FR2728905A1 - Nouvelle acide amine amidohydrolase, sequence nuclotidique correspondant et leurs utilisations - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une nouvelle acide aminé amidohydrolase, la séquence nucléotidique correspondante, les vecteurs et cellules correspondantes et l'utilisation de cette enzyme pour l'hydrolyse stéréosélective de dérivés N-acylés L-acides aminés.
Description
NOUVELLE ACIDE AMINE AMIDOHYDROLASE. SEOUENCE
NUCLEOTIDIQUE CORRESPONDANTE ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention conceme une nouvelle acide aminé amidohydrolase, la séquence nucléotidique codant pour cette enzyme, des plasmides d'expression conespondants et l'utilisation de cette enzyme.
NUCLEOTIDIQUE CORRESPONDANTE ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention conceme une nouvelle acide aminé amidohydrolase, la séquence nucléotidique codant pour cette enzyme, des plasmides d'expression conespondants et l'utilisation de cette enzyme.
Les acides aminés amidohydrolases sont des enzymes responsables chez les plaines, les animaux et les microorganismes de l'hydrolyse des résidus acyles des acides aminés. C'est ainsi que l'acétylornithine déacétylase catalyse la conversion de la
N2-acétyle L-omithine en L-omithine dans le processus de biosynthèse de l'@@ginine chez certaines bactéries. De par leur spécificité énantiomérique, ces enzymes sont particulièrement intéressantes sur le plan industried et sont notamment utilisées à ce titre pour la production sélective de stéréoisomères à partir de mélanges racém@tes.
N2-acétyle L-omithine en L-omithine dans le processus de biosynthèse de l'@@ginine chez certaines bactéries. De par leur spécificité énantiomérique, ces enzymes sont particulièrement intéressantes sur le plan industried et sont notamment utilisées à ce titre pour la production sélective de stéréoisomères à partir de mélanges racém@tes.
Malheureusement. ces acides aminés amidohydrolases possèdent très souvent des spécificités étroites de substrat, de température et/ ou de pH qui empêchent leur utilisation de de manière très générale. Par exemple. une souche d'Escherichia Col comportant le gène codant pour l'acétylornithine déacétylase est incapable d'hydrolyser des dérivés d'acides aminés aromatiques N-acylés.
Récemment, la Demanderesse a découvert et caractérisé, sur un fragment d'ADN de la souche Bacillus stearothermophilus NCIB8224, la présence d'un g@@e aminoacylase codant pour une acide aminé amidohydrolase hydrolysant des motifs Nacétyle des L-acides aminés (V.Sakanyan et al. 1993, Applied and Environmental
Microbiology 59(11), 3878-3888.). Cette enzyme est thermostable et possède avangageusement un optimum d'activité à 70 C. Outre cette qualité. elle hydroly@@ efficacement une grande variété de N-acyle L-acides aminés, comme N-acétyle, Nformyle, N-chloracetyl, mais pas N-carbamoyle.
Microbiology 59(11), 3878-3888.). Cette enzyme est thermostable et possède avangageusement un optimum d'activité à 70 C. Outre cette qualité. elle hydroly@@ efficacement une grande variété de N-acyle L-acides aminés, comme N-acétyle, Nformyle, N-chloracetyl, mais pas N-carbamoyle.
La présente invention a précisément pour objet de proposer une nouvelle acide aminé amidohydrolase avantageusement stéréospécifique et thermostable, efficace vis à vis d'acides aminés N-carbamoylés.
Dans le cadre de la présente invention, la demanderesse a localisé et caractérisé en amont du gène codant pour l'aminoacylase ci-avant, un second cadre de lecture correspondant à une séquence mcléotidiqsse codant pour une seconde aminé amidohydrolase. Il s'agit plus précsément d'une acide aminé amidohydrolase spécifique de l'hydrolyse des motifs N-carbamoyle des L-acides amines, que @o@@ appellerons ci-après carbamoylase : le gène correspondant sera désigné ca@@.
La présente invention a pour premier objet une carbamoylase exprimée par la souche Bacillus stearothermophilus NCIB 8224 et capable d'hydroly@er des motifs N-carbamoyle des L-acides aminés.
Elle décrit en particulier l'isolement et la caractérisation du gène codant pour une telle enzyme. Ce gène a été cloné, séquencé et exprimé chez E. coli et so@ activité enzymatique caractérisée.
La présente invention concerne plus particulièrement une carb@noyl@@e caractésisée en ce qu'elle possède la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID
N01.
N01.
La comparaison de cette séquence avec des séquences disponibles sur base de données a permis de mettre en évidence des homologies significatives avec respectivement la séquence codant pour l'amidohydrolase des N-carbamoyle des Lacides aminés de la souche Pseudomonas sp. NS671 (Watabe et aL; 1992, Journal of
Bacteriology 174(3), 962-969) et la séquence codant pour la carbamoylase de la souche Bacillus stearothermophilus NS112A (Mukohara et al. 1993. Biosci.
Bacteriology 174(3), 962-969) et la séquence codant pour la carbamoylase de la souche Bacillus stearothermophilus NS112A (Mukohara et al. 1993. Biosci.
Biotech- Biochem 57(11), 1935-1937.) et d'émblir ainsi son activité carbamoylase.
La carbamoylase revendiquée est avantageusement active i une de l'ordre de 550C et présente une L-stéréopécificité.
La présente invention a également pour objet une séquence nucléotidique codant pour une carbamoylase selon l'invention.
Plus précisément. il s'agit de la séquence nucléotidique représentée en SEQ
ID N01. De préférence. elle est de l'ordre de 1,2 kb.
ID N01. De préférence. elle est de l'ordre de 1,2 kb.
Un autre objet de la présente invention ccerne un ADN recombin@@t comprenant au moins une séquence nucléotidique telle que revendiquée.
Selon un mode préféré de l'invention, la séquence nucléotidique ci-avant fait partie d'un vecteur d'expression qui peut être à réplication autonome ou intégratif.
L'invention a également pour objet toute cellule recombinante contenant une séquence nucléotidique et/ou un vecteur tels que définis ci-avant. Les cellules recombinantes selon l'invention peuvent être aussi bien des cellules eucaryotes que procaryotes. Parmi les cellules eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO,
C127, les oeufs de Xénope, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Micromonospora, Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.De préférence, il s'agit de cellules procaryotes. A ce titre on peut plus particulièrement utiliser les bactéries suivantes Actinomycètes, Bacillus et Staphylococcus, et plus préférentiellement Ecoli. Les cellules recombiantes de Invention peuvent être obtenues par toute méthode permettant d'introduire une séquence nucléotidique étrangère dans une cellule. n peut s'agir notamment de transfomnation, électroporation, conjugaison, fusion de protoplastes, ou toute autre technique commue de l'homme de l'art.
C127, les oeufs de Xénope, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Micromonospora, Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.De préférence, il s'agit de cellules procaryotes. A ce titre on peut plus particulièrement utiliser les bactéries suivantes Actinomycètes, Bacillus et Staphylococcus, et plus préférentiellement Ecoli. Les cellules recombiantes de Invention peuvent être obtenues par toute méthode permettant d'introduire une séquence nucléotidique étrangère dans une cellule. n peut s'agir notamment de transfomnation, électroporation, conjugaison, fusion de protoplastes, ou toute autre technique commue de l'homme de l'art.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation de la carbamoylase revendiquée à partir de la culture d'une de ces cellules recombinantes.
La carbamoylase ainsi obtenue, est récupérée selon des méthodes classiques à rissue de la culture. Selon un mode particulier de ce procédé, rexpression du gène codant pour la carbamoylase de B. stearothennophilus NCIB 8224 est placée sous contrôle d'un promoteur du bactériophage 17. n en résulte une expssion nettement améliorée de l'enzyme. Elle est environ 1000 fois plus importante que dans la souche d'E. coli contenant un plasmide recombinant avec le gène de la carbamoylase mais sans le système d'expression T7.
La présente invention vise également un procédé enzymatique pour hydrolyser des N-carbamoyle L-acides aminés en L-acides aminés correspondants mettant en oeuvre une carbamoylase selon l'invention exprimée in situ ou non à partir d'une cellule comportant au moins un gène selon I'invention
Selon un mode particulier de ce procédé, I'hydrolyse est conduite en présence de sels métalliques et plus préférentiellement de sels de cobalt. Ce mode de réalisation est décrit plus en détail en exemple 3 ci-après.
Selon un mode particulier de ce procédé, I'hydrolyse est conduite en présence de sels métalliques et plus préférentiellement de sels de cobalt. Ce mode de réalisation est décrit plus en détail en exemple 3 ci-après.
La carbamoylase selon l'invention est tout particulièrement utile pour préparer de la L-méthionine.
Les exemples et la figure qui suivent, sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention et mettent en évidence d'autres avantages de celle-ci.
FIGURE
Figure 1: Construction du plasmide pETcam.
Figure 1: Construction du plasmide pETcam.
MATERIEL ET METHODES
A. Souches. plasmides et réactifs:
Les souches E. coli XS1D2 (Mountain et al., 1984, Molecular and General Genetics 197; 82-89.) et JM101 (Yanish-Peron et aL, 1985, Gene 33; 103-109.) ont été respectivement utilisées pour les constructions de pBC8 et du plasmide d'expression.
A. Souches. plasmides et réactifs:
Les souches E. coli XS1D2 (Mountain et al., 1984, Molecular and General Genetics 197; 82-89.) et JM101 (Yanish-Peron et aL, 1985, Gene 33; 103-109.) ont été respectivement utilisées pour les constructions de pBC8 et du plasmide d'expression.
La souche E. coli BL21 Q (DE3) qui porte le gène T7 de l'ARN polymérase sous le contrôle du promoteur lacUV5 dans son chromosome (Studier et al., 1990, Aneth
Enzymol 185; 60-89.) est utilisée comme hôte d'expression. B. stearothermophilus NCIB8224 est une souche du laboratoire ( qui provient elle-même de l'"All Ibiion
Collection of Microorganisms", Moscou). Le vecteur d'expression pET3a a été auprès de Novagen (Studier et al., 1990, Meth. Eiuymol 185; 6089.). Les acides aminés N-carbamoyle sont de chez Sigma sauf les N-carbamoyle methionine de serie
D, L-, D- et L- qui ont été synthétisées en laboratoire selon des protocoles classiques.Les enzymes de restriction, l'ADN ligase et l'isopropyl-ss-D- thiogalactopyranoside (IOG) sont de chez Boehringer Mannheim. L'ADN Taq polymérase et les oligodéoxynucleotides sont de chez Eurogentec.
Enzymol 185; 60-89.) est utilisée comme hôte d'expression. B. stearothermophilus NCIB8224 est une souche du laboratoire ( qui provient elle-même de l'"All Ibiion
Collection of Microorganisms", Moscou). Le vecteur d'expression pET3a a été auprès de Novagen (Studier et al., 1990, Meth. Eiuymol 185; 6089.). Les acides aminés N-carbamoyle sont de chez Sigma sauf les N-carbamoyle methionine de serie
D, L-, D- et L- qui ont été synthétisées en laboratoire selon des protocoles classiques.Les enzymes de restriction, l'ADN ligase et l'isopropyl-ss-D- thiogalactopyranoside (IOG) sont de chez Boehringer Mannheim. L'ADN Taq polymérase et les oligodéoxynucleotides sont de chez Eurogentec.
B. Construction de pETcam
Le plasmide d'expression pETcam est obtenu par clonage dans le vecteur pET3a du fragment correspondant à la région codant pour cam, ar-ifié par la réaction de polymérisation en chaine (PCR). Sa construction est représentée schématiquement sur la figure 1.
Le plasmide d'expression pETcam est obtenu par clonage dans le vecteur pET3a du fragment correspondant à la région codant pour cam, ar-ifié par la réaction de polymérisation en chaine (PCR). Sa construction est représentée schématiquement sur la figure 1.
Les séquences oligodéoxynucleotide 24mer et 29-mer utilisées pour amplifier la région codant pour le gène cam sont S AACATATGATTCAAGGGGAACGTC-3' et S
GCGGATCCTCGTTTGTCTTTTTCGTTATT-3'. Des séquences supplémentaires Ssont présentes sur toutes les amorces et correspondent aux sites des enzymes de restriction. Le fragment d'ADN cam AlwN I-Pvu II du plasmide pBC8 (ol:tenu in l'exemplel) a été utilisé pour l'amplification de la région codant pour le gène cam. Les produits de la PCR sont isolés, leurs extrémités sont rendues franches à raide la sous unité Klenow de l'ADN polymérase. Ils sont ensuite clonés dans le vecteur pUC18 lui même digéré par l'enzyme Sma I et déphosphorylé.Cette étape permet la digestion NdeI-BamHI de la région codant pour cam qui est ensuite clonée dans le vecteur d'expression pET3a prédigéré en NdeI-BamHI. On obtient ainsi pETcam.
GCGGATCCTCGTTTGTCTTTTTCGTTATT-3'. Des séquences supplémentaires Ssont présentes sur toutes les amorces et correspondent aux sites des enzymes de restriction. Le fragment d'ADN cam AlwN I-Pvu II du plasmide pBC8 (ol:tenu in l'exemplel) a été utilisé pour l'amplification de la région codant pour le gène cam. Les produits de la PCR sont isolés, leurs extrémités sont rendues franches à raide la sous unité Klenow de l'ADN polymérase. Ils sont ensuite clonés dans le vecteur pUC18 lui même digéré par l'enzyme Sma I et déphosphorylé.Cette étape permet la digestion NdeI-BamHI de la région codant pour cam qui est ensuite clonée dans le vecteur d'expression pET3a prédigéré en NdeI-BamHI. On obtient ainsi pETcam.
C. Protocole d'identification de la protéine carbamoylase par SDS-PAGE
Des culots cellulaires provenant de 200 l de milieu de culture sont resuspendus dans 100 l de tampon (Laemmli et al., 1970, Nature 227; 660-685) et soniqués. Classiquement, environ 10 p1 (soit près de 20 g de protéines totales) sont disposés sur le gel. Après migration (3 h) les protéines sont visualisées par coloration au bleu de Coomassie.
Des culots cellulaires provenant de 200 l de milieu de culture sont resuspendus dans 100 l de tampon (Laemmli et al., 1970, Nature 227; 660-685) et soniqués. Classiquement, environ 10 p1 (soit près de 20 g de protéines totales) sont disposés sur le gel. Après migration (3 h) les protéines sont visualisées par coloration au bleu de Coomassie.
D. Méthode pour évaluer l'activité carbamoylase
Des culots cellulaires provenant de 0,5 ml de culture sont resuspendus dans le même volume de tampon Tris-HCl (10 mM, pH 7,4) et lysés par sonication pendant 10 minutes. Classiquement 10 l (environ 10 g de protéines totales) de la suspension ainsi obtenue sont utilisés pour doser l'activité enzymatique dans un volume de 200 pl. La réaction se fait en présence de tampon phosphate (50 mM, pH 7,5), CoCl2 (1 mM) et de substrat N.carabamoyl D, L-méthionine 50 mM. Apès 15-20 minutes d'incubation à 55 C la réaction est arrêtée en ajoutant 100 pi dH3PO4 0,6 M.L'activité carbamoylase est évaluée en quanfiant la méthionine produite lors de la réaction, après séparation du milieu réactionnel en phase inverse (colorme
Kontron, Sphérisoeb S5 ODS 2, 250x5 mm) par HPLC (Système Kontron comprenant un passeur d'échantillons, autosampler 460: injection de 20 pi, une pompe, Pump 420 et Gradient former 425). L'élution est réalisée en présence du mélange Méthanol-
H3PO4 (100 mM)/10%-90% (v/v). La détection des produits se fait à 215 rnn (Détecteur, UVIKON 740 LC). Une gamme d'étalonnage permet d'estimer la quantité de méthionine formée en fonction de la surface des pics.En présence de substrats Ncarbamoyle D, L-alanine ou N-carbamoyle D, L-leucine, l'alanine et la leucine sont quantifiées par dosage colorimétrique (réactif à la ninhydrine : la coloration est obtenue à 70 C. température à laquelle le substrat N-carbamoyl ne réagit pas avec le réactif utilisé).
Des culots cellulaires provenant de 0,5 ml de culture sont resuspendus dans le même volume de tampon Tris-HCl (10 mM, pH 7,4) et lysés par sonication pendant 10 minutes. Classiquement 10 l (environ 10 g de protéines totales) de la suspension ainsi obtenue sont utilisés pour doser l'activité enzymatique dans un volume de 200 pl. La réaction se fait en présence de tampon phosphate (50 mM, pH 7,5), CoCl2 (1 mM) et de substrat N.carabamoyl D, L-méthionine 50 mM. Apès 15-20 minutes d'incubation à 55 C la réaction est arrêtée en ajoutant 100 pi dH3PO4 0,6 M.L'activité carbamoylase est évaluée en quanfiant la méthionine produite lors de la réaction, après séparation du milieu réactionnel en phase inverse (colorme
Kontron, Sphérisoeb S5 ODS 2, 250x5 mm) par HPLC (Système Kontron comprenant un passeur d'échantillons, autosampler 460: injection de 20 pi, une pompe, Pump 420 et Gradient former 425). L'élution est réalisée en présence du mélange Méthanol-
H3PO4 (100 mM)/10%-90% (v/v). La détection des produits se fait à 215 rnn (Détecteur, UVIKON 740 LC). Une gamme d'étalonnage permet d'estimer la quantité de méthionine formée en fonction de la surface des pics.En présence de substrats Ncarbamoyle D, L-alanine ou N-carbamoyle D, L-leucine, l'alanine et la leucine sont quantifiées par dosage colorimétrique (réactif à la ninhydrine : la coloration est obtenue à 70 C. température à laquelle le substrat N-carbamoyl ne réagit pas avec le réactif utilisé).
E. Séquenc,age de l'ADN
Le séquençage de l'ADN codant pour la carbamoylase a été effectué selon la méthode de Sanger (Sanger, 1981, Science, 214, 1205-1210 ).
Le séquençage de l'ADN codant pour la carbamoylase a été effectué selon la méthode de Sanger (Sanger, 1981, Science, 214, 1205-1210 ).
EXEMPLE 1 - Isolement et détermination de la séquence du gene codant pour la carbampylase revendiquée.
L'ADN génomique de la souche de B. stearothermophilus NCIB 8224 a été digéré par l'enzyme PstI puis ligaturé avec le vecteur pBR322 digéré par la même enzyme. Après transformation d'E. coli XS1D2, les clones ont été sélectiames par croissance sur milieu synthétique avec tétracycline sans arginine. Tous les plasmides recombinants contenaient un fragment d'ADN de B.stearothermophiZus de 4,7 kh
L'un d'entre eux a été désigné pBC8. Un sous-fragment de 1230 pb contenant l'intégralité de la séquence codante de la carbamoylase a été séquencé. La séquence est présentée en SEQ ID N 1. La carbamoylase est composée de 409 acides aminés et présente un poids moléculaire attendu de 44 202 daltons.
L'un d'entre eux a été désigné pBC8. Un sous-fragment de 1230 pb contenant l'intégralité de la séquence codante de la carbamoylase a été séquencé. La séquence est présentée en SEQ ID N 1. La carbamoylase est composée de 409 acides aminés et présente un poids moléculaire attendu de 44 202 daltons.
EXEMPLE 2 - Surexpression du gene carbamoylase
Une préculture de E. coli BL21Q (DE3) portant le plasmide pETcam est incubée à 37 C dans un milieu LB contenant de rampicilline (100 pg/ml). 0,2 ml de cette culture sont utilisés pour inoculer 20 ml du même milieu Lorsque la DO600 mn atteint environ 3,0, I'expression de l'ARN polymérase T7 est induite avec 0,1 niM d'IPTG. La culture induite est poursuivie pendant 4 heures supplémentaires La culture est centrifugée à 12 000 g pendant 3 minutes. Les culots de cellules sont conservées à - 20 C.L'activité enzymatique carbamoylase est appréciée selon il méthode décrite au point D précédent.
Une préculture de E. coli BL21Q (DE3) portant le plasmide pETcam est incubée à 37 C dans un milieu LB contenant de rampicilline (100 pg/ml). 0,2 ml de cette culture sont utilisés pour inoculer 20 ml du même milieu Lorsque la DO600 mn atteint environ 3,0, I'expression de l'ARN polymérase T7 est induite avec 0,1 niM d'IPTG. La culture induite est poursuivie pendant 4 heures supplémentaires La culture est centrifugée à 12 000 g pendant 3 minutes. Les culots de cellules sont conservées à - 20 C.L'activité enzymatique carbamoylase est appréciée selon il méthode décrite au point D précédent.
Le tableau I ci-après rend compte des résultats obtenus. A titre comparatif y sont également présentées les activités enzymatiques obtenues avec différentes souches contenant ou non le gène cam.
<tb>
<SEP> Addition <SEP> Actvité <SEP> Carbamoylase
<tb> <SEP> d'IPTG <SEP> mol <SEP> de <SEP> L-méth/h/mg <SEP> protéine
<tb> <SEP> Bacillus <SEP> 0,15
<tb> <SEP> stearothennophilus
<tb> <SEP> NCIB <SEP> 8224
<tb> <SEP> E. <SEP> coli <SEP> XS1D2 <SEP> non <SEP> détectable
<tb> <SEP> E. <SEP> coli <SEP> XS1D2 <SEP> | <SEP> 0,4
<tb> <SEP> (pBC8)
<tb> <SEP> E. <SEP> coli <SEP> BL21Q(DE3) <SEP> non <SEP> détectable
<tb> E. <SEP> coli <SEP> BL2152#(DE3) <SEP> <SEP> 200
<tb> <SEP> (pETcam) <SEP> + <SEP> 505
<tb>
TABLEAU I:
De ces résultats, il ressort les faits suivants: l'activité détectée dans la
B. stearothermophilus NCIB 8224 cultivée à 55 C en milieu LB est très faible.Les souches d'E. coli XS1D2 et BL21Q(DE3) ne présentent aucune activité carbamoylase. La souche XS1D2 (pBC8) possède une activité faible mais supéneure à celle détectée chez B. stearothermophilus NCIB 8224. L'expression du gène cam par le système T7 dans la souche BL21#(DE3) (pETcam) fournit une activité beaucoup plus importante, atteignant 505 mol L-méthionine/h/mg de protéine lasque la T7 polymérase est induite. En absence d'induction, le niveau d'activité est assez conséquent en raison de la fuite d'expression du gène de la polymérase T7, entraînant ainsi l'expression du gène codant pour la carbamoylase.
<tb> <SEP> d'IPTG <SEP> mol <SEP> de <SEP> L-méth/h/mg <SEP> protéine
<tb> <SEP> Bacillus <SEP> 0,15
<tb> <SEP> stearothennophilus
<tb> <SEP> NCIB <SEP> 8224
<tb> <SEP> E. <SEP> coli <SEP> XS1D2 <SEP> non <SEP> détectable
<tb> <SEP> E. <SEP> coli <SEP> XS1D2 <SEP> | <SEP> 0,4
<tb> <SEP> (pBC8)
<tb> <SEP> E. <SEP> coli <SEP> BL21Q(DE3) <SEP> non <SEP> détectable
<tb> E. <SEP> coli <SEP> BL2152#(DE3) <SEP> <SEP> 200
<tb> <SEP> (pETcam) <SEP> + <SEP> 505
<tb>
TABLEAU I:
De ces résultats, il ressort les faits suivants: l'activité détectée dans la
B. stearothermophilus NCIB 8224 cultivée à 55 C en milieu LB est très faible.Les souches d'E. coli XS1D2 et BL21Q(DE3) ne présentent aucune activité carbamoylase. La souche XS1D2 (pBC8) possède une activité faible mais supéneure à celle détectée chez B. stearothermophilus NCIB 8224. L'expression du gène cam par le système T7 dans la souche BL21#(DE3) (pETcam) fournit une activité beaucoup plus importante, atteignant 505 mol L-méthionine/h/mg de protéine lasque la T7 polymérase est induite. En absence d'induction, le niveau d'activité est assez conséquent en raison de la fuite d'expression du gène de la polymérase T7, entraînant ainsi l'expression du gène codant pour la carbamoylase.
La surexprion du gène cam dans la souche BL21Q(DE3) pETcam a été confirmée par l'analyse des protéines totales sur gel de PAGE SDS. Une bande majoritaire correspondant à environ 30 % des protéines totales (analyse densitométrique), possède un poids moléculaire de 44 Kda, en accord avec les données de la séquence de la carbamoylase.
EXEMPLE 3 Caractéristiques enzymatiques de la carbamoylase
La souche E. coll BL21#(DE3)(pETcam) présentant une forte activité carbamoylase a été utilisée pour toutes les analyses enzymatiques. Les tests ont été effectués avec l'enzyme non purifiée présente dans les extraits bactériens.
La souche E. coll BL21#(DE3)(pETcam) présentant une forte activité carbamoylase a été utilisée pour toutes les analyses enzymatiques. Les tests ont été effectués avec l'enzyme non purifiée présente dans les extraits bactériens.
La stéréospécificité de l'enzyme a été testée avec les énantiomères de la N-carbamoyle méthionine. L'activité a été trouvée pour la N-carbamoyle L-méthionine mais pas pour la N-carbamoyle D-méthionine. La carbamoylase est donc une enzyme strictement L- stéréospécifique visà-vis de la Nearbamoyle-méthionine.
L'enzyme peut également hydrolyser d'autres substrats; l'activité estimée en présence de la N-carbamoyle D,L-alanine et de la N-carbamoyle D,L-leucine représente respectivement 132 % et 25 % de l'activité envers la N-carbamoyle D,L-méthionine.
L'activité de la carbamoylase est augmentée d'au moins 5 fois en presence d'ions cobalt (1 mM) dans le mélange réactionnel par comparaison avec un témoin sans cobalt.
L'activité de la carbamoylase est maximale à 55GC ce qui est caractéristique des enzymes thermostables.
LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM : RHONE-POULENC NUTRITION ANIMALE
(B) RUE 42, avenue Aristide BRIAND
(C) VILLE : ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL : 92160
(ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVELLE AMINO ACIDE AMIDOHYDROLASE,
SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE CORRESPONDANTE ET UTILISATIONS.
(i) DEPOSANT:
(A) NOM : RHONE-POULENC NUTRITION ANIMALE
(B) RUE 42, avenue Aristide BRIAND
(C) VILLE : ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL : 92160
(ii) TITRE DE L' INVENTION: NOUVELLE AMINO ACIDE AMIDOHYDROLASE,
SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE CORRESPONDANTE ET UTILISATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: I
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL : PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1230 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS : double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Bacillus stearothermophilus
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1:
Met Ile Gln Gly Glu Arg Leu Trp Gln Arg Leu Met Glu Leu Gly Glu
TTG ATT CAA GGG GAA CGT CTT TGG CAA CGG CTC ATG GAA CTA GGG GAG
9 18 27 36 45
Val Gly Lys Gln Pro Ser Gly Gly Val Thr Arg Leu Ser Phe Thr Ala Glu Glu
GTC GGC AAG CAA CCA AGC GGC GGC GTC ACG CGC CTC TCG TTC ACT GCT GAA GAG
57 66 75 84 93 102
Arg Arg Ala Lys Asp Leu Val Ala Ser Tyr Met Arg Glu Ala Gly Leu Phe Val
CGG CGG GCC AAA GAT CTC GTC GCT TCC TAC ATG CGC GAA GCC GGG CTT TTC GTA
111 120 129 138 147 156
Tyr Glu Asp Ala Ala Gly Asn Leu Ile Gly Arg Lys Glu Gly Thr Asn Pro Asp
TAT GAA GAC GCG GCT GGC AAC TTG ATC GGA CGG AAA GAA GGG ACG AAT CCG GAT
165 174 183 192 201 210
Ala Thr Val Val Leu Val Gly Ser His Leu Asp Ser Val Tyr Asn Gly Gly Cys
GCC ACG GTC GTC CTT GTT GGA TCT CAT CTC GAT TCG GTT TAC AAC GGC GGC TGC
219 228 237 246 255 264
Phe Asp Gly Pro Leu Gly Val Leu Ala Gly Val Glu Val Val Gln Thr Met Asn
TTT GAT GGA CCG CTC GGG GTG TTG GCC GGC GTG GAA GTC GTT CAG ACG ATG AAC
273 282 291 300 309 318
Glu His Gly Val Val Thr His His Pro Ile Glu Val Val Ma Phe Thr Asp Glu
GAG CAC GGT GTT GTG ACG CAC CAC CCA ATT GAA GTA GTG GCG TTC ACT GAC GAA
327 336 345 354 363 372
Glu Gly Ala Arg Phe Arg Phe Gly Met Ile Gly Ser Arg Ala Met Ma Gly Thr
GAG GGA GCG CGC TTT CGT TTC GGC ATG ATC GGC AGC CGC CGC ATG CGC GGA ACA
381 390 399 408 417 426
Leu Pro Pro Glu Ala Leu Glu Cys Arg Asp Ala Glu Gly Ile Ser Leu Ala Glu
CTG CCG CCG GAA GCG CTC GAG TGC CGC GAC CGC GAA CGC ATT TCC cTc GCT GAA
435 444 453 462 471 480
Ala Met Lys Gln Ala Gly Leu Asp Pro Asp Arg Leu Pro Gln Ala Ala Arg Lys
CGC ATG AAA CAG GCG CGC CTT GAC CCG GAC CGC TTC CCG CAG GCA CGC CGA AAA
489 498 507 516 525 534
Pro Gly Thr Val Lys Ala Tyr Val Glu Leu His Ile Glu Gln Gly Arg Val Leu
CCA GGA ACG GTG AAA GCC TAT GTC GAA TTG CAT ATC GAA CAA GGA CGG GTG CTG
543 552 561 570 579 588
Glu Glu Ala Gly Leu Pro Val Gly Ile Val Thr Gly Ile Ala Gly Leu Ile Trp
GAG GAG GCT GGT CTT CCA GTT GGC ATC GTC ACT GGC ATC GCC GGT CTG ATT TGG
597 606 615 624 633 642
Val Lys Phe Thr Ile Ala Gly Pro Ala Glu His Ala Gly Ala Thr Pro Met Ser
GTG AAA TTT ACC ATC GCC GGC CCG GCG GAA CAT CGC GGC CGC ACG CCG ATG TCA
651 660 669 678 687 696
Leu Arg Arg Asp Pro Met Ala Ala Ala Ala Gln Ile Ile Ile Val Ile Glu Glu
TTG CGG CGC GAC CCG ATG GCG GCG CGC CGC CAG ATC ATC ATA GTG ATC GAA GAG
705 714 723 732 741 750
Glu Ala Arg Arg Thr Gly Thr Thr Val Gly Thr Val Gly Gln Leu His Val Tyr
GAA GCA AGA CGA ACA GGG ACA ACG GTC GGT ACT GTA GGA CAG TTG CAT GTA TAT
759 768 777 786 795 804
Pro Gly Gly Ile Asn Val Ile Pro Glu Arg Val Glu Phe Val Leu Asp Leu Arg
CCG GGC GGT ATT AAT GTC ATT CCG GAA CGG GTC GAA TTT GTG CTC GAT TTG CGC
813 822 831 840 849 858
Asp Leu Lys Ala Glu Val Arg Asp Gln Val Trp Lys Ala Ile Ala Val Arg Ala
GAC TTG AAG GCT GAG GTG CGC GAT CAA GTA TGG AAA GCC ATA GCC GTG CGG GCA
867 876 885 894 903 912
Glu Thr Ile Ala Lys Glu Arg Asn Val Arg Leu Thr Thr Glu Arg Leu Gln Glu
GAG ACG ATC GCC AAG GAG CGG AAC GTT CGC CTC ACG ACC GAG CGA CTG CAA GAA
921 930 939 948 957 966
Met Ala Pro Val Leu Cys Ser Glu Val Val Lys Gln Ala Ala Glu Arg Ala cys
ATG GCG CCG GTG TTA TGT TCC GAG GTG GTG AAA CAG GCC GCG GAA AGA GCG TGC
975 984 993 1002 1011 1020
Lys Gln Leu Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Leu Pro Ser Gly Ala Ala His Asp Gly
AAG CAG CTC GGG TAT CCG CCG TTT TGG CTG CCG AGC GGC GCA GCC CAT GAC GGC
1029 1038 1047 1056 1065 1074
Val Gln Leu Ala Pro Ile Cys Pro Ile Gly Met Ile Phe Val Arg Ser Gln Asp
GTA CAG TTG GCT CCG ATT TGC CCG ATC GGG ATG ATT TTT GTC CGC TCC CAA GAC
1083 1092 1101 1110 1119 1128
Gly Val Ser His Ser Pro Ala Glu Trp Ser Thr Lys Glu Asp Cys Ala Val Gly
GGG GTG AGT CAT AGT CCG GCG GAA TGG AGT ACT AAA GAA GAC TGC GCC GTT GGA
1137 1146 1155 1164 1173 1182
Ala Glu Val Leu Tyr His Thr Val Trp Gln Leu Ala Gln Gly Glu TER
GCA GAG GTG CTT TAT CAT ACA GTG TGG CAA CTG GCC CAA GGG GAA TAA
1191 1200 1209 1218 1227
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL : PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1230 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS : double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Bacillus stearothermophilus
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 1:
Met Ile Gln Gly Glu Arg Leu Trp Gln Arg Leu Met Glu Leu Gly Glu
TTG ATT CAA GGG GAA CGT CTT TGG CAA CGG CTC ATG GAA CTA GGG GAG
9 18 27 36 45
Val Gly Lys Gln Pro Ser Gly Gly Val Thr Arg Leu Ser Phe Thr Ala Glu Glu
GTC GGC AAG CAA CCA AGC GGC GGC GTC ACG CGC CTC TCG TTC ACT GCT GAA GAG
57 66 75 84 93 102
Arg Arg Ala Lys Asp Leu Val Ala Ser Tyr Met Arg Glu Ala Gly Leu Phe Val
CGG CGG GCC AAA GAT CTC GTC GCT TCC TAC ATG CGC GAA GCC GGG CTT TTC GTA
111 120 129 138 147 156
Tyr Glu Asp Ala Ala Gly Asn Leu Ile Gly Arg Lys Glu Gly Thr Asn Pro Asp
TAT GAA GAC GCG GCT GGC AAC TTG ATC GGA CGG AAA GAA GGG ACG AAT CCG GAT
165 174 183 192 201 210
Ala Thr Val Val Leu Val Gly Ser His Leu Asp Ser Val Tyr Asn Gly Gly Cys
GCC ACG GTC GTC CTT GTT GGA TCT CAT CTC GAT TCG GTT TAC AAC GGC GGC TGC
219 228 237 246 255 264
Phe Asp Gly Pro Leu Gly Val Leu Ala Gly Val Glu Val Val Gln Thr Met Asn
TTT GAT GGA CCG CTC GGG GTG TTG GCC GGC GTG GAA GTC GTT CAG ACG ATG AAC
273 282 291 300 309 318
Glu His Gly Val Val Thr His His Pro Ile Glu Val Val Ma Phe Thr Asp Glu
GAG CAC GGT GTT GTG ACG CAC CAC CCA ATT GAA GTA GTG GCG TTC ACT GAC GAA
327 336 345 354 363 372
Glu Gly Ala Arg Phe Arg Phe Gly Met Ile Gly Ser Arg Ala Met Ma Gly Thr
GAG GGA GCG CGC TTT CGT TTC GGC ATG ATC GGC AGC CGC CGC ATG CGC GGA ACA
381 390 399 408 417 426
Leu Pro Pro Glu Ala Leu Glu Cys Arg Asp Ala Glu Gly Ile Ser Leu Ala Glu
CTG CCG CCG GAA GCG CTC GAG TGC CGC GAC CGC GAA CGC ATT TCC cTc GCT GAA
435 444 453 462 471 480
Ala Met Lys Gln Ala Gly Leu Asp Pro Asp Arg Leu Pro Gln Ala Ala Arg Lys
CGC ATG AAA CAG GCG CGC CTT GAC CCG GAC CGC TTC CCG CAG GCA CGC CGA AAA
489 498 507 516 525 534
Pro Gly Thr Val Lys Ala Tyr Val Glu Leu His Ile Glu Gln Gly Arg Val Leu
CCA GGA ACG GTG AAA GCC TAT GTC GAA TTG CAT ATC GAA CAA GGA CGG GTG CTG
543 552 561 570 579 588
Glu Glu Ala Gly Leu Pro Val Gly Ile Val Thr Gly Ile Ala Gly Leu Ile Trp
GAG GAG GCT GGT CTT CCA GTT GGC ATC GTC ACT GGC ATC GCC GGT CTG ATT TGG
597 606 615 624 633 642
Val Lys Phe Thr Ile Ala Gly Pro Ala Glu His Ala Gly Ala Thr Pro Met Ser
GTG AAA TTT ACC ATC GCC GGC CCG GCG GAA CAT CGC GGC CGC ACG CCG ATG TCA
651 660 669 678 687 696
Leu Arg Arg Asp Pro Met Ala Ala Ala Ala Gln Ile Ile Ile Val Ile Glu Glu
TTG CGG CGC GAC CCG ATG GCG GCG CGC CGC CAG ATC ATC ATA GTG ATC GAA GAG
705 714 723 732 741 750
Glu Ala Arg Arg Thr Gly Thr Thr Val Gly Thr Val Gly Gln Leu His Val Tyr
GAA GCA AGA CGA ACA GGG ACA ACG GTC GGT ACT GTA GGA CAG TTG CAT GTA TAT
759 768 777 786 795 804
Pro Gly Gly Ile Asn Val Ile Pro Glu Arg Val Glu Phe Val Leu Asp Leu Arg
CCG GGC GGT ATT AAT GTC ATT CCG GAA CGG GTC GAA TTT GTG CTC GAT TTG CGC
813 822 831 840 849 858
Asp Leu Lys Ala Glu Val Arg Asp Gln Val Trp Lys Ala Ile Ala Val Arg Ala
GAC TTG AAG GCT GAG GTG CGC GAT CAA GTA TGG AAA GCC ATA GCC GTG CGG GCA
867 876 885 894 903 912
Glu Thr Ile Ala Lys Glu Arg Asn Val Arg Leu Thr Thr Glu Arg Leu Gln Glu
GAG ACG ATC GCC AAG GAG CGG AAC GTT CGC CTC ACG ACC GAG CGA CTG CAA GAA
921 930 939 948 957 966
Met Ala Pro Val Leu Cys Ser Glu Val Val Lys Gln Ala Ala Glu Arg Ala cys
ATG GCG CCG GTG TTA TGT TCC GAG GTG GTG AAA CAG GCC GCG GAA AGA GCG TGC
975 984 993 1002 1011 1020
Lys Gln Leu Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Leu Pro Ser Gly Ala Ala His Asp Gly
AAG CAG CTC GGG TAT CCG CCG TTT TGG CTG CCG AGC GGC GCA GCC CAT GAC GGC
1029 1038 1047 1056 1065 1074
Val Gln Leu Ala Pro Ile Cys Pro Ile Gly Met Ile Phe Val Arg Ser Gln Asp
GTA CAG TTG GCT CCG ATT TGC CCG ATC GGG ATG ATT TTT GTC CGC TCC CAA GAC
1083 1092 1101 1110 1119 1128
Gly Val Ser His Ser Pro Ala Glu Trp Ser Thr Lys Glu Asp Cys Ala Val Gly
GGG GTG AGT CAT AGT CCG GCG GAA TGG AGT ACT AAA GAA GAC TGC GCC GTT GGA
1137 1146 1155 1164 1173 1182
Ala Glu Val Leu Tyr His Thr Val Trp Gln Leu Ala Gln Gly Glu TER
GCA GAG GTG CTT TAT CAT ACA GTG TGG CAA CTG GCC CAA GGG GAA TAA
1191 1200 1209 1218 1227
Claims (13)
1. Acide aminé amidohydrolase possédant la séquence d'acides amis représentée en SEQ ID N 1.
2. Acide aminé amidohydrolase caractérisée en ce qu'elle est issue de la souche Bacillus stearothennophiIls NCIB8224 et est capable d'hydrolyeer des dérivés Ncarbamoyle acides aminés en L-acides aminés correspondants.
3. Séquence polynucléotidique caractérisée en ce qu'elle code pour une acide aminé amidohydrolase selon l'une des revendications 1 à 2.
4. Séquence selon la revendication 3 caractérisée en ce qu'il Sagit de la SEQ
ID N01.
5. ADN recombinant comprenant une séquence polynucléotidique selon la revendication 3 ou 4.
6. Vecteur d'expression à réplication autonome et/ou intégratif caractérisé en ce qu'il comprend une séquence polynucléotidique selon la revendication 3 ou 4.
7. Cellule recombinante contenant une séquence polynucléotidique selon la revendication 3 ou 4, un ADN recombinant selon la revendication 5 et/ou un vecteur d'expression selon la revendication 6.
8. Cellule selon la revendication 7 caractérisée en ce qu'il s'agit de préférence d'une bactérie.
9. Procédé de production d'une acide aminé amidokydrolase selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinante selon la revendication 7 ou 8 et l'on récupère l'acide aminé amidohydrolase attendue.
10. Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que Tsrpes90n du gène ou de l'ADN recombinant codant pour l'acide aminé amidohydrolase est placée sous contrôle d'un promoteur T7 dans la dite cellule recombinante.
11. Procédé pour l'hydrolyse enzymatique de N-carbamoyle Gacides aminés en L-acides aminés correspondants mettant en oeuvre une acide aminé amidohydrolase selon la revendication 1 ou 2 exprimée in situ ou non à partir d'une cellule selon la revendication 7 ou 8.
12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que lydese est effectuée en présence d'une quantité efficace de sels de oobalt.
13. Utilisation d'une acide aminé amidohydrolase selon la revendication 1 ou 2. ou d'une séquence selon la revendication 3 ou 4 pour la production enzymatique de
L-méthionine.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9415838A FR2728905A1 (fr) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Nouvelle acide amine amidohydrolase, sequence nuclotidique correspondant et leurs utilisations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9415838A FR2728905A1 (fr) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Nouvelle acide amine amidohydrolase, sequence nuclotidique correspondant et leurs utilisations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2728905A1 true FR2728905A1 (fr) | 1996-07-05 |
| FR2728905B1 FR2728905B1 (fr) | 1997-02-07 |
Family
ID=9470391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9415838A Granted FR2728905A1 (fr) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Nouvelle acide amine amidohydrolase, sequence nuclotidique correspondant et leurs utilisations |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2728905A1 (fr) |
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| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 120, no. 13, 28 March 1994, Columbus, Ohio, US; abstract no. 157385y, SAKANYAN, V. ET AL: "Gene cloning, sequence analysis, purification and characterization of a thermostable aminoacylase from Bacillus stearothermophilus." page 483; * |
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