10 mM 시트르산 (pH 4.0) / 메탄올 = 3/1 (v/v)
유속 : 1 ml/분
칼럼 : YMC Pack ODS AQ-312 (YMC 사제, 6 ×150 mm)
칼럼온도 : 50 ℃
검출 : 형광검출, 여기 파장 503 nm, 형광 파장 541 nm.
그 결과, L - 프롤린 4 위치 수산화 효소 반응에는 L - 프롤린, 2 - 케토글루타르산, Fe++이온이 필수이며, L - 아스코르브산은 반응을 촉진하고, 또 Zn++, Cu++이온 및 EDTA 의 첨가는 반응을 저해하였다.
결과를 제 6 표에 표시하였다.
1) 표준반응액 성분은 4 mM L - 프롤린, 8 mM 2 - 케토글루타르산, 2 mM 황산 제 1 철, 4 mM L - 아스코르브산, 카탈라아제 2 mg/ml 및 효소표품을 함유하는 80 mM TES 완충액, pH 7.5 이며, 액량은 계 500, 반응은 30 ℃, 15 분간.
2) 첨가물 (+) 은 표준 반응액에 표중 - 로 표시한 화합물을 첨가하여 반응을 실시하였다. 무첨가 (-) 는 표준 반응액으로 부터 표중 - 로 표시한 농도는 반응액 중의 농도를 나타낸다.
3) 활성은 표준 반응액에서의 활성을 100 으로 하여 상대치로 표시하였다.
(3) 최적 pH
L - 프롤린 4 위치 수산화 효소의 활성 측정법에 있어서, 반응액 성분 중의 완충액 성분을, pH 3.5 ∼ 5.5 는 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.5 ∼ 6.5 는 MES 완충액, pH 7.0 - 7.5 는 TES 완충액, pH 8.0 ∼ 9.0 는 TAPS 완충액, pH 9.5 ∼ 11.0 는 CAPSO 완충액으로 치환하여 반응을 실시한 결과, pH 6.0 ∼ 7.0 로 최고활성의 90 % 이상의 활성을 나타냈다. 결과를 제 7 표에 표시하였다.
(4) pH 안정성
본 효소를 50 mM 완충액 [pH 3.5 ∼ 5.5 는 나트륨 아세테이트 완충액, pH5.5 ∼ 6.5 는 MES 완충액, pH 7.0 ∼ 7.5 는 TES 완충액, pH 8.0 ∼ 9.0 는 TAPS 완충액, pH 9.5 ∼ 11.0 은 CAPSO 완충액], 2mM DTT 및 20 % (v/v) 글리세롤 존재하, 4 ℃, 24 시간 유지한 후 활성을 측정하였다.
pH 6.5 ∼ 10.0 의 범위에서 유지한 효소는 유지전의 활성의 90 % 이상의 활성을 갖고 있으며, pH 6.5 ∼ 10.0 의 범위에서 활성은 안정적으로 유지되었다.
(5) 최적 온도
L - 프롤린 4 - 위치 수산화 효소의 활성 측정법에 있어서, 15 ∼ 50 ℃ 의 온도범위에서 15 분간 반응을 실시한 결과, 30 ∼ 40 ℃ 에서 최고활성의 90 % 이상의 활성을 나타낸다. 결과를 제 8 표에 표시하였다.
(6) 온도 안정성
본 효소를 2 mM DTT, 0.1 % (v/v) Tween 20 및 20 % (v/v) 글리세롤을 함유하는 50 mM TAPS 완충액 (pH 9.0) 중에서 0 ∼ 60 ℃ 의 온도범위에서 30 분간 유지한 후, 활성 측정을 한 결과, 본 효소는 50 ℃, 30 분간의 처리로 완전히 실활(失活)하였다.
(7) N 말단 아미노산 배열
시마쓰제작소사제 Protein sequencer model PPSQ-10을 사용하여 본 효소단백의 N 말단 아미노산 배열을 분석한 결과, 이하의 결과를 얻었다.
실시예 7
L - 프롤린의 수산화
실시예 5 에서 수득한 정제 효소 표품을 사용하여 L - 프롤린의 수산화를 하였다. 20 mM L - 프롤린, 20 mM 2 - 케토글루타르산, 5 mM L- 아스코르브산, 2 mM 황산 제 1 철 및 9C U 의 정제 효소표품을 함유하는 200 mM MES 완충액 (pH 6.5) 50을 사용하여 35 ℃, 30 분간 반응을 실시하였다. 그 결과, 반응액 중에는 12.9 mM (1.7 g/l) 의 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린이 생성되었다.
본 발명에 의하면 발효법에 의해서 당원으로 부터 공업적으로 생산되고 있는 L - 프롤린을 직접 미생물적 혹은 효소적으로 수산화함으로써 공업적으로 유리하게 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 제조하는 방법, 이 제조법에 유용한 L - 프롤린 4 위치 수산화 효소를 제공할 수가 있다.
[ 배열표 ]
배열 번호 : 1 배열 길이 : 27
배열의 형 : 아미노산 토폴리지 : 직쇄상
배열의 종류 : 펩티드
기원 :
생물명 : 다크틸로스포란지움 종 (Dactylosporangium sp.)
균주명 : RH 1 (FERM BP-4400)
배열 :
Claims (5)
- 수성매체 중에 L-프롤린의 4-위치에서 L-프롤린을 수산화하는 반응을 촉매하는 효소원, 이가 철이온, 2-케토글루타르산과 L-프롤린을 공존시켜, L-프롤린을 트랜스-4-히드록시- L-프롤린으로 변환시키고; 트랜스-4-히드록시-L-프롤린을 이 수성매체로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 제조법으로서, 효소원이 2-케토글루타르산 및 이가 철이온의 존재 하에 L-프롤린의 4-위치에서 L-프롤린을 수산화하는 반응을 촉매하는 효소 활성을 갖는 미생물의 배양물, 균체, 균체처리물, 또는 미생물로부터 유래한 정제효소 또는 조(粗)효소로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 미생물이 다크틸로스포란지움 (Dactylosporangium) 속 또는 아미콜라톱시스(Amycolatopsis) 속에 속하는 미생물인 제조법.
- 제 1 항에 있어서, L - 프롤린으로부터 트랜스- 4 - 히드록시 - L - 프롤린으로의 변환을 미생물의 배양액 중에서 실시하는 것을 특징으로 하는 제조법.
- 제 1 항에 있어서, 효소원이 하기의 이화학적 성질을 나타내는 L - 프롤린 4-위치 수산화 효소인 제조법.(1) 작용 및 기질 특이성2 - 케토글루타르산 및 2가 철이온의 존재하, 유리의 L - 프롤린에 작용하여, 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성한다.(2) 최적 pH30 ℃, 20 분간의 반응에서, pH 6.0 ∼ 7.0 에 최적 pH 를 갖는다.(3) pH 안정성4 ℃, 24 시간의 처리로, pH 6.5 ∼ 10.0 의 범위에서 안정적으로 유지된다.(4) 최적 온도pH 6.5, 15 분간의 반응에서, 30 ∼ 40℃ 에 최적온도를 갖는다.(5) 온도 안정성pH 9.0, 50 ℃, 30 분간의 처리로 완전히 실활한다.(6) 저해제Zn++및 Cu++의 금속이온 및 에틸렌디아민 테트라아세트산에 의해 저해를 받는다.(7) 활성화활성화에는 보효소를 필요로 하지 않는다.반응액에의 L - 아스코르브산의 첨가는 반응을 촉진시킨다.(8) Km 치80 mM 의 2 - (N - 모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충액 (pH 6.5) 중에 4 mM L - 아스코르브산, 2 mM 황산 제 1 철 및 효소표품을 함유하는 반층액 중에서 측정한 L - 프롤린에 대한 Km 치는 0.27 mM 이며, 2 - 케토글루타르산에 대한 Km 치는 0.55 mM 이다.(9) 분자량도데실 황산 나트륨 - 폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의한 측정으로, 32,000 ±5,000 달톤이며, 겔 여과법에 의해서 측정한 분자량이 43,800 ±5,000 달톤이다.(10) N 말단 아미노산 배열배열번호 1 로 표시되는 N 말단 아미노산 배열을 갖는다.
- 하기의 이화학적 성질을 나타내는 L - 프롤린 4-위치 수산화 효소.(1) 작용 및 기질 특이성2 - 케토글루타르산 및 2 가 철이온의 존재하, 유리의 L - 프롤린에 작용하여, 트랜스 - 4 - 히드록시 - L - 프롤린을 생성한다.(2) 최적 pH30 ℃, 20 분간의 반응에서, pH 6.0 ∼ 7.0 에 최적 pH 를 갖는다.(3) pH 안정성4 ℃, 24 시간의 처리로 pH 6.5 ∼ 10.0 의 범위에서 안정적으로 유지된다.(4) 최적 온도pH 6.5, 15 분간의 반응에서 30 ∼ 40 ℃ 에 최적온도를 갖는다.(5) 온도 안정성pH 9.0, 50 ℃, 30 분간의 처리에서 완전히 실활한다.(6) 저해제Zn++및 Cu++의 금속이온 및 에틸렌디아민 테트라아세트산에 의해 저해를 받는다.(7) 활성화활성화에는 보효소를 필요로 하지 않는다.반응액에의 L - 아스코르브산의 첨가는 반응을 촉진시킨다.(8) Km 치80 mM 의 2 - (N - 모르폴리노) 에탄술폰산 (MES) 완충액 (pH 6.5) 중에 4 mM L - 아스코르브산, 2 mM 황산 제 1 철 및 효소표품을 함유하는 반응액 중에서 측정한 L - 프롤린에 대한 Km 치는 0.27 mM 이며, 2 - 케토글루타르산에 대한 Km 치는 0.55 mM 이다.(9) 분자량도데실 황산 나트륨 - 폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의한 측정으로, 32,000 ±5,000 달톤이며, 겔 여과법에 의해서 측정한 분자량이 43,800 ±5,000 달톤이다.(10) N 말단 아미노산 배열배열번호 1 로 표시되는 N 말단 아미노산 배열을 갖는다.(11) 기원 및 유래다크틸로스포란지움 또는 아미콜라톱시스.
- 다크틸로스포란지움 속에 속하고, 또한 L - 프롤린 4-위치 수산화 효소를 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양하고, 배양물 중에 L - 프롤린 4-위치 수산화 효소를 생성 축적시키고, 이 배양물로 부터 L - 프롤린 4-위치 수산화 효소를 채취하는 것을 특징으로 하는 L - 프롤린 4-위치 수산화 효소의 제조법.
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