DE69713436T2 - Fermentative Herstellung von d-Biotin - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von d-Biotin durch Fermentation.
- d-Biotin ist eines der für die Ernährung von Lebewesen, Pflanzen und Mikroorganismen essentiellen Vitamine und ist als Arzneimittel oder Nahrungsmittelzusatz sehr wichtig. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Herstellung von d- Biotin durch Fermentation in hoher Ausbeute.
- Es gibt viele Untersuchungen über die fermentative Produktion von d-Biotin. Bazillusstämme, die gegen Biotinantimetaboliten resistent sind [siehe japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 152495/1983], und Serratia-Stämme, die gegen Biotinantimetaboliten resistent sind (japanische Kokai Nr. 27980/1990), können 0,6 bis 4,0 mg/l bzw. 4,3 bis 22 mg/l d-Biotin erzeugen. Agric. Biol. Chem. 47(5) 1011-1016 (1983) beschreibt die Züchtungsbedingungen von Bazillus sphaericus, der größere Mengen Biotin erzeugt, wenn dessen Vorstufe zu dem Fermentationsmedium gegeben wird, insbesondere nach einem Tag Züchtung, als wenn es vor der Züchtung zugesetzt wird. Gegen Actithiazinsäure und/oder 5-(2-Thienyl)- valeriansäure resistente Mutanten wurden von B. sphaericus durch Behandlung mit N'-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin induziert. Es wurde gefunden, dass die Züchtung solcher Mutanten als mehr als das 7- bis 12fache Biotin gegenüber unbehandeltem B. sphaericus erzeugte. Jedoch wurde noch nie über die Erzeugung von d-Biotin durch Mikroorganismen, die zu der Gattung Kurthia gehören, welche beständig gegen Biotinantimetaboliten sind, berichtet.
- Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, große Mengen an d-Biotin zu akkumulieren. Es wurde gefunden, dass Mikroorganismen, die zur Gattung Kurthia gehören und die gegen Biotinantimetaboliten resistent sind, beispielsweise Acidomycin (nachstehend als ACM bezeichnet), 5-(2-Thienyl)valeriansäure (TVA), α-Methyldethiobiotin (MeDBT), 2-Methyl-ACM, Amiclenomycin, Bisnorbiotinol und Gemische davon, große Mengen d- Biotin in der Kulturbrühe akkumulieren können, und dass das d-Biotin daraus in guter Reinheit gewonnen werden kann. Es ist somit möglich, d-Biotin durch die vorliegende Erfindung in etwa 5- bis 200fach höheren Ausbeuten herzustellen als jene Ausbeuten, die mit bekannten Methoden unter Anwendung von Stämmen aus der Gattung Bazillus oder Serratia erzielt werden. Somit wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von d-Biotin bereitgestellt, das Züchten eines Mikroorganismus, der zur Gattung Kurthia gehört, wobei der Mikroorganismus gegen Biotin-Antimetaboliten resistent ist und unter aeroben Bedingungen d-Biotin in einem Medium erzeugen kann und Trennen des erhaltenen d-Biotins aus der Fermentationsbrühe umfasst.
- Der Gehalt des in der Kulturbrühe akkumulierten d- Biotins kann durch das Trübungsverfahren [J. Microbiological Methods, 6, 237-245 (1987)] mithilfe von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 56, 95-98 (1944)] bestimmt werden.
- Mikroorganismen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen alle die d-Biotin-erzeugenden Mikroorganismen ein, die zu der Gattung Kurthia gehören [siehe Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9. Ausgabe, Band 2, 1255 (1984)] und gegen die wie vorstehend erwähnten Biotinantimetaboliten resistent sind. Die vorstehend erwähnten Mikroorganismen können wirksam durch Behandeln der zur Gattung Kurthia gehörenden Stämme als Elternstämme mit einem Mutagen, beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (nachstehend als NTG bezeichnet), Ethylmethansulfonat, Acridin orange, W- oder Röntgenstrahlen, erhalten werden.
- Ein beliebiger zur Gattung Kurthia gehöriger Stamm kann als Elternstamm zum Erzeugen der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen eingesetzt werden. Die zu der Gattung Kurthia gehörenden Mikroorganismen können aus natürlichen Quellen isoliert werden oder können aus Kulturensammlungen bezogen werden. Kurthia sp. 538-6 (DSM-Nr. 9454) wird vorzugsweise für die vorliegende Erfindung verwendet. Die Mikroorganismen, die große Mengen d-Biotin erzeugen können, können durch Isolieren eines zur Gattung Kurthia gehörenden und gegen resistenten Biotinantimetaboliten-Mikroorganismus, wie jene, die vorstehend erwähnt wurden, erhalten werden. Beispielsweise wurde eine Mutante von Kurthia sp. 538-6 (DSM-Nr. 9454) unter Herstellen großer Mengen d-Biotin, wie nachstehend beschrieben, isoliert.
- Zellen von Kurthia sp. 538-6 (DSM-Nr. 9454), gezüchtet in einem flüssigen Medium, wurden durch Zentrifugierung geerntet, gewaschen und in Salzlösung suspendiert. Die Mutagenese wurde durch das Verfahren von Adelberg et al. [Biochem. Biophys. Res. Comm., 18, 788 (1965)] wie nachstehend beschrieben ausgeführt. Die Zellen wurden mit 50 bis 300 ug/ml NTG in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, unter Schütteln behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen gewaschen und in Salzlösung resuspendiert. Die gewaschenen Zellen wurden über Agarplatten eines d-Biotin-freien Synthesemediums, umfassend 20 g Glycerin, 5 g vitaminfreie Casaminosäuren (Difco), 2 g K&sub2;HPO&sub4;, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,01 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4;·5H&sub2;O und 100 ug Thiamin·HCl in 1000 ml destilliertem Wasser (nachstehend als BM bezeichnet) mit 100 ug/ml ACM ausgestrichen. Nach Inkubation wurden große gewachsene Kolonien auf Assayplatten, die Lactobacillus plantarum ATCC 8014 als einen Biotinindikatorstamm enthielten, inokuliert. Nach Inkubation bei 37ºC wurden die Durchmesser der gewachsenen Halos, die von der d-Biotinmenge abhängig sind, gemessen. Aus dem Ergebnis wurde eine die größte Halo erzeugende Kolonie erhalten und mit Kurthia sp. 538-KA 26 bezeichnet.
- Kurthia sp. 538-KA 26 wurde gezüchtet und die Zellen wurden mit NTG in einer kleinen Menge, ähnlich wie vorstehend in (1) beschrieben, behandelt. Die behandelten Zellen wurden in einem d-Biotin-freien Synthesemedium, zusammengesetzt aus 20 g Glycerin, 3 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 g K&sub2;HPO&sub4;, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,01 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4;·5H&sub2;O und 100 ug Thiamin·HCl in 1000 ml destilliertem Wasser (nachstehend als mm bezeichnet) mit 200 ug/ml ACM und 200 ug/ml TVA gezüchtet und anschließend seriell einige Male in frischem Medium mit 200 ug/ml ACM und 200 ug/ml TVA mit Intervallen von 2 bis 3 Tagen überführt. Die erhaltenen angereicherten Kulturen wurden verdünnt und auf Agarplatten von mm, enthaltend 200 ug/ml ACM und 200 ug/ml TVA, ausgestrichen. Nach Inkubation wurden große gewachsene Kolonien auf Assayplatten mit Lactobacillus plantarum ATCC 8014 in ähnlicher wie vorstehend in (1) beschriebener Weise inokuliert. Nach Inkubation wurden die Durchmesser der gewachsenen Halos gemessen. Im Ergebnis wurde eine die größte Halo erzeugende Kolonie erhalten und mit Kurthia sp. 538-17H4 bezeichnet.
- Kurthia sp. 538-17H4 wurde gezüchtet und die Zellen wurden in einer ähnlichen wie vorstehend in (1) beschriebenen Weise behandelt. Die behandelten Zellen wurden über Agarplatten von BM, enthaltend 100 um/ml ACM, ausgestrichen. Nach Inkubation wurden die Kolonien auf Agarblöcken eines Erzeugungsmediums, enthaltend 0,5 ug/ml d-Dethiobiotin und 80 ug/ml MeDTB, in einer Platte inokuliert. Nach Inkubation wurden die Agarblöcke mit UV-Licht bestrahlt und anschließend auf die Assayplatten mit Lactobacillus plantarum ATCC 8014 überführt. Nach Inkubation wurden die Durchmesser der gewachsenen Halos gemessen. Im Ergebnis wurde eine die größte Halo erzeugende Kolonie erhalten und mit Kurthia sp. 538-51F9 bezeichnet.
- Weiterhin wurde in einer ähnlichen Weise, wie in dem vorangehenden Absatz beschrieben, eine mutante Resistante zu 150 ug/ml MeDTB abgesucht. Aus der Untersuchung wurde eine Kolonie, die eine größere Halo als Kurthia sp. 538-51F9 erzeugt, erhalten und mit Kurthia sp. 538-2A13 bezeichnet.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird geeigneterweise durch Züchten (Inkubieren) der Mikroorganismen in einem Medium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verdaubare Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere Nährmittel, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, bewirkt. Als Kohlenstoffquelle kann beispielsweise Glucose, Fructose, Stärke, Lactose, Maltose, Galactose, Saccharose, Dextrin, Glycerin oder Hirsegelee, vorzugsweise Glycerin oder Glucose, eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle kann beispielsweise Pepton, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff oder ein Gemisch davon, vorzugsweise Pepton, eingesetzt werden. Weiterhin können als Spurenelemente Sulfate, Hydrochloride oder Phosphate von Calcium, Magnesium, Zink, Mangan, Kobalt und Eisen angewendet werden. Besonders geeignet als anorganische Salze sind Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(II)sulfat und Mangansulfat. Und, falls erforderlich, können auch herkömmliche Nährfaktoren oder ein Antischaummittel, wie ein tierisches Öl, Pflanzenöl oder Mineralöl, zugesetzt werden. Der pH-Wert des Kulturmediums ist geeigneterweise etwa 5,0 bis 9,0, vorzugsweise 6,5 bis 7,5. Die Züchtungstemperatur ist geeigneterweise etwa 10 bis 40ºC, vorzugsweise 26 bis 30ºC. Die Züchtungszeit kann etwa 1 bis 10 Tage, vorzugsweise 2 bis 7 Tage, besonders bevorzugt etwa 2 bis 4 Tage (48 bis 96 Stunden) sein. Bei der Züchtung ergeben Belüftung und Rühren gewöhnlich vorteilhafte Ergebnisse.
- Nach der Züchtung kann das hergestellte d-Biotin von der Kulturbrühe getrennt und gereinigt werden. Für diesen Zweck kann ein Verfahren, das allgemein zum Extrahieren eines bestimmten Produkts aus der Kulturbrühe verwendet wird, unter Anwendung verschiedener Eigenschaften von d-Biotin angewendet werden. Somit werden beispielsweise die Zellen aus der Kulturbrühe entfernt, die gewünschte Substanz in dem Filtrat wird auf Aktivkohle absorbiert, dann eluiert und weiter mit einem Ionenaustauschharz gereinigt. Alternativ wird das Kulturfiltrat direkt auf ein Ionenaustauschharz aufgetragen und nach Elution wird das gewünschte Produkt- aus einem Gemisch von Alkohol und Wasser umkristallisiert.
- Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismen schließen alle die Stämme ein, die gegen ACM, TVA, MeDTB, 2-Methyl-ACM, Amiclenomycin, Bisnorbiotinol oder Gemischen davon resistent sind, die zur Gattung Kurthia gehören und die in der Lage sind, d-Biotin zu erzeugen. Unter den Stämmen der Gattung Kurthia sind besonders bevorzugte Stämme Kurthia sp. 538-KA 26, Kurthia sp. 538-17H4, Kurthia sp. 538- 51F9 und Kurthia sp. 538-2A13, die bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) in Braunschweig, Deutschland unter DSM-Nrn. 10609, 10608, 10610 bzw. 10607 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 26. März 1996 hinterlegt wurden. Diese bevorzugten Stämme sind auch neu und werden an sich durch die vorliegende Erfindung auch umfasst.
- Die vorliegende Erfindung wird genauer durch die nachstehenden Beispiele erläutert, jedoch sollte es selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung nicht durch diese besonderen Beispiele begrenzt ist.
- Eine Schleife von Kurthia sp. 538-6 (DSM-Nr. 9454), gewachsen auf Agar von dem Medium, zusammengesetzt aus 1% Bouillon (Kyokutoh Seiyaku Co. Ltd., Japan) (nachstehend als NB bezeichnet), wurde in einen 500-ml-Kolben, enthaltend 50 ml NB-Medium inokuliert und anschließend wurde der Kolben an einem Rotationsschüttler (180 U/min) bei 28ºC geschüttelt. Nach Züchtung für 13,5 Stunden wurden die Zellen der Kulturbrühe durch Zentrifugierung bei 7500 U/min für 10 Minuten geerntet, zweimal mit steriler Salzlösung gewaschen und in 20 ml sterilem Wasser suspendiert. Die Röhren, die 5 ml des Reaktionsgemisches enthalten, zusammengesetzt aus 50 bis 300 ug/ml NTG und 1 · 10&sup7; Zellen pro ml in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), wurden unter Horizontalschütteln (285 U/min) bei 28ºC 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit 5 ml steriler Salzlösung gewaschen und in 5 ml-Salzlösung suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden seriell 10&supmin;¹ bis 10&supmin;¹ in steriler Salzlösung verdünnt und auf BM-Agar mit 100 ug/ml ACM ausgestrichen. Nach Inkubation für 3 Tage bei 28ºC wurde die d-Biotin-Produktivität von jeder gewachsenen Kolonie durch das Agarplattenverfahren, enthaltend Lactobacillus plantarum ATCC 8014 wie nachstehend beschrieben, bestimmt. Siebenhundertundfünfzig Kolonien wurden mit Zahnstochern auf die Assayplatten, die Lactobacillus plantarum ATCC 8014 enthielten, überführt. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Durchmesser der gewachsenen Halos, die von der Menge an d-Biotin abhängen, gemessen. Im Ergebnis wurde Kurthia sp. 538-KA 26 (DSM-Nr. 10609) unter Erzeugung der größten Halo erhalten.
- Eine Schleife voll Kurthia sp. 538-KA26-Zellen, gewachsen auf BM-Agar mit 100 ug/ml ACM, wurde in ein Röhrchen, enthaltend 5 ml des Herstellungsmediums, zusammengesetzt aus 2% Glycerin, 4% Proteosepepton (Nippon Seiyaku Co. Ltd., Japan), 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,001% FeSO&sub4;·7H&sub2;O und 0,001% MnSO&sub4;·5H&sub2;O, inokuliert und anschließend wurde das Röhrchen an einem Horizontalschüttler (285 U/min) bei 28ºC geschüttelt. Nach Züchtung für drei Tage wurde der Inhalt auf d-Biotin in dem Überstand der Kulturbrühe durch das Trübungsverfahren mit Lactobacillus plantarum ATCC8014, wie nachstehend beschrieben, bewertet. Der Überstand und Standardlösungen von d-Biotin (0 bis 10 mg/l) wurden 1,25 · 10&supmin;³ in destilliertem Wasser verdünnt. 50 ul der verdünnten Lösung und 5 ml destilliertes Wasser wurden in dieser Reihenfolge zu den Röhrchen gegeben. Nach Autoklavenbehandlung bei 120ºC für 10 Minuten wurden 5 ml des Assaymediums für d-Biotin (Nissui Co. Ltd., Japan) mit Lactobacillus plantarum ATCC 8014 zu den Röhrchen gegeben und anschließend wurden die Röhrchen in einer aufrechten Position bei 37ºC inkubiert. Nach Inkubation für 21 Stunden wurde das Zellwachstum durch Zusetzen von 5 ml 0,2 N Salzsäure gestoppt und anschließend wurde die Trübung der Proben bei 660 nm gemessen. Die Menge an d-Biotin in einer Probe wurde durch Vergleichen der Trübung der Probe mit der Standardwachstumskurve von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 bestimmt. Im Ergebnis enthielt der Überstand von drei Tage alter Brühe 3,9 mg d-Biotin pro Liter Kurthia sp. 538-KA 26 (DSM-Nr. 10609), erzeugte etwa 3900fach mehr Biotin als der Elternstamm, Kurthia sp. 538-6 (DSM-Nr. 9454).
- In ähnlicher wie in Beispiel 1 beschriebener Weise wurden die Zellen von Stamm 538-KA26 (DSM-Nr. 10609) mit NTG behandelt und die auf ACM und TVA resistenten Zellen wurden wie nachstehend beschrieben angereichert. Die nach NTG- Behandlung gewaschenen Zellen wurden in Röhrchen, die 5 ml BM-Medium mit 100 ug/ml ACM enthielten, inokuliert und die Röhrchen wurden auf einem Horizontalschüttler (285 U/min) bei 28ºC geschüttelt. Nach Inkubation über Nacht wurde die Kulturbrühe inokuliert unter Gewinnung einer Trübung bei 600 nm von ungefähr 0,03 in einem Röhrchen, das 5 ml MM mit 200 ug/ml ACM und 200 ug/ml TVA enthält. Die Röhrchen wurden bei 28ºC geschüttelt und ihre Inhalte wurden wachsen lassen, bis die Kultur trübe wurde. Diese Anreicherung wurde in den Röhrchen, die das frische MM-Medium mit 200 ug/ml ACM und 200 ug/ml TVA bei zwei oder drei Tagesintervallen enthielten, wiederholt. Nach drei Wiederholungen wurden die Kulturen in Salzlösung verdünnt und über Agar des gleichen Mediums ausgestrichen. Nach Inkubation für 3 bis 4 Tage bei 28ºC wurde die d-Biotin-Produktivität in 650 Kolonien auf Assayplatten mit Lactobacillus plantarum ATCC 8014 bestimmt. Im Ergebnis wurde Kurthia sp. 538-17H4 (DMS-Nr. 10608) unter Erzeugung der größten Halo erhalten.
- Eine Schleife von Kurthia sp. 538-17H4 (DSM-Nr. 10608), gewachsen auf BM-Agar mit 100 ug/ml ACM, wurde in ein Röhrchen, enthaltend 5 ml BM-Medium mit 500 ug/ml ACM, inokuliert und anschließend wurde das Röhrchen bei 28ºC geschüttelt. Nach Inkubation über Nacht wurde 1 ml der Kulturbrühe in einen Kolben, enthaltend 50 ml des Produktionsmediums, zusammengesetzt aus 4% Glycerin, 4,5% Proteosepepton, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,05% FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,001% MnSO&sub4;·5H&sub2;O und ein Tropfen Antifoam CA-115 (Nippon Yushi Co. Ltd., Japan), überführt und anschließend wurde der Kolben bei 28ºC geschüttelt. Nach Züchtung für 72 Stunden wurde der Inhalt an d-Biotin in dem Überstand der Kulturbrühe durch das Trübungsverfahren mit Lactobacillus plantarum ATCC 8014 bewertet. Im Ergebnis enthielt der Überstand 26,3 mg d-Biotin pro Liter. Kurthia sp. 538-17H4 (DSM-Nr. 10608) erzeugte etwa 6,7-mal so viel Biotin, wie der Elternstamm, Kurthia sp. 538-KA 26 (DSM- Nr. 10609).
- d-Biotin wurde aus der Kulturbrühe von Kurthia sp. 538-17H4 (DSM-Nr. 10608) gewonnen. Die d-Biotin-Konzentration wurde bei jedem Reinigungsschritt durch das Trübungsverfahren mit Lactobacillus plantarum ATCC 8014 verfolgt. Ein Liter der 72-Stunden-Kulturbrühe mit der d-Biotin-Aktivität von 25,7 mg/l gegen Lactobacillus plantarum ATCC 8014 wurde 10 Minuten bei 7500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Kolonne (3,6 · 42 cm), gefüllt mit 380 ml Aktivkohle (Wako Pure Chemical Industries, Co. Ltd., Japan), aufgetragen. Nach Waschen mit 500 ml desionisiertem Wasser wurde die Kolonne mit 500 ml ethanolischer Ammoniaklösung, zusammengesetzt aus 474 ml 50%igem Ethanol und 26 ml 25%igem Ammoniak entwickelt. 300 ml des Elutionsmittels mit d-Biotin-Aktivität von 82,1 mg/l gegen Lactobacillus plantarum ATCC 8014 wurden unter vermindertem Druck auf 50 ml aufkonzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Säule (2,6 · 38 cm), gefüllt mit 190 ml Dowex 1 · 4 (Formiatform, 100-200 Mesh, Dow Chemical Co. Ltd., USA), aufgetragen und dann wurde die Säule mit 200 ml 0,05 M Ameisensäure gewaschen. Die Säule wurde mit 250 ml des Ausgangspuffers an 0,1 M Ameisensäure und dann einem linearen Gradienten von 250 ml von jeweils 0,1 und 0,35 M Ameisensäure entwickelt. Einhundertundsechzig Milliliter des Elutionsmittels mit d-Biotin-Aktivität von 144,8 mg/l gegen Lactobacillus plantarum ATCC 8014 wurden unter vermindertem Druck aufkonzentriert unter Gewinnung von 17,6 mg weißem Pulver. Dies wurde aus einem Gemisch von Ethanol und Wasser kristallisiert unter Gewinnung von 15,1 mg weißen Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 232ºC. Der Schmelzpunkt, Rf-Wert auf DC (Lösungsittelsystem: Essigsäureethylester/Methanol = 10/1, Kieselgel 60 F254, E. Merck), Infrarotspektrum und NMR-Spektrum der Probe stimmte mit jenem von authentischem d-Biotin (Sigma Co. Ltd., USA) überein.
- In ähnlicher wie in Beispiel 1 beschriebener Weise wurden die Zellen von Kurthia sp. 538-17H4 (DSM-Nr. 10608) mit NTG behandelt und eine MeDTB-resistente Mutante wurde dann durch das nachstehend beschriebene Verfahren abgesucht. Nachdem die behandelten Zellen über Nacht bei 28ºC in BM- Medium mit 100 ug/ml ACM gezüchtet wurden, wurde die Kultur mit 10&supmin;¹ bis 10&supmin;&sup7; in steriler Salzlösung seriell verdünnt und auf BM-Agar mit 80 ug/ml ACM ausgestrichen. Nach Inkubation für zwei bis drei Tage bei 28ºC wurden 19500 Kolonien auf Agarblöcken des Erzeugungsmediums, zusammengesetzt aus 2% Glycerin, 2% Proteosepepton, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,05% FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,001% MnSO&sub4;·5H&sub2;O und 1,5% Agar, ergänzt mit 0,5 um/ml d-Dethiobiotin und 80 ug/ml MeDTB in Platten, inokuliert. Nach Inkubation für 2 Tage bei 28ºC wurden die Agarblöcke mit UV-Licht für zwei Stunden bestrahlt und dann auf die Assayplatten von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 überführt. Die Assayplatten wurden bei 37ºC 19 Stunden inkubiert und anschließend wurden die Durchmesser der Halos gemessen. Als das Ergebnis wurde Kurthia sp. 538-51F9 (DSM-Nr. 10610), das die größte Halo erzeugte, erhalten.
- Kurthia sp. 538-51F9 (DSM-Nr. 10610), gewachsen auf BM-Agar mit 100 ug/ml ACM, wurde bei 28ºC in einem Röhrchen, das 5 ml BM-Medium mit 500 ug/ml ACM enthielt, gezüchtet. Nach Züchtung über Nacht wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet und in der 10%igen Glycerinlösung suspendiert. 1 ml der Zellsuspension wurde in einen Kolben, enthaltend 50 ml des Produktionsmediums, zusammengesetzt aus 6% Glycerin, 5,5 % Proteosepepton, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05 MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,05% Fe- SO&sub4;·7H&sub2;O, 0,001% MnSO&sub4;·5H&sub2;O und einem Tropfen des Antischaummittels CA-115 (nachstehend als FM 1 bezeichnet), überführt, und dann wurde der Kolben bei 28ºC inkubiert. Nach Züchtung für 72 Stunden wurde der Inhalt von d-Biotin in dem Überstand der Kulturbrühe durch das Trübungsverfahren von Lactobacillus plantarum ATCC 8014 bewertet. Im Ergebnis enthielt der Überstand 41,5 mg d-Biotin pro Liter. Kurthia sp. 538-51F9 (DSM- Nr. 10610) erzeugte etwa 1,6fach so viel Biotin, wie der Elternstamm, Kurthia sp. 538-17H4 (DSM-Nr. 10608).
- Eine gegen MeDTB resistentere Mutante wurde von Kurthia sp. 538-51F9 (DSM-Nr. 10610) abgeleitet. In einer ähnlichen wie in Beispiel 1 beschriebenen Weise wurden die Zellen von Kurthia sp. 538-51F9 (DSM-Nr. 10610) mit NTG behandelt und die auf 150 ug/ml MeDTB resistenten Mutanten wurden durch das ähnlich zu jenem in Beispiel 4 beschriebene Verfahren mit der Ausnahme der Konzentration von MeDTB in Agarblöcken abgesucht. Im Ergebnis wurde somit Kurthia sp. 538-2A13 (DSM-Nr. 10607), welche die größte Halo erzeugte, erhalten.
- In einer ähnlichen wie in Beispiel 4 beschriebenen Weise wurde Kurthia sp. 538-2A13 (DSM-Nr. 10607) bei 28ºC in einem Kolben, enthaltend 50 ml FM1-Medium, gezüchtet. Nach Züchtung für 24 Stunden wurden 5 ml des sterilen Mediums, enthaltend 40% Glycerin und 20% Proteosepepton, zugesetzt und die Züchtung wurde fortgesetzt. Nach Züchtung für 120 Stunden wurde der Inhalt von d-Biotin in dem Überstand der Kulturbrühe durch das Trübungsverfahren mit Lactobacillus plantarum ATCC 8014 bewertet. Im Ergebnis enthielt der Überstand 126 ml d-Biotin pro Liter. Kurthia sp. 538-2A13 (DSM- Nr. 10607) erzeugte etwa dreimal so viel Biotin wie der Elternstamm, Kurthia sp. 538-51F9 (DSM-Nr. 10610).
- Nachstehende Tabelle 1 fasst die d-Biotin-Produktivitäten der sofern erhaltenen Mutanten zusammen. Tabelle 1 d-Biotin-Produktivitäten der von Kurthia sp. 538-6 abgeleiteten Mutanten (DSM-Nr. 9454)
- ACM: Acidomycin; TVA: 5-(2-Thienyl)valeriansäure; MeDTB: α-Methyldethiobiotin
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung von d-Biotin, das das Züchten
eines Mikroorganismus, der zur Gattung Kurthia gehört,
umfasst, wobei der Mikroorganismus gegen Biotin-
Antimetaboliten resistent ist und unter aeroben Bedingungen d-
Biotin in einem Medium erzeugen kann und Trennen des
erhaltenen d-Biotins aus der Fermentationsbrühe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die
Biotin-Antimetaboliten Acidomycin, 5-(2-Thienyl)valeriansäure,
α-Methyldethiobiotin, 2-Methylacidomycin, Amiclenomycin, Bisnorbiotinol oder
ein Gemisch davon sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Züchten in
einem Medium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine
verdauliche Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere
Nährmittel, die für das Wachstum des Mikroorganismus
erforderlich sind, enthält, bei einem pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa
9,0, bei einer Temperatur von etwa 10ºC bis 40ºC und für etwa
1 bis 10 Tage unter aeroben Bedingungen, ausgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Züchten in
einem Medium, das als Kohlenstoffquelle Glycerin oder Glucose
und als Stickstoffquelle Pepton und eine kleine Menge
anorganische Salze, wie Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat,
Eisen(II)sulfat und Mangansulfat, enthält, bei einem pH-Wert von
6,5 bis 7,5, bei einer Temperatur von 26ºC bis 30ºC und für 48
bis 96 Stunden unter aeroben Bedingungen ausgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der
Mikroorganismus aus Kurthia sp. 538-KA 26 (DSM Nr. 10609),
Kurthia sp. 538-17H4 (DSM Nr. 10608), Kurthia sp. 538-51F9
(DSM Nr. 10610) und Kurthia sp. 538-2A13 (DSM Nr. 10607)
ausgewählt ist.
6. Kurthia sp. 538-KA 26 (DSM Nr. 10609), Kurthia sp. 538-
17H4 (DSM Nr. 10608), Kurthia sp. 538-51F9 (DSM Nr. 10610) und
Kurthia sp. 538-2A13 (DSM Nr. 10607).
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