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CN1192798C - 疫苗 - Google Patents

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CN1192798C CNB00807528XA CN00807528A CN1192798C CN 1192798 C CN1192798 C CN 1192798C CN B00807528X A CNB00807528X A CN B00807528XA CN 00807528 A CN00807528 A CN 00807528A CN 1192798 C CN1192798 C CN 1192798C
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Abstract

本发明涉及细菌多糖抗原疫苗领域。具体地说，本发明涉及与流感嗜血菌D蛋白缀合的细菌多糖。

Description

疫苗
                       发明领域
本发明涉及细菌多糖抗原疫苗、其生产和这类多糖在医药方面的应用。
具体地说，本发明涉及3个相关的方面：A-疫苗，其包含一种肺炎球菌多糖抗原(通常为肺炎球菌多糖缀合物抗原)，用一种得自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的蛋白抗原和任选的一种Th1诱导性佐剂配制；B-加有Th1佐剂的特异性的有利的肺炎球菌多糖缀合物；和C-一般与得自流感嗜血菌(H.influenzae)的D蛋白缀合的细菌多糖缀合物。
                       发明背景
肺炎链球菌是一种革兰氏阳性细菌，引起相当大发病率和死亡率(特别是在青少年和老年人中)，引起侵袭性疾病例如肺炎、菌血症和脑膜炎，以及引起与定居相关的疾病例如急性中耳炎。在美国60岁以上的人中，肺炎球菌性肺炎的发病率估计为3-8/100,000。在20％的所述病例中这导致菌血症和其它表现，例如脑膜炎，甚至用抗生素治疗的死亡率也接近30％。
肺炎球菌被有化学连接的多糖的荚膜，所述多糖提供血清型特异性。有90种已知血清型的肺炎球菌，其荚膜是肺炎球菌的主要毒力决定子，因为荚膜不仅保护细菌的内表面抵抗补体，而且其免疫原性差。多糖是不依赖T的抗原，不能在MHC分子上加工或呈递，以与T细胞相互作用。然而，它们可以通过一种涉及B细胞表面受体交联的替代机制来刺激免疫系统。
在几个实验中，表明抵抗侵袭性肺炎球菌性疾病的保护作用与对荚膜特异性的抗体的关系最密切相关，所述保护作用是血清型特异性的。
基于多糖抗原的疫苗是本领域众所周知的。已经批准用于人类的四种疫苗包括：伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的Vi多糖；得自流感嗜血菌的PRP多糖；由血清型A、C、W135和Y组成的四价脑膜炎球菌疫苗；以及由对应于血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33的多糖(占肺炎球菌血分离菌的至少90％)组成的23价肺炎球菌疫苗。
后三种疫苗提供抵抗引起呼吸系统感染、在婴儿中导致严重病死率的细菌的保护作用，但这些疫苗尚未批准用于不满两岁的儿童，因为它们在该年龄组中的免疫原性不足[Peltola等(1984)，N.Engl.J.Med.310：1561-1566]。肺炎链球菌是婴幼儿侵袭性细菌性疾病和中耳炎的最常见的病因。同样，老年人对肺炎球菌疫苗应答的建立不好[Roghmann等，(1987)，J.Gerontol.42：265-270]，因而在该人群中细菌性肺炎的发生率增加[Verghese和Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62：271-285]。
已经设计用以解决这种在婴儿中免疫原性缺乏的策略包括：将所述多糖与大免疫原性蛋白连接，所述大免疫原性蛋白提供旁观者T细胞辅助，并且诱导针对与其缀合的所述多糖抗原的免疫记忆。目前正在评估肺炎球菌糖蛋白缀合物疫苗在各个年龄组中的安全性、免疫原性和功效。
A)肺炎球菌多糖疫苗
所述23价未缀合的肺炎球菌疫苗在临床功效中已经表现出变化大，从0％至81％(Fedson等(1994)Arch Intern Med. 154：2531-2535)。所述功效看来与正被免疫的风险组(例如老年人)、Hodgkin病、脾切除术、镰状细胞贫血病和丙球蛋白缺乏血症相关(Fine等(1994)Arch InternMed.154：2666-2677)，也与所述疾病表现相关。所述23价疫苗未表现出抗肺炎球菌性肺炎(在某些高危组例如老年人中)和中耳炎疾病的保护作用。
因此需要改进的肺炎球菌疫苗组合物，特别是将在老年人和幼儿中更有效地预防或缓解肺炎球菌性疾病(特别是肺炎)的疫苗。
本发明提供这样一种改进的疫苗。
B)选定的肺炎球菌多糖缀合物+3D-MPL组合物
人们普遍认为，商业化未缀合的肺炎球菌疫苗的保护功效多少涉及接种疫苗后诱导的抗体的浓度；实际上，所述23种多糖仅因每种组分多糖的免疫原性而被批准(Williams等编著，New York Academy ofSciences 1995第241-249页)。因此，进一步增强对所述肺炎球菌多糖的抗体应答，有可能提高婴儿和老年人对首次注射的多糖或多糖缀合物以保护性水平抗体应答的百分比，并且可以减少诱导抗肺炎链球菌所致感染的保护性免疫所需的注射剂量和注射次数。
由于在20世纪早期，研究人员已经用大量的可以加入抗原中以增强其在疫苗组合物中免疫原性的化合物进行了实验[综述参见M.F.Powell和M.J.Newman，Plenum Press，NY，“Vaccine Design-theSubunit and Adjuvant Approach”(1995)第7章，“疫苗佐剂和赋形剂简述”]。许多化合物是非常有效的，但因为引起显著的局部和系统性不利反应，而使其不能应用于人用疫苗组合物中。首次描述于1926年的铝基佐剂(aluminium-based adjuvant)(例如明矾、氢氧化铝或磷酸铝)仍是在美国批准的用于人用疫苗的仅有的免疫佐剂。
铝基佐剂是载体类佐剂的实例，它通过其诱导的“缓释(depot)效应”而发挥作用。抗原被吸附至其表面，当注射所述组合物时，所述佐剂和抗原在血流中不是立即消散，而是所述组合物在注射的局部环境中持久存在，引起更显著的免疫应答结果。这类载体佐剂具有的额外已知优点是适合于使倾向于分解的抗原(例如某些多糖抗原)稳定化。
3D-MPL是非载体佐剂的一个实例。其全名为3-O-脱酰单磷酰基脂质A(或3脱-O-酰化单磷酰基脂质A或3-O-去酰基-4’单磷酰基脂质A)，并且称为3D-MPL，以表明还原性末端氨基葡萄糖的3位是脱-O-酰化的。关于其制备，参见GB 2220211 A。在化学上，它是具有4、5或6个酰化链的3-脱酰单磷酰基脂质A的混合物。它最初在20世纪90年代早期制备，当时将脂质A的4’-单磷酰基衍生物(MPL)3-O-脱酰化的方法产生毒性进一步减弱而免疫刺激活性没有变化的分子。
3D-MPL其本身已经用作佐剂，或者优先与缓释型载体佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝)或水包油乳剂联合用作佐剂。在这类组合物中，抗原和3D-MPL包含在相同的微粒结构中，提供抗原信号和免疫刺激信号更为有效的传递。研究表明，3D-MPL能够进一步增强明矾所吸附的抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine(1998)16：708-14；EP 689454-B1]。在本领域中，对于倾向于吸附的抗原(例如细菌多糖缀合物)也优选这类组合，其中吸附至明矾上往往使所述抗原稳定化。主要使用沉淀的铝基佐剂，因为它们是目前在已批准的人用疫苗中使用的仅有的佐剂。因此，本领域偏爱含有与铝基佐剂联用的3D-MPL的疫苗，是因为它们易于研制并且引入市场的速度快。
已经用几种单价多糖-缀合物疫苗抗原评估了作为佐剂的MPL(非3-脱酰化的)。对于以下四种单价多糖缀合物而言，共同注射盐水中的MPL增强了血清抗体应答：肺炎球菌PS 6B-破伤风类毒素、肺炎球菌PS 12-白喉类毒素以及与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)内毒素A缀合的金黄色葡萄球菌(S.aureus)5型和金黄色葡萄球菌8型[Schneerson等，J.Immunology(1991)147：2136-2140]。增强的应答被认为是抗原特异性的。水包油乳剂(一种载体类型的佐剂)中的MPL由于MPL和抗原存在于同一微粒结构中，一致地增强盐水中的MPL的效应，并且被认为是选择用于其它多糖缀合物疫苗最佳传递的佐剂系统。
Devi等[Infect.Immun.(1991)59：3700-7]评估了盐水中的MPL(非3-脱酰化的)在对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)荚膜多糖的TT缀合物的鼠抗体应答方面的佐剂效应。当MPL与所述缀合物同时使用时，对所述PS的IgM特异性应答和IgG特异性应答都仅有最低限度的增加；然而，当在给予所述缀合物后2天给予时，MPL的效应要大得多。尤其在婴儿中采用需要相对于抗原延迟给予MPL的免疫方案的实用性有问题。MPL对于多糖和多糖-蛋白质缀合物的佐剂效应看来是组合物依赖性的。再者，在适当的缓释传递系统(例如采用载体佐剂)中加入MPL，提供了更为持久的佐剂效应并且避开定时给予和延迟给予的问题。
总之，现有技术水平已经表明：对于特定的多糖或多糖-缀合物抗原而言，当将MPL或3D-MPL用作佐剂时，最好将其与载体佐剂(例如铝基佐剂)一起使用，以便使其免疫刺激效应最大化。
出乎意料的是，本发明人已经发现，对于某些肺炎球菌多糖缀合物而言，当将所述抗原仅与3D-MPL一起配制，而不是将所述抗原与结合载体佐剂(例如铝基佐剂)的3D-MPL一起配制时，疫苗组合物的免疫原性明显更大。此外，所观察的改进与所用的3D-MPL浓度以及所述特定缀合物是否在单价组合物中或者它们是否混合形成多价组合物无关。
C)细菌多糖-D蛋白缀合物
如上所述，基于多糖抗原的疫苗是本领域众所周知的。上述已批准的多糖疫苗具有不同的已证明的临床功效。已经估计Vi多糖疫苗在预防培养物证实的伤寒方面的功效为55％-77％(Plotkin和Cam，(1995)Arch Intern Med  155：2293-99)。表明脑膜炎球菌C多糖疫苗在流行病条件下的功效为79％(De Wals P等(1996)Bull World Health Organ.74：407-411)。已经表明，所述23价肺炎球菌疫苗的临床功效变化大，从0％至81％(Fedson等(1994)Arch Intern Med. 154：2531-2535)。如上所述，人们认为，所述肺炎球菌疫苗的保护性功效多少与疫苗接种后诱导的抗体浓度有关。
在与疫苗接种的多糖途径相关的问题中，事实是多糖本身是不良免疫原。已经设计用于解决这种免疫原性缺乏的策略包括将所述多糖与提供旁观者T细胞辅助的大的高免疫原性蛋白载体连接。
目前在多糖免疫原生产中常用的这些高免疫原性载体的实例包括：白喉类毒素(DT或CRM197突变体)、破伤风类毒素(TT)、匙孔血蓝蛋白(KLH)和结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。
与常用载体相关的问题
许多问题与这些常用载体中的每种载体相关，包括在GMP缀合物生产方面以及在所述缀合物的免疫特性方面的问题。
尽管通常使用这些载体并且它们在诱导抗多糖抗体应答方面获得了成功，但它们也伴随有几个缺点。例如，已知抗原特异性免疫应答可能由于存在针对所述载体(在这种情况下是破伤风毒素)的已有抗体而受到抑制(表位抑制)(Di John等；(1989)Lancet，2：1415-8)。在所述人群中，通常非常高百分比的人群普遍具有针对DT和TT两者的已有的免疫应答，因为人们常规接种这些抗原。在美国例如95％的儿童接受包含DT和TT两者的DTP疫苗。其它作者已经描述了在动物模型中对肽疫苗的表位抑制的问题(Sad等，Immunology，1991；74：223-227；Schutze等，J.Immunol.135：4，1985；2319-2322)。
另外，对于需要定期加强的疫苗而言，应用高免疫原性载体例如TT或DT，在数次注射后有可能抑制所述多糖的抗体应答。这些多次疫苗接种也可能伴随有不希望有的反应，例如迟发型反应性过高(DTH)。
KLH已知为有效的免疫原，并且在人类临床试验中已经用作IgE肽的载体。然而，已经观察到某些不利反应(DTH样反应或IgE致敏)以及针对抗体的抗体应答。
因此，选择用于基于多糖的疫苗的载体蛋白，将需要在使用一种于所有患者中有效(广泛的MHC识别)的载体的必要性、高水平抗多糖抗体应答的诱导以及针对所述载体的低抗体应答之间的平衡。
因此，先前用于基于多糖的疫苗的载体有许多缺点。在联合疫苗中情况尤为如此，在联合疫苗的情况下如果不同的多糖抗原使用同一种载体，则表位抑制尤其成问题。在WO 98/51339中，在联合疫苗中使用多种载体，以便尝试克服这种效应。
本发明提供一种新型载体，以用于制备基于多糖/多肽的免疫原性缀合物，所述新型载体没有上述缺点。
本发明提供得自流感嗜血菌的D蛋白(EP 0 594 610 B1)或其片段，作为基于多糖的免疫原性组合物(包括疫苗)的载体。在联合疫苗中应用该载体尤为有利。
                         发明概述
A)肺炎球菌多糖疫苗
因此，发明提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种肺炎链球菌多糖抗原(最好是缀合的)和一种肺炎链球菌蛋白抗原或其免疫功能等同体，任选地包含一种Th1佐剂(诱导Th1免疫应答的佐剂)。最好是既包括肺炎球菌蛋白，又包括Th1佐剂。本发明的组合物尤其适合于治疗老年人肺炎。
肺炎球菌多糖疫苗(缀合的或非缀合的)在肺炎发病率非常高的老年人群中可能不能保护人们抵抗肺炎。抗肺炎球菌的关键防御机制是调理素吞噬作用(opsonophagocytosis)(由于产生抗肺炎球菌多糖的抗体引起的一种体液B细胞/嗜中性粒细胞介导的事件，所述细菌最终被吞噬)，然而，在老年人中所涉及的调理素机制的部分受损，即PMN(多形核细胞)产生超氧化物、产生其它活性氧种类、PMN迁移、PMN凋亡、PMN变形。在老年人中抗体应答也受损。
与普遍的看法相反，正常水平的抗荚膜多糖抗体可能在完全清除细菌方面不是有效的，因为肺炎球菌可能侵入宿主细胞以逃避免疫系统的这一分支。
出人意料的是，本发明人已经发现，通过除刺激免疫系统的体液分支(B细胞介导的)外，还同时刺激免疫系统的细胞介导的分支(例如T细胞介导的免疫)，产生能够加强从宿主中清除肺炎球菌的协同作用。这是一个发现，这将有助于一般预防(或治疗)肺炎球菌感染，而对于在显示基于多糖的疫苗无效的老年人中预防(或治疗)肺炎尤为重要。
本发明人已经发现，如果肺炎球菌多糖(最好是缀合的)与肺炎球菌蛋白(最好是在肺炎球菌表面表达或分泌或释放的蛋白，它可以被加工并且在受感染哺乳动物细胞表面上的II类和I类MHC环境下呈递)一起给予时，免疫系统的两个分支都可以以这种方式协同作用。虽然肺炎球菌蛋白自身可以触发细胞介导的免疫，但本发明人也已经发现，在疫苗制剂中存在Th1诱导性佐剂，有助于免疫系统的该分支，并且出乎意料地进一步增强免疫系统两个分支之间的协同作用。
B)选定的肺炎球菌多糖缀合物+3D-MPL组合物
因此，本发明也提供一种抗原性组合物，所述抗原性组合物包含一种或更多种肺炎球菌多糖缀合物、用3D-MPL作为佐剂并且基本上不含铝基佐剂，其中所述肺炎球菌多糖缀合物中的至少一种在包含3D-MPL的组合物中的免疫原性显著高于在包含与铝基佐剂结合的3D-MPL的组合物中的免疫原性。
提供的优选实施方案是包含以下肺炎球菌荚膜多糖的一种或更多种的缀合物的抗原性组合物：血清型4、6B、18C、19F和23F。在这类组合物中，每种所述多糖在仅包含3D-MPL的组合物中意外地比在包含3D-MPL和铝基佐剂的组合物中的免疫原性高。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供包含与免疫原性蛋白缀合的肺炎链球菌荚膜多糖血清型4、6B、18C、19F或23F以及3D-MPL佐剂的抗原性组合物，其中所述组合物基本上不含铝基佐剂。
在第二个实施方案中，本发明提供一种联合抗原性组合物，所述组合物基本上不含铝基佐剂，并且包含3D-MPL佐剂和两种或更多种选自以下的肺炎球菌多糖缀合物：血清型4、血清型6B、血清型18C、血清型19F和血清型23F。
C)细菌多糖-D蛋白缀合物
因此，本发明提供一种多糖缀合物抗原，其包含一种得自致病细菌、与流感嗜血菌D蛋白或其D蛋白片段缀合的多糖抗原。另外，本发明提供多价疫苗组合物，其中一个或多个所述多糖抗原与D蛋白缀合。
                     发明的描述
A)肺炎球菌多糖疫苗
本发明提供尤其用于预防或缓解老年人(和/或婴儿和学步幼儿)肺炎球菌感染的改进疫苗。
在本发明正文中，如果患者年龄为55岁或55岁以上，通常超出60岁，更为通常超过65岁，则认为该患者为老年人。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供一种适用于老年人(和/或婴儿和学步幼儿)的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种肺炎链球菌蛋白抗原。
在第二个优选实施方案中，本发明提供一种疫苗(适用于预防老年人肺炎)，其包含至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种肺炎链球菌蛋白抗原和一种Th1佐剂。
设想了这样一种疫苗也将可应用于在其它高危人群组(例如婴儿或学步幼儿)中治疗肺炎球菌感染(例如中耳炎)。
在第三个实施方案中，提供包含一种肺炎球菌多糖抗原和一种Th1佐剂的疫苗组合物。
本发明的肺炎链球菌多糖抗原
本发明的肺炎链球菌疫苗通常将包含多糖抗原(最好是缀合的)，其中所述多糖得自至少4种血清型的肺炎球菌。所述四种血清型优选包括6B、14、19F和23F。更优选在所述组合物中包含至少7种血清型，例如得自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的那些多糖。再更优选在所述组合物中包含至少11种血清型，例如在一个实施方案中所述组合物包括得自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖(最好是缀合的)。在本发明的一个优选实施方案中，包括至少13种多糖抗原(最好是缀合的)，虽然本发明也设想了其它多糖抗原，例如23价(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。
对于老年人疫苗(例如用于预防肺炎)，最好是在上述11价抗原性组合物中包括血清型8和12F(最优选15和22)，以形成15价疫苗，而对于婴儿或学步幼儿而言(其中更关注中耳炎)，最好包括血清型6A和19A，以形成13价疫苗。
为了预防/缓解老年人群(+55岁)的肺炎以及婴儿(至18个月)和学步幼儿(通常为18个月至5岁)的中耳炎，本发明的一个优选实施方案是将本文所述的一种多价肺炎链球菌多糖与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫功能等同体联合。
本发明的肺炎球菌蛋白
对于本发明的目的而言，“免疫功能等同体”的定义是包含至少一种来自本发明蛋白的保护性表位的肽或蛋白。这类表位是特征性表面暴露、高度保守的，并且可以诱发宿主的细菌抗体应答或防止毒性效应。最好是，所述功能等同体具有得自本发明蛋白的至少15个、优选30个或30个以上的连续氨基酸。最优选的是，可以使用所述蛋白的片段、缺失体例如其跨膜缺失变异体(即应用所述蛋白的胞外域)、融合体、化学或遗传解毒衍生物等，前提是它们能够产生与所述天然蛋白的情况基本上相同的免疫应答。
本发明的优选蛋白是在肺炎球菌外表面暴露的那些肺炎球菌蛋白(在所述肺炎球菌生命周期中的至少部分时期能够为宿主免疫系统所识别)，或是所述肺炎球菌分泌或释放的蛋白。最优选的是，所述蛋白是肺炎链球菌的毒素、粘附素、双组分信号转导物或脂蛋白、或其免疫功能等同体。
包括在这种联合疫苗中的特别优选的蛋白包括但不限于：肺炎球菌溶血素(最好是经化学处理或突变解毒)[Mitchell等，Nucleic AcidsRes.1990年7月11日；18(13)：4010“肺炎链球菌1型和2型的肺炎球菌溶血素基因和蛋白的比较”，Mitchell等Biochim Biophys Acta 1989年1月23日；1007(1)：67-72“肺炎球菌溶血素基因在大肠杆菌中的表达：快速纯化和生物学特性”，WO 96/05859(A.Cyanamid)，WO 90/06951(Paton等)，WO 99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失变异体(US5804193-Briles等)；PspC及其跨膜缺失变异体(WO 97/09994-Briles等)；PsaA及其跨膜缺失变异体(Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月；64(12)：5255-62“PsaA的序列异质性，一种肺炎链球菌毒力必需的37千道尔顿推定的粘附素”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜缺失变异体；CbpA及其跨膜缺失变异体(WO 97/41151；WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect.Immun.1996 64：3544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato等，FEMS Microbiol Lett 1998，164：207-14)；M样蛋白、SB专利申请号EP 0837130；和粘附素18627，SB专利申请号EP 0834568。
用于本发明的蛋白最好选自肺炎球菌溶血素、PsaA、PspA、PspC、CbpA或两种或更多种这类蛋白的组合。本发明也包括这类蛋白的免疫功能等同体(如上定义)。
在所述组合物中，所述蛋白可以有助于诱导针对肺炎球菌性疾病的T细胞介导的应答，尤其是保护抵抗肺炎所需的应答，所述应答与免疫系统的体液分支协同作用，以抑制肺炎球菌的侵入，并且刺激调理素吞噬作用。
包括所述蛋白抗原的其它优点是呈递其它抗原以进行调理素吞噬作用过程，并且抑制细菌粘附(如果使用粘附素)或中和毒素(如果使用毒素)。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供肺炎链球菌疫苗，包括肺炎球菌多糖缀合物疫苗，所述疫苗包含得自至少四种血清型、优选是至少7种血清型、更优选至少11种血清型的多糖抗原和至少一种、但最好两种肺炎链球菌蛋白。所述蛋白之一优选是肺炎球菌溶血素或PsaA或PspA或CbpA(最优选是解毒的肺炎球菌溶血素)。一种优选的组合至少含有肺炎球菌溶血素或其衍生物和PspA。
如上所述，与疫苗接种的多糖途径相关的问题是多糖本身是不良免疫原的事实。为了解决这一问题，可以将多糖与提供旁观者T细胞辅助的蛋白载体缀合。因此，最好是将用于本发明的多糖与这样一种蛋白载体连接。目前通常用来生产多糖免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT，DT CRM197和TT)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、得自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.neningitidis)的OMPC和结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。
然而，许多问题与这些常用载体中的每种相关(参见上述“与常用载体相关的问题”一节)。
在一个优选实施方案中本发明提供一种用于制备基于多糖的免疫原构建体的、没有上述缺点的新型载体。用于基于肺炎球菌多糖的免疫原性组合物(或疫苗)的优选载体是流感嗜血菌的D蛋白(EP594610-B)或其片段。适合应用的片段包括包含T辅助细胞表位的片段。特别是，D蛋白片段最好包含该蛋白N末端的1/3。
用于所述肺炎球菌多糖的再一优选载体是所述肺炎球菌蛋白本身(如在“本发明的肺炎球菌蛋白”一节中所定义)。
本发明的疫苗最好加有佐剂。合适的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。
最好是，选择作为TH1型应答优先诱导物的佐剂，以有助于免疫应答的细胞介导分支。
本发明的TH1佐剂
高水平的Th1型细胞因子往往有助于诱导对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子往往有助于诱导对所述抗原的体液免疫应答。
重要的是记住Th1型和Th2型免疫应答的区分不是绝对的。实际上一个个体将支持称为主要为Th1或主要为Th2的免疫应答。然而，通常方便的是根据Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT细胞克隆中的描述(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞：不同的淋巴因子分泌模式导致不同的功能特性。Anmual Review of Immunology，7，第145-173页)来考虑细胞因子家族。传统上，Th1型应答与T淋巴细胞产生IFN-γ和IL-2细胞因子有关。其它细胞因子通常直接与不是由T细胞产生的Th1型免疫应答的诱导相关，例如IL-12。相反，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL10的分泌有关。促进主要为Th1应答的合适佐剂系统包括单磷酰基脂质A或其衍生物(特别是3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A)以及单磷酰基脂质A(最好是3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL))与铝盐的组合。
一种增强的系统涉及单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合，特别是WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或较低反应原性组合物，其中如WO 96/33739中公开的，用胆固醇猝灭(quench)QS21。
一种在水包油乳液中包含QS21、3D-MPL和生育酚的特定有效的佐剂制剂描述于WO 95/17210，并且是优选的制剂。
最好是，所述疫苗还包含一种皂苷，更优选是QS21。所述制剂也可以包含一种水包油乳剂和生育酚(WO 95/17210)。
本发明也提供一种生产疫苗制剂的方法，包括将一种本发明的蛋白与一种药学上可接受的赋形剂(例如3D-MPL)混合在一起。
含有未甲基化CpG的寡核苷酸(WO 96/02555)也是TH1应答的优先诱导物，适用于本发明。
特别优选的本发明组合物包含一种或更多种缀合的肺炎球菌多糖、一种或更多种肺炎球菌蛋白和一种Th1佐剂。采用这样一种Th-1佐剂，可能有助于通过肺炎球菌蛋白(如上所述)诱导细胞介导的应答以及免疫系统两个分支之间的协同作用，产生一种特别有效的普遍抗肺炎球菌性疾病、重要的是在老年人中抗肺炎球菌性肺炎的疫苗。
在本发明的再一个方面，提供本文所述的用于医药的免疫原或疫苗。
在本发明的又一个方面，提供包含一种肺炎球菌多糖缀合物和一种Th1佐剂(最好是3D-MPL)的组合物，它能够使得血清转化，或者在无反应者群体中诱导针对所述多糖抗原的体液抗体应答。
已知10-30％的所述人群对于多糖免疫是无反应者(对疫苗中50％以上的血清型不反应)(Konradsen等，Scand.J.Immun 40：251(1994)；Rodriguez等，JID，173：1347(1996))。对于缀合疫苗也可能是这种情况(Musher等，Clin.Inf.Dis.27：1487(1998))。这对于高危区的所述人群(婴儿、学步幼儿和老年人)而言可能尤为严重。
本发明人已经发现，缀合的肺炎球菌多糖(所述多糖在特定人群中有低应答的倾向)与Th1佐剂(参见以上“本发明的Th1佐剂”)的组合可以出乎意料地解决这种无应答性。最好是，应该使用3D-MPL，最优选使用不含铝基佐剂的3D-MPL(这还提供更好的应答)。因此，本发明提供这类组合物，还提供一种通过给予这类组合物治疗肺炎球菌多糖无反应者的方法，还提供Th1佐剂在以下方面的应用：包含缀合的肺炎球菌多糖抗原的药物的生产、在所述多糖抗原无反应者中抗肺炎球菌性疾病的治疗(或保护所述多糖抗原无反应者免患肺炎球菌性疾病)。
在一个实施方案中，提供预防或缓解老年人肺炎的方法，包括给予所述老年患者安全且有效量的本文所述的疫苗，所述疫苗包含一种肺炎链球菌多糖抗原和或者一种Th1佐剂或者一种肺炎球菌蛋白(最好是这两者)。
在再一实施方案中，提供预防或缓解婴儿或学步幼儿中耳炎的方法，包括给予所述婴儿或学步幼儿安全而有效量的疫苗，所述疫苗包含一种肺炎链球菌多糖抗原和或者一种肺炎球菌蛋白或者一种Th1佐剂(最好是这两者)。
最好是，上述的本发明方法中，所述多糖抗原以多糖蛋白缀合物呈递。
本发明的疫苗制剂
通过系统途径或粘膜途径给予本发明的疫苗制剂，可以用本发明的疫苗支持保护或治疗易患感染的哺乳动物。这些给药可以包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或经粘膜给予口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。最好是鼻内给予疫苗以治疗肺炎或中耳炎(因为可以更为有效地预防肺炎球菌的鼻咽运输，因此在最早阶段减弱感染)。
每个疫苗剂量中的缀合物抗原量被选定为在典型的疫苗中诱导免疫保护性应答且无显著不利副作用的量。这种量将根据使用何种特定免疫原以及如何呈递所述免疫原而变化。一般而言，预期每一剂量将包含0.1-100μg多糖，最好是0.1-50μg，优选0.1-10μg，其中1-5μg是最优选的范围。
所述疫苗中所述蛋白抗原的含量通常为1-100μg，优选5-50μg，最优选的范围是5-25μg。
特定疫苗各组分的最佳量可以通过标准研究来确定，所述标准研究包括观察受治疗者中的适当免疫应答。在初次接种疫苗后，受治疗者可以接受适当间隔的一次或数次加强免疫。
在Vaccine Design(“亚单位和佐剂途径(The subunit and adjuvantapproach)”(Powell M.F.和Newman M.J.编著)(1995)Plenum Press NewYork)中全面描述了疫苗制剂。Fullerton的美国专利4,235,877描述了在脂质体中包胶囊。
B)选定的肺炎球菌多糖缀合物+3D-MPL组合物
对于本发明的目的，术语“本发明的肺炎球菌多糖缀合物”描述了肺炎链球菌荚膜多糖的那些缀合物，它们在包含3D-MPL的组合物中的免疫原性高于在包含3D-MPL和铝基佐剂的组合物中的免疫原性(例如血清型4、血清型6B、血清型18C、血清型19F或血清型23F的缀合物)。
对于本发明的目的，术语“基本上不含铝基佐剂”描述了不含足够的铝基佐剂(例如氢氧化铝，特别是磷酸铝)的组合物，与包含3D-MPL而不加入铝基佐剂的等同组合物相比，所述铝基佐剂使得本发明肺炎球菌多糖缀合物的免疫原性降低。最好是，所述抗原性组合物应该含有基本上由3D-MPL组成的佐剂。每剂量铝基佐剂的加入量优选应低于50μg，更优选低于30μg，再更优选低于10μg，最优选在本发明的抗原性组合物中不加入铝基佐剂。
对于本发明的目的，确定肺炎球菌多糖缀合物在包含3D-MPL的组合物中的免疫原性是否显著高于在包含3D-MPL和铝基佐剂的组合物中的免疫原性，这应该如实施例2中所述进行确立。作为当仅包含3D-MPL时组合物的免疫原性是否显著更高的指标，仅含3D-MPL的组合物与含有3D-MPL和磷酸铝佐剂的等同组合物之间的GMC IgG浓度(按实施例2所述方法测定)比应该大于2，优选大于5，更优选大于7，再更优选大于9，最优选大于14。
多糖本身是不良的免疫原，这一事实是与疫苗接种的多糖途径相关的问题之一。已经设计用于解决这种免疫原性缺乏的策略包括将所述多糖与提供旁观者T细胞辅助的大蛋白载体连接(缀合)。最好是，将本发明的肺炎球菌多糖与提供旁观者T细胞辅助的蛋白载体连接。可以使用的这类载体的实例包括：白喉类毒素、白喉突变体类毒素和破伤风类毒素(分别为DT、CRM197和TT)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)和脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC。
最优选将流感嗜血菌的D蛋白(EP 0 594 610-B)或其片段(参见C节)用作本发明的肺炎球菌多糖的免疫原性蛋白载体。
在一个实施方案中，本发明的抗原性组合物包含与一种免疫原性蛋白缀合的肺炎球菌多糖血清型(PS)4，并且用3D-MPL佐剂配制，其中所述组合物基本上不含铝基佐剂。在其它实施方案中，所述抗原性组合物分别包含与免疫原性蛋白缀合的PS 6B、18C、19F或23F，并且用3D-MPL佐剂配制，其中所述组合物基本上不含铝基佐剂。
在本发明的再一个实施方案中，提供联合抗原性组合物，该组合物包含2种或更多种得自组PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F并且用3D-MPL佐剂配制的肺炎球菌多糖缀合物，其中所述组合物基本上不含铝基佐剂。
本发明的肺炎球菌多糖缀合物的免疫原性不受与其它肺炎球菌多糖缀合物(实施例3)组合的显著影响。因此，本发明的一个优选方面提供一种联合抗原性组合物，所述组合物包含与一种或更多种其它肺炎球菌多糖缀合物联合的一种或更多种本发明的肺炎球菌多糖缀合物，其中所述组合物用3D-MPL佐剂配制，但基本上不含铝基佐剂。
在本发明的再一优选实施方案中，提供联合抗原性组合物，所述组合物包含PS 4、6B、18C、19F或23F肺炎球菌多糖缀合物中的至少一种、优选2种、3种、4种或所有5种，还包含与其它肺炎球菌多糖缀合物的任何组合，所述组合物用3D-MPL佐剂配制，但基本上不含铝基佐剂。
本发明的肺炎链球菌联合抗原性组合物通常将包含多糖缀合物抗原，其中所述多糖得自至少4、7、11、13、15或23种血清型(关于根据待治疗疾病的优选血清型组合，参见以上“本发明的肺炎链球菌多糖抗原”)。
本发明的抗原性组合物最好作为疫苗组合物使用，以预防(或治疗)肺炎球菌感染，特别是在老年人和婴儿以及学步幼儿中预防(或治疗)肺炎球菌感染。
本发明的其它实施方案包括：提供用于医药的上述抗原性组合物；诱导针对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，包括给予患者安全而有效量的一种上述抗原性组合物的步骤；和应用上述抗原性组合物之一生产肺炎球菌性疾病的预防(或治疗)药物。
为了预防/缓解老年(+55岁)人群的肺炎以及婴儿(至18个月)和学步幼儿(通常为18个月至5岁)的中耳炎，本发明的再一优选实施方案是将如本文所述配制的多价肺炎链球菌多糖缀合物与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫功能等同体联合。关于优选蛋白/蛋白组合参见上节“本发明的肺炎球菌蛋白”。
优选将上文描述的抗原性组合物(和疫苗)冻干待用，使用时用稀释剂将它们临时重建。更优选将它们在3D-MPL存在下冻干，并且用盐水溶液临时重建。
将所述组合物冻干，产生更为稳定的组合物(例如它防止所述多糖抗原分解)。该过程也意外地致使仍然针对所述肺炎球菌多糖的抗体效价更高。已经表明这对于PS 6B缀合物是尤为明显的。因此，本发明的另一方面是包含PS 6B缀合物、加有3D-MPL佐剂并且基本上不含铝基佐剂的冻干抗原性组合物。
关于疫苗的制备，参见上文“本发明的疫苗制剂”一节。
C)细菌多糖-D蛋白缀合物
联合疫苗发展方向的优点是：减少接受者的不适，便于制定时间表和确保方案的完整；但也伴随有降低疫苗功效的风险(参见上文关于因过度使用载体蛋白引起表位抑制的讨论)。因此，制备满足人群需求并且另外在其组分之间没有表现出免疫原性干扰的疫苗组合将是有利的。这些优势可以通过本发明的免疫原性组合物(或疫苗)来实现，将联合疫苗给予高危组别(例如婴儿、学步幼儿或老年人)特别有益。
本发明提供作为基于多糖的免疫原性组合物(包括疫苗)载体的流感嗜血菌D蛋白或其片段。适合使用的片段包括包含T辅助细胞表位的片段。特别是，D蛋白片段最好含有所述蛋白N末端的1/3。
D蛋白是一种得自流感嗜血菌的IgD结合蛋白(EP 0 594 610B1)，并且是一种潜在的免疫原。
本发明设想的待与D蛋白缀合的多糖包括但不限于：针对伤寒沙门氏菌的Vi多糖抗原、脑膜炎球菌多糖(包括A、C、W135和Y型，以及B组脑膜炎球菌的多糖和修饰多糖)、得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多糖、得自无乳链球菌(Streptococcusagalactae)的多糖、得自肺炎链球菌的多糖、得自分枝杆菌例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的多糖(例如甘露磷酸肌醇海藻糖、分枝菌酸、甘露糖加帽的阿拉伯甘露糖、其荚膜和阿拉伯半乳聚糖)、得自新型隐球菌的多糖、不可定型的(non-typeable)流感嗜血菌的脂多糖、得自流感嗜血菌b的荚膜多糖、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatharralis)的脂多糖、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)的脂多糖、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的脂肽基磷酸聚糖(lipopeptidophosphoglycan)(LPPG)、癌症相关的神经节苷脂GD3、GD2、肿瘤相关的粘蛋白(特别是T-F抗原以及唾酸T-F抗原)以及结构上涉及T-F抗原的HIV相关多糖。
可以用任一已知方法(例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757描述的方法)将所述多糖与所述载体蛋白连接。最好是进行CDAP缀合(WO 95/08348)。
在CDAP中，最好用氰化(cyanylating)试剂四氟硼酸1-氰基-二甲氨基吡啶鎓(CDAP)来合成多糖-蛋白缀合物。所述氰化反应可以在相对温和的条件下进行，避免碱敏感性多糖的水解。该合成允许直接与载体蛋白偶联。
在水或盐水溶液中溶解所述多糖。将CDAP溶于乙腈中，并且立即加入到所述多糖溶液中。CDAP与多糖的羟基反应，形成氰酸酯。在所述活化步骤后，加入载体蛋白。赖氨酸的氨基与所述活化多糖反应，形成异脲共价键。
在偶联反应之后，加入大量过量的甘氨酸，以猝灭残留的活化官能。然后使该产物通过凝胶渗透，以除去未反应的载体蛋白和残留的试剂。因此，本发明提供产生多糖D蛋白缀合物的方法，包括活化多糖和将多糖与D蛋白连接的步骤。
在本发明的一个优选实施方案中，提供一种用于预防肺炎链球菌感染的免疫原性组合物(或疫苗)制剂。
人们对肺炎球菌传播到肺、脑脊液和血液的机制知之甚少。到达正常肺泡的细菌由于其相对干燥以及肺泡巨噬细胞的吞噬活性，其生长受到抑制。这些协同防御的任何解剖学变化或生理学变化往往增加肺对感染的易感性。肺炎链球菌的细胞壁在肺泡中产生炎性反应方面具有重要作用(Gillespie等(1997)，I&I 65：3936)。
通常，本发明的肺炎链球菌疫苗将包含D蛋白多糖缀合物，其中所述多糖得自至少4、7、11、13、15或23种血清型。关于根据待治疗疾病的优选血清型组合，参见以上“本发明的肺炎链球菌多糖抗原”。
在本发明的再一实施方案中，提供一种脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗；所述脑膜炎奈瑟氏球菌特别是来自血清型A、B、C W-135和Y的脑膜炎奈瑟氏球菌。脑膜炎奈瑟氏球菌是细菌性脑膜炎的最重要的病因之一。这些生物的糖类荚膜可以用作毒力决定子和保护性抗体的靶。然而，众所周知糖类在幼儿中是差的免疫原。本发明提供一种特别适用于这些多糖的蛋白载体-D蛋白，它提供T细胞表位，所述T细胞表位可以激活T细胞应答，以有助于多糖抗原特异性B细胞增殖和成熟以及诱导免疫记忆。
在本发明的一个替代实施方案中，提供一种流感嗜血菌b的荚膜多糖(PRP)-D蛋白缀合物。
本发明也设想了提供抗多种不同病原体的保护作用的联合疫苗。出乎意料的是，D蛋白载体可用作联合疫苗中的载体，其中将多种多糖抗原缀合。如上所述，如果每种多糖使用同一载体，则有可能发生表位抑制。WO 98/51339提出了多种组合物，尝试通过将所述组合物中一定比率的所述多糖缀合到DT上、并且将其余多糖缀合到TT上，将这种干扰最小化。
出乎意料的是，本发明人已经发现：D蛋白特别适合于将联合疫苗中的这类表位抑制效应最小化。可以有利地将一种组合中的一种或更多种多糖缀合到D蛋白上，最好在这类联合疫苗中将所有抗原都缀合到D蛋白上。
一种优选组合包括提供抗脑膜炎奈瑟氏球菌C和Y(最好是A)感染保护作用的疫苗，其中将得自一种或更多种血清型Y和C(最优选是A)的多糖抗原与D蛋白连接。
基于流感嗜血菌多糖的疫苗(优选与TT、DT或CRM197缀合的、或最优选与D蛋白缀合的PRP)可以与上述联合疫苗一起配制。
许多儿科疫苗现在作为联合疫苗给出，以便减少儿童必须接受的注射次数。因此，对于儿科疫苗而言，可以将其它抗原与本发明的疫苗一起配制。例如，本发明的疫苗可以与众所周知的“三价”联合疫苗一起配制，或分别但同时给予；所述“三价”联合疫苗包含白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)和百日咳组分[通常为解毒的百日咳类毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)与任选的pertactin(PRN)和/或凝集素1+2]，例如市售的疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeechamBiologicals)，它含有DT、TT、PT、FHA和PRN抗原或具有全细胞百日咳组分，例如SmithKlineBeecham Biologicals s.a.出售的的组分，例如TritamrixTM。所述联合疫苗也可以包含其它抗原，例如乙型肝炎表面抗原(HbsAg)、脊髓灰质炎病毒抗原(例如灭活的三价脊髓灰质炎病毒-IPV)、粘膜炎莫拉氏菌外膜蛋白、不可定型的流感嗜血菌蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白。
可以包括在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎)中的优选粘膜炎莫拉氏菌蛋白抗原的实例是：OMP106 [WO 97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)]、OMP21、LbpA和LbpB[WO 98/55606(PMC)]、TbpA和TbpB[WO 97/13785和WO 97/32980 (PMC)]、CopB[Helminen ME等(1993)Infect.Immun.61：2003-2010]、UspA1/2[WO 93/03761(University of Texas)]和OmpCD。可以包括在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎)中的不可定型流感嗜血菌抗原的实例包括：丝束蛋白(Fimbrin protein)[(US 5766608-Ohio State Research Foundation)]和包含其肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US 5843464(OSU)或WO99/64067]、OMP26[WO 97/01638(Cortecs)]、P6[EP 281673(StateUniversity of New York)]、TbpA和TbpB、Hia、Hmw1，2、Hap和D15。
本发明设想的优选儿科疫苗是：
a)脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖缀合物和流感嗜血菌b多糖缀合物，
任选地与脑膜炎奈瑟氏球菌A和/或Y多糖缀合物，前提是至少一种多糖抗原、最好是所有多糖抗原与D蛋白缀合。
b)疫苗a)与DT、TT、百日咳组分(最好是PT、FHA和PRN)、乙型肝炎表面抗原和IPV(灭活的三价脊髓灰质炎病毒疫苗)。
c)与D蛋白缀合的肺炎链球菌多糖抗原。
d)疫苗c)与一种或更多种得自粘膜炎莫拉氏菌和/或不可定型流感嗜血菌的抗原。
所有上述联合疫苗均可以受益于包括D蛋白作为载体。显然，包括在联合疫苗中载体愈多(例如为了克服表位抑制)，则最终的疫苗愈昂贵和愈复杂。使联合疫苗的所有多糖抗原或大部分多糖抗原与D蛋白缀合，则提供了明显的优势。
为了预防老年(+55岁)人群中的肺炎和婴儿或学步幼儿的中耳炎，本发明的一个优选实施方案是将本文所述的多价肺炎链球菌多糖-D蛋白抗原与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫功能等同体组合。关于可以包括在这类组合中的优选蛋白/蛋白组合，参见以上“本发明的肺炎球菌蛋白”一节。
因此，本发明提供一种免疫原性组合物，所述组合物包含一种肺炎链球菌多糖-D蛋白缀合物和一种肺炎链球菌蛋白抗原。
本发明的多糖-D蛋白缀合物抗原最好在本发明的疫苗制剂中辅以佐剂。合适的佐剂包括铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或可以是酰化酪氨酸、或酰化糖、阳离子或阴离子衍生化多糖、或聚磷腈的不溶性悬浮液。
对于老年人疫苗，最好是选择作为TH1型应答优先诱导物的佐剂。
关于具体的Th1佐剂，参见以上“本发明的Th1佐剂”。
在本发明的再一方面，提供用于医药的本文所述的免疫原或疫苗。
关于所述缀合物的疫苗制备/给予，参见以上“本发明的疫苗制剂”。
D蛋白也可以有利地用于抗中耳炎的疫苗，因为它本身是一种能够产生抗不可定型流感嗜血菌(ntHi)的B细胞介导的保护作用的免疫原。ntHi可以侵入宿主细胞，并且逃避由蛋白抗原诱发的B细胞介导的效应。本发明人已经意外地发现了一种提高D蛋白(或者其本身或者作为多糖的载体)作为中耳炎疫苗抗原的效力的方式。这通过用D蛋白作为佐剂来进行，使得在受治疗者中诱发强Th1应答，因此使免疫系统的细胞介导分支对D蛋白最优化。这一目的可以采用一种冻于组合物来意外地达到，所述组合物包含D蛋白和一种Th1佐剂(最好是3D-MPL)，所述冻干组合物可在给药前不久重建。因此，本发明还提供这类组合物、制备这类组合物的方法(通常将包含D蛋白和一种Th1佐剂的混合物冻干)和这样一种组合物在中耳炎治疗方面的应用。
广义来讲，本发明人预计：将免疫原在一种Th1佐剂(参见“本发明的Th1佐剂”)、最好是3D-MPL存在下冻干，一般将增强抗所述免疫原的Th1免疫应答。因此，本发明适用于需要较强Th1免疫应答的任何免疫原。这类免疫原包括细菌蛋白抗原、病毒蛋白抗原和肿瘤蛋白抗原以及自身蛋白和肽。
                        实施例
所述实施例说明本发明，但不限制本发明。
实施例1
肺炎链球菌荚膜多糖：
所述11价候选疫苗包括基本上如EP 72513中所述方法制备的荚膜多糖血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F。将每种多糖灭活、用CDAP化学(WO 95/08348)衍生化并与所述蛋白载体缀合。除血清型3(将其大小减小，以降低其粘度)之外，所有多糖均以其天然形式缀合。
蛋白载体：
选定的蛋白载体是在大肠杆菌中表达的、得自不可定型流感嗜血菌的重组D蛋白(PD)。
D蛋白的表达
流感嗜血菌D蛋白
用于D蛋白表达的基因构建
原材料
编码D蛋白的DNA
D蛋白在流感嗜血菌的所有血清型和不可定型的菌株中是高度保守的。含有编码完整D蛋白基因的DNA序列的载体pHIC348得自A.Forsgren博士(Department of Medical Microbiology，University of Lund，Malm General Hospital，Malm，瑞典)。Janson等(1991)Infect.Immun.59：119-125已经发表了D蛋白的DNA序列。
表达载体pMG1
表达载体pMG1是一种pBR322(Gross等，1985)的衍生物，其中引入了用于转录和翻译外源插入基因的噬菌体λ来源的控制元件(Shatzman等，1983)。另外，将氨苄青霉素抗性基因与卡那霉素抗性基因交换。
大肠杆菌菌株AR58
通过用先前在SA500衍生物上生长的P1噬菌体储备液(galE::TN10，λKil-cI857ΔH1)转导N99，产生大肠杆菌菌株AR58。N99和SA500是得自National Institute of Health的Martin Rosenberg博士实验室的大肠杆菌K12菌株。
表达载体pMG1
为了产生D蛋白，已经将编码该蛋白的DNA克隆到表述载体pMG1中。该质粒利用来自λ噬菌体DNA的信号来驱动所插入的外源基因的转录和翻译。该载体含有启动子PL、操纵基因OL和两个利用位点(NutL和NutR)，以减轻提供N蛋白时的转录极性效应(Gross等，1985)。将含有PL启动子的载体导入大肠杆菌溶原性宿主中，以稳定所述质粒DNA。溶原性宿主菌株含有整合到基因组中的复制缺陷型入噬菌体DNA(Shatzman等，1983)。该染色体的λ噬菌体DNA指导cI阻抑蛋白的合成，cI阻抑蛋白结合于该载体的OL阻抑蛋白，阻止RNA聚合酶与PL启动子结合，由此阻止所插入基因的转录。表达菌株AR58的cI基因含有一种温度敏感型突变体，致使PL指导的转录可以受温度变化的调节，即培养温度的增加使所述阻抑蛋白失活，并且起动所述外源蛋白的合成。该表达系统使得可以受控制地合成外源蛋白，尤其是可能对细胞有毒性的那些蛋白(Shimataka和Rosenberg，1981)。
大肠杆菌菌株AR58
用以生产所述D蛋白载体的AR58溶原性大肠杆菌菌株是标准NIH大肠杆菌K12菌株N99的衍生物(F- su-galK2，LacZ-thr-)。它含有缺陷型溶原性λ噬菌体(galE::TN10，λKil-cI857 ΔH1)。Kil-表型防止宿主大分子合成的关闭。cI857给CI阻抑蛋白提供温度敏感损伤。ΔH1缺失除去了λ噬菌体右操纵子和宿主的bio、uvr3和chlA基因座。通过用先前在SA500衍生物上生长的P1噬菌体储备液(galE::TN10，λKil-cI857ΔH1)转导N99，产生AR58菌株。借助于在相邻galE基因中编码四环素抗性的TN10转座子，用四环素选择出所述缺陷型溶原体到N99中的导入。
载体pMGMDPPrD的构建
用含有流感病毒非结构S1蛋白编码基因的pMG1载体(pMGNSI)，构建pMGMDPPrD。用在5’端和3’端分别含有NcoI和XbaI限制位点的PCR引物，通过PCR，从pHIC348载体(Janson等，1991)中扩增D蛋白基因。然后将NcoI/XbaI片段导入pMGNS1的NcoI和XbaI之间，由此构建含有NS1蛋白N末端81个氨基酸、后接PD蛋白的融合蛋白。该载体标记为pMGNS1PrD。
在上述构建体的基础上，产生用于D蛋白表达的最终构建体。从pMGNS1PrD中除去一个BamHI/BamHI片段。该DNA水解除去了除前3个N末端残基外的NS1编码区。再连接所述载体时，产生了具有以下N末端氨基酸序列的融合蛋白的编码基因：
-----MDP SSHSSNMANT------
NS1                  D蛋白
D蛋白不含前导肽或正常连接脂质链的N末端半胱氨酸。因此，该蛋白既不分泌到周质中，又不会被脂质化，并且以可溶性形式保留在胞质中。
通过于37℃热激，将最终的构建体pMG-MDPPrD导入AR58宿主菌株中。在卡那霉素存在下选择含质粒的细菌。通过用选定的特定内切核酸酶消化所分离的质粒DNA，证实D蛋白编码DNA插入片段的存在。该重组大肠杆菌菌株称为ECD4。
D蛋白的表达受控于λPL启动子/OL操纵基因。宿主菌株AR58在基因组中含有一个温度敏感型cI基因，它在低温下通过与OL结合，阻断λPL的表达。一旦温度升高，cI则从OL上释放，因此D蛋白表达。在发酵结束时，将细胞浓缩并冷冻。
如下从收获的细胞中提取并纯化D蛋白。将冷冻的细胞培养物沉淀解冻，并重悬于细胞破碎溶液(柠檬酸缓冲液pH6.0)，至最终OD650＝60。使该悬浮液2次于P＝1000巴下通过高压匀浆器。通过离心澄清细胞培养物匀浆，并通过过滤除去细胞碎片。在第一个纯化步骤中，将经过滤的裂解液加样至阳离子交换层析柱(SP Sepharose Fast Flow)上。PD通过离子相互作用与凝胶基质结合，并通过一步增加洗脱缓冲液的离子强度而被洗脱下来。
在第二个纯化步骤中，杂质保留在阴离子交换基质(Q SepharoseFast Flow)上。PD不结合至凝胶上，并且可以在流通液中收集。
在两个柱层析步骤中，通过OD监测分步收集物。通过超滤，浓缩含有所述纯化D蛋白的阴离子交换柱层析流通液。
最后，让含D蛋白的超滤保留物(retentate)通过0.2μm膜。
化学：
活化和偶联化学：
活化条件和偶联条件对于每种多糖是特定的。在表1中给出了这些条件。将天然多糖(除PS3外)溶于NaCl 2M或注射用水中。评估对于所有血清型的最适多糖浓度。
由100mg/ml乙腈储备液，将CDAP(CDAP/PS比为0.75mg/mg PS)加入到多糖溶液中。1.5分钟后，加入0.2M三乙胺以获得特定活化pH。于25℃，在2分钟内在该pH下进行所述多糖的活化。将D蛋白(其量取决于原始PS/PD比)加入到活化多糖中，于特定pH下进行1小时偶联反应。然后用甘氨酸25℃30分钟并于4℃过夜，猝灭该反应。
采用以0.2M NaCl平衡的Sephacryl 500HR凝胶过滤柱，通过凝胶过滤纯化所述缀合物。
测定洗脱出的流分中的糖含量和蛋白含量。将所述缀合物合并，并在0.22μm除菌膜上过滤除菌。测定所述缀合物制剂中的PS/蛋白比。
特征鉴定：
对每种缀合物进行了特征鉴定，并且符合表2所述的具体描述。通过间苯二酚试验测定多糖含量(μg/ml)，而通过Lowry试验测定蛋白含量(μg/ml)。通过所述浓度比确定最终的PS/PD比(w/w)。
残留DMAP含量(ng/μg PS)：
用CDAP活化所述多糖，在所述多糖中引入了一个氰酸基团，并释放出DMAP(4-二甲氨基-吡啶)。通过SB发展的特定测定，测定残留DMAP含量。
游离多糖含量(％)：
在与α-PD抗体一起温育、用硫酸铵饱和、然后离心之后获得的上清液上，测定于4℃保持或于37℃贮藏7天的缀合物的游离多糖含量。
用α-PS/α-PS ELISA来定量测定上清液中的游离多糖。也通过α-PD/α-PS ELISA测定缺乏缀合物的对照。减少游离多糖的量产生一种改进的缀合物疫苗。
抗原性：
在夹心型ELISA中分析相同缀合物的原性，其中抗体的捕获和检测分别为α-PS和α-PD。
游离蛋白含量(％)：
通过采用以SDS处理样品的方法，测定残留“游离”D蛋白的水平。将缀合物在0.1％SDS存在下于100℃加热10分钟，并注射到SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK 3000-PWXL)上。由于D蛋白是二聚体，因此由于用SDS使所述结构解离，有过高估计“游离”D蛋白水平的风险。
分子大小(Kav)：
在SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK 5000-PWXL)上进行分子大小测定。
稳定性：
在HPLC-SEC凝胶过滤(TSK 6000-PWXL)上测定于4℃保持并于37℃贮藏7天的缀合物的稳定性。
表2给出了所述11价疫苗的特征鉴定。
可以将所述蛋白缀合物吸附至磷酸铝上，并混合形成最终的疫苗。
结论：
已经产生的免疫原性缀合物，因为已经表明所述缀合物是有希望的疫苗的组分。发现了用于每种所述11价疫苗的最佳质量的最终缀合肺炎球菌多糖产物的优化CDAP条件。通过上述改进(优化)CDAP法获得的这些肺炎球菌多糖的缀合物(无论何种载体蛋白，但最好是D蛋白)因此是本发明的再一方面。
实施例2-改进(advanced)佐剂对所述11价肺炎球菌PS-PD缀合物疫苗在大鼠幼鼠中免疫原性的影响的研究
采用以下佐剂制剂：无、AlPO4、3D-MPL、AlPO4上的3D-MPL，用11价肺炎球菌PS-PD缀合物疫苗(按照实施例1的方法制备的)以每种多糖0.1μg的剂量免疫大鼠幼鼠。
对于11种抗原中的5种抗原而言，仅具有3D-MPL的制剂的免疫原性(最高GMC IgG)在统计学上(并且意外地)高于其它制剂。在高浓度和低浓度3D-MPL下情况都是如此。
调理素吞噬作用证实所述GMC结果。
材料和方法
免疫方案
将OFA大鼠幼鼠随机分给不同的母鼠，当所述幼鼠接受第一次免疫时为7日龄。14天和28天后它们接受另外2次免疫。在第56天(第三次后28天)放血。所有的疫苗均皮下注射，每个疫苗组有10只大鼠。
用包含缀合至D蛋白上的以下多糖血清型的一种11价肺炎球菌缀合物疫苗免疫大鼠：1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F。
制剂
为了检查不同改进佐剂的效应，缀合物的剂量保持恒定，为每种多糖0.1μg，佐剂AlPO4和3D-MPL以不同剂量和组合配制，包括根本无佐剂。这些以数值列于表3中用于参考。
在AlPO4上的吸附
按照以下方法制备浓缩的吸附型单价制剂。将50μg AlPO4(pH5.1)与5μg缀合多糖混合2小时。将pH调至pH5.1，并将混合物再放置16小时。加入1500mM NaCl，以使盐浓度为150mM。5分钟后，加入5mg/ml 2-苯氧乙醇。再经30分钟后，将pH调至6.1，并于4℃放置超过3天。
稀释剂的制备
在NaCl 150mM/5mg/ml苯氧乙醇中制备三种稀释剂。
A：1mg/ml AlPO4。
B：分别为250μg/ml和1000μg/ml AlPO4上的3D-MPL重量比3D-MPL/AlPO4＝5/20
C：分别为561μg/ml和1000μg/ml AlPO4上的3D-MPL重量比3D-MPL/AlPO4＝50/89
吸附型11价制剂的制备
以正确的比率混合11种浓缩的吸附型PS-PD单价制剂。加入补足量作为稀释剂A的AlPO4。需要时，将3D-MPL或者作为水溶液(非吸附型，方式1，参见下文)或者作为稀释剂B或C(以两个剂量吸附至AlPO4上的3D-MPL，方式2，参见下文)加入。
方式1
将3D-MPL作为水性悬浮液加入到联合吸附型缀合物中。将其混合到所述11价制剂中，于室温达10分钟，并贮藏于4℃直至给药。
方式2
将3D-MPL预吸附至AlPO4，然后加入所述联合吸附型缀合物(稀释剂B和C)中。为了制备1ml稀释剂，将3D-MPL(250或561μg)的水性悬浮液与NaCl 150mM pH6.3中的1mg AlPO4于室温混合5分钟。该溶液在NaCl pH6.1/苯氧基中稀释，并于4℃温育过夜。
非吸附型11价制剂的制备
将11种PS-PD缀合物在NaCl 150mM pH6.1苯氧基中混合并以正确的比率稀释。需要时，将3D-MPL作为溶液(非吸附型)加入。
在首次给予之前18天，制备用于所有注射的制剂。
ELISA
进行ELISA，以用衍生自WHO Workshop对ELISA法的方案测量大鼠IgG，以定量测定人血清中针对肺炎链球菌荚膜多糖的IgG抗体。实质上，将纯化的荚膜多糖直接包被在微量滴定板上。血清样品与所有肺炎球菌共有的并约以0.5％按照公开内容(EP 72513 B1)纯化的肺炎球菌多糖存在的细胞壁多糖(C物质)预温育。用JacksonImmunoLaboratories Inc.的试剂检测结合的鼠IgG。效价曲线以通过对数log公式建模的内部标准(单克隆抗体)作为参比。运用SaftMax Pro软件，进行计算。这些结果的最大绝对误差预期在2倍的范围内。相对误差低于30％。
调理素吞噬作用
采用CDC方案(采用分化的HL60细胞的肺炎链球菌调理素吞噬作用，版本1.1)与纯化的人PMN和幼兔补体，测定血清型3、6B、7F、14、19F和23F的调理素效价。改进包括使用in-house肺炎球菌菌株，并且用纯化的人嗜中性粒细胞PMN再接种吞噬性HL60细胞(在这些吞噬细胞之间有高度相关性)。另外，将3mm玻璃珠加入微量滴定板各孔中，以增加混合，这使得可以降低吞噬细胞：细菌之比，该比率建议为400。
结果
IgG浓度
测量的每种血清型的几何平均IgG浓度和PD示于表4-10。对于血清型6B、14、19F和23F，包括先前用四价制剂获得的结果用于对比。
在表4-10中突出了最高IgG浓度。3D-MPL组合物与3D-MPL/AlPO4组合物的统计学p值示于表11中。4号佐剂制剂(具有高剂量3D-MPL的非吸附型缀合物)对于11种情况中的9种产生最高GMC。在5/11种情况下，低剂量的MPL具有第二最高免疫原性。另外，对于所有血清型而言，加入佐剂产生的GMC高于通过改变剂量产生的GMC(数据未显示)，这对于血清型4、6B、7F、18C和23F而言是统计学显著的(来自95％CI的p＜0.05)。
调理素吞噬作用
在表4-8中显示了血清型3、6B、7F、14、19F和23F的混合血清的调理素吞噬作用结果。对于大部分而言，这些调理素效价证实了GMC IgG。实际上，对于血清型6B、19F、23F，与IgG浓度的相关性高于85％(数据未显示)。对于血清型3，重要的是注意到仅3D-MPL组诱发高于阈值的调理素活性。
结论
在该实验中，仅应用3D-MPL能够诱导最高IgG浓度是出乎意料的。
将通过改变佐剂获得的最大GMC IgG与通过改变PS剂量获得的最大GMC进行比较，发现3D-MPL在5/11的血清型中可以诱发显著更高的应答。
表11表明，当比较(比较配制方法和3D-MPL剂量)3D-MPL和3D-MPL/AlPO4组合物时，当仅用3D-MPL配制而不用3D-MPL+AlPO4配制时，其中5种所述多糖缀合物在免疫原性方面得到显著改进：PS4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F。
实施例3-组合对PS 4、PS 6b、PS 18C、PS 19F和PS 23F缀合物在成年大鼠中的免疫原性影响的研究
成年大鼠用或者单独的、或者在多价组合物(或者四价、五价、七价或十价)中联合的肺炎球菌多糖-D蛋白缀合物疫苗免疫。以28天的间隔对每组10只大鼠免疫2次，在第28天和第42天(第二次给药后14天)获得试验放血血样。
通过ELISA测试血清中抗所述肺炎球菌多糖的IgG抗体。通过ELISA测定，所有缀合物均诱导特异性IgG抗体。表12显示了根据第二次给药后14天时IgG的浓度测定的、单价PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F D蛋白缀合物的组合对其在成年大鼠中免疫原性的影响。
对所有样品进行统计学分析，以确定联合时抗体浓度的差异是否显著。血清型PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F D蛋白缀合物中任一种在多价疫苗中的联合不显著改变其免疫原性。
表1
PS肺炎链球菌-D蛋白缀合物的具体活化/偶联/猝灭条件
  血清型     1     3(μfluid.)     4     5     6B     7F
  PS浓度(mg/ml)     2.0     3.0     2.0     7.5     5.4     3.0
  PS溶解     NaCl 2M     NaCl2M     H2O     H2O     NaCl2M     NaCl2M
  PD浓度(mg/ml)     5.0     5.0     5.0     5.0     5.0     5.0
  原始PS/PD比(w/w)     1/1     1/1     1/1     1/1     1/1     1/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)     0.75     0.75     0.75     0.75     0.75     0.75
  pHn＝pHc＝pHq     9.0/9.0/9.0     9.0/9.0/9.0     9.0/9.0/9.0     9.0/9.0/9.0     9.5/9.5/9.0     9.0/9.0/9.0
  血清型     9V     14     18C     19F     23F
  PS浓度(mg/ml)     2.5     2.5     2.0     4.0     3.3
  PS溶解     NaCl2M     NaCl2M     H2O     NaCl2M     NaCl2M
  PD浓度(mg/ml)     5.0     5.0     5.0     5.0     5.0
  原始PS/PD比(w/w)     1/0.75     1/0.75     1/1     1/0.5     1/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)     0.75     0.75     0.75     0.75     0.75
  pHn＝pHc＝pHq     8.5/8.5/9.0     9.0/9.0/9.0     9.0/9.0/9.0     10/9.5/9.0     9.0/9.0/9.0
表2：11价肺炎球菌PS-PD疫苗的具体描述(批号代码的第一个数字表示血清型)
    标准     D01PDJ227     D03PDJ236   D4PDJ228   D5PDJ235   D6PDJ209
    比率PS/蛋白(w/w)游离多糖含量(％)＜10％游离蛋白含量(％)＜15％DMAP含量(ng/μg PS)＜0.5ng/μgPS分子大小(Kav)稳定性     1/0.66180.20.18无变化     1/1.091＜10.60.13无变化     1/0.867190.40.12无变化     1/0.869211.20.11变化小     1/0.69090.30.13无变化
    D07PDJ225     D09PDJ222     D14PDJ202     D18PDJ221     D19PDJ206    D23PDJ212
    比率PS/蛋白(w/w)游离多糖含量(％)＜10％游离蛋白含量(％)＜15％DMAP含量(ng/μg PS)＜0.5n/μg PS分子大小(Kav)稳定性     1/0.58180.10.14无变化     1/0.80＜10.30.60.14无变化     1/0.68＜130.30.17无变化     1/0.624210.20.10无变化     1/0.454100.10.12变化     1/0.740120.90.12无变化
表3.在大鼠幼鼠中用11价肺炎球菌PS-PD测试的佐剂制剂的概述
表
组别 AlPO4 MPL 方法 描述
1 无
2  100 AlPO4
3  5 MPL低
4  50 MPL高
5  100  5 方式1 方式1低
6  100  50 方式1 方式1高
7  100  5 方式2 方式2低
8  100  50 方式2 方式2高
表4.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型6B的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价(和与四价免疫进行比较)
组别 AlPO4μg MPLμg 方法  6BGMCIgG(μg/ml) 6B血清转化 6B调理素效价*  6BGMCIgG(μg/ml) 6B血清转化 6B调理素效价*
四价 11价
 1  0.047  2/10  12.5  0.004  1/10 ＜6.25
 2  100  0.048  4/10  65  0.019  4/10 ＜6.25
 3  5  1.345  10/10 43
 4  50  4.927  10/10 192
 5  100  5  1  0.042  7/10 ＜6.25
 6  100  50  1  0.255  10/10 ＜6.25
 7  100  5  2  0.033  3/10 ＜6.25  0.048  8/10 ＜6.25
 8  100  50  2  0.057  8/10 ＜6.25
表5.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型14的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价(和与四价免疫进行比较)
组别 AlPO4  MPL 方法  14GMCIgG(μg/ml) 14血清转化 14调理素效价*  14GMCIgG(μg/ml) 14血清转化 14调理素效价*
 四价  11价
 1  0.046  3/10  64  0.022  3/10  ＜6.25
 2  100  0.99  10/10  88  0.237  8/10  27
 3  5  0.233  10/10  41
 4  50  0.676  10/10  81
 5  100  5  1  0.460  9/10  67
 6  100  50  1  0.477  10/10  98
 7  100  5  2  0.81  10/10  49  0.165  8/10  81
 8  100  50  2  1.611  10/10  133
表6.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型19F的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价(和与四价免疫进行比较)
组别 AlPO4μg MPLμg 方法  19FGMCIgG(μg/ml) 19F血清转化 19F调理素效价*  19FGMCIgG(μg/ml) 19F血清转化 19F调理素效价*
四价 11价
 1  0.04  2/10  64  0.021  2/10  ＜6.25
 2  100  1.07  9/10  367  0.222  7/10  79
 3  5  4.028  10/10  296
 4  50  21.411  10/10  1276
 5  100  5  1  1.649  10/10  172
 6  100  50  1  2.818  10/10  208
 7  100  5  2  1.09  10/10  193  0.766  10/10  323
 8  100  50  2  3.539  10/10  241
表7.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型23F的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价(和与四价免疫进行比较)
组别 AlPO4μg  MPLμg 方法  23FGMCIgG(μg/ml) 23F血清转化 23F调理素效价*  23FGMCIgG(μg/ml) 23F血清转化 23F调理素效价*
 四价  11价
1  0.06  2/10 ＜6.25  0.152  3/10 ＜6.25
 2  100  0.29  10/10 70  0.56  8/10 ＜6.25
 3  5  2.296  9/10 389
 4  50  4.969  10/10 ＞1600
 5  100  5  1  0.462  5/10 17
 6  100  50  1  0.635  8/10 54
 7  100  5  2  0.38  10/10 ＜6.25  0.203  3/10 18
 8  100  50  2  0.501  7/10 43
表8.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型3和7F的几何平均IgG浓度、血清转化和平均调理素效价
组别  AlPO4μg  MPLμg 方法  3GMCIgG(μg/ml) 3血清转化 3调理素效价*  7FGMCIgG(μg/ml) 7F血清转化 7F调理素效价*
四价 11价
 1  0.003  1/10 ＜6.25  0.040  7/10  ＜6.25
 2  100  0.008  6/10 ＜6.25  0.25  9/10  43
 3  5  0.070  10/10 ＜6.25  2.435  10/10  477
 4  50  0.108  10/10 18  2.569  10/10  332
 5  100  5  1  0.015  10/10 ＜6.25  0.579  10/10  54
 6  100  50  1  0.027  10/10 ＜6.25  0.611  9/10  59
 7  100  5  2  0.006  10/10 ＜6.25  0.154  8/10  30
 8  100  50  2  0.034  10/10 ＜6.25  0.638  9/10  140
表9.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型1、4和5的几何平均IgG浓度和血清转化
组别 AlPO4μg  MPLμg 方法  1GMCIgG(μg/ml) 1血清转化  4GMCIgG(μg/ml) 4血清转化  5GMCIgG(μg/ml) 5血清转化
 1  0.026  4/10  0.005  0/10  0.040  3/10
 2  100  0.282  8/10  0.052  5/10  0.774  9/10
 3  5  1.614  10/10  3.452  10/10  7.927  10/10
 4  50  2.261  10/10  7.102  10/10  13.974  10/10
 5  100  5  1  0.568  10/10  0.676  10/10  3.105  10/10
 6  100  50  1  1.430  10/10  0.419  9/10  5.755  10/10
 7  100  5  2  0.478  10/10  0.267  9/10  2.062  10/10
 8  100  50  2  1.458  10/10  0.423  10/10  5.009  10/10
表10.采用不同佐剂用11价PS-PD第3次免疫大鼠幼鼠后第28天血清型9V、18C和PD的几何平均IgG浓度和血清转化
组别 AlPO4μg  MPLμg 方法  9VGMCIgG(μg/ml) 9V血清转化  18CGMCIgG(μg/ml) 18C血清转化  PDGMCIgG(μg/ml) PD血清转化
 1  0.018  0/10  0.013  1/10  0.003  0/10
 2  100  0.489  6/10  0.092  5/10  0.993  10/10
 3  5  0.482  7/10  6.560  10/10  3.349  10/10
 4  50  11.421  10/10  14.023  10/10  5.446  10/10
 5  100  5  1  2.133  9/10  0.690  10/10  11.407  10/10
 6  100  50  1  2.558  10/10  1.771  10/10  1.258  10/10
 7  100  5  2  1.536  10/10  0.528  10/10  1.665  8/10
 8  100  50  2  2.448  9/10  0.980  10/10  5.665  10/10
表11.当仅用3D-MPL配制相对于用3D-MPL/AlPO4配制时，某些肺炎球菌多糖缀合物的免疫原性是否改进的统计学显著性(p值)。低于0.01的p值被认为是高度显著性的。方式1和方式2表明配制的方法。
血清型 50μg3D-MPL对3D-MPL/AlPO4  5μg 3D-MPL对3D-MPL/AlPO4
方式1 方式2 方式1 方式2
 1  0.3  0.05  0.079  0.11
 3  0.075  0.01  0.27  0.008
 4  0.002  0.0003  0.02  0.003
 5  0.04  0.002  0.1  0.12
 6B  0.001  0.0001  0.001  0.0006
 7F  0.13  0.15  0.01  0.005
 9V  0.02  0.02  0.1  0.04
 14  0.65  0.21  0.3  0.66
 18C  0.0008  0.0002  0.006  0.004
 19F  0.0009  0.006  0.21  0.04
 23F  0.002  0.0004  0.01  0.0004
表12：在用单独的或与四价、五价、七价或十价疫苗联合的1.0μg多糖-D蛋白缀合物第二次免疫成年大鼠后第14天的几何平均IgG浓度(μg/ml)。这些数据由5组独立实验综合。
血清型疫苗 4H  6BT  18CH  19FT  23FT
单独 9.3  0.11  15  5.2  2.5
联合 4  0.23  3.7  3.7  2.8
T：与四价(T)(PS 6B、14、19F、23F)、五价(T+PS3)、七价(H)(T+PS4、9V和18C)和十价(H+PS1、5和7F)联合疫苗联合。H：与七价(H)(T+PS4、9V和18C)和十价(H+PS1、5和7F)联合疫苗联合。
实施例4-加入肺炎球菌溶血素和3D-MPL对PD缀合的11价多糖疫苗在小鼠中抗肺炎球菌性肺部定居的保护效应的有益影响
免疫读出
肺炎球菌溶血素特异性血清IgG的ELISA剂量
Maxisorp Nunc免疫板用100μl孔在PBS中稀释的2μg/ml重组天然肺炎球菌溶血素(PLY)于37℃包被2小时。用NaCl 0.9％Tween-200.05％缓冲液洗板3次。然后，将抗PLY血清参考的2倍连续稀释液(在PBS/Tween-20 0.05％中，100μl/孔)作为标准曲线(始于670ng/ml IgG)加入，在搅拌下将血清样品(始于1/10稀释度)于20℃温育30分钟。经如上所述洗涤后，在搅拌下，将在PBS/Tween-20 0.05％中稀释5000倍的过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson)于20℃温育30分钟(100μl/孔)。洗涤后，将板于室温与100μ/孔显色缓冲液(100mM pH4.5柠檬酸缓冲液中的OPDA 0.4mg/ml和过氧化氢0.05％)温育15分钟。加入50μl/孔HCl 1N终止显色。用Emax免疫读数仪(Molecular Devices)于490nm和620nm读出光密度。运用SoftMaxPro软件，通过4参数数学方法计算抗体效价。
溶血抑制
进行该测定以测量血清抗体抑制肺炎球菌溶血素(PLY)溶血活性的能力。为了消除胆固醇(易与PLY相互作用)，将血清样品如下处理2次：将其与等体积氯仿混合，然后在搅拌下温育45分钟。以1000rpm离心10分钟后，收集上清液。在96孔小平板(Nunc)中稀释(在1mM二硫苏糖醇，0.01％BSA，15mM TRIS，150mM NaCl，pH7.5中2倍连续稀释)清除胆固醇的血清。每孔中加入50μl含4HU(溶血单位)PLY的溶液，并于37℃温育15分钟。然后，加入100μl绵羊红细胞(1％溶液)于37℃达30分钟。以1000rpm离心10分钟后，收集上清液(150μl)，并将其置于另一96孔小平板中，以读出405nm的光密度。结果以中点稀释效价表示。
肺炎球菌溶血素的化学解毒
将重组天然肺炎球菌溶血素(PLY)对磷酸盐50mM NaCl 500mMpH7.6缓冲液透析。在偶尔搅拌下于39.5℃进行所有以下步骤。第1天，将Tween-80 10％(1/250v/v)、N-乙酰色氨酸57.4mM pH7.6(3/100v/v)、甘氨酸2.2M的磷酸缓冲液(1/100v/v)和10％甲醛的磷酸缓冲液(3/100v/v)加入PLY溶液中。第2天和第3天，分别以3/100和2/100v/v的比率再加入10％甲醛。在偶尔搅拌下继续于39.5℃温育直至第7天。最后，将PLY对磷酸盐50mM NaCl 500mM pH7.6缓冲液透析。在溶血测定中证明PLY完全失活。
在OF1小鼠中肺炎球菌的鼻内攻击
在麻醉下，给7周龄OF1雌性小鼠鼻内接种5.105CFU适应小鼠的肺炎链球菌血清型6B。攻击后6小时取出肺并将其在Todd HewithBroth(THB，Gibco)培养基中匀浆(Ultramax，24000rpm，4℃)。将肺匀浆的10倍连续稀释液接种到含补充酵母提取物的THB琼脂的培养皿中，于37℃培养过夜。以CFU数/小鼠测定肺炎球菌肺感染，并以对数加权平均表示。检测极限是2.14log CFU/小鼠。
实施例4A    3D-MPL对抗肺炎球菌溶血素免疫应答的佐剂效应
在该实施例中，我们评估了3D-MPL佐剂对抗天然重组肺炎球菌溶血素(PLY，由J.Paton提供，Children’s Hospital，North Adelaide，澳大利亚)及其化学解毒对应物(DPLY)免疫应答的影响。如上所述进行化学解毒。
在第0、14和21天，用包含在A：AlPO4 100μg；或B：AlPO4 100μg+5μg 3D-MPL(3脱-O-酰化单磷酰基脂质A，有Ribi Immunochem供应)中的1μg PLY或DPLY，肌内免疫每组10只雌性6周龄Balb/c小鼠。图1A和1B显示在第三次免疫后血清中测量的ELISA IgG和溶血抑制效价(HLI)。
无论何种抗原，都在用补充3D-MPL的制剂接种的动物中诱导最佳免疫应答。有趣的是，当用AlPO4+3D-MPL一起给予时，DPLY的免疫原性与PLY相同，而在AlPO4制剂中DPLY是较弱的免疫原。这显示出3D-MPL有利的改进抗解毒肺炎球菌溶血素抗体应答的能力。
在含肺炎球菌溶血素的组合物中，可能最好使用化学解毒的肺炎球菌溶血素，而非突变解毒的肺炎球菌溶血素。这是因为迄今获得的解毒突变体仍具有残留的毒素活性，而化学解毒的肺炎球菌溶血素不具此活性。因此，认为本发明的另一方面一般而言是：包含已经化学解毒用于疫苗的肺炎球菌溶血素(或肺炎球菌溶血素突变体)的组合物，应该加入Th1佐剂，最好是3D-MPL。本发明提供这类组合物。也设计了提高免疫原性组合物中化学解毒肺所述炎球菌溶血素的免疫应答的方法，包括加入Th1佐剂(最好是3D-MPL)到组合物中的步骤。
实施例4B  加入减毒突变肺炎球菌溶血素和3D-MPL佐剂对在用血清型6B鼻内攻击的OF1小鼠中PD缀合的11价多糖疫苗抗肺炎球菌肺定居保护效应的有益影响
在本实施例中，我们评估了与经典的AlPO4吸附型11价多糖-D蛋白缀合物制剂相比，含所述11价多糖-D蛋白缀合物、减毒突变肺炎球菌溶血素抗原(PdB，WO 90/06951)和AlPO4+3D-MPL佐剂的疫苗的预防功效。
第0天和第14天，用含A：50μg AlPO4；B：0.1μg PS/血清型的PD缀合的11价多糖疫苗+50μg AlPO4；或C：0.1μg PS/血清型PD缀合的11价多糖疫苗+10μg PdB(由J.Paton提供，Children’s Hospital，North Adelaide，澳大利亚)+50μg AlPO4+5μg 3D-MPL(由RibiImmunochem供应)的制剂，皮下免疫每组12只4周龄OF1雌性小鼠。第21天，如上所述进行攻击。
如图1C所示，补充PdB并且加入AlPO4+MPL作为佐剂的11价多糖缀合物疫苗提供了非常显著的保护作用(p＜0.007)(黑色条带表示算术平均)。相反，在用11价多糖缀合物/AlPO4制剂免疫的动物中没有观察到显著的保护作用。这一结果证明，加入肺炎球菌溶血素抗原(甚至是减毒的)和3D-MPL佐剂增强了所述11价多糖缀合物疫苗抗肺炎的效力。
实施例4C  实施例4B中所示保护作用的免疫相关物
为了确立实施例4B中有补充减毒突变肺炎球菌溶血素(PdB)和3D-MPL的11价多糖缀合物疫苗提供的保护作用的免疫相关物，如上所述测量攻击前抗多糖6B和PdB的血清抗体应答。
然后将抗体效价与在攻击后6小时收集的相应动物肺中测量的细菌菌落数相比。根据Log/Log线性回归计算R2。
计算的抗PdD抗体应答和抗6B抗体应答的R2分别等于0.18和0.02。这表明，在体液免疫应答和针对这两种抗原的保护作用之间没有相关性。抗6B抗体效价在用所述11价缀合物疫苗免疫的组(GMT＝0.318ng/ml)或补充PdD和3D-MPL的同一疫苗免疫的组(GMT＝0.458ng/ml)中没有显著差异。因此，用制剂C观察到的保护作用的改进不仅仅因为对多糖6B的抗体应答较高。
综合而言，所述结果提示，保护作用不仅由体液免疫应答介导，而是也由PdB抗原在存在3D-MPL时诱导的细胞介导的免疫介导。这对在肺炎球菌多糖缀合物疫苗中蛋白抗原和有效佐剂的加入以使免疫系统两个分支协作提供最佳保护提供了额外的支持。
实施例5-在用肺炎球菌溶血素主动免疫和用抗肺炎球菌PS抗体被动免疫的小鼠体内免疫系统两个分支协作
实施例5A-发现被动给予的抗6B多糖(抗PS)抗体保护抵抗肺炎的浓度
方法
疫苗组：每组16只小鼠的四个组在第-1天用100μl未稀释的大鼠抗多糖抗血清按照以下详述的组别被动免疫(i.p.)。(总共64只小鼠)
组别 特异性 抗血清中IgG的浓度
G1 α-PS-6B  5μg/ml
G2 α-PS-6B  2μg/ml
G3 α-PS-6B  0.75μg/ml
G4 对照  0μg/ml
动物：得自加拿大Charles River的64只雄性CD-1小鼠，重约35g(约10周龄)。
麻醉法：用异氟烷(3％)加O2(1L/分钟)麻醉小鼠。
生物：从补充5％马血的胰胨豆胨琼脂平板(TSA)收获肺炎链球菌N1387(血清型6)，并将其悬浮于6ml PBS中。将1ml细菌悬浮液稀释到9ml冷却并保持41℃的熔融营养琼脂(BBL)中，然后立即进行感染。小鼠接受体积为50ul、约6.0log 10cfu/小鼠。
感染：第0天，如上所述麻醉小鼠，并通过非手术性气管内插管经支气管内滴注用肺炎链球菌N1387(50μl冷却的细菌悬浮液)进行感染。该方法由Woodnut和Berry描述(Antimicrob.Ag.Chemotherap.43：29(1999))。
样品：感染后第3天，通过过量的二氧化碳处死8只小鼠/组，并切下肺，在1ml PBS中匀浆。在PBS中制备10倍连续稀释液，以计算活细菌数。将样品以三份平行样品接种(20μl)到补充5％马血的TSA平板上，并于37℃温育过夜，然后进行评估。第7天处死其它组小鼠，并如上所述制备样品。
结果：
大鼠血清中的IgG浓度(ug/ml)     细菌数(log 10 cfu/肺)于感染后的天数
    3     8
5     6.7±0.7(1/7)     7.2±0.7(5/8)
2     6.5±0.7(1/7)     6.9±1.8(4/7)
0.75     7.7±0.5(5/8)     4.8±1.4(2/8)
0     6.7±1.5(3/6)     6.3±1.5(3/9)
括号中的数字是取样之前死亡的动物数目。
总结：总体而言，从任一处理组分离的细菌数没有显著差异。这表明浓度直至5μg/ml并包括5μg/ml的所述抗多糖未提供可测量的保护作用。
这与在某些人类临床试验中观察的相似，亦即在某些人群中抗多糖抗体不足以保护抵抗肺炎球菌性肺炎。
实施例5B-确定通过主动给予加入或不加入佐剂的Ply(肺炎球菌溶血素)提供的抵抗肺炎的保护以及与亚适抗PS抗体协作。
方法
动物：128只雄性CD-1小鼠(给药时6周龄，感染时10周龄)来自Charles River，St.Constant，Quebec，加拿大。动物6周龄时重约20克，10周龄时重约38克。
免疫：在第-22天和第-14天，通过用100 ul以下详述的疫苗皮下注射，免疫每组16只小鼠的6组小鼠。(总共128只小鼠)。PdB(WO90/06951)是澳大利亚James Paton博士的馈赠。3D-MPL得自Ribi/Corixa。
第-1天，特定组别(参见下表)用浓度为4.26μg/ml(4ml 5μ/ml+1.3ml 2μg/ml)的小鼠抗多糖抗体被动免疫(i.p.100μl)。
组别 注射体积主动 第-22、-14天给予的疫苗(剂量μg) 注射体积被动 被动IgG(第-1天)
1-1  100μls.c. PdB/AlPO4(10/50) 无
1-2  100μls.c. PdB/MPL/AlPO4(10/5/50) 无
1-3  100μls.c. PdB/AlPO4(10/50) 100μli.p. α-PS
1-4  100μls.c. PdB/MPL/AlO4(10/5/50) 100μli.p. α-PS
1-5  100μls.c. MPL/AlPO4(5/50) 100μli.p. α-PS
1-6  100μls.c. MPL/AlPO4(5/50) 无
感染：第0天，麻醉(3％异氟烷加1 L/分钟O2)小鼠。通过从补充5％马血的胰胨豆胨琼脂平板(TSA)上收获肺炎链球菌N1387(血清型6)的生长物，制备细菌接种物，并将其悬浮于6ml PBS中。在冷却的熔融营养琼脂(保持41℃)中制备10倍稀释液(1ml加9ml)，然后立即进行感染。小鼠通过气管内插管经支气管内滴注感染，并且接受体积为50ul、约6.0log 10cfu/小鼠。该方法由Woodnut和Berry描述(Antimicrob.Ag.Chemotherap.43：29(1999))。
样品：感染后第72天，通过过量的二氧化碳处死8只小鼠/组，并切下肺，在1ml PBS中匀浆。在PBS中制备10倍连续稀释液，以计算活细菌数。将样品以三份平行样品接种(20μl)到补充5％马血的TSA平板上，并于37℃温育过夜，然后进行评估。感染后第8天处死其它组小鼠，并如上所述制备样品。
数据分析
处理比较的测量结果是感染后3天和7天时肺中的细菌数。结果以各组平均值与标准误差表示。用Students t检定进行统计学分析，其中＜0.05的P值被认为是显著性的。
结果：
感染后72小时
得自组1-4的细菌计数显著低于(p＜0.05)得自组1-3的细菌计数。
得自组1-4的细菌计数显著低于(p＜0.05)得自组1-5的细菌计数。
注射后168小时
所有组别中的细菌数在8天时均低于3天时的约100倍，表明感染正在减轻。
得自组1-2的细菌计数显著低于(p＜0.05)得自组1-5的细菌计数。
组别     第3天     第8天
LogCFU/肺 标准误差 LogCFU/肺 标准误差
 1-1  6.93  0.61  5.23  1.28
 1-2  6.59  1.25  4.08  1.34
 1-3  7.09  0.8  5.32  1.26
 1-4  6.09  1.43  4.46  2.32
 1-5  7.19  0.89  5.42  1.05
 1-6  6.68  1.14  5.01  1.48
正如以上证明的，仅抗多糖抗体(组1-5)不提供抗肺炎球菌在肺中生长的保护作用。加有AlPO4佐剂的PdB也不提供保护，但当将PdB与3D-MPL联用时，在第8天倾向于保护(组1-2)。
第3天，最显著受保护的组-组1-4具有所有三种成分-PdB、3D-MPL和被动给予的抗多糖抗体。这一结论得到死亡率的支持。与组1-5和1-3的死亡率为5/10相比，组1-4的死亡率仅为2/8。
结论：
由于该实验是用被动免疫的动物进行的，因而也用肺炎球菌溶血素和MPL主动免疫的协同效应不可能是由于抗所述多糖抗原抗体水平的增加引起的。
因为所述动物仅针对肺炎球菌多糖被动免疫，所以到第8天时，这种抗体的水平将从宿主中大大消失。
即便如此，在用肺炎球菌溶血素加3D-MPL免疫的组别中，尤其是在用肺炎球菌溶血素加3D-MPL加被动给予的抗多糖抗体免疫的组别中，可以观察到抗肺炎球菌性肺炎的显著保护作用，表明这种联合的协同作用。
如果已经主动(最好是用缀合多糖)进行了抗多糖免疫，则由于B细胞记忆的效应，将观察到所述效应甚至更为显著，并且恒定水平的抗PS抗体将导致免疫应答协同作用(参见例如图1C，其中许多用多糖和蛋白主动免疫的动物表现出在攻击后肺中无细菌)。
实施例6-加有3D-MPL佐剂的11价肺炎球菌多糖D蛋白缀合物疫苗在1岁的Balb/C小鼠中的免疫原性
介绍和目标：
血清型特异性抗体通过调理素吞噬作用介导抗肺炎球菌感染的保护作用。可以推测：抗体浓度的增加将导致更大的保护，因此已经作了大量的工作，以找到增加体液应答的方法。在临床前研究中已经成功应用于缀合物疫苗的一种策略是应用免疫刺激性佐剂(关于综述参见Poolman等1998，基于糖类的细菌疫苗。Handbook of ExperimentalPharmacology，P.Perlmann和H.Wigsell编著，Springer-Verlag，Heidelberg，D)。
这一节中所示的数据显示了在设计模拟临床实验的一个方案中，运用多个临床批号的最近的实验结果。
方案：
用1/10人用剂量的肺炎球菌多糖D蛋白缀合物疫苗或23价普通多糖疫苗免疫1岁的balb/c小鼠。所用疫苗的临床批号DSP009、DSP013或DSP014，分别对应于1mcg剂量的血清型6B和23F和5mcg所述11价缀合疫苗中的其余血清型、0.1mcg剂量的所述11价缀合疫苗、或加有5mcg 3D-MPL佐剂的0.1mcg剂量的所述11价缀合疫苗。所有11价缀合疫苗也加有50μgAlPO4佐剂。
肌内免疫每组的20只小鼠。下表中所列组别的注射在第0天和第21天进行。第35天(在第二次注射后的14天)获得实验放血样品。
表：用多个临床批号的肺炎球菌多糖D蛋白缀合物疫苗免疫1岁Balb/c小鼠的免疫时间表
  组别     第0天疫苗第1剂     第21天疫苗第2剂   小鼠数
    1     Pneumovax-232.5mcg     缓冲液     20
    2a     11价Pn-PD0.1mcg     缓冲液     20
    2b     11价Pn-PD0.1mcg     11价Pn-PD0.1mcg     20
    3a     11价Pn-PD+MPL0.1mcg+5mcg     缓冲液     20
    3b     11价Pn-PD+MPL0.1mcg+5mcg     11价Pn-PD+MPL0.1mcg+5mcg     20
    4a     11价Pn-PD1/0.5mcg     缓冲液     20
    4b     11价Pn-PD1/0.5mcg     11价Pn-PD1/0.5mcg     20
    对照     缓冲液     缓冲液     20
按照CDC/WHO的一致方案，即在用细胞壁多糖中和血清后，通过ELISA测试血清中的抗所述肺炎球菌多糖的IgG抗体。用血清型特异性IgG1单克隆抗体校正所述ELISA，以得到以mcg/ml计的抗体浓度。
运用UNISTAT 5.0β版本，计算比较的统计学分析。在对数转化的IgG浓度上进行用Tukey-HSD方法的ANOVA。运用费歇尔恰当实验，进行血清转化率的成对对比。
结果：
在第二次免疫(2剂)后14天诱导的抗所述11种血清型和D蛋白的GMC IgG和95％置信区间示于下表中。显示其中可能计算95％置信区间的血清转化率。
组1表明用普通多糖免疫的效应，普通多糖在动物中通常仅诱导IgM。大多数IgG水平低于检测阈值；然而，balb/c小鼠能够产生抗几种肺炎球菌多糖、特别是抗血清型3、19F和14的IgG。
用缀合物疫苗免疫，诱导了高血清转化率的抗除23F外所有血清型的IgG抗体。
对于血清型7F和19F，仅观察到剂量依赖性反应(组4对组2)，但这些观察不是统计学显著的。对于血清型3、6B、7F和19F以及PD，在2剂后观察到更大的反应(b组对a组)，这些观察在所有三种制剂的许多情况下都是统计学显著的。
最有趣的是3D-MPL的效应。2剂3D-MPL配制的疫苗(组3b)诱导最高的特异性IgG的GMC，并且这对于除23F外的所有血清型而言都是统计学显著的，在23F的情况下，具有显著更高的血清转化率(组3b对2b的p＝0.02，费歇尔恰当实验)。
表：用11价PS-PD缀合物疫苗第二次免疫后14天、选定肺炎球菌血清型和D蛋白在1岁Balb/c中的几何平均[IgG]和95％置信区间
组别     1     2a     2b  3a     3b     4a     4b
血清型   GM[IgG]μg/ml(95％CI)   GM[IgG]μg/ml(95％CI)   GM[IgG]μg/ml(95％CI)  GM[IgG]μg/ml(95％CI)   GM[IgG]μg/ml(95％CI)   GM[IgG]μg/ml(95％CI)   GM[IgG]μg/ml(95％CI)
3    0.24(0.16-0.6)   0.18(0.11-0.27)   0.84(0.47-1.5)  0.72(0.51-1.0)   4.84(3.0-7.9)   0.22(0.14-0.35)   0.95(0.19-1.8)
6B   0.020/20#   0.048/19   0.19(0.09-0.41)  0.14(0.07-0.27)   0.74(0.29-1.9)   0.09(0.05-0.16)   0.11(0.05-0.23)
7F   0.040/20#   0.07(0.04-0.12)   0.19(0.10-0.39)  0.15(0.10-0.22)   0.97(0.49-2.0)   0.09(0.06-0.14)   0.45(0.20-1.02)
14   0.153/20#   4.5(2.5-8.1)   6.2(3.6-10.5)  12.9(7.8-21.2)   13.6(9.4-19.7)   4.0(2.0-8.0)   6.9(4.6-10.6)
19F   1.2(0.56-2.6)   6.7(3.6-12.5)   12.1(7.6-19.3)  10.1(5.5-18.5)   58.5(42-81)   5.9(3.5-9.9)   22.0(16.0-30.2
23F   0.071/20#   0.083/20#   0.082/19#  0.072/10#   0.179/20#   0.061/18#   0.104/20#
PD*   0.251/20#   5.2(3.3-8.3)   11.9(6.9-20.7)  13.5(9.5-19.0)   98.0(49.1-195.)   10.9(6.4-18.4)   38.7(21.3-70.3)
*以EU/ml计；#血清转化率，定义为高于阴性对照平均值的2倍标准偏差。
关于组别的定义，请参考前表。
结论：
这里所示的数据证明，在所述11价肺炎球菌多糖D蛋白缀合物疫苗中加入3D-MPL，在老年balb/c小鼠中增加了抗所有试验血清型的免疫应答。
在大多数情况下，与1剂疫苗相比，2剂疫苗诱导更高的几何平均IgG浓度。由于用普通多糖疫苗甚至在人类中也没有观察到这种现象，因此认为显示出T细胞依赖性免疫应答和诱导免疫记忆。
这些数据支持采用加有Th1佐剂(最好是3D-MPL)的缀合肺炎球菌多糖的疫苗给予方案，因而优选以1-12周间隔，最优选以3周间隔，至少给予2剂加有佐剂的疫苗。这样一种给予方案认为是本发明的再一方面。
用于该试验的小鼠对PS 23(普通的或缀合的)无应答。有趣的是，虽然无论使用何种疫苗组合物，抗所述多糖的抗体水平都保持低水平，但当将3D-MPL用作佐剂时许多小鼠对PS 23应答(血清转化率显著更高)。在包含缀合肺炎球菌多糖的疫苗组合物中应用Th1佐剂(最好是3D-MPL)，以便缓解对疫苗中的肺炎球菌多糖无应答性，这是本发明的又一方面。用上述组合物采用上述2剂给药方案缓解无应答性的方法是再一方面。
实施例7-脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖-D蛋白缀合物(PSC-PD)
A：D蛋白的表述
同实施例1一样。
B：C多糖的生产
C组多糖的来源是脑膜炎奈瑟氏球菌的菌株C11。运用经典的发酵技术(EP 72513)让所述菌株发酵。用于所述缀合方法的干粉多糖与Mencevax(SB Biologicals s.a.)相同。
将1等份C11菌株解冻，将0.1ml悬浮液在一个含补充酵母提取物透析液(10％v/v)的Mueller Hinton培养基的培养皿上划线接种，并在水饱和的空气培养箱中于36℃培养23-25小时。
然后将表面生长物重悬于灭菌发酵培养基中，并将该悬浮液接种到一个含有补充酵母提取物透析液(10％，v/v)的Mueller Hinton培养基和无菌玻璃珠的Roux瓶中。在水饱和的空气培养箱中将Roux瓶于36℃培养23-25小时后，将表面生长物重悬于10ml灭菌发酵培养基中，并将0.2-0.3ml该悬浮液接种到12个其它含Mueller Hinton培养基的Roux瓶中。
在水饱和的空气培养箱中于36℃培养23-25小时后，将表面生长物重悬于10ml灭菌发酵培养基中。将细菌悬浮液合并到一个锥形瓶中。
然后用无菌注射器将该悬浮液无菌转移到发酵罐中。
在置于清洁室中负压下的发酵罐中进行脑膜炎球菌发酵。发酵一般在10-12小时后完成，相当于约1010细菌/ml(即早期稳定期)，然后根据pH的增加进行检测。
在该阶段，将整个肉汤加热灭活(于56℃12分钟)，然后离心。在灭活之前和之后，取出肉汤样品，并在Mueller Hinton培养基的培养皿上划线接种。
C：PS纯化
该纯化方法是在整个发酵肉汤上进行的多步法。在纯化的第一阶段，通过离心澄清灭活的培养物，并回收上清液。
多糖的纯化基于用季铵盐(溴化十六烷基三甲基铵/CTAB，CETAVLONR)沉淀。CTAB与聚阴离子(例如多糖、核酸和蛋白)形成不溶性复合物，这取决于其pI。采用离子控制的条件，该方法可以用来沉淀杂质(低电导率)或多糖(高电导率)。
包括在经澄清的上清液中的多糖采用硅藻土(CELITER545)作为基质来沉淀，以避免不同沉淀/纯化步骤期间不溶性惰性物质的形成。
脑膜炎奈瑟氏球菌C多糖的纯化方案
步骤1：将PSC-CTAB复合物固定在CELITER545上，并通过用CTAB 0.05％洗涤，除去细胞碎片、核酸和蛋白。
步骤2：用EtOH50％洗脱PS。弃去浑浊并且含有杂质和LPS的最初的流分。通过絮凝试验证实在以后的流分中存在PS。
步骤3：将PS-CTAB复合物再固定在CELITE R 545上，并通过用CTAB0.05％洗涤，除去较小的核酸和蛋白。
步骤4：用EtOH50％洗脱PS。弃去最初的浑浊流分。通过絮凝试验证实在以后的流分中存在PS。
将流出液过滤，并收集含粗制多糖的滤液。通过加入乙醇至终浓度80％，从滤液中沉淀出所述多糖。然后回收作为白色粉末的所述多糖，将其真空干燥并贮存于-20℃。
D：CDAP缀合
PSC和PD的缀合
对于PSC和PD的缀合，CDAP缀合技术优于经典的CNBr活化和通过一个间隔物偶联至载体蛋白。首先通过用四氟硼酸1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓(CDAP)进行氰化，活化所述多糖。CDAP是一种水溶性氰化剂，其中氰基的亲电性高于CNBr的亲电性，使氰化反应能够在相对温和的条件下进行。在活化后，可以将多糖通过其氨基直接偶联至载体蛋白，而不用引入任何间隔分子。未反应的氰酸酯基团借助延伸反应用甘氨酸猝灭。缀合物疫苗制备中包括的步骤总数得以减少，最重要的是在终产物中不存在潜在的免疫原性间隔分子。
用CDAP活化多糖，在多糖中引入了一个氰酸酯基团，并且释放二甲氨基吡啶(DMAP)。在随后的偶联步骤中所述氰酸酯基团与NH2基团反应，并且转化为氨基甲酸酯。
PSC活化和PSC-PD偶联
活化和偶联在+25℃下进行。
将120mg PS在WFI中溶解至少4小时。
加入CDAP溶液(100mg/ml，在乙腈中新鲜制备的)，以达到0.75的CDAP/PS(w/w)比率。
1分钟30秒后，通过加入三乙胺将pH升至活化pH(pH10)，并将其稳定化直至加入PD。
3分钟30秒时，加入NaCl至终浓度为2M。
4分钟时，加入纯化PD，以达到1.5/1的PD/PS比；立即将pH调至偶联pH(pH10)。将该溶液在pH调节下放置1小时。
猝灭
将6ml 2M甘氨酸溶液加入PS/PD/CDAP混合物中。将pH调至猝灭pH(pH8.8)。将溶液于该工作温度下搅拌30分钟，然后于+2-8℃在连续缓慢搅拌下过夜。
PS-PD纯化
过滤(5μm)后，在冷房中通过S400HR Sephacryl凝胶的凝胶渗透层析纯化所述PS-PD缀合物，以除去小分子(包括DMAP)和未缀合的PD：洗脱-NaCl 150mM pH6.5；监测-UV 280nm，pH和电导率。
根据反应组分的不同分子大小，PS-PD缀合物首先被洗脱，然后是游离PD，最后是DMAP。合并通过DMAB(PS)和μBCA(蛋白)检测含有缀合物的流分。将合并的流分过滤除菌(0.2μm)。
E：PSC-PD吸附型缀合物疫苗的配制
AlPO4的洗涤
为了优化PSC-PD缀合物在AlPO4上的吸附，洗涤AlPO4以降低PO4 3-浓度：
-用NaCl 150mM洗涤AlPO4，并离心(4×)；
-然后将沉淀重悬于NaCl 150mM中，然后过滤(100μm)；和
-将滤液加热灭菌。
这种经洗涤的AlPO4称为WAP(经洗涤的高压灭菌磷酸盐)。
配制方法
在最终配制成品之前，将PSC-PD缀合物主体吸附到AlPO4 WAP上。将AlPO4 WAP与PSC-PD一起于室温搅拌5分钟。将pH调至5.1，然后将混合物再于室温搅拌18小时。加入NaCl溶液至150mM，然后将混合物于室温搅拌5分钟。加入1-苯氧乙醇至5mg/ml，将混合物于室温搅拌15分钟，然后调至pH6.1.
最终组合物/剂量
-PSC-PD：        10μgPS
-AlPO4 WAP：     0.25mg Al3+
-NaCl：          150mM
-2-苯氧乙醇：    2.5mg
-注射用水        至0.5ml
-pH：            6.1
F：临床前资料
多糖缀合物在小鼠中的免疫原性
已经在6周龄至8周龄Balb/C小鼠中评价了所述PSC-PD缀合物的免疫原性。将所述普通(非吸附型)缀合物或吸附至AlPO4的缀合物作为单价疫苗注射。通过ELISA测定诱导的抗PSC抗体，而运用杀细菌试验分析功能性抗体，两种方法均基于CDC(Centers for DiseaseControl and Prevention，Atlanta，USA)方案。显示了为评价所述反应的相对剂量和佐剂(AlPO4)效应而进行的得自两种不同试验的结果。
剂量范围实验
在该实验中，给Balb/C小鼠注射2次(两周间隔)所述PSC-PD。使用在AlPO4上配制的缀合物的四种不同剂量：0.1、0.5、2.5和9.6μg/动物。第14天(14 PostI)、第28天(14 Post II)和第42天(28 Post II)给小鼠(10只/组)放血。用纯化的IgG作为参比，以μg IgG/ml表示通过ELISA测定的C多糖特异性抗体的几何平均浓度(GMC)。使用脑膜炎奈瑟氏球菌C11菌株，在幼兔补体存在下，对混合血清测定杀细菌抗体，效价以能够杀死50％细菌的稀释度的倒数表示。
获得的剂量反应显示出从2.5μg剂量开始的一个平台。结果表明，在14 PostI和14 PostII之间有良好的加强反应。28 PostII的抗体水平至少等于14 PostII的抗体水平。杀细菌抗体效价与ELISA浓度一致，证实所述PSC-PD缀合物的免疫原性。
佐剂的效应
在该实验中，评价一批在AlPO4上配制的PSC-PD缀合物，注射普通(无佐剂的)缀合物用于对比。通过皮下途径，给10只小鼠/组注射2次2μg缀合物(两周间隔)。第14天(14 PostI)、第28天(14 PostII)和第42天(28 PostII)给小鼠放血，用并测量ELISA和功能性抗体的效价(对于杀细菌试验，仅对14 PostII和28 PostII进行)。所述AlPO4制剂诱导的抗体效价至多10倍于抗体无佐剂的制剂。
结论
根据上述实验结果，可以作出以下一般性结论：
-PSC-PD缀合物诱导回忆反应，证明当PSC缀合时成为T细胞依赖性抗原。
-通过ELISA测定的抗PSC抗体浓度与杀细菌抗体效价的相关性良好，表明所述PSC-PD缀合物诱导的抗体对于抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌C血清组有功能。
-约2.5μg吸附至AlPO4的缀合物看来在小鼠中诱发最佳抗体应答。
-CDAP化学看来是一种合适的制备免疫原性PSC-PD缀合物的方法。
实施例8-制备得自脑膜炎奈瑟氏球菌A血清组的多糖-PD缀合物
将A多糖(PSA)干粉在NaCl 0.2M溶液中溶解1小时，至终浓度为8mg/ml。然后或者用HCl或者用NaOH将pH固定至数值6，然后将溶液在25℃进行热调节。将0.75mg CDAP/mg PSA(至100mg/ml乙腈的制剂)加入PSA溶液中。在不调节pH的1.5分钟后，加入NaOH0.2M，以得到pH10。2.5分钟后，按照约为1的PD/PSA比加入D蛋白(浓缩至5mg/ml)。在1小时的偶联反应期间将pH保持在10。然后加入10mg甘氨酸(2M pH9.0)/mg PSA，将pH调至9.0，于25℃达30分钟。在通过排阻柱层析(Sephacryl S400HR，Pharmacia)纯化之前，将混合物于4℃放置过夜。所述缀合物首先被洗脱，然后是未反应的PD和副产物(DMAP、甘氨酸、盐)。收集缀合物，并通过在Sartorius的0.2μm Sartopore膜上过滤除菌。
实施例9-实施例7和8的产物的体外表征
                  主要特性概述于下表中：
  编号   缀合物描述 蛋白和PS含量(μg/ml) PS/蛋白比(w/w) 游离蛋白(％)   游离PS(％)
    1  PSC-PDNaOH用于pH调节  PD：210PS：308 1/0.68 ＜2 8-9
    2  PSC-PDTEA用于pH调节  PD：230PS：351 1/0.65 ＜2 5-6
    3  PSA-PDNaOH用于pH调节  PD：159PS：149 1/1.07 5 5-9
体内结果
用Balb/C小鼠作为动物模型，测试所述缀合物的免疫原性。将缀合物或者吸附至AlPO4或者吸附至Al(OH)3(500μg Al3+上10μg PS)，或者不吸附。如下给小鼠注射：以2周间隔注射2次(2μg PS/注射)。
根据这些结果，我们可以首先推断：游离PS大大影响所述免疫应答。用游离PS低于10％的缀合物已经获得了较好的结果。因此，以上对CDAP法的改进是本发明的再一方面。
配方也是重要的。在该模型中，AlPO4看来是最合适的佐剂。所述缀合物诱导一种加强效应，这在仅注射多糖时是观察不到的。
结论
获得了最终PS/蛋白比分别为1和0.6-0.7(w/w)的脑膜炎奈瑟氏球菌A和C的缀合物。游离PS和游离载体蛋白分别低于10％和15％。多糖的收率高于70％。因而，通过上述改进的(优化的)CDAP法(无论何种载体蛋白，但最好是D蛋白)可获得的PSA和PSC的缀合物是本发明的又一方面。
实施例10-得自流感嗜血菌b的多糖-PD缀合物的制备
流感嗜血菌b是2岁以下儿童的脑膜炎主要病因之一。作为与破伤风类毒素的缀合物的流感嗜血菌荚膜多糖(PRP)是众所周知的(通过J.Robbins开发的化学缀合)。CDAP是一种改进的化学。以下是发现用于缀合PRP、最好是将其缀合于PD的最佳CDAP条件的说明。
影响缀合反应的参数是以下参数：
●多糖的初始浓度(它可能对最终的游离多糖水平和无菌过滤步骤有着双重作用)。
●载体蛋白的初始浓度。
●多糖与蛋白的初始比率(它也可能对最终的游离多糖水平和无菌过滤步骤有着双重作用)。
●CDAP的用量(通常大量过量)。
●反应温度(它可以影响多糖的分解、反应动力学和反应基的分解)。
●活化和偶联的pH。
●猝灭pH(影响残留DMAP水平)。
●活化、偶联和猝灭的时间。
本发明人已经发现：3个对于优化终产物质量最为关键性的参数是：多糖/蛋白的初始比率；多糖的初始浓度；和偶联pH。
因此，用上述3个条件作为3个轴，设计一种反应立方体。这3个轴的中心点(和实验的数值范围)是：PS/蛋白比-1/1(±0.3/1)；[PS]＝5mg/ml(±2mg/ml)；和偶联pH＝8.0(±1.0pH单位)。
如下固定所述不太必需的参数：使用30mg多糖；温度25℃；[CDAP]＝0.75mg/mg PS；用0.2M NaOH滴定pH；活化pH＝9.5；活化温度＝1.5分钟；偶联温度-1小时；[蛋白]＝10mg/ml；猝灭pH＝9.0；猝灭温度＝1小时；将PS溶于溶剂的温度＝在2M NaCl中1小时；在Sephacryl S-400HR上纯化，用NaCl 150mM以12cm/小时洗脱；和用SARTOLAB P20以5mg/分钟过滤除菌。
当在上述反应立方体内制备产物时着眼于建立优化条件的数据是：加工数据-过滤后的最大收率、掺入蛋白的最大水平；产物数据的质量-最终PS/蛋白质比率、游离PS水平、游离蛋白水平、最低残留DMAP(一种CDAP的分解产物)水平。
过滤结果
影响过滤后结果的因素是初始[PS]和偶联pH以及初始PS/蛋白比率之间的相互作用。在低[PS]下，在后两个因素之间几乎没有相互作用，总是得到良好的可滤性(对于所有产物均约为95％)。然而，在高浓度下，如果所述pH和所述初始比率增加，则可滤性降低(高[PS]、最低比率、最低pH＝99％过滤；但高[PS]、最高比率和pH＝19％过滤)。
所述蛋白掺入水平
最终的PS/蛋白比率相对于初始比率的比率是偶联效率的度量。高[PS]下，pH不影响两种比率之比。然而，初始比率则影响两种比率之比(在低初始比率下为1.75，在高初始比率下为1.26)。在低[PS]下，两种比率之比对于大部分而言是较低的，然而pH现在的影响较大(低pH、低比率＝0.96；低pH、高比率＝0.8；高pH、低比率＝1.4；而高pH、高比率＝0.92)。
最终PS/蛋白比率
所述最终比率取决于初始比率和[PS]。用高初始比率和高[PS]的组合获得最适当的最终比率。PH对所述最终比率的影响没有弱[PS]的影响显著。
游离D蛋白水平
在高pH和高[PS]下，观察到最少量的游离D蛋白(水平达到0.0)。高[PS]的影响在pH低时尤为显著。初始比率的上升致使游离D蛋白少许增加。
残留DMAP
初始比率没有显著作用。相反，DMAP的水平随[PS]而提高，但当所述pH上升时降低。
结论
因此，最优选的缀合条件如下：偶联pH＝9.0；[PS]＝3mg/ml；而初始比率＝1/1.采用这些条件，终产物的特征如下：
最终PS/蛋白比率   得自过滤的PS结果(％)   两种比率之比   游离D蛋白(％) DMAP水平(ng/10μgPS)
数值 范围  数值 范围 数值 范围 数值 范围 数值 范围
1.10 0.91-1.30  92.6  50-138  1.16 1.03-1.29  0.71 0-10.40  4.95 2.60-7.80
因而，通过上述改进的(优化)CDAP法(无论何种载体蛋白，但优选D蛋白)可获得的PRP缀合物是本发明的再一方面。
实施例11：作为抗原的D蛋白-其抗不可定型流感嗜血菌的保护功效如何通过将D蛋白与3D-MPL一起配制而得到改进
雌性Balb/c小鼠(10只/组)在20周龄(D0)时用所述11价肺炎球菌多糖-D蛋白缀合物疫苗初次免疫(肌内)，并且2周后(D14)接受第二次免疫。第二次免疫后7天收集血液。根据IgG1、IgG2a和IgG2b型抗体的量，测量抗D蛋白抗体的效价。
通过将所述缀合物与15.75％乳糖混合，于室温搅拌15分钟，将pH调至6.1±0.1，并且冻干(该循环通常始于-69℃，在3小时内逐渐调至-24℃，然后保持该温度达18小时，然后在1小时内逐渐调至-16℃，随后保持该温度达6小时，然后在3小时内逐渐调至+34℃，最后在9小时内保持该温度)，制备冷冻干燥的11价疫苗(无AlPO4)。
表13显示了制剂的组成和冻干粉的重建。
关于Th1型细胞介导的免疫应答是否已经发生的最具特征的测量已知与IgG2a抗体水平相关。正如从数据中看到的，如果将D蛋白与Th1佐剂(在这种情况下是3D-MPL)一起冻干，则导致IgG2a出乎意料地大大增加。
表13：制剂的组成(每人用剂量)，和小鼠中抗D蛋白(用1/10的剂量)的抗体效价
  物理状态   PS(/500μl) AlPO4(/500μl) 免疫刺激剂 粘结剂 防腐剂 重建剂   IgG1  IgG2a  IgG2b   IgG1  IgG2a   IgG2b
    μg/ml     ％
  液体   1μg   500μg     无   无   2-pE3   无     76   0.425   0.24   99.1   0.554   0.313
  液体   5μg   500μg     无   无   2-PE   无     66   0.284   0.176   99.3   0.427   0.265
  液体   1μg   0μg     无   无   2-PE   无     6.6   0.207   0.036   96.4   3.02   0.526
  液体   5μg   0μg     无   无   2-PE   无     5.2   0.169   0.043   96.1   3.12   0.795
  冻干   1μg   0μg     无   乳糖3.15％   无   NaCl 150mM1     5.2   0.147   0.046   96.4   2.73   0.853
  冻干   5μg   0μg     无   乳糖3.15％   无   NaCl 150mM1     11.1   0.11   0.168   97.6   0.967   1.477
  冻干   1μg   0μg     无   乳糖3.15％   无   AlPO4500μg2     45   1.86   0.075   95.9   3.96   0.160
  冻干   5μg   0μg     无   乳糖3.15％   无   AlPO4500μg2     19   0.077   0.119   99.0   0.401   0.620
  冻干   1μg   0μg     无   乳糖3.15％   无   MPL50μg1     45   2.6   3.5   88.1   5.09   6.849
  冻干   5μg   0μg     无   乳糖3.15％   无   MPL50μg1     135   25   5.1   81.8   15.1   3.089
  冻干   1μg   0μg MPL(50μg)   乳糖3.15％   无   缓冲液1     43   22   5.7   60.8   31.1   8.062
  液体   1μg   500μg MPL(50μg)   无   2-PE   无     441   7.1   9.1   96.5   1.55   1.990
  液体   5μg   500μg MPL(50μg)   无   2-PE   无     299   1.4   0.899   99.2   0.465   0.298
1注射前；2+/-注射前2小时；32-苯氧乙醇

Claims (18)

1.一种免疫原性组合物，所述组合物包含多种多糖缀合物抗原，所述多糖缀合物抗原由与得自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的D蛋白或其包含T辅助细胞表位的D蛋白片段缀合的、得自致病细菌的不同的多糖抗原组成。
2.一种权利要求1的免疫原性组合物，其中所述多糖抗原选自：来自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的Vi多糖、脑膜炎球菌多糖、B组脑膜炎球菌的多糖和修饰多糖、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多糖、来自无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的多糖、来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的多糖、来自分枝杆菌的多糖、来自新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的多糖、不可定型的流感嗜血菌的脂多糖、来自流感嗜血菌b的荚膜多糖、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catharralis)的脂多糖、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)的脂多糖和克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)的脂肽基磷酸聚糖(LPPG)。
3.权利要求2的免疫原性组合物，所述组合物包含来自至少4种肺炎链球菌血清型的肺炎链球菌多糖抗原。
4.权利要求2或3的免疫原性组合物，所述组合物还包含至少一种肺炎链球菌蛋白抗原。
5.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述蛋白抗原是肺炎链球菌的外表面蛋白或分泌蛋白或其免疫功能等同体。
6.权利要求4或5的免疫原性组合物，其中所述蛋白抗原是肺炎链球菌的毒素、粘附素或脂蛋白或其免疫功能等同体。
7.权利要求4-6的免疫原性组合物，其中所述蛋白抗原或其免疫功能等同体选自：肺炎球菌溶血素、PspA或其跨膜缺失变异体、PspC或其跨膜缺失变异体、PsaA或其跨膜缺失变异体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和CbpA或其跨膜缺失变异体。
8.权利要求2的免疫原性组合物，其中所述与D蛋白缀合的多糖抗原得自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清型A、C或Y的组合。
9.一种免疫原性组合物，所述组合物包含流感嗜血菌b、脑膜炎球菌C和脑膜炎球菌Y的缀合荚膜多糖，其中来自脑膜炎球菌C和脑膜炎球菌Y的所述荚膜多糖抗原与得自流感嗜血菌的D蛋白缀合，而所述来自流感嗜血菌b的荚膜多糖与破伤风类毒素缀合。
10.一种免疫原性组合物，所述组合物包含肺炎链球菌、流感嗜血菌b、脑膜炎球菌C和脑膜炎球菌Y的缀合荚膜多糖，其中来自肺炎链球菌、脑膜炎球菌C和脑膜炎球菌Y的所述荚膜多糖抗原与得自流感嗜血菌的D蛋白缀合，而所述来自流感嗜血菌b的荚膜多糖与破伤风类毒素缀合。
11.一种任一前述权利要求的免疫原性组合物，所述组合物还包含一种佐剂。
12.一种权利要求11的免疫原性组合物，其中所述多糖-D蛋白缀合物抗原吸附至磷酸铝上。
13.一种权利要求11的免疫原性组合物，其中所述佐剂是一种TH1应答的优先诱导物。
14.一种权利要求13的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含至少一种以下佐剂：3D-MPL、一种皂苷免疫刺激剂或免疫刺激性CpG寡核苷酸。
15.一种任一前述权利要求的用作药物的免疫原性组合物。
16.一种疫苗，所述疫苗包含权利要求1-14的免疫原性组合物。
17.一种产生针对多种致病细菌的免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
从所述致病细菌中分离多种多糖抗原；
活化所述多糖；
将所述多糖与得自流感嗜血菌的D蛋白缀合；和
将所述缀合的多糖混合在一起。
18.有效量的任一前述权利要求的免疫原性组合物在制备用于治疗患有或易患致病细菌感染的患者的药物中的用途。
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