JPH1142083A - ５−アミノレブリン酸生産微生物及びこれを用いた５−アミノレブリン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 溶存酸素濃度が０．７０〜６．６０ppm
である好気培養条件下で、５−アミノレブリン酸合成酵
素活性が２〜７（n mol／min／mgタンパク）である５−
アミノレブリン酸生産微生物、及びこれを培養し、得ら
れた培養物から５−アミノレブリン酸を採取する５−ア
ミノレブリン酸の製造法。 【効果】 ５−アミノレブリン酸を工業的に有利に製造
し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、５−アミノレブリ
ン酸を高濃度で生産・蓄積することのできる微生物及び
これを用いた５−アミノレブリン酸の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】５−ア
ミノレブリン酸は、テトラピロール化合物の前駆体とし
て広く生物圏に存在し、生体中で重要な役割を果たして
いる化合物である。５−アミノレブリン酸は、除草剤、
殺虫剤、植物成長調節剤、植物の光合成増強剤等として
優れた作用を示し、しかも人畜に対して毒性を示さず、
分解性が高いため環境への残留性もないなど、優れた特
性を有する天然化合物である（特開昭６１−５０２８１
４号公報、特開平２−１３８２０１号公報等参照）。

【０００３】しかし、５−アミノレブリン酸は、生産コ
ストが高く、上記用途に使用するには実用性に欠けると
いう問題がある（CHEMICAL WEEK／OCTOBER, 29, 198
4）。

【０００４】このため、多くの化学合成法が検討されて
いる（例えば、特開平２−７６８４１号公報参照）が、
未だ十分な方法は開発されていない。

【０００５】一方、ロドバクテリウム（Rhodobacteriu
m）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）
属、メタノバクテリウム（Methanobacterium）属、メタ
ノサルシナ（Methanosarcina）属等の微生物を用いた５
−アミノレブリン酸の製造方法も検討されている。しか
し、プロピオニバクテリウム属、メタノバクテリウム
属、メタノサルシナ属等（特開平５−１８４３７６号等
参照）を用いる方法では生産量が非常に低く、満足でき
るものではない。

【０００６】ロドバクテリウム属、ロドシュードモナス
（Rhodopseudomonas）属等の紅色非硫黄細菌の微生物
は、５−アミノレブリン酸を代謝中間体とするテトラピ
ロール化合物の合成能力が高いことが知られている。し
かしながら、これらの微生物を使用すると、生成した５
−アミノレブリン酸は、テトラピロール化合物に代謝さ
れてしまい、望ましい量の５−アミノレブリン酸が蓄積
されないという問題があった。

【０００７】このように生体内において５−アミノレブ
リン酸の生合成は複雑に制御を受けているため、５−ア
ミノレブリン酸を高濃度に蓄積する菌株を作出すること
は容易ではない。

【０００８】これに対し、グルコースを炭素源とし、５
−アミノレブリン酸を最大１４．３mM蓄積することが可
能なロドバクテリウム属変異株を用いる方法が提案され
ている（特開平８−１６８３９１号）。しかし、この方
法は、培養中の溶存酸素濃度を低濃度に保つ必要があ
り、空気に窒素ガスを混合し培養槽内に通気することが
必要であり、工業的に有利な方法とは言えないものであ
った。なお、この方法では、グルコースを炭素源として
好気的に５−アミノレブリン酸を蓄積させようとする場
合、酸素が必要となる。従って、酸素が十分に存在する
条件下でも微生物がこれを消費することにより、溶存酸
素濃度が下がり、５−アミノレブリン酸が効率よく生産
されることも考えられる。しかし、この微生物を用い比
較的高い溶存酸素条件下で、効率良く５−アミノレブリ
ン酸を生産することは不可能であった。

【０００９】従って本発明の目的は、溶存酸素濃度が比
較的高い条件下でも窒素ガス等の導入が不要で、５−ア
ミノレブリン酸を効率よく生産し得る微生物及びこれを
用いた５−アミノレブリン酸の製造法を提供することに
ある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み本発明
者は、５−アミノレブリン酸を効率よく生産する微生物
を得るべく鋭意研究を行った結果、グリシン、レブリン
酸等の添加量を適切に変化させ、多数の突然変異株を評
価することができる極めて効率のよい５−アミノレブリ
ン酸生産微生物を選抜する方法を見出し、この方法によ
り、溶存酸素濃度が比較的高くとも５−アミノレブリン
酸を高濃度で蓄積する微生物を見出し本発明を完成し
た。更に本発明者は、培地に糖類、グリシン、レブリン
酸、鉄分等を適切に添加し、培養液中の溶存酸素、酸化
還元電位を制御することにより、５−アミノレブリン酸
の生産量を向上させることができることを見出し本発明
を完成した。

【００１１】すなわち本発明は、溶存酸素濃度が０．７
０〜６．６０ppm である好気培養条件下で、５−アミノ
レブリン酸合成酵素活性が２〜７（n mol／min／mgタン
パク）である５−アミノレブリン酸生産微生物を提供す
るものである。

【００１２】また、本発明は、該５−アミノレブリン酸
生産微生物を培養し、得られた培養物から５−アミノレ
ブリン酸を採取することを特徴とする５−アミノレブリ
ン酸の製造法を提供するものである。

【００１３】更に本発明は、鉄成分を５〜５００μＭ含
有する培地中で５−アミノレブリン酸生産微生物を培養
し、得られた培養物から５−アミノレブリン酸を採取す
ることを特徴とする、５−アミノレブリン酸の製造法を
提供するものである。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の５−アミノレブリン酸生
産微生物は、例えば、紅色非硫黄細菌の野性株又はその
変異株等を親株として、これを変異処理後、溶存酸素濃
度が０．７０〜６．６０ppm である条件下で、５−アミ
ノレブリン酸合成酵素活性が２〜７（n mol／min／mgタ
ンパク）好ましくは、溶存酸素濃度が１．４６〜５．８
６で５−アミノレブリン酸合成酵素活性が３．５〜５．
６である株を選抜することにより得られる。

【００１５】より具体的には、次の方法により得られ
る。

【００１６】まず、親株が増殖し得る液体培地を試験管
中に調製し、滅菌した後、親株を接種し、振とう培養す
る。そして増殖した菌体を緩衝液で洗浄後、変異操作を
行う。

【００１７】この変異操作としては、通常の変異手段を
用いることができる。例えば、紫外線、電離放射線等の
物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、エチル
メタンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルニト
ロソ尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤、ブロモデオキシ
ウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログなどの化学
的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養する方法を用
いることができる。

【００１８】上記のような変異手段によって処理した菌
体を、更に緩衝液で洗浄し、寒天培地等に撒き、培養す
る。なお、この培養により生育した変異株の中から、上
記の性質を示す菌株を選抜するには、以下のような工程
にて行う。

【００１９】得られた変異株を試験管等で培養し、菌体
増殖後、レブリン酸とグリシンを添加する。これらを添
加後培養液中の５−アミノレブリン酸蓄積量を測定し
て、５−アミノレブリン酸の生産量が多い株を選抜すれ
ばよい。また、より多くの微生物を培養し、評価するた
めには、マイクロタイタープレートを用いることが効率
的で好ましい。更に５−アミノレブリン酸の測定をエー
リッヒ反応により行えば、５−アミノレブリン酸の蓄積
量が視覚的に認識できるので効率的に選抜を行うことが
できる。

【００２０】選抜は、まず一回の変異処理で得られた変
異株群およそ１５，０００株から、５−アミノレブリン
酸の生産性の高い株を１〜１００株程度選び、次いで、
これらの株を試験管や寒天プレート上で継代し、生育度
や生産性の安定な菌株を更に選ぶことにより行われる。
このときも、エーリッヒ反応やマイクロタイタープレー
トを用いることが好ましい。

【００２１】ここで得られた菌株を更に親株として、上
記変異操作及び選抜を繰り返す。変異を重ね５−アミノ
レブリン酸の生産性が高まるにつれて、最適なレブリン
酸の添加濃度が変化することがあるので、レブリン酸の
添加濃度は適宜変更することが好ましい。このようにし
て変異育種を重ね、好気条件で５−アミノレブリン酸を
著量蓄積する能力を備えた菌株は、５−アミノレブリン
酸の代謝関連酵素のうち５−アミノレブリン酸合成酵素
が増強されているという特徴を持っている。また、培養
液中の溶存酸素濃度が２ppm を超えるような条件であっ
ても、同属の光合成細菌の野性株に観られるような５−
アミノレブリン酸合成酵素活性の抑制が起こりにくくな
っている。

【００２２】上記方法で最初に用いる親株としては、紅
色非硫黄細菌の野性株又はその変異株を用いることが好
ましく、特に好気条件下で、グルコース等の安価な炭素
源で良く生育し、バクテリオクロロフィル等のテトラピ
ロール合成能の高い菌株を用いることが好ましい。この
ような好ましい菌株としては、ロドバクテリウム属のも
の、特にロドバクター・スフェロイデス（Rhodobactor
sphaeroides）又はこれらの変異株が挙げられ、具体的
には、ロドバクター・スフェロイデス ＣＲ−００２株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１２）等が好ましい親株として
挙げられる。

【００２３】また、上記の変異、選抜によって得られる
菌株としても、ロドバクテリウム属、特にロドバクター
・スフェロイデスの変異株が好ましく、具体的には、ロ
ドバクター・スフェロイデス ＣＲ−００７２００９と
命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２１７として寄託された
ものが好ましい。この菌株は前記ロドバクター・スフェ
ロイデス ＣＲ−００２株の変異、選抜を繰り返し行い
得られたもので、５−アミノレブリン酸を著量蓄積し得
る菌株である。

【００２４】ロドバクター・スフェロイデス ＣＲ−０
０７２００９株は、上記の通りロドバクター・スフェロ
イデス ＣＲ−００２株を起源として変異処理によって
得られたものであるから、その菌学的性質の多くは、Ｃ
Ｒ−００２株と同様である。以下、ロドバクター・スフ
ェロイデス ＣＲ−００７２００９株の菌学的性質につ
いて説明する。

【００２５】 ａ形態的特徴 ・細胞の大きさ形 ０．５×１〜２．５μｍ、桿菌、数個の細胞が長軸 方向に連なる ・胞子の有無 なし ｂ寒天培地における生育状況 ・表１の培地において 円形のコロニー、光沢があり、赤褐色 ｃ生理学的性質 ・グラム染色性 − ・硝酸塩の還元 ＋ ・オキシダーゼ ＋ ・グルコース発酵性 − ・生育の範囲 pH４．０から９．０、１０℃から４０℃ ｄ化学分類学的性質 ・ＤＮＡのＧ／Ｃ含量（モル％） ６８ ・キノンタイプ Ｑ−１０ ・カロチノイド ＋（主要成分：クロロキサンチン、メチルク ロロキサンチン） ・バクテリオクロロフィル ＋ ｅその他生育条件など ・光合成生育 表１の培地で極めて微弱。起源菌は光合成細 菌であるが光合成生育能が低下している。 ・グルコースの資化性（好気的） ＋ ・酢酸ナトリウムの資化性（好気的） ＋ ・５−アミノレブリン酸脱水酵素活性 好気培養で、起源菌（ＣＲ−００２株） に比べて１／３以下

【００２６】以下、本発明の５−アミノレブリン酸生産
微生物を用いた５−アミノレブリン酸の生産条件につい
て、ロドバクター・スフェロイデス ＣＲ−００７２０
０９株を用いた場合を中心に説明する。５−アミノレブ
リン酸の生産条件については、通常の微生物培養条件を
適用することができる。例えば、炭素源としてグルコー
ス等の糖類、あるいは酢酸、リンゴ酸、コハク酸等の酸
類を用いることができ、特に糖類が価格の面で有利であ
る。また、窒素源としては、硫安、塩安等のアンモニア
態窒素化合物、硝酸ナトリウム等の硝酸態窒素化合物等
の無機窒素源；グリシン、尿素、ポリペプトン、酵母エ
キス、カザミノ酸等の有機窒素源を用いることができ
る。このうち、グリシンを添加することが、５−アミノ
レブリン酸の生産向上のため好ましい。グリシンの添加
量は、通常１０〜１０００mMとなるような範囲が好まし
く、特に１０〜４００mMの範囲が好ましい。またグリシ
ンの１回当りの添加量は１０〜２００mMが好ましく、こ
れを数回添加することが好ましい。また、培地には、必
要により、ビタミン類、無機塩類等の成分を添加しても
よい。

【００２７】ロドバクテリウム属、ロドシュードモナス
属等の紅色非硫黄細菌に属する微生物は、一般に５−ア
ミノレブリン酸デヒドラターゼを有し、生成した５−ア
ミノレブリン酸を代謝してしまうことが知られている。
しかし、本発明の菌株は、５−アミノレブリン酸デヒド
ラターゼ活性が顕著に低下しているため、レブリン酸等
の５−アミノレブリン酸デヒドラターゼ阻害剤を添加し
なくとも５−アミノレブリン酸を菌体外に蓄積し得る
が、わずかな量の阻害剤を添加すると５−アミノレブリ
ン酸生産能の向上に効果的である。この場合、その添加
量は０．０１〜２０mM、特に０．１〜１０mMの範囲が好
ましい。培養条件としては、ロドバクター・スフェロイ
デスＣＲ−００７２００９株が生育可能な条件はすべて
用いることができるが、一般には、培養温度は１０〜４
０℃、特に２０〜３５℃とするのが好ましく、培地のpH
は４〜９、特に５〜８とすることが好ましい。なお、培
養時にpHが変化する場合には、水酸化ナトリウム、アン
モニア、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液や、塩酸、
硫酸、リン酸等の酸で上記範囲に調整することが好まし
い。

【００２８】５−アミノレブリン酸の生産は、微生物の
増殖と同時に行うことができるが、独立しても行うこと
ができる。この場合に使用する微生物は、増殖菌体、休
止菌体のいずれでもよく、そのまま５−アミノレブリン
酸の生産に使用できるが、遠心分離機等の装置により集
菌し、培地やリン酸緩衝液等の適当な溶液に再懸濁させ
るなど、菌濃度を高くして用いることもできる。

【００２９】また、更に５−アミノレブリン酸の生産性
を向上させるには、培養液中の溶存酸素量を０．００１
〜２ppm 、酸化還元電位を−２２０mVから５０mVの範囲
で制御することが望ましく、更に望ましくは、それぞれ
０．００１〜１ppm 、−２００mVから０mVの範囲であ
る。このときの制御方法としては、攪拌回転数や通気量
を変化させる方法、糖類や酵母エキスなどを添加して微
生物の呼吸を活発化する方法、あるいはそれらを組み合
わせて行うことができる。

【００３０】また、更に安定的に溶存酸素あるいは酸化
還元電位を制御するには、微生物の生育速度を上げ、呼
吸活性を安定化させるべく培地中に鉄成分を含有せしめ
ることが有効である。ここで用いる鉄成分は、その塩が
好ましく、この場合の鉄の価数は特に制限はない。鉄成
分としては、塩化第二鉄、硫酸第二鉄、クエン酸鉄等が
挙げられる。また、培地成分として用いられる酵母エキ
スやコーンスティープリカー等の天然成分中に必要量の
鉄分が含まれている場合は、これを鉄成分として用いる
ことができる。鉄成分は、培地中に鉄として５〜５００
μＭとなるように添加することが好ましい。これが５μ
Ｍ未満であると生育促進効果及び呼吸活性を安定化させ
る効果が得られず、５００μＭを超えると微生物の生育
が阻害されることがある。特に好ましい鉄成分の濃度と
しては、１０〜３００μＭであり、更に好ましい濃度と
しては２０〜２００μＭである。

【００３１】生産された５−アミノレブリン酸はイオン
交換法、クロマト法、抽出法等の常法によって必要に応
じて分離・精製することができる。

【００３２】

【発明の効果】本発明の微生物は、５−アミノレブリン
酸の生産性に優れ、これを用いた５−アミノレブリン酸
の製造方法は、溶存酸素濃度が比較的高くとも窒素ガス
導入等の必要がなく、工業的に有利に５−アミノレブリ
ン酸を製造することができる。

【００３３】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を説明するが、こ
れらは単に例示の目的で掲げるものであり、本発明はこ
れらに限定されるものではない。

【００３４】実施例１ 表１に示すグルタメート・グルコース培地（培地１）１
０mlを２１mmφの試験管に分注し、１２１℃で１５分間
滅菌した後、放冷した。これにロドバクター・スフェロ
イデスＣＲ−００２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５３１２）の
一白金耳を植菌後、３０℃、暗所にて２日間振とう培養
した。

【００３５】別の２１mmφの試験管に培地１を１０ml分
注して、上記と同様にして滅菌した。これに、上記の培
養液０．５mlを植え継ぎ、３２℃の条件下暗所にて１８
時間振とう培養した。

【００３６】

【表１】

【００３７】この培養液を洗浄のため３０００ｇにて５
分間遠心分離し、その上清を捨て、遠心分離前と同量の
トリス・マレイン酸緩衝液（pH６．０）に懸濁させた。
この洗浄操作を更に２度繰り返した。この後、再び３０
００ｇにて５分間遠心分離し、その上清を捨て、１００
μｇ／mlのＮＴＧを含むトリス・マレイン酸（pH６．
０）に懸濁させ、室温にて８０分間静置培養した。この
ようにして変異処理した菌を、上記と同様の方法で３回
洗浄した後、滅菌した培地１を分注した試験管に植え継
ぎ、暗所３２℃にて２日間振とう培養した。培地１に寒
天１５ｇ／Ｌを添加し、１２１℃で１５分間滅菌して調
製した寒天プレートに、上記の培養液を希釈して塗布
し、暗所３２℃で４日間培養した。これにより、約１５
０００株のコロニーを得た。

【００３８】次に、滅菌済みの９６穴マイクロプレート
に１ウエル当り０．２mlの滅菌済みの培地１を分注し、
上記の約１５０００株の変異株をそれぞれ植菌した。こ
れを、３０℃、暗所にてマイクロプレートシェイカーを
用いて振とう培養し、４８時間後、各ウエルにグリシ
ン、レブリン酸が最終濃度それぞれ３０mMとなるように
添加した。更に２４時間上記と同じ条件下で振とう培養
した。

【００３９】各ウエルの５−アミノレブリン酸は以下の
ように検出した（エイリッヒ反応）。 （１）各ウエルから培養液を別のマイクロタイタープレ
ートに採取し、１％のアセチルアセトンを含む１Ｍの酢
酸緩衝液０．１mlを添加し、シールで蓋をして、１００
℃、１５分インキュベートした後、マイクロタイタープ
レートを氷中で急冷した。 （２）次に、２％のｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒ
ド、１６％の過塩素酸を含む酢酸溶液を０．１ml添加
し、室温で１５分後、エイリッヒ反応による赤紫の呈色
を観察し、 （３）このとき、反応液を一部取りＴＬＣ分析によって
５−アミノレブリン酸に由来しない赤紫の呈色を示す菌
株を排除し、５−アミノレブリン酸生産の高い変異株６
株を選抜した。

【００４０】上記６株を培地１試験管にて暗所、３０℃
にて４８時間培養し、培地１の組成の寒天プレート上に
塗布し、コロニーを形成させた。次に、滅菌済みの９６
穴マイクロプレートに１ウエル当り０．２mlの滅菌済み
の培地１を分注し、上記の各コロニーに由来した６０個
のコロニーを任意に選び、それぞれ植菌した。これを、
３２℃、暗所にてマイクロプレートシェイカーを用いて
振とう培養し、４８時間後、各ウエルにグリシンが、最
終濃度３０mMとなるように添加し、上記６０コロニーの
２０コロニーずつについて、レブリン酸を３０、１５、
１mM添加した。更に２４時間上記と同じ条件下で振とう
培養し、各ウエルから培養液を採取しエイリッヒ反応に
より、５−アミノレブリン酸の生産性及びレブリン酸の
至適濃度を調べた。この操作を３回繰り返し、生産性の
高さ及びコロニー間の生産性のバラツキを指標にして、
ＣＲ−００２株より安定的に生産性の高い変異株１株を
分離した。これをＣＲ−１５０株と名付けた。レブリン
酸の至適濃度は３０mMであった。３０mMのレブリン酸を
添加した場合のエーリッヒ反応の５５３nmの吸光度をマ
イクロプレートリーダーを用いて、５−アミノレブリン
酸の蓄積量を定量したところ、ＣＲ−００２株が０．０
１mMであるのに対してＣＲ−１５０株は０．１mMであっ
た。

【００４１】実施例２ 用いる菌株をＣＲ−１５０株として実施例１と同様に操
作を行い、約１５０００株の変異株を誘導した。実施例
１と同様に選抜試験を行い、ＣＲ−１５０株にくらべて
生産性の向上した変異株ＣＲ−２６８株を得た。マイク
ロプレートリーダーを用いてエーリッヒ反応の５５３nm
の吸光度により５−アミノレブリン酸の蓄積量を定量し
たところ、ＣＲ−２６８株は０．３mMであった。

【００４２】実施例３ 用いる菌株をＣＲ−２６８株として実施例１と同様に操
作を行い、約１５０００株の変異株を誘導した。実施例
１と同様に選抜試験を行い、ＣＲ−２６８株にくらべて
生産性の向上した変異株ＣＲ−３６８株を得た。マイク
ロプレートリーダーを用いてエーリッヒ反応の５５３nm
の吸光度により５−アミノレブリン酸の蓄積量を定量し
たところ、ＣＲ−３６８株は０．５mMであった。

【００４３】実施例４ 用いる菌株をＣＲ−３６８株として実施例１と同様に操
作を行い、約１５０００株の変異株を誘導した。実施例
１と同様に選抜試験を行い、ＣＲ−３６８株にくらべて
生産性の向上した変異株ＣＲ−４０５株を得た。マイク
ロプレートリーダーを用いてエーリッヒ反応の５５３nm
の吸光度により５−アミノレブリン酸の蓄積量を定量し
たところ、ＣＲ−４０５株は１．０mMであった。

【００４４】実施例５ 用いる菌株をＣＲ−４０５株として実施例１と同様に操
作を行い、約１５０００株の変異株を誘導した。加える
レブリン酸濃度を１５mMとする以外は実施例１と同様に
選抜試験を行い、ＣＲ−４０５株にくらべて生産性の向
上した変異株ＣＲ−５０２株を得た。マイクロプレート
リーダーを用いてエーリッヒ反応の５５３nmの吸光度に
より５−アミノレブリン酸の蓄積量を定量したところ、
ＣＲ−４０５株が１．２mMであったのに対して、ＣＲ−
５０２株は２．１mMであった。

【００４５】実施例６ 用いる菌株をＣＲ−５０２株として実施例１と同様に操
作を行い、約１５０００株の変異株を誘導した。加える
レブリン酸濃度を１mMとする以外は実施例１と同様に選
抜試験を行い、ＣＲ−５０２株にくらべて生産性の向上
した変異株ＣＲ−６６０株を得た。マイクロプレートリ
ーダーを用いてエーリッヒ反応の５５３nmの吸光度によ
り５−アミノレブリン酸の蓄積量を定量したところ、Ｃ
Ｒ−５０２株が２．４mMであったのに対して、ＣＲ−６
６０株は３．３mMであった。

【００４６】実施例７ 用いる菌株をＣＲ−６６０株として実施例１と同様に操
作を行い、約１５０００株の変異株を誘導した。加える
レブリン酸濃度を１mMとする以外は実施例１と同様に選
抜試験を行い、ＣＲ−６６０株にくらべて生産性の向上
した変異株ＣＲ−００７２００１、ＣＲ−００７２００
２、ＣＲ−００７２００９株を得た。マイクロプレート
リーダーを用いてエーリッヒ反応の５５３nmの吸光度に
より５−アミノレブリン酸の蓄積量を定量したところ、
ＣＲ−００７２００１、ＣＲ−００７２００２、ＣＲ−
００７２００９株はそれぞれ５．９、５．６、４．６mM
であった。

【００４７】実施例８ 実施例７で得た変異株ＣＲ−００７２００１、ＣＲ−０
０７２００２、ＣＲ−００７２００９株を、培地１を２
００ml調製した５００ml容の浸透フラスコに植菌し、暗
所、３２℃で４８時間往復振とう培養した。培養後、５
０００ｇで１０分間遠心して菌体を集め、それぞれ湿菌
体重量が０．５ｇ／１０mlとなるように下記培地２で懸
濁させ、２１mmの試験管に３mlずつ分注した。このよう
にして得られた試験管を暗所、３２℃で往復振とう培養
し、２０時間後の培養液中の５−アミノレブリン酸を岡
山らの方法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，
Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐ−１４９４，１９９０）で
測定した。その結果、ＣＲ−００７２００１、ＣＲ−０
０７２００２、ＣＲ−００７２００９株はそれぞれ１
９．０、２１．５、３１．０mMであった。

【００４８】

【表２】

【００４９】実施例９ 変異株ＣＲ−００７２００９株を、培地３を５０ml調製
した３００ml容のバッフル付三角フラスコに植菌し、暗
所、３２℃で４８時間回転振とう培養した。これを３Ｌ
容の発酵槽に１．８Ｌの培地３を調製したところへ全量
植菌し、３２℃、通気量０．３６Ｌ／分、４００rpm で
攪拌培養した。硫酸と水酸化ナトリウムを用いてpHを
６．５〜６．６に制御しながら培養を続け、培養４０時
間後、レブリン酸０．２１０ｇ、グリシン８．１ｇ、酵
母エキス（日本製薬社製、Ｄ−３）１８ｇを添加し、攪
拌回転数を３２５rpm にして、硫酸と水酸化ナトリウム
を用いてpH６．３から６．４に保ちながら培養を続け
た。更に１２時間、２６時間、３８時間後にグリシンを
８．１ｇづつ添加した。レブリン酸添加後５０時間で培
養を止めた。この培養液中の５−アミノレブリン酸を岡
山らの方法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，
Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐ−１４９４，１９９０）で
定量したところ６０mMであった。このときのレブリン酸
添加後の培養液内の溶存酸素濃度の平均値は、０．０１
ppm であった。また、レブリン酸添加後の培養液内の酸
化還元電位は、−１８０mVから−５０mVの範囲で推移し
ていた。

【００５０】

【表３】

【００５１】実施例１０ 変異株ＣＲ−００７２００９株を、培地３を５０ml調製
した３００ml容のバッフル付三角フラスコに植菌し、暗
所、３２℃で４８時間回転振とう培養した。これを３Ｌ
容の発酵槽に１．８Ｌの培地３を調製したところへ全量
植菌し、３２℃、通気量０．３６Ｌ／分、４００rpm で
攪拌培養した。硫酸と水酸化ナトリウムを用いてpHを
６．５〜６．６に制御しながら培養を続け、培養４０時
間後、レブリン酸０．２１０ｇ、グリシン８．１ｇ、酵
母エキス１８ｇを添加し、通気量を０．７２Ｌ／分、攪
拌回転数６００rpm にして、硫酸と水酸化ナトリウムを
用いてpH６．３から６．４に保ちながら培養を続けた。
更に１２時間、２４時間、３８時間後にグリシンを８．
１ｇずつ添加した。レブリン酸添加後５０時間で培養を
止めた。この培養液中の５−アミノレブリン酸を岡山ら
の方法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏ
ｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐ−１４９４，１９９０）で定量
したところ１３mMであった。このときのレブリン酸添加
後の培養液内の溶存酸素濃度の平均値は、２．３ppm で
あった。また、レブリン酸添加後の培養液内の酸化還元
電位は、５０mVから７０mVの範囲で推移していた。

【００５２】実施例１１ 変異株ＣＲ−００７２００９株を、培地３を５０ml調製
した３００ml容のバッフル付三角フラスコに植菌し、暗
所、３２℃で４８時間回転振とう培養した。これを３Ｌ
容の発酵槽に１．８Ｌの培地３を調製したところへ全量
植菌し、３２℃、通気量０．３６Ｌ／分、４００rpm で
攪拌培養した。硫酸と水酸化ナトリウムを用いてpHを
６．５〜６．６に制御しながら培養を続け、培養４０時
間後、レブリン酸０．２１０ｇ、グリシン８．１ｇ、酵
母エキス１８ｇを添加し、通気量を０．１８Ｌ／分、攪
拌回転数を２００rpm にして、硫酸と水酸化ナトリウム
を用いてpH６．０から６．５に保ちながら培養を続け
た。更に１２時間、２４時間後にグリシンを８．１ｇず
つ添加した。レブリン酸添加後５０時間で培養を止め
た。この培養液中の５−アミノレブリン酸を岡山らの方
法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．
３６，Ｎｏ．８，ｐ−１４９４，１９９０）で定量した
ところ１５mMであった。このときのレブリン酸添加後の
培養液内の溶存酸素濃度は、検出限界以下であった。ま
た、レブリン酸添加後の培養液内の酸化還元電位は、−
２２０mVから−１８０mVの範囲で推移していた。実施例
７に示されるごとくＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａ
ｅｒｏｉｄｅｓＣＲ−００２株を起源菌として変異を重
ねて得られたＣＲ−００７２００９株は、グルコースや
グリシンなど安価な原料を用いて飛躍的に高い濃度で５
−アミノレブリン酸を生産することのできる菌株であ
り、本菌株を用いれば工業的に５−アミノレブリン酸を
製造することが可能である。また、実施例１０、１１か
らわかるように、生産性を高めるには、レブリン酸添加
後の培養液内の溶存酸素濃度を２．０ppm 以下、あるい
は培養液内の酸化還元電位を−２２０mVから５０mVの範
囲で制御することが望ましく、これは、攪拌回転数を低
下させることによって容易に行うことができる。

【００５３】実施例１２ 培地３を５０ml調製した３００ml容のバッフル付三角フ
ラスコ３つを調製し、それぞれに変異株ＣＲ−００７２
００９株を植菌し、暗所、３２℃で４８時間回転振とう
培養した。これを３基の３Ｌ容の発酵槽に１．８Ｌの培
地３を調製したものへそれぞれ全量植菌し、３２℃で培
養した。硫酸と水酸化ナトリウムを用いてpHを６．５〜
６．６に制御しながら、通気量０．３６Ｌ／分とし、攪
拌数を４００rpm とし、うち１基については培養２５時
間後に攪拌回転数を２５０rpm とし、それぞれ９０時間
まで培養を続けた。培養中、溶存酸素濃度、５−アミノ
レブリン酸合成酵素活性を測定した。５−アミノレブリ
ン酸合成酵素活性は以下のように測定した。

【００５４】培養液を約３０mlサンプリングし、遠心分
離により菌体を集めた。集めた菌体をリン酸緩衝液（５
０mM、pH７．２）で洗浄後、同じ組成の緩衝液５mlに再
懸濁し、常法によりフレンチプレスにて、菌体を破砕し
１００００ｇで３０分間遠心分離して、得られた上清を
５−アミノレブリン酸合成酵素粗酵素液とした。

【００５５】リン酸緩衝液（５０mM、pH７．２）の１ml
中にグリシン５０mMと、ピリドキサールリン酸０．１mM
とＥＤＴＡ１mMを含み、更に上記の粗酵素液を蛋白量換
算で１．０mg／mlとなるように加え酵素反応液を調製し
た。これにスクシニル−ＣｏＡが０．２mMの濃度で含有
するように加え、３７℃でインキュベートした。１５分
後、１０vol％トリクロロ酢酸を１ml加えて反応を停止
させた。これを３５００rpm で１０分間遠心分離し、上
清を１mlとり、１％のアセチルアセトンを含む１Ｍ酢酸
緩衝液（pH４．７）２mlを加え１００℃、１５分反応さ
せて直ちに氷冷した。３．５mlのエイリッヒ試薬を加え
１５分後の５５３nmの吸光度からピロール化合物生成量
を測定し、酵素反応による５−アミノレブリン酸生成量
（ａ）を算出した。次の数１の式によって５−アミノレ
ブリン酸生成速度を求め、これを５−アミノレブリン酸
合成酵素活性とした。培養液中の溶存酸素濃度と、その
ときの５−アミノレブリン酸合成酵素活性の関係を図１
及び表４に示す。尚、図１中溶存酸素濃度１０％は０．
７ppm に、溶存酸素濃度９０％は６．６ppm に相当す
る。

【００５６】

【数１】

【００５７】比較例１ 用いる菌株をＣＲ−００２株とする以外は実施例１０と
同様に行った。結果を図１及び表４に示す。図１からわ
かるように、ＣＲ−００７２００９株は培養液中の溶存
酸素濃度が２ppm を超えるような条件であっても、光合
成細菌の野性株に観られるような５−アミノレブリン酸
合成酵素活性の抑制が起こりにくくなっている。

【００５８】

【表４】

【００５９】実施例１３ 実施例９で用いた培地３（表３）に含まれる酵母エキス
に代え別のメーカーの酵母エキスＢ（オリエンタル酵母
社製、Ｂ−２）５．０ｇ／Ｌを含有する培地を用い以下
の実験を行った。実施例９と同様、変異株ＣＲ−００７
２００９株を３００ml容のバッフル付三角フラスコで４
８時間培養した培養液を、３Ｌ容の発酵槽中で、１．８
Ｌの酵母エキスＢで調製した培地３へ全量植菌し、３２
℃、通気量０．３６Ｌ／分、４００rpm で攪拌培養し、
レブリン酸０．２１０ｇ、グリシン８．１ｇ、酵母エキ
スＢ１８ｇを添加し、攪拌回転数を３２５rpm に低下さ
せ培養を続けた。レブリン酸添加後、およそ４時間の間
は溶存酸素が０．５ppm を推移したが、５時間後溶存酸
素が上昇し始めた。６時間後これが４ppm まで上昇し、
５−アミノレブリン酸の生成が１０mMで停止した。これ
に、塩化第二鉄が２０μＭとなるように添加したとこ
ろ、添加後２時間以内に溶存酸素が再び０．５ppm 以下
となり、５−アミノレブリン酸の生成が再開したので、
更に１２時間、２６時間、３８時間後にグリシンを８．
１ｇずつ添加した。レブリン酸添加後５０時間で培養を
止めた。この培養液中の５−アミノレブリン酸を岡山ら
の方法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏ
ｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐ−１４９４，１９９０）で定量
したところ４０mMであった。

【００６０】実施例１３から明らかなように鉄分の添加
が呼吸を回復させる効果があることがわかる。

【００６１】参考例 実施例９で用いた酵母エキス、実施例１３で用いた酵母
エキスＢ、更に下記実施例で用いる別のメーカーの酵母
エキスＣ（オリエンタル酵母社製、工業用酵母エキス）
に含まれる鉄分をＩＣＰmass法にて調べたところ、酵母
エキス１ｇあたり、それぞれ７３μｇ、２５μｇ、１５
５μｇであった。この鉄分量からそれぞれの酵母エキス
を用いて調製した培地３に含まれる鉄分は、それぞれ
６．６４、２．２７、１４．１μＭであることがわか
る。これより、実施例９では５−アミノレブリン酸を生
産している時点で培養液中に２０μＭの鉄分が含まれて
おり、実施例１３の鉄添加以前の培地では６．８μＭ、
鉄添加後は、２６．８μＭの鉄分が含まれていることが
わかる。

【００６２】実施例１４ 培地３の酵母エキスに代え上記酵母エキスＣを３ｇ／Ｌ
として調製した培地に塩化第二鉄を表５に示す濃度にな
るよう添加した培地５０mlを調製した３００ml容のバッ
フル付三角フラスコに変異株ＣＲ−００７２００９株
〔２１mmφの試験管中酵母エキスＣ１０mlで４８時間培
養した培養液１ml（６６０nmの光学密度で０．２）〕を
植菌し、暗所、３２℃で回転振とう培養した。酵母エキ
ス中に含まれる鉄分とあわせると表５に示す量の鉄分を
含んでいる。培養３０時間後の菌体濃度を６６０nmの光
学密度で測定した結果を表５に示す。

【００６３】

【表５】

【００６４】表５から明らかなように、適切な鉄分の添
加が生育速度を上昇させる効果があることがわかる。

【００６５】実施例１５ 培地３の酵母エキスに代え上記酵母エキスＣを３ｇ／Ｌ
として調製した培地に更に２０μＭの塩化第二鉄を添加
した培地５０mlを調製した３００ml容のバッフル付三角
フラスコに変異株ＣＲ−００７２００９株〔２１mmφの
試験管中酵母エキスＣ１０mlで４８時間培養した培養液
１ml（６６０nmの光学密度で０．２）〕を植菌し、暗
所、３２℃で４８時間回転振とう培養した。これを３Ｌ
容の発酵槽に１．８Ｌの上記塩化第二鉄添加培地を調製
したところへ全量植菌し、３２℃、通気量０．３６Ｌ／
分、４００rpm で攪拌培養した。培養２４時間後、レブ
リン酸０．２１０ｇ、グリシン８．１ｇ、酵母エキスＣ
９ｇを添加し、攪拌回転数を３２５rpm にして、硫酸と
水酸化ナトリウムを用いてpH６．３から６．４に保ちな
がら培養を続けた。更に１２時間、２６時間、３８時間
後にグリシンを８．１ｇずつ添加した。レブリン酸添加
後５０時間で培養を止めた。この培養液中の５−アミノ
レブリン酸を岡山らの方法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥ
ＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐ−１４９
４，１９９０）で定量したところ５５mMであった。この
ときのレブリン酸添加後の培養液内の溶存酸素濃度の平
均値は、０．０１ppm であった。また、レブリン酸添加
後の培養液内の酸化還元電位は、−１８０mVから−５０
mVの範囲で推移していた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 溶存酸素と５−アミノレブリン酸合成酵素活
性との関係を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年９月２９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項４

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の５−アミノレブリン酸生
産微生物は、例えば、紅色非硫黄細菌の野性株又はその
変異株等を親株として、これを変異処理後、溶存酸素濃
度が０．７０〜６．６０ｐｐｍである条件下で、５−ア
ミノレブリン酸合成酵素活性が２〜７（ｎ ｍｏｌ／ｍ
ｉｎ／ｍｇタンパク）好ましくは、溶存酸素濃度が１．
４６〜５．８６ｐｐｍで５−アミノレブリン酸合成酵素
活性が３．５〜５．６ｎ ｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパ
ク）である株を選抜することにより得られる。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】また、上記の変異、選抜によって得られる
菌株としても、ロドバクテリウム属、特にロドバクター
・スフェロイデスの変異株が好ましく、具体的には、ロ
ドバクター・スフェロイデス ＣＲ−００７２００９と
命名され、ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２０として寄託された
ものが好ましい。この菌株は前記ロドバクター・スフェ
ロイデス ＣＲ−００２株の変異、選抜を繰り返し行い
得られたもので、５−アミノレブリン酸を著量蓄積し得

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成１０年９月２９日

【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６２１７

【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２０

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 神永 智稔 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 渡辺 喜久男 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 宮地 伸也 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 渡辺 圭太郎 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 堀田 康司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 溶存酸素濃度が０．７０〜６．６０ppm
   である好気培養条件下で、５−アミノレブリン酸合成酵
   素活性が２〜７（n mol／min／mgタンパク）である５−
   アミノレブリン酸生産微生物。
2. 【請求項２】 ロドバクテリウム（Rhodobacterium）属
   に属するものである請求項１記載の５−アミノレブリン
   酸生産微生物。
3. 【請求項３】 ロドバクター・スフェロイデス（Rhodob
   acter sphaeroides）又はその変異株である請求項１又
   は２記載の５−アミノレブリン酸生産微生物。
4. 【請求項４】 ロドバクター・スフェロイデス（Rhodob
   acter sphaeroides）ＣＲ−００７２００９と命名さ
   れ、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２１７として寄託されたもので
   ある請求項１〜３のいずれか１項記載の５−アミノレブ
   リン酸生産微生物。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項記載の微生
   物を培養し、得られた培養物から５−アミノレブリン酸
   を採取することを特徴とする５−アミノレブリン酸の製
   造法。
6. 【請求項６】 培養が、レブリン酸又はグリシンを添加
   した培地で行われるものである請求項５記載の５−アミ
   ノレブリン酸の製造法。
7. 【請求項７】 グリシンの添加量が２００mM／回以下で
   ある請求項６記載の５−アミノレブリン酸の製造法。
8. 【請求項８】 培養が、培養液中の溶存酸素濃度を０．
   ００１〜２ppm とするか又は酸化還元電位を−２２０〜
   ５０mVとした条件で行われるものである請求項５〜７い
   ずれか１項記載の５−アミノレブリン酸の製造法。
9. 【請求項９】 鉄成分を５〜５００μＭ含有する培地中
   で５−アミノレブリン酸生産微生物を培養し、得られた
   培養物から５−アミノレブリン酸を採取することを特徴
   とする、５−アミノレブリン酸の製造法。
10. 【請求項１０】 ５−アミノレブリン酸生産微生物が、
    請求項１〜４のいずれか１項記載の微生物である請求項
    ９記載の５−アミノレブリン酸の製造法。