JP3492750B2 - ５−アミノレブリン酸生産微生物及びその製造方法 - Google Patents
５−アミノレブリン酸生産微生物及びその製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、農薬等として有用な５
−アミノレブリン酸を効率よく生産する微生物、当該微
生物の製造法、及び５−アミノレブリン酸の製造法に関
する。
−アミノレブリン酸を効率よく生産する微生物、当該微
生物の製造法、及び５−アミノレブリン酸の製造法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】５−アミノレブリン酸は、テトラピロー
ル化合物の前駆物質として広く生物圏に存在し、生体中
で重要な役割を担っていると共に、除草剤、殺虫剤、植
物成長調節剤、植物の光合成増強剤として優れた効果を
示し、しかも人畜に対して毒性を示さず分解性が高いた
め、環境中への残留性もないなど優れた性質を示す天然
化合物である（特開昭６１−５０２８１４号公報、特開
平２−１３８２０１号公報など参照）。
ル化合物の前駆物質として広く生物圏に存在し、生体中
で重要な役割を担っていると共に、除草剤、殺虫剤、植
物成長調節剤、植物の光合成増強剤として優れた効果を
示し、しかも人畜に対して毒性を示さず分解性が高いた
め、環境中への残留性もないなど優れた性質を示す天然
化合物である（特開昭６１−５０２８１４号公報、特開
平２−１３８２０１号公報など参照）。
【０００３】この５−アミノレブリン酸の製造方法とし
ては、従来、種々の方法があり、微生物を用いた製造方
法（特開平５−１８４３７６号公報）も検討されている
が、従来の微生物を用いた製造方法では５−アミノレブ
リン酸の生産性が低く、満足できるものではない。ま
た、５−アミノレブリン酸がグリシンを前駆体として生
合成されるＣ４経路を有する光合成細菌や酵母などを用
いた５−アミノレブリン酸の製造方法として、５−アミ
ノレブリン酸の生合成の前駆体であるグリシンを培養液
中に添加する方法がある。
ては、従来、種々の方法があり、微生物を用いた製造方
法（特開平５−１８４３７６号公報）も検討されている
が、従来の微生物を用いた製造方法では５−アミノレブ
リン酸の生産性が低く、満足できるものではない。ま
た、５−アミノレブリン酸がグリシンを前駆体として生
合成されるＣ４経路を有する光合成細菌や酵母などを用
いた５−アミノレブリン酸の製造方法として、５−アミ
ノレブリン酸の生合成の前駆体であるグリシンを培養液
中に添加する方法がある。
【０００４】グリシンの添加は、５−アミノレブリン酸
の生産量を著しく増大させる効果をもたらすが、大量の
グリシンの添加は、微生物の生育や機能を著しく阻害す
る。従って、グリシンの５−アミノレブリン酸への転換
率を上昇させることが、５−アミノレブリン酸の生産性
を向上させるための重要な手段となる。
の生産量を著しく増大させる効果をもたらすが、大量の
グリシンの添加は、微生物の生育や機能を著しく阻害す
る。従って、グリシンの５−アミノレブリン酸への転換
率を上昇させることが、５−アミノレブリン酸の生産性
を向上させるための重要な手段となる。
【０００５】一方、生体内でのグリシンの代謝には幾つ
もの経路が知られているが、中でもグリシンとアセチル
−ＣｏＡを基質としてアミノアセトン（アミノアセトン
シンターゼ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．２９）を生成する反
応は、グリシンだけでなく、この反応に必要な補酵素で
あるピリドキサールリン酸に関しても、５−アミノレブ
リン酸生産反応である５−アミノレブリン酸シンターゼ
反応と競合する。
もの経路が知られているが、中でもグリシンとアセチル
−ＣｏＡを基質としてアミノアセトン（アミノアセトン
シンターゼ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．２９）を生成する反
応は、グリシンだけでなく、この反応に必要な補酵素で
あるピリドキサールリン酸に関しても、５−アミノレブ
リン酸生産反応である５−アミノレブリン酸シンターゼ
反応と競合する。
【０００６】また、５−アミノレブリン酸の生産性を向
上させるためには、生体内でスクシニル−ＣｏＡが安定
に供給されなくてはならない。なおかつ、スクシニル−
ＣｏＡが安定に供給されていても、スクシニル−ＣｏＡ
が５−アミノレブリン酸シンターゼによって５−アミノ
レブリン酸に転換される際にアセチル−ＣｏＡが存在す
れば、アセチル−ＣｏＡが競合的に働く。さらに、５−
アミノレブリン酸シンターゼによってスクシニル−Ｃｏ
Ａの代わりにアセチル−ＣｏＡがグリシンとの縮合反応
を受ければ、アミノアセトンが生じる（Ｔｈｅ Ｅｎｚ
ｙｍｅ、Ｐ．Ｄ．ベイヤー編、１９７２年参照）。
上させるためには、生体内でスクシニル−ＣｏＡが安定
に供給されなくてはならない。なおかつ、スクシニル−
ＣｏＡが安定に供給されていても、スクシニル−ＣｏＡ
が５−アミノレブリン酸シンターゼによって５−アミノ
レブリン酸に転換される際にアセチル−ＣｏＡが存在す
れば、アセチル−ＣｏＡが競合的に働く。さらに、５−
アミノレブリン酸シンターゼによってスクシニル−Ｃｏ
Ａの代わりにアセチル−ＣｏＡがグリシンとの縮合反応
を受ければ、アミノアセトンが生じる（Ｔｈｅ Ｅｎｚ
ｙｍｅ、Ｐ．Ｄ．ベイヤー編、１９７２年参照）。
【０００７】以上のようにグリシンから５−アミノレブ
リン酸及びアミノアセトンへの代謝経路は酵素及び補酵
素が複雑に関与しており、これを制御することは困難で
あった。
リン酸及びアミノアセトンへの代謝経路は酵素及び補酵
素が複雑に関与しており、これを制御することは困難で
あった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はアミノアセトンの生産性を抑制し、選択的に５−アミ
ノレブリン酸を生産する微生物、当該微生物の創製法、
及び当該微生物を利用した５−アミノレブリン酸の製造
法を提供することにある。
はアミノアセトンの生産性を抑制し、選択的に５−アミ
ノレブリン酸を生産する微生物、当該微生物の創製法、
及び当該微生物を利用した５−アミノレブリン酸の製造
法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】このような実情におい
て、本発明者は、５−アミノレブリン酸生産菌の突然変
異処理について鋭意検索した結果、光合成細菌であるロ
ドバクター属に属する微生物を変異処理して得られる変
異株群のうち、比較的著量のアミノアセトンを蓄積する
ものが５−アミノレブリン酸の生産が著しく低下してい
ることを発見し、さらに上記変異株群の中からアミノア
セトンを蓄積しない菌株を選択することによって、５−
アミノレブリン酸を特異的に高蓄積する変異株を選択す
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
て、本発明者は、５−アミノレブリン酸生産菌の突然変
異処理について鋭意検索した結果、光合成細菌であるロ
ドバクター属に属する微生物を変異処理して得られる変
異株群のうち、比較的著量のアミノアセトンを蓄積する
ものが５−アミノレブリン酸の生産が著しく低下してい
ることを発見し、さらに上記変異株群の中からアミノア
セトンを蓄積しない菌株を選択することによって、５−
アミノレブリン酸を特異的に高蓄積する変異株を選択す
ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
【産業上の利用分野】すなわち、本発明は５−アミノレ
ブリン酸を蓄積し、かつアミノアセトンを蓄積しないロ
ドバクター・セファロイデスに属する微生物を提供する
ものである。
ブリン酸を蓄積し、かつアミノアセトンを蓄積しないロ
ドバクター・セファロイデスに属する微生物を提供する
ものである。
【００１１】 また、本発明はロドバクター・セファロ
イデスに属し、５−アミノレブリン酸及びアミノアセト
ンを蓄積する微生物を突然変異処理し、５−アミノレブ
リン酸を蓄積し、かつアミノアセトンを蓄積しない変異
株を選択することを特徴とする上記の微生物の製造法を
提供するものである。
イデスに属し、５−アミノレブリン酸及びアミノアセト
ンを蓄積する微生物を突然変異処理し、５−アミノレブ
リン酸を蓄積し、かつアミノアセトンを蓄積しない変異
株を選択することを特徴とする上記の微生物の製造法を
提供するものである。
【００１２】さらにまた、本発明は上記の微生物を培養
し、得られた培養物から５−アミノレブリン酸を採取す
ることを特徴とする、５−アミノレブリン酸の製造法を
提供するものである。
し、得られた培養物から５−アミノレブリン酸を採取す
ることを特徴とする、５−アミノレブリン酸の製造法を
提供するものである。
【００１３】本発明の微生物はロドバクター・セファロ
イデスに属し、グリシン及びレブリン酸存在下で５−ア
ミノレブリン酸を高蓄積し、かつアミノアセトンを副生
しないものであれば特に制限されない。
イデスに属し、グリシン及びレブリン酸存在下で５−ア
ミノレブリン酸を高蓄積し、かつアミノアセトンを副生
しないものであれば特に制限されない。
【００１４】 本発明の微生物は、例えば光合成細菌で
あるロドバクター・セファロイデスに属し、５−アミノ
レブリン酸及びアミノアセトンを蓄積する微生物を突然
変異処理し、当該変異株の中から５−アミノレブリン酸
の生産性を維持し、アミノアセトン生産性を失った株を
選択することにより得られる。
あるロドバクター・セファロイデスに属し、５−アミノ
レブリン酸及びアミノアセトンを蓄積する微生物を突然
変異処理し、当該変異株の中から５−アミノレブリン酸
の生産性を維持し、アミノアセトン生産性を失った株を
選択することにより得られる。
【００１５】ここで用いられる親株としては、ロドバク
ター・セファロイデスに属する菌株、例えばＣＲ−３８
６株（微工研菌寄第１３１５９号）が挙げられる。この
ＣＲ−３８６株は、既知の菌株であるロドバクター・セ
ファロイデス（ＩＦＯ１２２０３）をＮＴＧで変異処理
し、得られた変異株より５−アミノレブリン酸デヒドラ
ターゼ変異酵素を有する株を選択することにより得られ
たものである。
ター・セファロイデスに属する菌株、例えばＣＲ−３８
６株（微工研菌寄第１３１５９号）が挙げられる。この
ＣＲ−３８６株は、既知の菌株であるロドバクター・セ
ファロイデス（ＩＦＯ１２２０３）をＮＴＧで変異処理
し、得られた変異株より５−アミノレブリン酸デヒドラ
ターゼ変異酵素を有する株を選択することにより得られ
たものである。
【００１６】親株の突然変異処理は、例えばまず、親株
が増殖し得る液体培地を試験管中に調製し、滅菌した後
この培地中に滅菌した親株を接種し、振とう培養して、
菌体を増殖させ、得られた菌体を緩衝液で洗浄した後、
物理的変異原、化学的変異原などを用いた公知の変異手
法によって行われる。ここで物理的変異原としては紫外
線、電離放射線などが挙げられ、この場合、増殖した寒
天培地上の親株に上記線原から照射する方法を用いるこ
とができる。また、化学的変異原としては、エチルメタ
ンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルニトロソ
尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオキシウリ
ジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログなどが挙げら
れ、この場合、これらの化合物を添加した緩衝液中で親
株を培養する方法を用いることができる。
が増殖し得る液体培地を試験管中に調製し、滅菌した後
この培地中に滅菌した親株を接種し、振とう培養して、
菌体を増殖させ、得られた菌体を緩衝液で洗浄した後、
物理的変異原、化学的変異原などを用いた公知の変異手
法によって行われる。ここで物理的変異原としては紫外
線、電離放射線などが挙げられ、この場合、増殖した寒
天培地上の親株に上記線原から照射する方法を用いるこ
とができる。また、化学的変異原としては、エチルメタ
ンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルニトロソ
尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオキシウリ
ジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログなどが挙げら
れ、この場合、これらの化合物を添加した緩衝液中で親
株を培養する方法を用いることができる。
【００１７】本発明の微生物を得るための上記親株を増
殖・培養するために用いる培地としては、該微生物が十
分に増殖し得るものであればいずれをも用いることがで
きるが、該培地中には資化し得る炭素源及び窒素源を適
当量含有せしめておくことが好ましい。炭素源として
は、グルコース等の糖類、酢酸、リンゴ酸、コハク酸等
の酸類などを用いることができる。また、窒素源として
は、硫安、塩安等のアンモニア態窒素化合物、硝酸ナト
リウム等の硝酸態窒素化合物等の無機窒素源、尿素、ポ
リペプトン、酵母エキス等の有機窒素化合物などを用い
ることができる。さらに、無機塩類等の微量成分などを
適宜添加することができる。
殖・培養するために用いる培地としては、該微生物が十
分に増殖し得るものであればいずれをも用いることがで
きるが、該培地中には資化し得る炭素源及び窒素源を適
当量含有せしめておくことが好ましい。炭素源として
は、グルコース等の糖類、酢酸、リンゴ酸、コハク酸等
の酸類などを用いることができる。また、窒素源として
は、硫安、塩安等のアンモニア態窒素化合物、硝酸ナト
リウム等の硝酸態窒素化合物等の無機窒素源、尿素、ポ
リペプトン、酵母エキス等の有機窒素化合物などを用い
ることができる。さらに、無機塩類等の微量成分などを
適宜添加することができる。
【００１８】上記変異処理により得られた変異株から、
本発明微生物を選択するには、変異株をグリシン及びレ
ブリン酸含有培地中で培養し、５−アミノレブリン酸を
産生し、かつアミノアセトンを産生しない菌株を選択す
ればよい。
本発明微生物を選択するには、変異株をグリシン及びレ
ブリン酸含有培地中で培養し、５−アミノレブリン酸を
産生し、かつアミノアセトンを産生しない菌株を選択す
ればよい。
【００１９】より具体的には、変異株をさらに緩衝液で
洗浄した後、寒天培地に撒いて培養し、この培養によっ
て生育した変異株の中から以下の工程によって目的とす
る菌株を選択する。
洗浄した後、寒天培地に撒いて培養し、この培養によっ
て生育した変異株の中から以下の工程によって目的とす
る菌株を選択する。
【００２０】（１）得られた変異株を上記と同様の培地
に植菌し、２４時間程度振とう培養する。このとき使用
する培養器としては通常の試験管を利用する他に、効率
的に多くの変異株を評価するためにマイクロプレート等
を利用することもできる。
に植菌し、２４時間程度振とう培養する。このとき使用
する培養器としては通常の試験管を利用する他に、効率
的に多くの変異株を評価するためにマイクロプレート等
を利用することもできる。
【００２１】（２）グリシン及びレブリン酸を添加し、
２４時間程度振とう培養した後、それぞれの培養液の一
部を採取し、試薬１（酢酸ナトリウム６８ｇとアセチル
アセトン１０mlとを混合し、氷酢酸でpHを４．７に調整
し、蒸留水で１０００mlとしたもの）と混合する。沸騰
浴中で加熱したもの（反応液１）を用いて薄層クロマト
グラフィーを行う。このとき使用するゲル及び展開液
は、２，４−ジメチル−３−アセチルピロール（Ｉ）
（アミノアセトン発色体）と２−メチル−３−アセチル
−４−（３−プロピオン酸）ピロール（II）（５−アミ
ノレブリン酸発色体）を分離できるものであればいかな
る方法でもよい。
２４時間程度振とう培養した後、それぞれの培養液の一
部を採取し、試薬１（酢酸ナトリウム６８ｇとアセチル
アセトン１０mlとを混合し、氷酢酸でpHを４．７に調整
し、蒸留水で１０００mlとしたもの）と混合する。沸騰
浴中で加熱したもの（反応液１）を用いて薄層クロマト
グラフィーを行う。このとき使用するゲル及び展開液
は、２，４−ジメチル−３−アセチルピロール（Ｉ）
（アミノアセトン発色体）と２−メチル−３−アセチル
−４−（３−プロピオン酸）ピロール（II）（５−アミ
ノレブリン酸発色体）を分離できるものであればいかな
る方法でもよい。
【００２２】（３）上記条件で十分に展開した後、上記
化合物（Ｉ）のスポットの見られない株を選択する。こ
のとき、上記化合物（II）のスポットの発色の強いもの
が望ましい。なお、この確認のために反応液１の１部を
試薬２（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１ｇと７
０％過塩素酸８mlを混合し、氷酢酸で５０mlとしたも
の）と混合したもの（反応液２）の５５３nmの吸光度を
測定する（エーリッヒ法）ことにより５−アミノレブリ
ン酸生産量を検討してもよい。
化合物（Ｉ）のスポットの見られない株を選択する。こ
のとき、上記化合物（II）のスポットの発色の強いもの
が望ましい。なお、この確認のために反応液１の１部を
試薬２（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１ｇと７
０％過塩素酸８mlを混合し、氷酢酸で５０mlとしたも
の）と混合したもの（反応液２）の５５３nmの吸光度を
測定する（エーリッヒ法）ことにより５−アミノレブリ
ン酸生産量を検討してもよい。
【００２３】このようにして得られる本発明微生物の例
としてはＣＲ−４５０株が挙げられる。このＣＲ−４５
０株の菌学的性質は、５−アミノレブリン酸を蓄積し、
アミノアセトンを蓄積しないという特性以外は前記ＣＲ
−３８６株と同様である。従って、このＣＲ−４５０株
をロドバクター・セファロイデス ＣＲ−４５０と命名
し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１４０８５として寄託した。
としてはＣＲ−４５０株が挙げられる。このＣＲ−４５
０株の菌学的性質は、５−アミノレブリン酸を蓄積し、
アミノアセトンを蓄積しないという特性以外は前記ＣＲ
−３８６株と同様である。従って、このＣＲ−４５０株
をロドバクター・セファロイデス ＣＲ−４５０と命名
し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１４０８５として寄託した。
【００２４】本発明微生物を用いて５−アミノレブリン
酸を生産するには、上記微生物を培養し、その培養物か
ら５−アミノレブリン酸を採取すればよい。
酸を生産するには、上記微生物を培養し、その培養物か
ら５−アミノレブリン酸を採取すればよい。
【００２５】本発明微生物の培養条件は、通常のロドバ
クター属の微生物の培養と同様の条件を採用できる。５
−アミノレブリン酸の生産を主目的とする場合、培地
は、前記親株と同様の培地にグリシン及びレブリン酸を
添加したものが好ましい。グリシンの添加量は５〜１０
０mM、特に１０〜６０mMとすることが好ましく、レブリ
ン酸の添加量は１〜６０mM、特に５〜３０mMとすること
が好ましい。培養条件は、特に限定されるものではない
が、一般には１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の
好気条件において培養すればよく、また、上記培地のpH
は５〜８、特に５．５〜７．５とすることが好ましい。
なお、５−アミノレブリン酸の生産時にpHが変化する場
合には、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウ
ム等のアルカリ溶液や塩酸、硫酸、燐酸等の酸を用いて
pHを調整することが好ましい。
クター属の微生物の培養と同様の条件を採用できる。５
−アミノレブリン酸の生産を主目的とする場合、培地
は、前記親株と同様の培地にグリシン及びレブリン酸を
添加したものが好ましい。グリシンの添加量は５〜１０
０mM、特に１０〜６０mMとすることが好ましく、レブリ
ン酸の添加量は１〜６０mM、特に５〜３０mMとすること
が好ましい。培養条件は、特に限定されるものではない
が、一般には１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の
好気条件において培養すればよく、また、上記培地のpH
は５〜８、特に５．５〜７．５とすることが好ましい。
なお、５−アミノレブリン酸の生産時にpHが変化する場
合には、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウ
ム等のアルカリ溶液や塩酸、硫酸、燐酸等の酸を用いて
pHを調整することが好ましい。
【００２６】また、５−アミノレブリン酸の生産は本発
明微生物の増殖と同時に行うこともでき、菌体の増殖と
独立して行うこともできる。この場合、使用する微生物
は、増殖基菌体、休止菌体のいずれでもよく、そのまま
５−アミノレブリン酸の生産に使用することができる
が、遠心分離等の方法により集菌し、培地やリン酸緩衝
液等の適当な溶媒に再懸濁させるなどの方法を採用する
ことにより、菌濃度を高くして用いることもできる。
明微生物の増殖と同時に行うこともでき、菌体の増殖と
独立して行うこともできる。この場合、使用する微生物
は、増殖基菌体、休止菌体のいずれでもよく、そのまま
５−アミノレブリン酸の生産に使用することができる
が、遠心分離等の方法により集菌し、培地やリン酸緩衝
液等の適当な溶媒に再懸濁させるなどの方法を採用する
ことにより、菌濃度を高くして用いることもできる。
【００２７】培養物から５−アミノレブリン酸を採取す
るには、培養により５−アミノレブリン酸は菌体外に分
泌されるので通常、培養液から、イオン交換樹脂を用い
る等の手段により分離すればよい。
るには、培養により５−アミノレブリン酸は菌体外に分
泌されるので通常、培養液から、イオン交換樹脂を用い
る等の手段により分離すればよい。
【００２８】
【発明の効果】本発明の微生物を５−アミノレブリン酸
の生産に用いた場合、副生するアミノアセトンの量が著
しく低減し、かつグリシンの５−アミノレブリン酸への
転換率の向上及び／又はスクシニル−ＣｏＡを５−アミ
ノレブリン酸に転換する際のアセチルＣｏＡによる競争
阻害の緩和の効果により、５−アミノレブリン酸の生産
性が著しく向上する。
の生産に用いた場合、副生するアミノアセトンの量が著
しく低減し、かつグリシンの５−アミノレブリン酸への
転換率の向上及び／又はスクシニル−ＣｏＡを５−アミ
ノレブリン酸に転換する際のアセチルＣｏＡによる競争
阻害の緩和の効果により、５−アミノレブリン酸の生産
性が著しく向上する。
【００２９】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００３０】実施例１
表１に示すグルタメート・グルコース培地（培地１）１
０mlを直径２１mmの試験管に分注し、１２１℃で１５分
間滅菌し、冷却した。これにＣＲ−３８６株（微工研菌
寄第１３１５９号）の一白金耳を植菌した後、暗所にて
３０℃で２日間振とう培養した。別の直径２１mmの試験
管に培地１を１０ml分注して、上記と同様にして滅菌し
た。これに、上記の培養液０．５mlを植え継ぎ、暗所に
て３０℃で１８時間振とうすることにより培養した。次
に、この培養液を１００００rpm にて５分間遠心分離
し、その上清を捨て、遠心分離前と同量のトリス・マレ
イン酸緩衝液（pH６．０）に懸濁させた。この洗浄操作
をさらに２度繰り返した。この後、再び１００００rpm
にて５分間遠心分離し、その上清を捨て、１００μｇ／
mlのＮＴＧを含むトリス・マレイン酸（pH６．０）に懸
濁させ、室温にて８０分間静置培養した。このようにし
て変異処理した菌を、上記と同様の方法で３回洗浄した
後、滅菌した培地１の試験管に植え継ぎ、暗所にて３０
℃で２日間振とう培養し、培養液を得た。培地１に寒天
１５ｇ／ｌを添加し、１２１℃で１５分間滅菌して調製
した寒天プレートに、上記の培養液を生理食塩水で適宜
希釈して塗布し、暗所にて３０℃で４日間培養すること
により、約１００００株のコロニーを得た。上記の操作
で得られた変異株それぞれを培地１の試験管に植菌し、
暗所にて３０℃にて２日間振とう培養した。培養後それ
ぞれの試験管にグリシンを３０mM、レブリン酸を１mMと
なるように添加し、さらに２日間培養を続けた。培養上
清１mlと試薬１（酢酸ナトリウム６８ｇとアセチルアセ
トン１０mlとを混合し、氷酢酸でpHを４．７に調整し、
蒸留水で１０００mlとしたもの）を２mlとを混合し、沸
騰浴中で１５分間加熱し（反応液１）、これを冷却後、
反応液を一部取り、３．５mlの試薬２（ｐ−ジメチルア
ミノベンズアルデヒド１ｇと７０％過塩素酸８mlを混合
し、氷酢酸で５０mlとしたもの）を加えてよく混合し、
室温にて５分間静置した（反応液２）。上記反応液の５
５３nmの吸光度を測定し、吸光度の高いもの２７株（選
択菌）を得た。結果を表２に示す。
０mlを直径２１mmの試験管に分注し、１２１℃で１５分
間滅菌し、冷却した。これにＣＲ−３８６株（微工研菌
寄第１３１５９号）の一白金耳を植菌した後、暗所にて
３０℃で２日間振とう培養した。別の直径２１mmの試験
管に培地１を１０ml分注して、上記と同様にして滅菌し
た。これに、上記の培養液０．５mlを植え継ぎ、暗所に
て３０℃で１８時間振とうすることにより培養した。次
に、この培養液を１００００rpm にて５分間遠心分離
し、その上清を捨て、遠心分離前と同量のトリス・マレ
イン酸緩衝液（pH６．０）に懸濁させた。この洗浄操作
をさらに２度繰り返した。この後、再び１００００rpm
にて５分間遠心分離し、その上清を捨て、１００μｇ／
mlのＮＴＧを含むトリス・マレイン酸（pH６．０）に懸
濁させ、室温にて８０分間静置培養した。このようにし
て変異処理した菌を、上記と同様の方法で３回洗浄した
後、滅菌した培地１の試験管に植え継ぎ、暗所にて３０
℃で２日間振とう培養し、培養液を得た。培地１に寒天
１５ｇ／ｌを添加し、１２１℃で１５分間滅菌して調製
した寒天プレートに、上記の培養液を生理食塩水で適宜
希釈して塗布し、暗所にて３０℃で４日間培養すること
により、約１００００株のコロニーを得た。上記の操作
で得られた変異株それぞれを培地１の試験管に植菌し、
暗所にて３０℃にて２日間振とう培養した。培養後それ
ぞれの試験管にグリシンを３０mM、レブリン酸を１mMと
なるように添加し、さらに２日間培養を続けた。培養上
清１mlと試薬１（酢酸ナトリウム６８ｇとアセチルアセ
トン１０mlとを混合し、氷酢酸でpHを４．７に調整し、
蒸留水で１０００mlとしたもの）を２mlとを混合し、沸
騰浴中で１５分間加熱し（反応液１）、これを冷却後、
反応液を一部取り、３．５mlの試薬２（ｐ−ジメチルア
ミノベンズアルデヒド１ｇと７０％過塩素酸８mlを混合
し、氷酢酸で５０mlとしたもの）を加えてよく混合し、
室温にて５分間静置した（反応液２）。上記反応液の５
５３nmの吸光度を測定し、吸光度の高いもの２７株（選
択菌）を得た。結果を表２に示す。
【００３１】上記選択菌２７株を含む反応液１を薄層ク
ロマトグラフィーに供し、十分に展開後、風乾した。こ
の場合、展開溶媒としては、酢酸エチル：イソプロピル
アルコール：２５％アンモニア＝９：７：４（容積比）
の混合液を用いた。次に、上記薄層板に試薬２を噴霧
し、５分間放置する方法を用いて、Ｒ．ｆ．＝０．８７
に検出される赤色のスポット（化合物Ｉに対応）の有無
を調べた。結果を表２に示す。
ロマトグラフィーに供し、十分に展開後、風乾した。こ
の場合、展開溶媒としては、酢酸エチル：イソプロピル
アルコール：２５％アンモニア＝９：７：４（容積比）
の混合液を用いた。次に、上記薄層板に試薬２を噴霧
し、５分間放置する方法を用いて、Ｒ．ｆ．＝０．８７
に検出される赤色のスポット（化合物Ｉに対応）の有無
を調べた。結果を表２に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】＊：
−；無し。
±；Ｒ．ｆ．＝０．１及びＲ．ｆ．＝０．８７有り。
＋；Ｒ．ｆ．＝０．８７のみ有り。
【００３５】表２から、本発明に係る変異株Ｎｏ．４５
（ＣＲ４５０（ＦＥＲＭ Ｐ１４０８５））は、アミノ
アセトンを蓄積せず、なおかつピロール環に由来する５
５３nmの吸光度が高いことがわかる。
（ＣＲ４５０（ＦＥＲＭ Ｐ１４０８５））は、アミノ
アセトンを蓄積せず、なおかつピロール環に由来する５
５３nmの吸光度が高いことがわかる。
【００３６】実施例２
１０mlの培地１を直径２１mmの試験管に分注して、１２
１℃で１５分間滅菌し、冷却した。これにＣＲ−４５０
株の一白金耳を植菌後、暗所にて３０℃で２日間振とう
培養した。５００mlの振とうフラスコに培地１を２００
ml分注して、上記と同様にして滅菌した。これに、上記
の培養液１０mlを植え継ぎ、暗所にて３０℃で２日間振
とう培養した。これを１００００rpm で１０分間遠心分
離した後、菌体をグリシン３０mM、レブリン酸１５mMを
含む培地２に湿菌体０．３ｇ／１０mlとなるように懸濁
させ、暗所にて３０℃で振とう培養した。培養１５時間
及び４０時間後それぞれの培養液中の５−アミノレブリ
ン酸を岡山らの方法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳ
ＴＲＹ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐ１４９４，１９９
０）により定量した。結果を表３に示す。
１℃で１５分間滅菌し、冷却した。これにＣＲ−４５０
株の一白金耳を植菌後、暗所にて３０℃で２日間振とう
培養した。５００mlの振とうフラスコに培地１を２００
ml分注して、上記と同様にして滅菌した。これに、上記
の培養液１０mlを植え継ぎ、暗所にて３０℃で２日間振
とう培養した。これを１００００rpm で１０分間遠心分
離した後、菌体をグリシン３０mM、レブリン酸１５mMを
含む培地２に湿菌体０．３ｇ／１０mlとなるように懸濁
させ、暗所にて３０℃で振とう培養した。培養１５時間
及び４０時間後それぞれの培養液中の５−アミノレブリ
ン酸を岡山らの方法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳ
ＴＲＹ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐ１４９４，１９９
０）により定量した。結果を表３に示す。
【００３７】比較例１〜３
実施例２において、植菌する菌株をＣＲ−３８６株（比
較例１）、表２に示すＮｏ．７８株（比較例２）、表２
に示すＮｏ．１０株（比較例３）とし、レブリン酸濃度
を３０mMとした以外は実施例３と同様に操作した。結果
を表３に示す。
較例１）、表２に示すＮｏ．７８株（比較例２）、表２
に示すＮｏ．１０株（比較例３）とし、レブリン酸濃度
を３０mMとした以外は実施例３と同様に操作した。結果
を表３に示す。
【００３８】
【表３】
【００３９】表３から、アミノアセトン非蓄積菌株であ
る本発明に係るＣＲ−４５０株は、親株であるＣＲ−３
８６株や他のアミノアセトン蓄積株に比べて５−アミノ
レブリン酸の生産性が著しく上昇していることがわか
る。
る本発明に係るＣＲ−４５０株は、親株であるＣＲ−３
８６株や他のアミノアセトン蓄積株に比べて５−アミノ
レブリン酸の生産性が著しく上昇していることがわか
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 田中 徹
埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社
コスモ総合研究所研究開発センター内
(72)発明者 堀田 康司
埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社
コスモ総合研究所研究開発センター内
(56)参考文献 特開 平５−95782（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 1/00 - 1/38
C12P 13/00 - 13/24
ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (4)
- 【請求項１】５−アミノレブリン酸を蓄積し、かつアミ
ノアセトンを蓄積しないロドバクター・セファロイデス
に属する微生物。 - 【請求項２】ロドバクター・セファロイデス ＣＲ−４
５０と命名され、ＦＥＲＭＰ−１４０８５として寄託さ
れたものである請求項１記載の微生物。 - 【請求項３】ロドバクター・セファロイデスに属し、５
−アミノレブリン酸及びアミノアセトンを蓄積する微生
物を突然変異処理し、５−アミノレブリン酸を蓄積し、
かつアミノアセトンを蓄積しない変異株を選択すること
を特徴とする請求項１記載の微生物の製造法。 - 【請求項４】請求項１記載の微生物を培養し、得られた
培養物から５−アミノレブリン酸を採取することを特徴
とする５−アミノレブリン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3670594A JP3492750B2 (ja) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | ５−アミノレブリン酸生産微生物及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3670594A JP3492750B2 (ja) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | ５−アミノレブリン酸生産微生物及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07246088A JPH07246088A (ja) | 1995-09-26 |
| JP3492750B2 true JP3492750B2 (ja) | 2004-02-03 |
Family
ID=12477195
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3670594A Expired - Fee Related JP3492750B2 (ja) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | ５−アミノレブリン酸生産微生物及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3492750B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0718405B1 (en) * | 1994-12-20 | 2002-10-02 | Cosmo Research Institute | 5-Aminolevulinic acid producing microorganism |
-
1994
- 1994-03-08 JP JP3670594A patent/JP3492750B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07246088A (ja) | 1995-09-26 |
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