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CN100339130C - 疫苗 - Google Patents

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CN100339130C CNB008077738A CN00807773A CN100339130C CN 100339130 C CN100339130 C CN 100339130C CN B008077738 A CNB008077738 A CN B008077738A CN 00807773 A CN00807773 A CN 00807773A CN 100339130 C CN100339130 C CN 100339130C
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Abstract

本发明涉及细菌多糖抗原疫苗的领域。特别地，本发明涉及添加有3D-MPL佐剂并且基本不含铝型佐剂的特定的有利肺炎球菌多糖结合物。

Description

疫苗
发明领域
本发明涉及细菌多糖抗原疫苗、其生产方法以及此类多糖在医学中的应用。
特别地，本发明涉及相互关联的三个方面：A-疫苗，含有一种肺炎球菌多糖抗原，特别是肺炎球菌多糖结合物抗原，该疫苗添加有一种来自肺炎链球菌的蛋白抗原和一种可选的Th1诱导佐剂；B-添加有Th1佐剂的特定的有利肺炎球菌多糖结合物；以及C-细菌多糖结合物，通常与来自流感嗜血菌的蛋白D结合。
发明背景
肺炎链球菌属革兰氏阳性菌，它可导致非常高的发病率甚至死亡(尤其对幼龄和高龄人)，并可引起诸如肺炎、菌血症和脑膜炎等侵袭性疾病以及与集群相关的疾病，如急性中耳炎。在美国，年龄大于60岁的人患有肺炎球菌性肺炎的比例估计为十万分之3-8。其中有20％会引发菌血症，其他则表现为脑膜炎，其死亡率接近30％，甚至用抗生素治疗也是如此。
肺炎球菌包裹着化学交联的多糖荚膜，这可赋予其血清型特异性。目前已知的肺炎球菌血清型有90种，肺炎球菌的荚膜是其毒力的主要决定因素，因为这些细菌的荚膜不但可保护其内表面免受补体作用，而且荚膜本身的免疫原性很弱。多糖是非T细胞依赖性抗原，不能被加工或呈递到MHC分子上以与T细胞相互作用。但它们可通过替代机制来刺激免疫系统，该机制涉及与B细胞表面受体的交联。
一些实验表明，对侵袭性肺炎球菌疾病的防护作用与荚膜特异性抗体强烈相关，并且这种防护作用具有血清型特异性。
基于多糖抗原的疫苗已为该领域所熟知。已被准许用于人类的有四种，包括伤寒沙门菌的Vi多糖、来自流感嗜血菌的PRP多糖、含有血清型A、C、W135和Y的四价脑膜炎球菌疫苗，以及含有相当于血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33的多糖的23价肺炎球菌疫苗(至少占肺炎球菌血分离物的90％)。
后三种疫苗可用来防护致呼吸道感染的细菌，此类感染能够在婴儿中导致严重的发病率和死亡，但这些疫苗未被准许用于年龄小于2岁的儿童，原因是它们在该年龄组中不具有足够的免疫原性〔Peltolaet al.(1984)，N.Engl.J.Med.310：l561-1566〕。肺炎链球菌是婴儿和幼龄儿童的侵袭性细菌疾病与中耳炎的最常见病因。同样，高龄人对肺炎球菌疫苗的反应很弱〔Roghmann et al.，(1987)，J.Gerontol.42：265-270〕，使得该群体的细菌性肺炎发病率上升〔Verghese and Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62：271-285〕。
用来克服婴儿中的这种免疫原性缺陷的策略包括，将这种多糖与免疫原性大蛋白相连接，该蛋白能够协助旁T细胞，并可诱导出针对其结合的多糖抗原的免疫记忆。通过评定，目前认为肺炎球菌糖蛋白结合物疫苗在不同年龄组中均安全有效，并且具有免疫原性。
A)肺炎球菌多糖疫苗
23价非结合肺炎球菌疫苗的临床效果在0％-81％之间变化很大(Fedson et al.(1994)Arch Intern Med. 154：2531-2535)。其效果似乎与被免疫的风险人群有关，如高龄人、何杰金氏病、脾脏切除、镰状细胞病和无丙种球蛋白血症(Fine et al.(1994)Arch InternMed.154：2666-2677)，并且与疾病的临床表现有关。这种23价疫苗并未显示出可防护肺炎球菌性肺炎(在诸如高龄人等某些高危人群中)以及中耳炎病。
因此，我们需要改进的肺炎球菌疫苗组合物，特别是在预防或改善高龄人及幼龄儿童的肺炎球菌性疾病(尤其是肺炎)方面更有效的疫苗组合物。
本发明将提供这种改进疫苗。
B)选定的肺炎球菌多糖结合物+3D-MPL组合物
一般认为商品化非结合肺炎球菌疫苗的防护效率与接种时诱导出的抗体浓度有或多或少的关系；实际上，这23种多糖只是在每种多糖组分的免疫原性方面获得了认证(Ed.Williams et al.New YorkAcademy of Sciences 1995 pp.241-249)。因此，进一步加强对肺炎球菌多糖的抗体反应可提高婴儿与高龄人利用保护性水平的抗体对首次注射的多糖或多糖结合物产生应答的比例，并且可减少诱导对肺炎链球菌感染的保护性免疫所必需的剂量和注射次数。
研究人员从20世纪初就开始对大量能够添加到抗原中以提高其在疫苗组合物中的免疫原性的复合物进行试验〔综述见M.F.Powell& M.J.Newman，Plenum Press，NY，“疫苗设计——亚基及佐剂方法”(1995)第7章“疫苗佐剂与赋形剂一览表”〕。其中有许多非常有效，但是会引起明显的局部或全身性副作用，从而阻碍其应用于人类疫苗组合物。1926年首次描述的铝型佐剂(如明矾、氢氧化铝或磷酸铝)仍然是经美国准许而用于人类疫苗的唯一免疫佐剂。
铝型佐剂属于载体类佐剂，可通过其攻击的“贮积效应”来发挥作用。抗原吸附在其表面，当注射该组合物时，佐剂和抗原不会立即分散在血流中——而是保留在注射的局部环境中，从而可获得更明显的免疫应答。这些载体类佐剂还具有其它优势，即适于使易分解抗原，如某些多糖抗原，保持稳定。
3D-MPL属于非载体类佐剂。其全称为3-O-脱酰基单磷酰脂A(或3脱-O-酰基单磷酰脂A或3-O-脱酰基-4’单磷酰脂A)，表示为3D-MPL，以说明其还原端葡糖胺的第3位为脱-O-酰基形式。其制备方法可参考GB2220211A。从化学上分析，它是3-脱酰基单磷酰脂A与4、5或6种酰化链的混合物。它最早制备于20世纪90年代初期，当时的方法是将脂A的4’-单磷酰衍生物(MPL)进行3-O-脱酰化，这种方法可产生一种毒性更弱但免疫刺激活性不变的分子。
目前已将3D-MPL本身作为一种独立佐剂，或是优选地与一种积累型载体佐剂结合使用，如氢氧化铝、磷酸铝或水包油型乳剂。这些组合物中包含的抗原和3D-MPL呈相同的颗粒结构，从而可更有效地呈递抗原信号和免疫刺激信号。研究表明，3D-MPL可进一步增强被明矾吸附的抗原的免疫原性〔Thoelen et al.Vaccine(1998)16：708-14；EP 689454-B1〕。此类组合还被该领域作为优选方法用于易吸附抗原(如细菌多糖结合物)，这些抗原被吸附到明矶上后有助于使其保持稳定。最常用的是沉淀的铝型佐剂，因为它们是目前被许可的人类疫苗中使用的唯一佐剂。因此，同时含有3D-MPL和铝型佐剂的疫苗因其易于研制且能够快速引入市场而备受该领域喜爱。
MPL(非3-脱酰化)已被用作几种一价多糖-结合物疫苗抗原的佐剂，并由此来对其进行评定。将MPL与生理盐水同时注射可加强血清抗体对四种一价多糖结合物的应答：肺炎球菌PS 6B-破伤风类毒素、肺炎球菌PS 12-白喉毒素以及与绿脓假单胞菌外毒素A结合的金黄色葡萄球菌5型和金黄色葡萄球菌8型〔Schneerson et al.J.Immunology(1991)147：2136-2140〕。增强的应答被认为具有抗原特异性。处于水包油型乳剂(载体型佐剂)中的MPL因其和抗原以相同的颗粒结构存在而始终强于生理盐水中MPL的作用，并且被认为是递送其它多糖结合物疫苗的优选佐剂系统。
Devi等人〔Infect.Immun.(1991)59：3700-7〕评定了处于生理盐水中的MPL(非3-脱酰化)在鼠对新生隐球菌荚膜多糖TT结合物的抗体应答方面的辅助效果。当 同时使用MPL和该结合物时，对PS的IgM-和IgG-特异性应答都只有轻微的提高；但是在结合物给药2天后将MPL给药时，MPL的作用要大得多。需要将MPL相对于抗原进行延迟给药的免疫方案的实用性值得怀疑，尤其是对婴儿。MPL对多糖和多糖-蛋白结合物的辅助效果似乎依赖于组合物。此外，将MPL加到适当缓释递送系统中(如使用载体佐剂)可获得更持久的辅助效应，并且可避免时间调配以及延迟给药的问题。
总之，以目前的技术发展水平而言，当用MPL或3D-MPL为佐剂时，最好是将其与一种载体佐剂(如铝型佐剂)协同使用，以便最大程度地实现其免疫刺激效应。
本发明人惊奇地发现，对某些肺炎球菌多糖结合物而言，其疫苗组合物在抗原与3D-MPL单独配制时的免疫原性要明显高于抗原与3D-MPL和载体佐剂(如一种铝型佐剂)协同配制时的免疫原性。观测到的这种改进不依赖于所用3D-MPL的浓度，也与将特定结合物以单价组合物形式使用或是将其结合使用以形成多价组合物无关。
C)细菌多糖-蛋白D结合物
如上所述，基于多糖抗原的疫苗已为该领域所熟知。上述被许可的多糖疫苗具有不同的实际临床效果。据估计，Vi多糖疫苗在预防由培养确认的伤寒方面的效力为55％-77％(Plotkin and Cam，(1995)Arch Intern Med  155：2293-99)。脑膜炎球菌C多糖疫苗在流行情况下则显示出79％的效力(De Wals P，et al.(1996)Bull WorldHealth Organ.74：407-411)。23价肺炎球菌疫苗的临床效果在0％-81％之间具有很大的差异(Fedson et al.(1994)Arch Intern Med.154：2531-2535)。如上所述，一般认为肺炎球菌疫苗的防护效率与接种时诱导出的抗体浓度有或多或少的关系。
用多糖进行接种的方法存在一个问题，即多糖本身为弱免疫原。用来克服这种免疫原性缺陷的策略包括，将多糖与能够协助旁T细胞的高免疫原性大蛋白载体相连接。
目前用来产生多糖免疫原的这些常用高免疫原性载体包括，例如，白喉毒素(DT或CRM197突变体)、破伤风类毒素(TT)、钥孔血兰素(KLH)以及结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)。
常用载体的问题
这些常用载体各自都具有许多问题，其中包括产生GMP结合物方面的，也包括这些结合物的免疫学特性方面的。
尽管这些载体被经常使用，并且也成功诱导出抗多糖的抗体应答，但是它们具有一些缺点。举例来说，当预先存在针对该载体，此处为破伤风毒素，的抗体时，抗原特异性免疫应答会被抑制(表位抑制)(Di John et al；(1989)Lancet，2：1415-8)。而作为惯例，这些疫苗都用于人类的接种，所以在整个群体中，对DT和TT均预先存在免疫力的人占有非常高的比例。例如，在英国有95％的儿童接受DTP疫苗，其中就含有DT和TT。其它作者还描述了动物模型中对肽类疫苗的表位抑制问题(Sad et al，Immunology，1991；74：223-227；Schutze et al，J.Immunol.135：4，1985；2319-2322)。
此外，对需要定期促升的疫苗而言，使用诸如TT和DT等高免疫原性载体可能会在注射数次后即抑制多糖抗原的应答。多次接种还会伴有不良反应，如迟发型超反应(DTH)。
KLH作为强免疫原已作为IgE肽的载体用于人类的临床试验。但也观测到一些副反应(DTH样反应或IgE致敏)和针对抗体的抗体应答。
因此，在选择载体蛋白用于以多糖为基础的疫苗时，需要在使用可适用于所有患者的载体(广泛MHC识别)的必要性、诱导高水平的抗多糖抗体应答和低水平的抗载体抗体应答之间寻求一种平衡。
因此，以前用于以多糖为基础的疫苗的载体有很多缺点。用在组合疫苗中则尤其明显，此时若将同一种载体用于不同的多糖抗原，则表位抑制问题会特别严重。为了尽量克服这种影响，WO98/51339是在组合疫苗中使用了多种载体。
本发明提供一种新载体，用于制备不具有上述缺点的多糖/基于多糖的免疫原性结合物。
本发明提供一种来源于流感嗜血菌的蛋白D(EP059461B1)或其片段，作为基于多糖的免疫原性组合物，其中包括疫苗，的载体。该载体特别利于在组合疫苗中使用。
发明概述
A)肺炎链球菌多糖疫苗
本发明提供一种免疫原性组合物，该组合物含有至少11种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖抗原、至少一种肺炎链球菌蛋白抗原和一种佐剂，该佐剂是TH1应答的优先诱导剂。
本发明提供一种疫苗组合物，该组合物至少含有一种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖抗原(优选的为结合的多糖抗原)和一种肺炎链球菌蛋白抗原或其免疫学功能等价物，并选择性地含有一种Th1佐剂(诱导Th1免疫应答的佐剂)。优选的是肺炎球菌蛋白和Th1佐剂均包括。本发明的该组合物特别适用于高龄人的肺炎治疗。
肺炎球菌多糖疫苗(结合的或未结合的)可能无法保护高龄人群不得肺炎，该群体患此疾病的几率非常高。抵抗肺炎球菌的主要防御机制是调理素吞噬作用(通过产生抗肺炎球菌多糖抗体而引发的由体液性B细胞/嗜中性粒细胞介导的事件，最后将细菌吞噬)，但高龄人体内涉及调理素机制的某些部分出现障碍，即PMN(多形核细胞)产生过氧化物、其它类型活性氧的产生、PMN动员、PMN凋亡、PMN的变形性。高龄人体内的抗体应答也会出现障碍。
正常水平的抗荚膜多糖抗体不能有效地完全清除细菌，这与公认的法则正相反，其原因是肺炎球菌能够侵入宿主细胞以躲避免疫系统这一分支途径。
本发明人惊奇地发现，除体液免疫系统这一分支途径(如B细胞介导的免疫)之外再同时刺激细胞介导的免疫系统这一分支途径(如T细胞介导的免疫)可获得一种增效作用(或协同作用)，这种作用能够促进宿主清除肺炎球菌。这一发现有助于预防一般人的肺炎球菌性感染，而对高龄人的肺炎预防而言却至关重要，因为基于多糖的疫苗对他们不具有疗效。
本发明人发现，若将肺炎球菌多糖(优选的为结合的肺炎球菌多糖)与一种肺炎球菌蛋白(优选的为肺炎球菌表面表达的或由其分泌或释放的一种能够在II类和MHC I类环境中加工并呈递到被感染哺乳动物细胞表面的蛋白)一同给药，则两种免疫系统可由此产生协同作用。本发明人还发现，尽管肺炎球菌蛋白本身可触发细胞介导的免疫，但疫苗制剂中Th1诱导佐剂的存在可协助这种免疫系统，并且能够令人惊奇地进一步加强这两种免疫系统之间的协同作用。
B)选定的肺炎球菌多糖结合物+3D-MPL组合物
因此，本发明还提供一种抗原组合物，该组合物含有一种或多种肺炎球菌多糖结合物，并且添加有3D-MPL佐剂而基本不合铝型佐剂，其中至少有一种肺炎球菌多糖结合物是在含有3D-MPL的组合物中的免疫原性明显高于在同时含有3D-MPL和铝型佐剂的组合物中的免疫原性。
本发明提供的优选实施方案是含有以下一种或多种肺炎球菌荚膜多糖的结合物的抗原组合物：血清型4、6B、18C、19F和23F。这些组合物中的每种多糖都是在只含有3D-MPL的组合物中的免疫原性明显高于在同时含有3D-MPL和一种铝型佐剂的组合物中的免疫原性。
因此，本发明的一项实施方案提供一种抗原组合物，该组合物含有与一种免疫原性蛋白以及3D-MPL佐剂结合的血清型4、6B、18C、19F或23F肺炎链球菌荚膜多糖，其中该组合物基本不含铝型佐剂。
本发明的另一实施方案提供一种基本不含铝型佐剂的组合型抗原组合物，该组合物含有3D-MPL佐剂以及选自血清型4、血清型6B、血清型18C、血清型19F和血清型23F的两种或多种肺炎球菌多糖结合物。
C)细菌多糖-蛋白D结合物
因此，本发明提供一种多糖结合物抗原，该抗原含有一种与来自流感嗜血菌(H.influenzae)的蛋白D或其蛋白D片段结合的来源于一种致病菌的多糖抗原。此外，本发明还提供多价疫苗组合物，其中有一种或多种多糖抗原与蛋白D结合。
发明详述
A)肺炎球菌多糖疫苗
本发明提供一种改进疫苗，特别用来预防或改善高龄人(和/或婴儿与幼儿)的肺炎球菌性感染。
在本发明中，年龄等于或大于55岁的患者被认为是高龄人，典型的则大于60岁，更一般的则大于65岁。
因此，本发明的一项实施方案提供一种适用于高龄人(和/或婴儿与幼儿)的疫苗组合物，该组合物含有至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种肺炎链球菌蛋白抗原。
本发明的另一优选的实施方案提供一种疫苗(适用于高龄人的肺炎预防)，该疫苗含有至少一种肺炎链球菌多糖抗原和至少一种肺炎链球菌蛋白抗原以及一种Th1佐剂。
可以认为该疫苗也适用于其它高危人群，如婴儿或幼儿，的肺炎球菌性感染(如中耳炎)的治疗。
本发明的第三实施方案提供一种疫苗组合物，该组合物含有一种肺炎球菌多糖抗原和一种Th1佐剂。
本发明的肺炎链球菌多糖抗原
本发明的肺炎链球菌疫苗通常都含有多糖抗原(优选的为结合的多糖抗原)，其中的多糖抗原至少来源于四种血清型的肺炎球菌。优选而言，这四种血清型包括6B、14、19F和23F。更优选的是该组合物中至少含有7种血清型，如来源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F。更加优选的是该组合物中至少含有11种血清型，例如一项实施方案中的组合物含有来源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖(优选的为结合的多糖)。尽管本发明也考虑采用，例如，23价的方案(如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)，但本发明的一项优选实施方案含有的是至少13种多糖抗原(优选的为结合的多糖抗原)。
对高龄人接种(如用来预防肺炎)而言，在上述11价抗原组合物中另加上血清型8和12F(最优选的是再加上15和22)以形成15价疫苗的方案更具优势，而加上6A和19A以形成13价疫苗的方案更利于婴儿或幼儿使用(此时更关注的是中耳炎)。
在预防/改善高龄人群(+55岁)的肺炎和婴儿(18个月以前)与幼儿(通常为18个月-5岁)的中耳炎时，本发明的优选实施方案是将文中所述的多价肺炎链球菌多糖与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫学功能等价物相结合。
本发明的肺炎球菌蛋白
对本发明而言，“免疫学功能等价物”的定义是一种蛋白的肽，该蛋白至少含有一种来源于本发明所述蛋白的保护性表位。这些表位的特性是暴露在表面，高度保守，并且能够在宿主内引发杀菌性抗体应答或能够避免毒性作用。优选而言，该功能等价物至少具有15个来源于本发明所述蛋白的连续氨基酸，优选的则至少为30个或更多。最优选的是使用该蛋白的片段、诸如跨膜区缺失变异体(即使用蛋白的细胞外区域)等缺失体、融合体、经化学或遗传方法去毒的衍生物等，前提是它们能够引起与天然蛋白基本相同的免疫应答。
本发明的优选蛋白是那些暴露在肺炎球菌外表面(至少在肺炎球菌生活周期的部分时间里能够被宿主的免疫系统识别)的肺炎球菌蛋白，或由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。最优选的蛋白则是肺炎链球菌的毒素、粘附素、双组分信号转导蛋白或脂蛋白，或其免疫学功能等价物。
可包含在所述组合疫苗中的特别优选的蛋白包括，但不局限于：肺炎球菌溶血素(pneumolysin)(优选的是通过化学处理或突变进行去毒)〔Mitchell et al.Nucleic Acids Res.1990 Jul 11；18(13)：4010“来源于1型和2型肺炎链球菌的肺炎球菌溶血素基因及蛋白的比较”，Mitchell et al.Biochim Biophys Acta 1989 Jan23；1007(1)：67-72“大肠杆菌中的肺炎球菌溶血素基因表达：快速纯化及生物学特性”，WO 96/05859(A.Cyanamid)，WO 90/06951(Paton et al)，WO 99/03884(NAVA)〕；PspA及其跨膜区缺失突变体(US 5804193-Briles et al.)；PspC及其跨膜区缺失突变体(WO 97/09994-Briles et al.)；PsaA及其跨膜区缺失突变体(Berry & Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)：5255-62“PsaA，对肺炎链球菌的毒力至关重要的一种37kD假定粘附素，的序列异质性”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜区缺失突变体；CbpA及其跨膜区缺失突变体(WO 97/41151；WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(Infect.Immun.1996 64：3544)；HSP70(WO96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMS Microbiol Lett 1998，164：207-14)；M样蛋白，SB专利申请号EP0837130；以及粘附素18627，SB专利申请号EP0834568。
优选而言，本发明使用的蛋白选自肺炎球菌溶血素、PsaA、PspA、PspC、CbpA或这些蛋白中的两种或多种的组合。本发明还包括这些蛋白(如上文所定)的免疫学功能等价物。
组合物内的该蛋白可协助诱导抗肺炎球菌疾病的T细胞介导的应答——这是防护肺炎所特别需要的——这种应答与体液免疫系统相配合可抑制肺炎球菌的侵袭，并且可刺激调理素吞噬作用。
包含有这种蛋白抗原的另一优势在于可向调理素吞噬过程递送更多的抗原，并且可抑制细菌粘附素(若使用粘附素)或使毒素中和(若使用毒素)。
本发明在一项实施方案中提供一种肺炎链球菌疫苗，该肺炎链球菌疫苗含有一种肺炎球菌多糖结合物疫苗，该肺炎球菌多糖结合物疫苗含有来源于至少4种血清型的多糖抗原，优选的为至少7种，更优选的为至少11种，并含有至少一种肺炎链球菌蛋白，而优选的为两种。优选而言，其中有一种蛋白为肺炎球菌溶血素或PsaA或PspA或CbpA(最优选的为去毒的肺炎球菌溶血素)。优选的组合为至少含有肺炎球菌溶血素或其衍生物，以及PspA。
如上文所述，用多糖进行接种的方法存在一个问题，即多糖本身为弱免疫原。为了克服这一点，可将多糖与能够协助旁T细胞(bystander T-cell help)的蛋白载体相连接。因此，优选的是将本发明使用的多糖与这样一种蛋白载体相连接。目前常用来产生多糖免疫原的此类载体包括，例如，白喉类和破伤风类毒素(分别为DT、DTCRM197和TT)、钥孔血兰素(KLH)、来自脑膜炎奈瑟菌的OMPC以及结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)
但这些常用载体各自都存在许多问题(见上文“常用载体的问题”一节)。
本发明在一项优选实施方案中提供一种新载体，用于制备不具有这些缺点的基于多糖的免疫原构建体。用于以肺炎球菌多糖为基础的免疫原组合物(或疫苗)的优选载体为流感嗜血菌蛋白D或其片段(EP594610-B)。适于使用的片段包括含有辅助T细胞表位的片段。特别地，蛋白D的片段优选地应含有该蛋白N端1/3的部分。
用于肺炎球菌多糖的另一优选载体为肺炎球菌蛋白本身(如上文“本发明的肺炎球菌蛋白”一节所定)。
本发明的疫苗优选地应被佐剂化。适当的佐剂包括一种铝盐，如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝，但也可以是一种钙盐、铁盐或锌盐，或是酰化酪氨酸，或酰化糖的不溶悬浮物、多糖的阳离子或阴离子衍生物、或聚磷腈。
优选而言，所选佐剂应该是TH1型应答的一种优选诱导剂，以协助细胞介导的免疫应答。
本发明的TH1佐剂
高水平的Th1型细胞因子利于诱导出对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子利于诱导出对抗原的体液免疫应答。
重要的是应记住，Th1型与Th2型免疫应答的差异并不是绝对的。实际上我们把个体所维持的免疫应答描述成Th1占优势或Th2占优势。但通常可依据Mosmann和Coffman对鼠CD4+ve T细胞克隆的描述来方便地对细胞因子家族进行研究(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1与TH2细胞：不同的淋巴因子分泌方式导致不同的功能特性。Annual Review of Immunology，7，p145-173)。通常Th1型应答与T淋巴细胞产生的INF-γ和IL-2有关。常与诱导Th1型免疫应答直接相关的其它细胞因子，如IL-12，则不由T细胞产生。相比之下，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。可促进Th1占优势的应答的适当佐剂包括单磷酰脂A或其衍生物，特别是3-脱-O-酰基单磷酰脂A，以及单磷酰脂A，优选的是3-脱-O-酰基单磷酰脂A(3D-MPL)与一种铝盐的组合物。
一种改进系统涉及单磷酰脂A与一种皂甙衍生物的组合，特别是WO 94/00153中公开的QS21与3D-MPL的组合，或是按WO 96/33739的公开方法用胆固醇将QS21淬灭从而反应原性较弱的一种组合物。
WO 95/17210描述了一种特别有效的佐剂配方，该配方涉及将QS21、3D-MPL和生育酚加到一种水包油型乳剂中，该配方是优选的配方。
优选而言，疫苗中可另含有一种皂甙，更优选的则为QS21。该配方还可包含一种水包油型乳剂和生育酚(WO 95/17210)。
本发明还提供一种方法，用于产生一种疫苗制剂，该方法包括将本发明的一种蛋白与一种药学容许的赋形剂，如3D-MPL，相混合。
含有寡核苷酸的非甲基化CpG(WO 96/02555)也是适用于本发明的优选TH1应答诱导剂。
本发明的特别优选组合物含有一种或多种结合的肺炎球菌多糖、一种或多种肺炎球菌蛋白和一种Th1佐剂。使用该Th1佐剂有助于通过肺炎球菌蛋白(如上文所述)来诱导细胞介导的应答，并有助于两种免疫系统之间的协同，从而可获得一种特别有效的疫苗，来对抗一般人的肺炎球菌性疾病，更重要的是可对抗高龄人的肺炎球菌性肺炎。
另一方面，本发明提供如文中所述的一种免疫原或疫苗，用来在医学中使用。
再一方面，本发明提供一种含有肺炎球菌多糖结合物和Th1佐剂(优选的为3D-MPL)的组合物，该组合物可在无应答群体中引发血清转化或诱导出抗多糖抗原的体液抗体应答。
已知有10-30％的人对多糖免疫法不产生应答(对疫苗中50％以上的血清型不产生应答)(Konradsen et al.，Scand.J.Immun 40：251(1994)；Rodriguez et al.，JID，173：1347(1996))。使用结合物疫苗也是如此(Musher et al.Clin.Inf.Dis.27：1487(1998))。对高危人群(婴儿、幼儿和高龄人)则特别严重。
本发明人惊奇地发现，将结合的肺炎球菌多糖(易于在特定群体中产生低应答)与一种Th1佐剂(见上文“本发明的Th1佐剂”)结合使用可克服这种无应答性。优选的是使用3D-MPL，最优选的是使用不含铝型佐剂的3D-MPL(这样可获得更好的应答)。因此，本发明提供这些组合物，并进一步提供一种方法，用于治疗对肺炎球菌多糖不产生应答的个体，方法是将这些组合物给药，同时还提供Th1佐剂在含有结合的肺炎球菌多糖抗原的药物生产中的应用，以及在针对(或防护)多糖抗原无应答性个体的肺炎球菌性疾病的治疗中的应用。
本发明在一项实施方案中提供一种方法，用来预防或改善高龄人的肺炎，该方法包括将安全并且有效剂量的文中所述疫苗向所述高龄患者给药，该疫苗含有一种肺炎链球菌多糖抗原，并含有一种Th1佐剂或一种肺炎球菌蛋白(优选的是两者都包含)。
本发明在另一项实施方案中提供一种方法，用来预防或改善婴儿或幼儿的中耳炎，该方法包括将安全并且有效剂量的一种疫苗向所述婴儿或幼儿给药，该疫苗含有一种肺炎链球菌多糖抗原，并含有一种肺炎链球菌蛋白抗原或一种Th1佐剂(优选的是两者都包含)。
在本发明的上述方法中，优选的是以多糖蛋白结合物形式提供所述多糖抗原。
本发明的疫苗制剂
本发明的疫苗制剂可用来保护或治疗易感染哺乳动物，方法是将所述疫苗经全身或粘膜途径给药。这些给药方法包括肌内注射、腹腔内注射、皮内注射或静脉内注射；或经粘膜向口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道给药。用于治疗肺炎或中耳炎的优选方法是将疫苗进行鼻内给药(因为可更有效地预防肺炎球菌经鼻咽运输，从而在其最早阶段使感染减弱)。
每剂疫苗中的结合抗原量可选择在典型疫苗中能够引发免疫保护性应答但不造成明显副作用的量。其数值将根据所用特定免疫原及其呈递方法的不同而有所不同。一般认为每剂应含有0.1-100μg多糖，优选的为0.1-50μg，更优选的为0.1-10μg，最优选的为1-5μg。
疫苗中的蛋白抗原含量通常为1-100μg，优选的为5-50μg，最优选的通常为5-25μg。
特定疫苗的最佳组分含量可通过标准研究方法来加以确定，该方法涉及对主体的适当免疫应答进行观测。在初次接种后，主体可接受一次或数次间隔时间适当的促升免疫。
在《疫苗设计》中对疫苗的制备方法进行了综合论述(“亚基及佐剂方法”(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum PressNew York)。Fullerton的美国专利4,235,877则描述了封装在脂质体中的方法。
B)选定的肺炎球菌多糖结合物+3D-MPL组合物
对本发明而言，术语“本发明的肺炎球菌多糖结合物”是指那些在只含有3D-MPL的组合物中的免疫原性高于在同时含有3D-MPL和一种铝型佐剂的组合物中的免疫原性的肺炎链球菌荚膜多糖结合物(如血清型4的结合物、血清型6B的结合物、血清型18C的结合物、血清型19F的结合物或血清型23F的结合物)。
对本发明而言，术语“基本不含铝型佐剂”是指组合物中不含有足以使本发明的肺炎球菌多糖结合物在免疫原性方面低于只含有3D-MPL而不加铝型佐剂的相同组合物的铝型佐剂(如氢氧化铝，特别是磷酸铝)。优选的抗原组合物所包含的佐剂应基本上为3D-MPL。优选而言，每剂量中添加的铝型佐剂的量应少于50μg，更优选的是少于30μg，更加优选的是少于10μg，而最优选的是本发明的抗原组合物中不添加任何铝型佐剂。
对本发明而言，应按实施例2所述来确定是否肺炎球菌多糖结合物在只含有3D-MPL的组合物中的免疫原性明显高于在同时含有3D-MPL和一种铝型佐剂的组合物中的免疫原性。作为只含有3D-MPL的组合物的免疫原性是否明显更高的指征，只含有3D-MPL的组合物与同时含有3D-MPL和一种铝型佐剂的组合物的GMC IgG浓度比应大于2，优选的为大于5，更优选的为大于7，更加优选的为大于9，而最优选的是大于14。
在与多糖接种方法有关的问题中，有一个问题是多糖本身为弱免疫原。用来克服这种免疫原性缺陷的策略包括，将多糖与能够协助旁T细胞的大蛋白载体相连接(结合)。优选的是将本发明的肺炎球菌多糖与一种可协助旁T细胞的蛋白载体相连接。可使用的此类载体包括，例如，白喉毒素、白喉毒素突变体及破伤风类毒素(分别为DT、CRM197和TT)、钥孔血兰素(KLH)、结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)以及脑膜炎奈瑟菌的OMPC。
最优选的是将流感嗜血菌的蛋白D(EP 0594610-B)或其片段(见C小节)作为该免疫原性蛋白载体用于本发明的肺炎球菌多糖。
在一项实施方案中，本发明的抗原组合物含有与一种免疫原性蛋白相结合的肺炎球菌多糖血清型(PS)4，并且用3D-MPL佐剂配制，其中该组合物基本不含铝型佐剂。其它实施方案中的抗原组合物则分别含有与一种免疫原性蛋白相结合的PS 6B、18C、19F或23F，并且用3D-MPL佐剂配制，其中该组合物基本不含铝型佐剂。
本发明在另一项实施方案中提供一种组合型抗原组合物，该组合物含有两种或多种肺炎球菌多糖结合物，并且用3D-MPL佐剂配制，这些结合物选自PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F，其中该组合物基本不含铝型佐剂。
加入其它肺炎球菌多糖结合物不会明显影响本发明所述肺炎球菌多糖结合物的免疫原性(实施例3)。因此，作为优选方式，本发明提供一种组合型抗原组合物，该组合物同时含有一种或多种本发明的肺炎球菌多糖结合物和一种或多种其它肺炎球菌多糖结合物，其中该组合物用3D-MPL佐剂配制，并且基本不含铝型佐剂。
本发明在另一优选实施方案中提供组合型抗原组合物，这些组合物至少含有PS 4、6B、18C、19F或23F肺炎球菌多糖结合物中的一种，优选的则含有其中的2种、3种、4种或所有5种，此外还含有任意组合的其它肺炎球菌多糖结合物，这些组合物均用3D-MPL佐剂配制，但基本不含铝型佐剂。
本发明的组合型肺炎链球菌抗原组合物通常都含有多糖结合物抗原，其中的多糖至少来源于4种、7种、11种、13种、15种或23种血清型(见上文“本发明的肺炎链球菌多糖抗原”，其优选的血清型组合方式取决于要治疗的疾病)。
优选地，可将本发明的抗原组合物作为疫苗组合物用于肺炎球菌性感染的预防(或治疗)，特别是用于高龄人以及婴儿和幼儿。
本发明的其它实施方案包括：提供上述抗原组合物用于医学领域；一种方法，用来诱导对肺炎链球菌荚膜多糖结合物的免疫应答，该方法包括将安全并且有效剂量的上述抗原组合物之一向患者给药的步骤；以及上述抗原组合物之一在用于预防(或治疗)肺炎球菌性疾病的药物生产中的应用。
在预防/改善高龄人群(+55岁)的肺炎和婴儿(18个月以前)与幼儿(通常为18个月-5岁)的中耳炎时，本发明的另一优选实施方案是将按文中所述方法制备的多价肺炎链球菌多糖结合物与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫学功能等价物相结合。优选的蛋白/蛋白组合可参考上文“本发明的肺炎球菌蛋白”一节。
若不立即使用，优选的是将上文所述抗原组合物(和疫苗)冻干，并可在使用前以稀释剂将其即时重构。更优选的是在3D-MPL存在的情况下将其冻干，并用盐溶液即时重构。
将组合物冻干可使其更加稳定(例如可避免多糖抗原分解)。令人惊奇的是，该方法还可以使抗体对肺炎球菌多糖的效价更高。对PS6B结合物而言，这种现象特别明显。因此，本发明的另一形式是一种冻干的抗原组合物，该组合物含有PS 6B结合物，并用3D-MPL佐剂配制且基本不含铝型佐剂。
疫苗的制备可参考上文“本发明的疫苗制剂”一节。
C)细菌多糖-蛋白D结合物
倾向于使用组合疫苗的优势有，减少对赋形剂的不适、便于安排进度，以及确保严格管理的完成；但也会伴随有疫苗效率降低的危险(见上文有关过度使用载体蛋白导致表位抑制的论述)。因此，有益的是应该制定能够满足某个群体的需要并且其组分间不表现出免疫原性干扰的疫苗组合方式。这些优势可通过本发明的免疫原性组合物(或疫苗)来实现，它们特别有利于将组合型疫苗向婴儿、幼儿或高龄人等高危人群给药。
本发明提供一种流感嗜血菌蛋白D或其片段，以作为载体用于以多糖为基础的免疫原性组合物，其中包括疫苗。适于使用的片段包括含有辅助T细胞表位的片段。特别地，蛋白D的片段优选地应含有该蛋白N端1/3的部分。
蛋白D是来源于流感嗜血菌的一种IgD结合蛋白(EP 0594610B1)，它是一种潜在的免疫原。
本发明考虑的与蛋白D结合的多糖包括，但不局限于，抗伤寒沙门菌的Vi多糖抗原、脑膜炎球菌多糖(包括A型、C型、W135型和Y型，以及B类脑膜炎球菌多糖和修饰多糖)、来自金黄色葡萄球菌的多糖、来自无乳链球菌的多糖、来自肺炎链球菌的多糖、来自诸如结核分支杆菌等分支杆菌的多糖(如甘露糖磷酸肌醇海藻糖、分支菌酸、带甘露糖帽的阿拉伯甘露聚糖、其荚膜以及阿拉伯半乳聚糖)、来自新生隐球菌的多糖、未分类流感嗜血菌的脂多糖、来自流感嗜血菌b的荚膜多糖、粘膜炎莫拉菌的脂多糖、宋内志贺菌的脂多糖、克氏锥虫的脂肽磷酸聚糖(LPPG)、与癌症相关的神经节苷脂GD3、GD2、与肿瘤相关的粘蛋白，特别是T-F抗原和唾液酸T-F抗原，以及结构上与T-F抗原有关的HIV相关多糖。
多糖与载体蛋白的连接可采用任何已知的方法(如Likhite的美国专利4,372,945以及Armor等人的美国专利4,474,757的方法)。优选的是采用CDAP结合法(WO 95/08348)。
在CDAP方法中，优选的是使用氰化剂1-氰基-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)来合成多糖-蛋白结合物。这种氰化剂可在相对温和的条件下发挥作用，从而可避免碱敏感性多糖的水解。该合成方法可用于与载体蛋白的直接结合。
将多糖增溶于水或盐溶液。将CDAP溶于乙腈，并立即加到多糖溶液中。CDAP能够与多糖的羟基反应，从而形成一种氰基酯。在该活化步骤之后加入载体蛋白。赖氨酸的氨基能够与活化的多糖反应，从而形成一种异脲共价连接。
在该结合反应之后，再加入大大过量的甘氨酸以淬灭剩余的活化官能团。然后将产物进行凝胶渗透层析以去除未反应的载体蛋白及残留试剂。因此，本发明提供一种方法，用来产生多糖蛋白D结合物，该方法包括将多糖活化并将多糖与蛋白D连接的步骤。
本发明在一项优选实施方案中提供一种免疫原性组合物(或疫苗)制剂，用来预防肺炎链球菌感染。
肺炎球菌向肺、脑脊液和血液扩散的机制还不是很清楚。细菌生长向正常肺泡的延伸可被其相对干燥的环境以及肺泡巨噬细胞的吞噬活性所抑制。这些相互协调的防御若出现任何组织上或生理上的变化，都会导致肺对感染的易感性增加。肺炎链球菌的细胞壁在肺泡炎性反应的产生过程中具有重要作用(Gillespie et al.(1997)I&I65：3936)。
本发明的肺炎链球菌疫苗一般都含有蛋白D多糖结合物，其中的多糖至少来源于4种、7种、11种、13种、15种或23种血清型。优选的血清型组合可参考上文“本发明的肺炎链球菌多糖抗原”，这些组合方式取决于要治疗的疾病。
本发明在另一实施方案中提供一种脑膜炎奈瑟菌疫苗；特别是来源于血清型A、B、C、W-135和Y的疫苗。脑膜炎奈瑟菌是细菌性脑膜炎的最重要病因之一。这些细菌的糖类荚膜可作为其毒力的决定因素，并且可充当保护性抗体的作用对象。但众所周知的是，糖类在幼龄儿童体内是一种弱免疫原。本发明提供一种特别适用于这些多糖的蛋白载体，蛋白D，它可提供能够激活T细胞应答的T细胞表位，从而有助于多糖抗原特异性B细胞的增殖和成熟，并有助于诱导免疫记忆。
本发明在一项可选实施方案中提供一种流感嗜血菌b荚膜多糖(PRP)一蛋白D结合物。
本发明还考虑了能够防护一系列不同病原体的组合型疫苗。令人惊奇的是，蛋白D载体可以作为结合有多种多糖抗原的组合型疫苗的有效载体。如上所述，若各种多糖都使用相同的载体，则可能引发表位抑制。WO 98/51339提供了一些组合物，试图将这种干扰减至最小，方法是将组合物中一定比例的多糖结合在DT上，其余的则结合在TT上。
本发明人惊奇地发现，蛋白D特别适于在组合型疫苗中将此类表位抑制效应减至最小。将组合物中的一种或多种多糖结合在蛋白D上是有益的，优选的则是将此类组合型疫苗中的所有抗原均结合在蛋白D上。
优选的组合物包括可防护脑膜炎奈瑟菌C和Y(优选的则还有A)感染的一种疫苗，其中来源于血清型Y和C(最优选的则还有A)之一种或多种的多糖抗原均连接于蛋白D。
基于流感嗜血菌多糖的疫苗(优选的是与TT、DT或CRM197结合的PRP，或最优选的是与蛋白D结合的PRP)可用上述组合型疫苗来配制。
目前，有许多小儿用疫苗是以组合型疫苗形式提供的，这样可减少儿童必须接受的注射次数。因此，当作为小儿用疫苗时，可用本发明的疫苗来配制其它抗原。举例来说，可使用众所周知的含有白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)以及百日咳组分〔通常为去毒的百日咳类毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)以及可选的pertaction(PRN)和/或凝集素1+2〕的“三价”组合疫苗，如含有DT、TT、PT、FHA和PRN抗原的商品化疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeechamBiologicals)，或全细胞百日咳组分，如SmithKlineBeechamBiologicals s.a.的商品化TritanrixTM，来配制本发明的疫苗，或是同时独立给药。组合的疫苗还可含有其它抗原，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰质炎病毒抗原(如灭活的三价脊髓灰质炎病毒——IPV)、粘膜炎莫拉菌外膜蛋白、未分类流感嗜血菌蛋白、脑膜炎奈瑟菌B外膜蛋白。
可包含在组合型疫苗(特别是用来预防中耳炎的)中的粘膜炎莫拉菌蛋白抗原的实例有：OMP106〔WO 97/41731(Antex)& WO 96/34960(PMC)〕；OMP21；LbpA & LbpB〔WO 98/55606(PMC)〕；TbpA &TbpB〔WO 97/13785 & WO 97/32980(PMC)〕；CopB〔Helminen ME，et al.(1993)Infect.Immun.61：2003-2010〕；UspA1/2〔WO 93/03761(University of Texas)〕；和OmpCD。可包含在组合型疫苗(特别是用来预防中耳炎的)中的未分类流感嗜血菌抗原的实例有：丝束蛋白〔(US 5766608-Ohio State Research Foundation)〕及含有来自丝束蛋白肽的融合体〔如LB1(f)肽融合体；US 5843464(OSU)或WO 99/64067〕；OMP26〔WO 97/01638(Cortecs)〕；P6〔EP 281673(State University of New York)〕；TbpA和TbpB；Hia；Hmw1，2；Hap；以及D15。
本发明考虑的优选小儿用疫苗有：
a)脑膜炎奈瑟菌C多糖结合物和流感嗜血菌b多糖结合物，以及可选的脑膜炎奈瑟菌A和/或Y多糖结合物，条件是至少有一种多糖抗原，优选的是所有多糖抗原，与蛋白D相结合。
b)含有DT、TT、百日咳组分(优选的含有PT、FHA和PRN)、乙型肝炎表面抗原以及IPV(灭活的三价脊髓灰质炎病毒疫苗)的疫苗a)。
c)与蛋白D结合的肺炎链球菌多糖抗原。
d)含有来源于粘膜炎莫拉菌和/或未分类流感嗜血菌的一种或多种抗原的疫苗c)。
加入蛋白D作为载体对以上所有组合型疫苗均有利。很明显，组合型疫苗中包含的载体种类越多(例如为了克服表位抑制)，最终疫苗就越昂贵并且越复杂。因此，将组合型疫苗的所有或大多数多糖抗原结合在蛋白D上可带来相当大的利益。
在预防高龄人群(+55岁)的肺炎和婴儿或幼儿的中耳炎时，本发明的优选实施方案是将文中所述的多价肺炎链球菌多糖-蛋白D抗原与一种肺炎链球菌蛋白或其免疫学功能等价物相结合。关于这种组合物可包含的优选蛋白/蛋白组合物，可参考上文“本发明的肺炎球菌蛋白”一节。
因此，本发明提供一种免疫原性组合物，该组合物含有一种肺炎链球菌多糖-蛋白D结合物以及一种肺炎链球菌蛋白抗原。
优选的是在本发明的疫苗制剂中将本发明的多糖-蛋白D结合物抗原佐剂化。适当的佐剂包括铝盐，如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或是酰化酪氨酸的不溶悬浮物，或酰化糖、多糖的阳离子或阴离子衍生物，或聚磷腈。
对用于高龄人的疫苗而言，优选的是所选佐剂可作为TH1型应答的优选诱导剂。
关于特定的Th1佐剂可参考上文“本发明的Th1佐剂”。
另一方面，本发明提供如文中所述的一种免疫原或疫苗，用来在医学中使用。
关于结合物疫苗的制备/给药方法，可参考上文“本发明的疫苗制剂”。
在抗中耳炎的疫苗中使用蛋白D也同样有利，因为蛋白D本身是一种免疫原，可产生B细胞介导的抗未分类流感嗜血菌(ntHi)防护作用。ntHi可侵入宿主细胞，并躲避由蛋白抗原诱导的B细胞介导的效应。本发明人惊奇地发现，有一种方法可提高蛋白D作为抗原(无论是单独使用还是作为多糖的载体)用于中耳炎疫苗的有效性。方法是将蛋白D佐剂化，使其能够在受试者体内诱导一种强Th1应答，这样就可以优化针对蛋白D的细胞介导的免疫系统。令人惊奇的是，使用含有蛋白D和一种Th1佐剂(优选的为3D-MPL)的冻干组合物即可实现这一点，该组合物可在给药前即时重构。因此，本发明还提供此类组合物、一种制备此类组合物的方法(方法是将含有蛋白D和一种Th1佐剂的混合物冻干)以及该组合物在中耳炎种类中的应用。
从更广泛的意义上来看，本发明人认为，在Th1佐剂(见“本发明的Th1佐剂”)，优选的为3D-MPL，存在的情况下将免疫原冻干通常都会提高对该免疫原的Th1免疫应答。因此，本发明适用于任何需要针对其产生强Th1免疫应答的免疫原。这些免疫原包括细菌性、病毒性和肿瘤性蛋白抗原，也包括这些蛋白本身及其肽。
实施例
这些实施例可对本发明进行说明，但并不限制本发明。
实施例1
肺炎链球菌荚膜多糖：
候选的11价疫苗含有血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F荚膜多糖，其制备基本如EP 72513所述。利用CDAP化学物(WO 95/08348)将每种多糖活化和派生，并与蛋白载体相结合。除血清型3(减小尺寸以降低其粘度)之外，所有多糖都以其天然形式结合。
蛋白载体：
所选蛋白载体为来源于未分类流感嗜血菌但在大肠杆菌中表达的重组蛋白D。
蛋白D的表达
流感嗜血菌
用于蛋白D表达的基因构建
原材料
蛋白D编码DNA
蛋白D在所有血清型以及未分类的流感嗜血菌中都高度保守。含有整个蛋白D基因编码DNA序列的载体pHIC348由A.Forsgren博士，Department of Medical Microbiology，University of Lund，Malm General Hospital，Malm，Sweden提供。蛋白D的DNA序列由Janson et al.(1991)Infect.Immun.59：119-125发表。
表达载体pMG1
表达载体pMG1派生于pBR322(Gross et al.，1985)，其中引入了衍生于噬菌体λ的调控因子，该调控因子用于调控插入的外源基因的转录和翻译(Shatzman et al.，1983)。此外，氨苄青霉素抗性基因被替换成了卡那霉素抗性基因。
大肠杆菌菌株AR58
用预先在SA500派生菌(galE::TN10，LambdaKil cI857 ΔH1)中生长的P1噬菌体原种转导N99即获得大肠杆菌菌株AR58。N99和SA500属于大肠杆菌K12菌株，由National Institute of Health的Martin Rosenberg博士的实验室提供。
表达载体pMG1
产生蛋白D时，将编码该蛋白的DNA克隆到表达载体pMG1中。该质粒使用λ噬菌体DNA的信号来推动外源插入基因的转录和翻译。该载体含有启动子PL、操纵子OL和2种可用位点(NutL和NutR)，从而当N蛋白存在时可缓解转录极性效应(Gross et al.，1985)。将含有PL启动子的载体引入一种大肠杆菌溶原性宿主，以保持质粒DNA的稳定。溶原性宿主菌株含有整合到基因组中的复制缺陷型λ噬菌体DNA(Shatzman et al.，1983)。染色体中的λ噬菌体DNA可指导cI阻抑物蛋白的合成，该蛋白能够与载体的OL阻抑物结合，从而避免插入基因通过RNA聚合酶与PL启动子结合而转录。表达菌株AR58的cI基因含有一种温度敏感性突变，因而可通过温度变化来调控PL指导的转录，即提高培养温度可使阻抑物失活，从而开始合成外源蛋白。该表达系统可实现外源蛋白，特别是对细胞有毒性的外源蛋白，的受控合成(Shimataka & Rosenberg)。
大肠杆菌菌株AR58
用来产生蛋白D载体的AR58溶原性大肠杆菌菌株派生于标准的NIH大肠杆菌K12菌株N99(F-su-galK2，lacZ-thr-)。它含有缺陷型溶原性λ噬菌体(gal E::TN10，LambdaKil- cI857 ΔH1)。Kil表型可防止宿主停止合成大分子。cI857突变可使cI阻抑物具有一种对温度敏感的损伤。ΔH1缺失可去除λ噬菌体的右侧操纵子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因位点。用预先在SA500派生菌(galE::TN10，LambdaKil-cI857 ΔH1)中生长的P1噬菌体原种转导N99即获得大肠杆菌菌株AR58。由于galE基因附近存在编码四环素抗性的TN10转座子，因而可利用四环素对缺陷型溶菌原向N99的转导情况进行筛选。
载体pMGMDPPrD的构建
pMGMDPPrD的构建使用的是含有流感病毒S1非结构蛋白编码基因的pMG1载体(pMGNSI)。利用在5’和3’端分别含有NcoI与XbaI限制位点的PCR引物经PCR由pHIC348载体(Janson et al.1991)扩增出蛋白D基因。然后将NcoI/XbaI片段引入到pMGNSI的NcoI与XbaI之间，这样就创建了一种在PD蛋白前含有NS1蛋白N端81个氨基酸的融合蛋白。该载体记为pMGNS1PrD。
在上述构建体的基础上产生用于蛋白D表达的最终构建体。从pMGNS1PrD中去除BamHI/BamHI片段。该DNA水解反应可去除NS 1编码区而只保留其N端的前3个残基。将载体重新连接，即产生了一种可编码具有以下N端氨基酸序列的融合蛋白的基因：
-----MDP SSHSSNMANT-----
NS1              蛋白D
蛋白D不含有导肽或通常连接有脂链的N端半胱氨酸。因此，该蛋白不会被分泌到周质中，也不会被脂化，而是以可溶形式保留在细胞质中。
通过37℃热休克将最终构建体pMG-MDPPrD引入到AR58宿主菌中。在卡那霉素存在的情况下筛选含有质粒的细菌。用选定的核酸内切酶消化分离的质粒DNA，因此来证明蛋白D编码DNA插入序列的存在。重组的大肠杆菌菌株称为ECD4。
在λPL启动子/OL操纵子的调控下表达蛋白D。宿主菌AR58的基因组中含有温度敏感性cI基因，它在低温下可通过与OL结合来阻碍由λPL起始的表达。一旦温度提高，OL即释放cI，从而使蛋白D能够表达。当发酵结束后，可将细胞浓缩并冷冻。
如下所述由收集的细胞抽提并纯化蛋白D。将冷冻的细胞培养物沉淀融解，并重悬于细胞裂解液(柠檬酸缓冲液pH6.0)，使最终OD650＝60。使该悬浮液两次流经P＝1000bar的高压匀浆仪。通过离心澄清细胞培养物匀浆，并过滤去除细胞碎片。第一次纯化步骤是将过滤的溶菌产物上样于阳离子交换层析柱(SP Sepharose Fast Flow)。PD可通过离子交换与凝胶基质结合，并可通过增加洗脱缓冲液的离子强度而将其洗脱。
第二次纯化步骤可使杂质保留在阴离子交换基质上(Q SepharoseFast Flow)。PD不与该凝胶结合，从而可收集在流出物中。
两次柱层析步骤均利用OD来监测分部收集物。将阴离子交换层析柱的流出物超滤浓缩，其中含有纯化的蛋白D。
最后，使含有蛋白D的超滤滞留物流经0.2μm滤膜。
化学反应：
活化及偶联化学反应：
每种多糖有特定的活化及偶联条件。这些条件列于表1。将天然多糖(PS3除外)溶于2M NaCl或水以用于注射。评定所有血清型的最佳多糖浓度。
将溶于乙腈的100mg/ml CDAP储液加到多糖溶液中(CDAP/PS比率为0.75mg/mg PS)。1.5分钟后加入0.2M三乙胺以获得特定的活化pH值。在该pH及25℃条件下将多糖活化2分钟。将蛋白D(数量取决于最初的PS/PD比率)加到活化的多糖中，并使偶联反应在特定pH下持续1小时。然后在25℃下用甘氨酸将反应淬灭30分钟，再4℃过夜。
通过凝胶过滤将结合物纯化，过滤使用的是0.2M NaCl平衡的Sephacryl 500HR凝胶过滤柱。
测定洗脱组分的糖类及蛋白含量。将结合物合并，再用0.22μm除菌膜过滤除菌。测定该结合物制剂的PS/蛋白比率。
性质鉴定：
鉴定各结合物的性质，其结果符合表2所述的详细说明。多糖含量(μg/ml)的测定采用间苯二酚测定法，蛋白含量(μg/ml)的测定采用Lowry测定法。由浓度的比值确定最终的PS/PD比率(w/w)。残留DMAP含量(ng/μg PS)：
用CDAP活化多糖可将氰基引入多糖，并且释放出DMAP(4-二甲氨基-吡啶)。利用SB开发的特定测试法确定残留的DMAP含量。游离多糖含量(％)：
将4℃保存或37℃储存7天的结合物与α-PD抗体保温，再用硫酸铵饱和，然后离心，最后测量上清液中的游离多糖含量。
利用α-PS/α-PS ELISA方法测定上清液中游离多糖的含量。另外还利用α-PD/α-PS ELISA方法测量结合物空白对照。降低游离多糖的量可获得改进的结合物疫苗。
抗原性：
利用夹心式ELISA方法分析上述结合物的抗原性，其中捕获抗体和检测抗体分别为α-PS和α-PD。
游离蛋白含量(％)：
通过用SDS处理样品的方法测定“游离的”残留蛋白D的水平。在100℃及存在0.1％SDS的条件下将结合物加热10分钟，然后上样于SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK 3000-PWXL)。由于蛋白D为二聚体，所以用SDS将该结构解离的方法可能会使“游离”蛋白D的水平被过高估计。
分子大小(Kav)：
在SEC-HPLC凝胶过滤柱(TSK 5000-PWXL)上测定分子大小。
稳定性：
在HPLC-SEC凝胶过滤柱(TSK 6000-PWXL)上测量4℃保存或37℃储存7天的结合物的稳定性。
表2给出11价疫苗的特性。
可将蛋白结合物吸附在磷酸铝上，然后合并，成为最终的疫苗。
结论：
由此即产生了免疫原性结合物，后来发现，该结合物可作为一种颇有前途的疫苗的成分。针对每种11价疫苗都找到了获得高品质的最终肺炎球菌多糖结合物的优化CDAP条件。因此，由上述改进(优化)的CDAP方法获得的这些肺炎球菌多糖结合物(与所用载体蛋白无关，但优选的为蛋白D)可作为本发明的另一方面。
实施例2-改进的佐剂对11价肺炎球菌PS-PD结合物疫苗在未成年大鼠中的免疫原性影响的研究
用11价肺炎球菌PS-PD结合物疫苗免疫未成年大鼠，剂量为每种多糖(按实施例1的方法制备)0.1μg，并且使用以下佐剂配方：无佐剂、AlPO4、3D-MPL、吸附在AlPO4上的3D-MPL。
在11种抗原中，只含有3D-MPL的剂型比其它剂型在统计学上更具免疫原性(最高的GMC IgG)的有5种。使用高浓度和低浓度3D-MPL时均是如此。
调理素吞噬作用也支持该GMC结果。
材料与方法
免疫方案
将不同母鼠随机繁殖的7天龄未成年OFA大鼠进行首次免疫。并在14和28天后再进行2次免疫。第56天(III级免疫后第28天)时取血。所有疫苗均为皮下注射，每组疫苗免疫10只大鼠。
用含有结合在蛋白D上的下列血清型多糖的11价肺炎球菌结合物疫苗免疫大鼠：1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F。
配制方法
为检测不同改进佐剂的效果，将每种多糖结合物的剂量保持在0.1μg不变，并用AlPO4和3D-MPL佐剂以不同剂量和组合形式进行配制，其中包括不加任何佐剂。其结果以数值形式列于表3，以供参考。
吸附在AlPO4上
被吸附的浓缩单价疫苗的制备方法如下。将50μg AlPO4(pH5.1)与5μg结合物多糖混合。2小时后将其pH调至pH5.1，然后再放置16小时。添加1500mM NaCl，使盐浓度最终为150mM。5分钟后，添加5mg/ml的2-苯氧乙醇。放置30分钟，再将pH调至6.1，然后于4℃放置3天以上。
稀释剂的制备
在NaCl 150mM/5mg/ml苯氧乙醇中制备3种稀释剂
A：1mg/ml AlPO4
B：浓度分别为250和1000μg/ml的吸附在AlPO4上的3D-MPL，3D-MPL/AlPO4的重量比＝5/20。
C：浓度分别为561和1000μg/ml的吸附在AlPO4上的3D-MPL，3D-MPL/AlPO4的重量比＝50/89。
被吸附的11价疫苗的制备
将11种被吸附的浓缩PS-PD单价疫苗以适当比例混合。按稀释剂A补加AlPO4。当需要加3D-MPL时，则以水溶液形式(未吸附形式，见下文的方法1)或按稀释剂B或C(2倍剂量的吸附在AlPO4上的3D-MPL，见下文的方法2)添加。
方法1
将3D-MPL以水性悬浮液形式添加到被吸附的组合型结合物中。室温下将其与11价疫苗混合10分钟，并在给药前保存于4℃。
方法2
将3D-MPL预先吸附在AlPO4上，然后添加到被吸附的组合型结合物中(稀释剂B和C)。室温下将3D-MPL的水性悬浮液(250或561μg)与1mg溶于150mM NaCl pH6.3的AlPO4混合5分钟，制成1ml稀释剂。用NaCl pH6.1/苯氧乙醇稀释该溶液，再4℃保温过夜。
未被吸附的11价疫苗的制备
将11种PS-PD结合物混合，并以适当比例稀释于150mM NaClpH6.1，苯氧乙醇。当需要加3D-MPL时，则以溶液形式(未吸附形式)添加。
用于注射的所有制剂都是在首次给药前第18天时制备。
ELISA
测量大鼠IgG的ELISA方法采用的是WHO Workshop的方案，该ELISA方法可用来测定人类血清中的抗肺炎链球菌荚膜多糖IgG抗体含量。从本质上说，是用纯化的荚膜多糖直接包被微量滴定板。将血清样品与所有肺炎球菌共有的细胞壁多糖(C物质)预保温，该细胞壁多糖在按照公开内容(EP 72513 B1)纯化的肺炎球菌多糖中约占0.5％。然后利用Jackson ImmunoLaboratories Inc.试剂检测结合的鼠IgG。根据内标物(单克隆抗体)的逻辑对数方程模型绘制效价曲线。再利用SoftMax Pro软件加以计算。可认为这些结果的最大绝对误差系数小于2。相对误差则低于30％。
调理素吞噬作用
通过CDC方法(用分化的HL60细胞检测肺炎链球菌的调理素吞噬作用，1.1方案)用纯化的人PMN和幼兔补体测定血清型3、6B、7F、14、19F及23F的调理素效价。所做修改包括使用自身(in house)肺炎球菌菌株并用纯化的人嗜中性粒细胞PMN代替HL60吞噬细胞(这些吞噬细胞之间具有高度的相关性)。此外还在微量滴定板中加入3mm玻璃珠以加强混合，这样能够使吞噬细胞：细菌的比例降低至400这一推荐值。
结果
IgG浓度
表4-10显示每种血清型与PD的IgG浓度几何平均数。为便于比较，还提供了此前由4价疫苗制剂获得的血清型6B、14、19F及23F的结果。
表4-10突出显示了最高的IgG浓度。表11为3D-MPL相对于3D-MPL/AlPO4组合物的统计学p值。在11种血清型中，有9种血清型的最高GMC’s是由第4号佐剂配方(含有高剂量3D-MPL的未吸附结合物)获得。另一种最具免疫原性是低剂量MPL配方，占5/11。此外，与改变剂量的方法相比，佐剂化方法能够使所有血清型都获得更高的GMC’s(数据未显示)，血清型4、6B、7F、18C和23F在这一方面具有统计显著性(由95％CI得出的p＜0.05)。
调理素吞噬作用
表4-8显示血清型3、6B、7F、14、19F和23F的合并血清的调理素吞噬作用结果。这些调理素效价在很大程度上可进一步证实GMCIgG。事实上，血清型6B、19F、23F的IgG浓度相关性大于85％(数据未显示)。重要的是应注意到，对血清型3而言，只有3D-MPL组诱导出了高于阈值的调理素活性。
结论
在该实验中，出乎意料的是单独使用3D-MPL诱导出的IgG浓度最高。
将通过改变佐剂获得的最大GMC IgG与通过改变PS剂量获得的最大GMC进行比较，可发现在11种血清型中，有5种是3D-MPL诱导出明显更高的应答。
表11显示，通过3D-MPL与3D-MPL/AlPO4组合物的比较(比较配制方法和3D-MPL剂量)可发现，只用3D-MPL配制时的免疫原性明显高于用3D-MPL+AlPO4配制时的免疫原性的多糖结合物有5种：PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F。
实施例3-组合方法对PS 4、PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F在成年大鼠中的免疫原性影响的研究
用肺炎球菌多糖-蛋白D结合物疫苗单独免疫成年大鼠，或用合并的多价组合物(4价、5价、7价或10价)免疫成年大鼠。10只大鼠为1组，每组免疫两次，间隔28天，并在第28天和第42天(第二次给药后第14天)取血测试。
通过ELISA测定血清中的抗肺炎球菌多糖IgG抗体。ELISA的测定结果表明，所有结合物都诱导出特定的IgG抗体。表12显示单价PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F蛋白D结合物的组合方法对其在成年大鼠中的免疫原性的影响，该结果是通过测量第二次给药后第14天的IgG浓度而获得。
对所有样品进行统计分析，以确定组合后的抗体浓度是否有明显差异。用血清型PS 6B、PS 18C、PS 19F和PS 23F蛋白D结合物任意组合的多价疫苗均不会明显改变其免疫原性。
表1
PS肺炎链球菌-蛋白D结合物的特定活化/偶联/淬灭条件
  血清型   1   3(μfluid.)   4   5   6B   7F
  PS浓度(mg/ml)   2.0   3.0   2.0   7.5   5.4   3.0
  PS溶解   NaCl2M   NaCl 2M   H2O   H2O   NaCl 2M   NaCl 2M
  PD浓度(mg/ml)   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0
  PS/PD初始比(w/w)   1/1   1/1   1/1   1/1   1/1   1/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)   0.75   0.75   0.75   0.75   0.75   0.75
  pHa＝pHc＝pHq   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   9.5/9.5/9.0   9.0/9.0/9.0
  血清型   9V   14   18C   19F   23F
  PS浓度(mg/ml)   2.5   2.5   2.0   4.0   3.3
  PS溶解   NaCl 2M   NaCl 2M   H2O   NaCl 2M   NaCl 2M
  PD浓度(mg/ml)   5.0   5.0   5.0   5.0   5.0
  PS/PD初始比(w/w)   1/0.75   1/0.75   1/1   1/0.5   1/1
  CDAP浓度(mg/mg PS)   0.75   0.75   0.75   0.75   0.75
  pHa＝pHc＝pHq   8.5/8.5/9.0   9.0/9.0/9.0   9.0/9.0/9.0   10/9.5/9.0   9.0/9.0/9.0
表2：11价肺炎球菌PS-PD疫苗的详细说明(批号代码的第一个数表明血清型)
  标准   D01PDJ227   D03PDJ236   D4PDJ228   D5PDJ235   D6PDJ209
  PS/蛋白比率(w/w)游离多糖含量(％)＜10％游离蛋白含量(％)＜15％DMAP含量(ng/μg PS)＜0.5ng/μg PS分子大小(Kav)稳定性   1/0.66180.20.18未改变   1/1.091＜10.60.13来改变   1/0.867190.40.12未改变   1/0.869211.20.11轻微改变   1/0.69090.30.13未改变
  D07PDJ225   D09PDJ222   D14PDJ202   D18PDJ221   D19PDJ206   D23PDJ212
  PS/蛋白比率(w/w)游离多糖含量(％)＜10％游离蛋白含量(％)＜15％OMAP含量(ng/μg PS)＜0.5ng/μg PS分子大小(Kav)稳定性   1/0.58180.10.14未改变   1/0.80＜10.30.60.14未改变   1/0.68＜130.30.17未改变   1/0.624210.20.10未改变   1/0.454100.10.12改变   1/0.740120.90.12未改变
表3.在未成年大鼠中测试的11价肺炎球菌PS-PD所使用的佐剂配方一览表
  组号   AlPO4  MPL  方法   说明
  1   无
  2   100   AlPO4
  3  5   MPL低
  4  50   MPL高
  5   100  5  方法1   方法1低
  6   100  50  方法1   方法1高
  7   100  5  方法2   方法2低
  8   100  50  方法2   方法2高
表4.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型6B的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价(与4价疫苗免疫相比)
  组号   AlPO4μg   MPLμg   方法   6BGMCIgG(μg/ml)   6B血清转化   6B调理素效价*   6BGMCIgG(μg/ml)   6B血清转化   6B调理素效价*
  4价疫苗   11价疫苗
  1   0.047   2/10   12.5   0.004   1/10   ＜6.25
  2   100   0.048   4/10   65   0.019   4/10   ＜6.25
  3   5   1.345   10/10   43
  4   50   4.927   10/10   192
  5   100   5   1   0.042   7/10   ＜6.25
  6   100   50   1   0.255   10/10   ＜6.25
  7   100   5   2   0.033   3/10   ＜6.25   0.048   8/10   ＜6.25
  8   100   50   2   0.057   8/10   ＜6.25
表5.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型14的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价(与4价疫苗免疫相比)
  组号   AlPO4   MPL   方法   14GMCIgG(μg/ml)   14血清转化   14调理素效价*   14GMCIgG(μg/ml)   14血清转化   14调理素效价*
  4价疫苗   11价疫苗
  1   0.046   3/10   64   0.022   3/10   ＜6.25
  2   100   0.99   10/10   88   0.237   8/10   27
  3   5   0.233   10/10   41
  4   50   0.676   10/10   81
  5   100   5   1   0.460   9/10   67
  6   100   50   1   0.477   10/10   98
  7   100   5   2   0.81   10/10   49   0.165   8/10   81
  8   100   50   2   1.611   10/10   133
表6.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型19F的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价(与4价疫苗免疫相比)
  组号  AlPO4   MPLμg   方法   19FGMCIgG(μg/ml)   19F血清转化   19F调理素效价*   19FGMCIgG(μg/ml)   19F血清转化   19F调理素效价*
  4价疫苗   11价疫苗
  1   0.04   2/10   64   0.021   2/10   ＜6.25
  2  100   1.07   9/10   367   0.222   7/10   79
  3   5   4.028   10/10   296
  4   50   21.411   10/10   1276
  5  100   5   1   1.649   10/10   172
  6  100   50   1   2.818   10/10   208
  7  100   5   2   1.09   10/10   193   0.766   10/10   323
  8  100   50   2   3.539   10/10   241
表7.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型23F的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价(与4价疫苗免疫相比)
  组号   AlPO4   MPLμg   方法   23FGMCIgG(μg/ml)   23F血清转化   23F调理素效价*   23FGMCIgG(μg/ml)   23F血清转化   23F调理素效价*
  4价疫苗   11价疫苗
  1   0.06   2/10   ＜6.25   0.152   3/10   ＜6.25
  2   100   0.29   10/10   70   0.56   8/10   ＜6.25
  3   5   2.296   9/10   389
  4   50   4.969   10/10   ＞1600
  5   100   5   1   0.462   5/10   17
  6   100   50   1   0.635   8/10   54
  7   100   5   2   0.38   10/10   ＜6.25   0.203   3/10   18
  8   100   50   2   0.501   7/10   43
表8.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型3和7F的IgG浓度几何平均数、血清转化和调理素平均效价
  组号   AlPO4   MPLμg   方法   3GMCIgG(μg/ml)   3血清转化   3调理素效价*   7FGMCIgG(μg/ml)   7F血清转化   7F调理素效价*
  1   0.003   1/10   ＜6.25   0.040   7/10   ＜6.25
  2   100   0.008   6/10   ＜6.25   0.25   9/10   43
  3   5   0.070   10/10   ＜6.25   2.435   10/10   477
  4   50   0.108   10/10   18   2.569   10/10   332
  5   100   5   1   0.015   10/10   ＜6.25   0.579   10/10   54
  6   100   50   1   0.027   10/10   ＜6.25   0.611   9/10   59
  7   100   5   2   0.006   10/10   ＜6.25   0.154   8/10   30
  8   100   50   2   0.034   10/10   ＜6.25   0.638   9/10   140
表9.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型1、4和5的IgG浓度几何平均数及血清转化
  组号  AlPO4   MPLμg   方法   1GMCIgG(μg/ml)   1血清转化   4GMCIgG(μg/ml)   4血清转化   5GMCIgG(μg/ml)   5血清转化
  1   0.026   4/10   0.005   0/10   0.040   3/10
  2   100   0.282   8/10   0.052   5/10   0.774   9/10
  3   5   1.614   10/10   3.452   10/10   7.927   10/10
  4   50   2.261   10/10   7.102   10/10   13.974   10/10
  5   100   5   1   0.568   10/10   0.676   10/10   3.015   10/10
  6   100   50   1   1.430   10/10   0.419   9/10   5.755   10/10
  7   100   5   2   0.478   10/10   0.267   9/10   2.062   10/10
  8   100   50   2   1.458   10/10   0.423   10/10   5.009   10/10
表10.用含有不同佐剂的11价PS-PD对未成年大鼠进行III级免疫后第28天的血清型9V、18C以及PD的IgG浓度几何平均数和血清转化
  组号   AlPO4  MPLμg   方法   9VGMCIgG(μg/ml)   9V血清转化   18CGMCIgG(μg/ml)   18C血清转化   PDGMCIgG(μg/ml)   PD血清转化
  1   0.018   0/10   0.013   1/10   0.003   0/10
  2   100   0.489   6/10   0.092   5/10   0.993   10/10
  3   5   0.482   7/10   6.560   10/10   3.349   10/10
  4   50   11.421   10/10   14.023   10/10   5.446   10/10
  5   100   5   1   2.133   9/10   0.690   10/10   11.407   10/10
  6   100   50   1   2.558   10/10   1.771   10/10   1.258   10/10
  7   100   5   2   1.536   10/10   0.528   10/10   1.665   8/10
  8   100   50   2   2.448   9/10   0.980   10/10   5.665   10/10
表11：某些肺炎球菌多糖结合物只用3D-MPL配制时的免疫原性相对于用3D-MPL/AlPO4配制时的免疫原性的改进情况的统计显著性(p值)。p值小于0.01则被认为显著性很高。方法1和方法2表明配制方法。
  血清型   50μg 3D-MPL对3D-MPL/AlPO4   5μg 3D-MPL对3D-MPL/AlPO4
  方法1   方法2   方法1   方法2
  1   0.3   0.05   0.079   0.11
  3   0.075   0.01   0.27   0.008
  4   0.002   0.0003   0.02   0.003
  5   0.04   0.002   0.1   0.12
  6B   0.001   0.0001   0.001   0.0006
  7F   0.13   0.15   0.01   0.005
  9V   0.02   0.02   0.1   0.04
  14   0.65   0.21   0.3   0.66
  18C   0.0008   0.0002   0.006   0.004
  19F   0.0009   0.006   0.21   0.04
  23F   0.002   0.0004   0.01   0.0004
表12：单独使用1.0μg多糖蛋白D结合物或使用4价、5价、7价或10价组合疫苗对成年大鼠进行第二次给药后第14天的IgG浓度几何平均数(μg/ml)。这些数据综合了5次单独实验的结果。
  血清型疫苗   4H   6BT   18CH   19FT   23FT
  单独的   9.3   0.11   15   5.2   2.5
  组合的   4   0.23   3.7   3.7   2.8
  T：组合成4价(T)(PS 6B、14、19F、23F)、5价(T加PS 3)、7价(H)(T加PS 4、9V和18C)及10价(H加PS 1、5和7F)组合疫苗。H：组合成7价(H)(T加PS 4、9V和18C)及10价(H加PS 1、5和7F)组合疫苗。
实施例4-添加肺炎球菌溶血素及3D-MPL对11价多糖PD结合物疫苗在抗小鼠肺炎球菌性肺集群方面的保护效果的有益影响免疫显示
肺炎球菌溶血素特异性血清IgG的ELISA用量
用稀释于PBS的2μg/ml重组天然肺炎球菌溶血素(PLY)以100μl/孔的量将Maxisorp Nunc免疫板37℃包被2小时。用NaCl 0.9％Tween-20 0.05％缓冲液将板清洗3次。然后加入作为标准曲线(从670ng/ml IgG开始)的依次2倍稀释(于PBS/Tween-20 0.05％，100μl/孔)的抗PLY参照血清以及血清样品(由1/10稀释度开始)，20℃振荡保温30分钟。如前所述清洗，加入5000×稀释于PBS/Tween-20 0.05％的过氧化物酶偶联山羊抗鼠IgG(Jackson)，20℃振荡保温30分钟。如上清洗，然后室温下与100μl/孔的显象缓冲液(溶于100mM柠檬酸缓冲液pH4.5的OPDA 0.4mg/ml和H2O20.05％)保温15分钟。通过加入50μl/孔HCl 1N终止显象。利用Emax免疫读出仪(Molecular Devices)在490和620nm下测量光密度。用SoftMaxPro软件以4参数数学法计算抗体效价。
溶血抑制
该测定方法可测量血清抗体对肺炎球菌溶血素(PLY)溶血活性的抑制能力。为了去除胆固醇(易与PLY相互作用)，将血清样品进行如下的2×处理：与等体积的氯仿混合后振荡保温45分钟。1000rpm离心10分钟，然后收集上清液。在96孔板(Nunc.)中将去除胆固醇的血清稀释(用1mM二硫苏糖醇，0.01％BSA，15mM TRIS，150mMNaCl，pH7.5)依次2倍稀释。每孔加入50μl含有4HU(溶血单位)PLY的溶液，37℃保温15分钟。然后加入100μl羊血红细胞(1％的溶液)，37℃保温30分钟。1000rpm离心10分钟，然后收集上清液(150μl)至另一96孔板，在405nm下测量光密度。给出的结果为中点稀释度的效价。
肺炎球菌溶血素的化学去毒
将重组的天然肺炎球菌溶血素(PLY)对磷酸盐50mM、NaCl 500mM pH7.6的缓冲液透析。以下所有步骤都在39.5℃及偶尔振荡的条件下进行。第1天，在PLY溶液中加入含有Tween-80 10％(1/250v/v)、N-乙酰色氨酸57.4mM pH7.6(3/100v/v)、甘氨酸2.2M的磷酸缓冲液(1/100v/v)和含有10％甲醛的磷酸缓冲液(3/100v/v)。第2和第3天再分别加入3/100及2/100v/v比的10％甲醛。在偶尔振荡的条件下39.5℃保温至第7天。最后将PLY对磷酸盐50mM、NaCl 500mM pH7.6的缓冲液透析。溶血测定表明PLY完全失活。
OF1小鼠的肺炎球菌鼻内攻击
将7周龄OF1雌性小鼠麻醉，用5.105CFU的鼠适应性肺炎链球菌血清型6B进行鼻内接种。攻击6小时后将肺取出，并匀浆(Ultramax，24000rpm，4℃)于Todd Hewith Broth(THB，Gibco)培养基。用依次10倍稀释的肺匀浆物将含有THB琼脂并补加酵母抽提物的培养皿37℃包被过夜。测定肺炎球菌性肺感染的CFU/鼠的数量，表示为对数的加权平均数。检测极限为2.14log CFU/鼠。
实施例4A
3D-MPL佐剂在抗肺炎球菌溶血素免疫应答方面的影响
本发明评定了3D-MPL佐剂在抗天然重组肺炎球菌溶血素(PLY，由J.Paton，Children’s Hospital，North Adelaide，Australia提供)及其化学去毒的对应物(DPLY)的免疫应答方面的影响。化学去毒的实施如下文所述。
每10只6周龄Balb/c小鼠为一组，在第0、14和21天用包含在A：AlPO4 100μg；或B：AlPO4 100μg+5μg 3D-MPL(3脱-O-酰基单磷酰脂A，由Ribi Immunochem提供)中的1μg PLY或DPLY对多组小鼠进行肌内免疫。图1A和1B显示由III级免疫后血清测量的ELISA IgG和溶血抑制效价(HLI)。
无论何种抗原，诱导出最佳免疫应答的都是用补加3D-MPL的制剂接种的动物。有趣的是，当与AlPO4+3D-MPL一同给药时，DPLY的免疫原性与PLY相同，而在AlPO4制剂中却是一种较弱的免疫原。这表明3D-MPL具有提高抗体对去毒肺炎球菌溶血素的应答的优点。
在含有肺炎球菌溶血素的组合物中，优选的是使用以化学方法去毒的肺炎球菌溶血素而不使用以突变方法去毒的肺炎球菌溶血素。这是因为，迄今为止获得的去毒突变体仍残留有毒素化学——而化学去毒的肺炎球菌溶血素不会。因此，作为本发明的另一方面，一般应使用一种Th1佐剂，优选的为3D-MPL，来辅佐含有经化学去毒以用于疫苗的肺炎球菌溶血素(或肺炎球菌溶血素突变体)的组合物。本发明即提供这些组合物。另外还提供一种方法，用来提高免疫原性组合物中经化学去毒的肺炎球菌溶血素的免疫应答，该方法包括在组合物中添加一种Th1佐剂(优选的为3D-MPL)的步骤。
实施例4B
添加肺炎球菌溶血素减毒突变体和3D-MPL佐剂对11价多糖PD结合物疫苗在抵抗经血清型6B鼻内攻击的OF1小鼠的肺炎球菌性肺集群方面的保护效果的有益影响
本发明评定了含有11价多糖-蛋白D结合物、肺炎球菌溶血素减毒突变体抗原(PdB，WO 90/06951)和AlPO4+3D-MPL佐剂的疫苗的预防效果，并与吸附在AlPO4上的11价多糖-蛋白D结合物传统制剂进行了比较。
每12只4周龄雌性OF1小鼠为一组，在第0和14天用含有A：50μg AlPO4；B：0.1μg PS/血清型的11价多糖-PD结合物疫苗+50μg AlPO4；或C：0.1μg PS/血清型的11价多糖-PD结合物疫苗+10μg PdB(由J.Paton，Children’s Hospital，North Adelaide，Australia提供)+50μg AlPO4+5μg 3D-MPL(由Ribi Immunochem提供)的制剂对多组小鼠进行皮下免疫。并如上所述在第21天进行攻击。
如图1C所示，补加有PdB和AlPO4+MPL佐剂的11价多糖结合物疫苗产生了非常明显的防护作用(p＜0.007)(黑色条带表示算术平均数)。相反，在用11价多糖结合物/AlPO4制剂免疫的动物体内未观测到明显的防护作用。该结果证明，添加肺炎球菌溶血素抗原(甚至是减毒的)和3D-MPL佐剂可增强11价多糖结合物疫苗的抗肺炎效率。
实施例4C
实施例4B所示防护作用的免疫相关性
为了确立实施例4B中产生的防护作用的免疫相关性，在11价多糖结合物疫苗中补加减毒的肺炎球菌溶血素突变体(PdB)和3D-MPL，并如上文所述测定攻击前对多糖6B及PdB的血清抗体应答。
然后将抗体效价与攻去6小时后相应动物的肺部细菌菌落测量值相比较。在Log/Log线性回归图上计算R2。
通过计算，抗PdB和抗6B抗体应答的R2分别为0.18和0.02。这表明体液免疫应答与这两种抗原的防护作用之间没有相关性。抗6B抗体的效价在用11价结合物疫苗(GMY＝0.318ng/ml)免疫或用补加有PdD和3D-MPL的相同疫苗(GMY＝0.458ng/ml)免疫的不同组之间没有明显的差异。因此，由制剂C观测到的防护作用加强不只是因为对多糖6B的抗体应答较强。
综上所述，这些结果表明防护作用并非只由体液免疫应答介导，而是还有PdB抗原在3D-MPL存在的情况下诱导出的细胞介导的免疫的参与。这就更加支持了在肺炎球菌多糖结合物疫苗中添加蛋白抗原和潜在佐剂以协调两种免疫系统来获得最佳防护作用的观点。
实施例5-用肺炎球菌溶血素主动免疫以及用抗肺炎球菌PS抗体被动免疫的小鼠体内的两种免疫系统的协同作用
实施例5A-确定经被动给药后可预防肺炎的抗6B多糖(抗PS)抗体的浓度
方法
疫苗组：按下表所述分组方法在第1天用100μl未稀释的大鼠抗多糖抗血清对4组小鼠进行被动免疫(i.p.)，每组16只小鼠(共64只小鼠)。
  组号   特异性   抗血清中的IgG浓度
  G1   α-PS-6B   5μg/ml
  G2   α-PS-6B   2μg/ml
  G3   α-PS-6B   0.75μg/ml
  G4   对照   0μg/ml
动物：来自Charles River，Canada的64只雄性CD-1小鼠。重量约35g(约10周龄)
麻醉：用异氟烷(3％)加02(1L/min)将小鼠麻醉。
生物体：从补加有5％马血的胰胨豆胨琼脂平板(TSA)收集肺炎链球菌N1387(血清型6)并悬浮在6ml PBS中。在进行感染前，将1ml细菌悬浮液稀释于9ml冷却的溶融营养琼脂，并保持于41℃。每只小鼠约接受6.0 log10 cfu，体积50μl。
感染：第0天，如上文所述将小鼠麻醉，并用肺炎链球菌N1387(50μl冷却的细菌悬浮液)感染小鼠，方法是通过非手术气管内插管进行支气管内滴注。Woodnut and Berry(Antimicrob.Ag.Chemotherap.43：29(1999))对该方法有所描述。
取样：感染后第3天，利用过量CO2将每组中的8只小鼠处死，取出肺并匀浆在1ml PBS中。用PBS依次10倍稀释，以计算存活菌的数量。将样品(20μμl)接种在补加有5％马血的TSA平板上，一式三份，37℃保温过夜，然后进行评定。其它的小鼠则在第7天处死并如上所述取样。
结果：
  大鼠血清中的IgG浓度(μg/ml)   感染后某天的细菌数(log 10cfu/肺)
  3   8
  5   6.7±0.7(1/7)   7.2±0.7(5/8)
  2   6.5±0.7(1/7)   6.9±1.8(4/7)
  0.75   7.7±0.5(5/8)   4.8±1.4(2/8)
  0   6.7±1.5(3/6)   6.3±1.5(3/9)
括号中的数字为取样时间前死亡的动物数量。
结论：
总的来说，从所有处理组分离出的细菌数之间没有明显的差异。这表明，直至并包括5μg/ml浓度的抗多糖抗血清也不能产生可测量的防护作用。
这与某些人类临床试验的观测结果相类似，即抗多糖抗体不足以防护某些群体的肺炎球菌性肺炎。
实施例5B-测定由含有或不含有佐剂的Ply(肺炎球菌溶血素)的主动给药产生的防肺炎作用以及与亚-最佳(sub-optimal)抗PS抗体的协同作用。
方法
动物：来自Charles River，St.Constant，Quebec，Canada的128只雄性CD-1小鼠(免疫时为6周龄，感染时为10周龄)。动物在6周时约重20gm，10周时约重38g。
免疫：在第22天和第14天用100μl下述疫苗对6组小鼠进行皮下免疫，每组16只小鼠(共128只小鼠)。PdB(WO 90/06951)由澳大利亚的James Paton博士慷慨捐赠。3D-MPL来自Ribi/Corixa。
第1天，用4.26μg/ml浓度(5μg/ml浓度取4ml+2μg/ml浓度取1.3ml)的鼠抗多糖抗体对特定的组(见下表)进行被动免疫(i.p.100μl)。
  组号   主动注射体积   第22、14天注射的疫苗(剂量μg)   被动注射体积   被动IgG(第1天)
  1-1   100μl s.c.   PdB/AlPO4(10/50)   None
  1-2   100μl s.c.   PdB/MPL/AlPO4(10/5/50)   None
  1-3   100μl s.c.   PdB/AlPO4(10/50)   100μl i.p.   α-PS
  1-4   100μl s.c.   PdB/MPL/AlPO4(10/5/50)   100μl i.p.   α-PS
  1-5   100μl s.c.   MPL/AlPO4(5/50)   100μl i.p.   α-PS
  1-6   100μl s.c.   MPL/AlPO4(5/50)   None
感染：第0天，将小鼠麻醉(3％异氟烷加1L/min 02)。细菌接种物的制备方法是从补加有5％马血的胰胨豆胨琼脂平板(TSA)收集生长的肺炎链球菌N1387(血清型6)并悬浮在6ml PBS中。在感染前用冷却的溶融营养琼脂制备成10倍稀释液(1ml+9ml)(保持于41℃)。通过非手术气管内插管进行支气管内滴注，以感染小鼠。每只小鼠约接受6.0 log10 cfu，体积50μl。Woodnut and Berry(Antimicrob.Ag.Chemotherap.43：29(1999))对该方法有所描述。
取样：感染后第72，利用过量CO2将每组中的8只小鼠处死，取出肺并匀浆在1ml PBS中。用PBS依次10倍稀释，以计算存活菌的数量。将样品(20μl)接种在补加有5％马血的TSA平板上，一式三份，37℃保温过夜，然后进行评定。其它的小鼠则在感染后第8天处死并如上所述取样。
数据分析
测量感染后第3天和第7天的肺中细菌数，并将不同处理方法的结果进行比较。结果表示为组平均值和标准偏差。通过Studentst-test进行统计分析，p值＜0.05的被认为具有显著性。
结果：
感染后第72小时
1-4组的细菌计数明显低于1-3组(p＜0.05)。
1-4组的细菌计数明显低于1-5组(p＜0.05)。
感染后第168小时
各组的第8天细菌数均比第3天细菌数低约2个数量级，这表明感染正在消退。
1-2组的细菌计数明显低于1-5组(p＜0.05)。
  组号   第3天   第8天
  LogCFU/肺   标准偏差   LogCFU/肺 标准偏差
  1-1   6.93   0.61   5.23   1.28
  1-2   6.59   1.25   4.08   1.34
  1-3   7.09   0.8   5.32   1.26
  1-4   6.09   1.43   4.46   2.32
  1-5   7.19   0.89   5.42   1.05
  1-6   6.68   1.14   5.01   1.48
如上所示，单独使用抗多糖抗体(组1-5)不会产生抗肺部肺炎球菌生长的防护作用。用AlPO4为佐剂的PdB也是如此，但PdB与3D-MPL结合使用时，在第8天倾向于产生一种防护作用(组1-2)。
第3天时，使用所有3种成分，PdB、3D-MPL和被动给药的抗多糖抗体，的组1-4产生了最明显的防护作用。死亡率也支持这一结果。组1-4只有2/8死亡，相比之下，组1-5和1-3有5/10死亡。
结论：
因为该实验使用被动免疫的动物，所以，另由肺炎球菌溶血素和MPL的主动免疫产生的协同效应不是由抗多糖抗原的抗体水平增加引起的。
由于动物只接受一次抗肺炎球菌多糖的被动免疫。因而在第8天时，这种抗体的大部分已被宿主消耗。
尽管如此，在用肺炎球菌溶血素加3D-MPL免疫的组中，尤其在用肺炎球菌溶血素加3D-MPL加被动给药的抗多糖抗体免疫的组中，仍观测到了明显的抗肺炎球菌性肺炎的防护作用，这表明该组合方式具有协同效应。
如果以主动方式(优选的是使用结合的多糖)进行抗多糖免疫，则效果会因B细胞的记忆效应而更加明显，另外恒定水平的抗PS抗体也会促进免疫系统的协同作用(可参考，例如，图1C，其中显示的多种以多糖和蛋白进行主动免疫的动物在攻击后肺部无细菌存在)。
实施例6-3D-MPL辅佐的11价肺炎球菌-多糖蛋白D结合物疫苗在1岁Balb/C小鼠中的免疫原性
前言及目标：
抗肺炎球菌性感染的防护作用是由血清型特异性抗体通过调理素吞噬作用来介导的。可以推测，增加该抗体的浓度会使防护作用更强，因而所做的许多努力都是为了寻求加强体液应答的方法。有一种使用免疫刺激性佐剂的策略已成功应用于临床前结合物疫苗的研究(见综述Poolman et al.1998，基于糖类的细菌疫苗。In：Handbookof Experimental Pharmacology eds.P.Perlmann and H.Wigsell.Springer-Verlag，Heidelberg，D)。
本节提供的数据为最新实验的结果，该实验采用经设计可模拟临床试验的方案，并使用临床批药。
方案：
用肺炎球菌-多糖蛋白D结合物疫苗或23价普通多糖疫苗免疫1岁balb/c小鼠，剂量为人类剂量的1/10。所用疫苗为临床批药DSP009、DSP013或DSP014，分别相当于1mcg剂量血清型6B与23F及5mcg其余血清型的11价结合疫苗、0.1mcg剂量的11价结合疫苗，或用5mcg 3D-MPL佐剂配制的0.1mcg剂量的11价结合疫苗。所有11价结合疫苗都另加有50μg AlPO4佐剂。
对20只为一组的小鼠进行肌内免疫。在第0天和第21天对下表所列的各组小鼠进行注射。在第35天(第二次给药后第14天)取血测试。
表：用肺炎球菌-多糖蛋白D结合物疫苗的临床批药免疫1岁Balb/c小鼠的免疫时间表
  组号   第0天第1次疫苗给药   第21天第1次疫苗给药   小鼠数
  1   Pneumovax-232.5mcg   缓冲液   20
  2a   11-价Pn-PD0.1mcg   缓冲液   20
  2b   11-价Pn-PD0.1mcg   11-价Pn-PD0.1mcg   20
  3a   11-价Pn-PD+MPL0.1mcg+5mcg   缓冲液   20
  3b   11-价Pn-PD+MPL0.1mcg+5mcg   11-价Pn-PD+MPL0.1mcg+5mcg   20
  4a   11-价Pn-PD1/0.5mcg   缓冲液   20
  4b   11-价Pn-PD1/0.5mcg   11-价Pn-PD1/0.5mcg   20
  对照   缓冲液   缓冲液   20
按照CDC/WHO统一方案，即用细胞壁多糖将血清中和后，利用ELISA方法测试血清的抗肺炎球菌多糖IgG抗体。以血清型特异性IgG1单克隆抗体为标准对ELISA的结果进行校正，以获得单位为mcg/ml的抗体浓度。
比较结果的统计分析用UNISTAT 5.0beta版进行计算。IgG浓度log值的方差分析采用Tukey-HSD方法。血清转化率的成对比较使用Fisher的精确测试方法。
结果：
下表显示第二次免疫(第二次给药)后第14天的抗11种血清型及蛋白D的GMC IgG以及95％的置信区间。其中无法计算出95％置信区间的则显示为血清转化率。
组1表明用普通多糖进行免疫的结果一般是只在动物体内诱导出IgM。大部分IgG水平低于检测阈值；但balb/c小鼠能够针对少量肺炎球菌多糖产生IgG，尤其是血清型3、19F和14。
用结合物疫苗进行免疫可诱导出抗23F以外的所有血清型的IgG抗体，并且可获得高血清转化率。
通过观测发现，只有血清型7F和19F产生了剂量依赖性应答(组4与组2相比)，但这些观测结果不具有统计显著性。在两次给药后获得较强应答的(b组与a组相比)有血清型3、6B、7F和19F以及PD，这些观测结果在所有3种制剂的多种情况下都具有统计显著性。
最有趣的是3D-MPL的效应。将3D-MPL配制的疫苗两次给药(组3b)可诱导出最高的特异性GMC IgG，这对23F以外的所有血清型都具有统计显著性，而对23F则是获得明显更高的血清转化率(p＝0.02组3b与组2b相比，Fisher的精确测试)。
表：用11价PS-PD结合物疫苗进行II级免疫后第14天的1岁Balb/c小鼠体内特定肺炎球菌血清型及蛋白D的[IgG]几何平均数和95％的置信区间
  组   1   2a   2b   3a   3b   4a   4b
  血清型   GM[IgG]μg/ml(95％Cl)   GM[IgG]μg/ml(95％Cl)   GM[IgG]μg/ml(95％Cl)   GM[IgG]μg/ml(95％Cl)   GM[IgG]μg/ml(95％Cl)   GM[IgG]μg/ml(95％Cl)   GM[IgG]μg/ml(95％Cl)
  3   0.24(0.16-0.6)   0.18(0.11-0.27)   0.84(0.47-1.5)   0.72(0.51-1.0)   4.84(3.0-7.9)   0.22(0.14-0.35)   0.95(0.19-1.8)
  6B   0.020/20#   0.048/19   0.19(0.09-0.41)   0.14(0.07-0.27)   0.74(0.29-1.9)   0.09(0.05-0.16)   0.11(0.05-0.23)
  7F   0.040/20#   0.07(0.04-0.12)   0.19(0.10-0.39)   0.15(0.10-0.22)   0.97(0.49-2.0)   0.09(0.06-0.14)   0.45(0.20-1.02)
  14   0.153/20#   4.5(2.5-8.1)   6.2(3.6-10.5)   12.9(7.8-21.2)   13.6(9.4-19.7)   4.0(2.0-8.0)   6.9(4.6-10.6)
  19F   1.2(0.56-2.6)   6.7(3.6-12.5)   12.1(7.6-19.3)   10.1(5.5-18.5)   58.5(42-81)   5.9(3.5-9.9)   22.0(16.0-30.2)
  23F   0.071/20#   0.083/20#   0.082/19#   0.072/10#   0.179/20#   0.061/18#   0.104/20#
  PD*   0.251/20#   5.2(3.3-8.3)   11.9(6.9-20.7)   13.5(9.5-19.0)   98.0(49.1-195.)   10.9(6.4-18.4)   38.7(21.3-70.3)
*单位为EU/ml；#血清转化率，解释为比阴性对照的平均值超出2倍标准偏差。
请参照前表对组的定义。
结论：
提供的数据表明，在11价肺炎球菌-多糖蛋白D结合物疫苗中添加3D-MPL可加强高龄balb/c小鼠对所有已测试血清型的免疫应答。
在大多数情况下，将疫苗两次给药可诱导出比单次给药更高的IgG浓度几何平均数。而使用普通多糖疫苗并未观测到这种现象，甚至用于人类也是如此，因而可认为该结果表明了一种T细胞依赖性免疫应答以及免疫记忆的产生。
这些数据对使用结合的肺炎球菌多糖并用一种Th1佐剂(优选的为3D-MPL)辅佐的疫苗给药方案给予了支持，该方案至少将2倍剂量的佐剂化疫苗给药，其间隔优选的为1-12周，最优选的为3周。该给药方案可作为本发明的另一方面。
该实验使用的小鼠对PS 23(普通的或结合的)不产生应答。有趣的是，当以3D-MPL为佐剂时，尽管抗多糖抗体的水平仍然很低，并且无论使用何种疫苗组合物都是如此，但还是有更多的小鼠对PS23产生了应答(血清转化率则明显提高)。Th1佐剂，特别是3D-MPL，为解除对疫苗中某种肺炎球菌多糖的无应答性而在含有结合的肺炎球菌多糖的疫苗中的应用可作为本发明的又一方面。利用二倍剂量给药方案来解除对上述组合物的无应答性的方法也可作为本发明的一个方面。
实施例7-脑膜炎奈瑟菌C多糖-蛋白D结合物(PSC-PD)
A：蛋白D的表达
如实施例1
B：多糖C的产生
C型多糖来源于脑膜炎奈瑟菌C11菌株。利用传统的发酵技术(EP72513)将其发酵。用于结合过程的多糖干粉与Mencevax(SBBiologicals s.a.)完全相同。
将一份C11菌株试样融解，取0.1ml悬浮液在一个补加有酵母抽提物渗析液(10％，v/v)的Mueller Hinton培养基平皿上划线培养，并在水蒸气饱和的36℃空气振荡器中保温23-25小时。
然后将表面生长的单菌落重悬在无菌发酵培养基中，并将该悬浮液接种在一个含有补加酵母抽提物渗析液(10％，v/v)的MuellerHinton培养基以及无菌玻璃珠的Roux瓶中。在水蒸气饱和的36℃空气振荡器中保温23-25小时，然后将表面生长的单菌落重悬在10ml无菌发酵培养基中，再将0.2-0.3ml该悬浮液接种在另外12个Mueller Hinton培养基Roux瓶中。
在水蒸气饱和的36℃空气振荡器中保温23-25小时，然后将表面生长的单菌落重悬在10ml无菌发酵培养基中。将细菌悬浮液合并在一个锥形瓶中。
然后在无菌条件下用无菌注射器将该悬浮液转移到发酵罐中。
在置于负压超净室的发酵罐中将脑膜炎球菌发酵。发酵一般在10-12小时后完成，相当于约1010个细菌/ml(即稳定期早期)，然后提高pH以进行检测。
在此期将整个肉汤培养基加热灭活(56℃12分钟)，然后离心。在灭活前及灭活后从肉汤培养基中取样，并在Mueller Hinton培养基平皿上划线培养。
C：PS纯化
该纯化方法需对整个发酵肉汤进行多步操作。纯化初期，将灭活培养物离心澄清，回收上清液。
多糖纯化的依据是用季铵盐(溴棕三甲铵/CTAB，CETAVLON R)进行沉淀。CTAB可根据多糖、核酸及蛋白等多聚阴离子的pI值而与其形成不溶性复合物。在控制离子条件的情况下，该方法可用来沉淀杂质(低电导率)或多糖(高电导率)。
以硅藻土(CELITER 545)为基质将澄清上清液中包含的多糖沉淀，这样可避免在不同的沉淀/纯化过程中形成不溶性惰性物质。脑膜炎奈瑟菌多糖C的纯化方案
步骤1：将PBC-CTAB复合物固定在CELITER 545上，并用0.05％CTAB清洗以去除细胞碎片、核酸及蛋白。
步骤2：用50％EtOH洗脱PS。丢弃最初的含有杂质和LPS的混浊组分。利用絮凝测试法验证随后组分中的PS存在情况。
步骤3：将PS-CTAB复合物再次固定在CELITE R 545上，并用0.05％CTAB清洗以去除微量的核酸和蛋白。
步骤4：用50％EtOH洗脱PS。丢弃最初的混浊组分。利用絮凝测试法验证随后组分中的PS存在情况。
将洗脱物过滤，并收集含有粗制多糖的滤出液。添加乙醇至终浓度80％，使滤出液中的多糖沉淀。然后回收白色的粉状多糖，真空干燥并保存于-20℃。
D：CDAP的结合
PSC与PD的结合
PSC与PD结合时，优选的CDAP结合技术是CNBr活化并通过一种间隔物与载体蛋白结合的经典方法。首先用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)通过氰化作用将多糖活化。CDAP是一种水溶性氰化剂，其氰基基团的亲电性要高于CNBr，从而能够在相对温和的条件下进行氰化反应。活化后的多糖可直接通过其氨基与载体蛋白连接，而无需引入任何间隔分子。通过甘氨酸的过量反应可淬灭未反应的氰酸酯基团。这样可减少结合物疫苗制备所需的总步骤数，最重要的是终产物中不存在可能有免疫原性的间隔分子。
用CDAP活化多糖会将氰基引入多糖，并且释放出二甲氨基吡啶(DMAP)。氰基基团能够在随后的结合步骤中与蛋白的NH2-基团反应而转变成氨基甲酸酯。
PSC活化及PSC-PD的结合
活化及结合在+25℃下进行。
在WFI中将120mg PS溶解至少4小时。
加入CDAP溶液(以100mg/ml浓度新溶于乙腈)，使CDAP/PS(w/w)比率为0.75。
1分30秒后，加入三乙胺使pH升至活化pH值(pH10)，并保持稳定直至添加PD。
3分30秒时，加NaCl至终浓度为2M。
4分钟时，加入纯化的PD，使PD/PS比率为1.5/1；立即将pH调至结合pH值(pH10)。在保持pH稳定的情况下将溶液放置1小时。淬灭
将6ml 2M的甘氨酸溶液加到PS/PD/CDAP混合物中。将pH调至淬灭pH值(pH8.8)。在工作温度下将溶液搅拌30分钟，然后+2-8℃过夜并不断缓慢搅拌。
PS-PD的纯化
在冷室内用S400HR Sephacryl凝胶以凝胶渗透层析法将过滤(5μm)后的PS-PD结合物纯化，以去除小分子(包括DMAP)和未结合的PD；洗脱——NaCl 150mM pH6.5；监测——UV 280nm、pH和电导率。
根据反应成分的不同分子大小，首先洗脱下来的是PS-PD结合物，然后是游离的PD，最后是DMAP。根据DMAB(PS)和BCA(蛋白)的检测结果将含有结合物的组分合并。将合并的组分过滤除菌(0.2μm)。
E：吸附于PSC-PD的结合物疫苗的配制
清洗AlPO4
为了使PSC-PD结合物尽可能完善地吸附在AlPO4上，可将AlPO4清洗以降低PO4 3-的浓度：
——用150mM NaCl清洗AlPO4，再离心(4×)；
——然后将沉淀重悬在150mM NaCl中，然后过滤(100μm)；以及
——将滤出液加热除菌。
这种清洗过的AlPO4被称为WAP(清洗并灭菌的磷酸盐)。
配制方法
将松散的PSC-PD结合物吸附在AlPO4 WAP上，最后配制成终产物。室温下将含有PSC-PD的AlPO4 WAP搅拌5分钟。将pH调至5.1，并在室温下将混合物再搅拌18小时。加入NaCl溶液至浓度为150mM，并在室温下将混合物搅拌5分钟。加入2-苯氧乙醇至浓度为5mg/mL，室温下搅拌15分钟，然后将pH调至6.1。
最终成分/用量
——PSC-PD        10μg PS
——AlPO4 WAP    0.25mg Al3+
——NaCl          150mM
——2-苯氧乙醇    2.5mg
——注射用水      至0.5ml
——pH            6.1
F：临床使用前的信息
多糖结合物在小鼠体内的免疫原性
PSC-PD结合物的免疫原性已在6-8周龄Balb/C小鼠中进行了评定。将普通(未吸附的)结合物或吸附在AlPO4上的结合物作为单价疫苗进行注射。诱导出的抗PSC抗体的测定采用ELISA方法，而功能性抗体的分析采用杀菌测试法，这两种方法均以CDC(疾病控制及预防中心，Atlanta，USA)方案为基础。为评定应答随剂量的变化以及佐剂(AlPO4)的效果而实施的这两种不同实验的结果如下。
剂量范围实验
在该实验中，用PSC-PD两次(间隔2周)注射Balb/C小鼠。配制在AlPO4上的结合物的使用剂量有四种：0.1；0.5；2.5；和9.6μg/动物。在第14天(I级免疫后14天)、第28天(II级免疫后第14天)和第42天(II级免疫后第28天)将小鼠(10只/组)取血。通过ELISA测量多糖C特异性抗体的几何平均浓度(GMCs)，并以纯化的IgG为参照将结果表示为μg IgG/ml的形式。在加有幼兔补体的条件下用脑膜炎奈瑟菌C11菌株测量合并血清的杀菌性抗体，并将效价表示成可杀死50％细菌的稀释度的倒数形式。
获得的剂量-应答曲线从2.5μg剂量处开始显示为平台区。结果表明，在I级免疫后14天与II级免疫后第14天之间有一次良好的促升应答。II级免疫后第28天的抗体水平至少与II级免疫后第14天的相等。杀菌性抗体的效价与ELISA的浓度结果相符，从而证实了PSC-PD结合物的免疫原性。
佐剂的作用
该实验对配制在AlPO4上的一批PSC-PD结合物进行评定，并以注射普通(未结合的)结合物为对照。用2μg结合物对10只为一组的小鼠进行两次皮下注射，间隔2周。在第14天(I级免疫后14天)、第28天(II级免疫后第14天)和第42天(II级免疫后第28天)将小鼠取血并进行ELISA和功能性抗体效价的测量(只对II级免疫后第14天和II级免疫后第28天的血样进行杀菌测试)。与未加佐剂的制剂相比，加AlPO4的制剂可诱导出高达10倍的抗体效价。结论
由上述实验结果可得出以下一般结论：
——PSC-PD结合物可诱导出一种回忆应答，表明PSC结合后可变成一种T细胞依赖性抗原。
——由ELISA测量的抗PSC抗体浓度与杀菌性抗体的效价具有良好的相关性，说明PSC-PD结合物诱导出的抗体具有抗脑膜炎奈瑟菌血清群C的功能。
——将大约2.5μg结合物吸附在AlPO4上似乎可在小鼠体内获得最佳的抗体应答。
——CDAP化学物可作为一种适当的方法用于免疫原性PSC-PD结合物的制备。
实施例8-来源于脑膜炎奈瑟菌血清群A的多糖-PD结合物的制备
在0.2M NaC1溶液中将多糖A(PSA)干粉溶解1小时，使其终浓度为8mg/ml。然后用HCl或NaOH使pH值稳定于6，并将溶液的温度控制在25℃。在PSA溶液中加入0.75mg CDAP/mg PSA(以100mg/ml浓度溶于乙腈的制剂)。1.5分钟后加入0.2M NaOH，在不调节pH的情况下使pH值为10。2.5分钟后加入蛋白D(浓缩至5mg/ml)，使PD/PSA的比率约为1。在1个小时的结合反应期过程中保持pH值为10。然后加入10mg甘氨酸(2M pH9.0)/mg PSA，并将pH值调至9.0，25℃保持30分钟。然后将混合物4℃保存过夜，再利用排阻柱层析法(购于Pharmacia的Sephacryl S400HR)进行纯化。首先洗脱下来的是结合物，然后是未反应的PD和副产物(DMAP、甘氨酸、盐类)。收集结合物并在购于Sartorius的Sartopore膜上进行0.2μm过滤除菌。
实施例9-实施例7和8的产物的体外特性鉴定
重要特性总结于下表：
  编号   结合物说明   蛋白及PS含量(μg/ml)   PS/蛋白比率   游离蛋白(％)   游离PS(％)
  1   PSC-PD用NaOH调pH   PD：210PS：308   1/0.68   ＜2   8-9
  2   PSC-PD用TEA调pH   PD：230PS：351   1/0.65   ＜2   5-6
  3   PSA-PD用NaOH调pH   PD：159PS：149   1/1.07   5   5-9
体内结果
以Balb/C小鼠为动物模型测试结合物的免疫原性。将结合物吸附在AlPO4或Al(OH)3上(500μg Al3+吸附10μg PS)或不进行吸附。如下所述对小鼠进行注射：注射2次，间隔2周(2μg PS/次)。
由这些结果可首先断定，游离PS对免疫应答影响很大。而利用含游离PS少于10％的结合物获得了更好的结果。因此，对CDAP方法的以上改进可作为本发明的另一方面。
剂型也很重要。在该模型中，AlPO4似乎是最适当的佐剂。结合物可产生促升效应，当只注射多糖时，这种效应不会出现。
结论
所得脑膜炎奈瑟菌A结合物及C结合物的最终PS/蛋白比率分别为1和0.6-0.7(w/w)。游离PS和游离载体蛋白分别低于10％和15％。多糖回收率高于70％。因此，可由上述的改进(优化)CDAP方法获得的PSA结合物及PSC结合物(不考虑载体蛋白，但优选的是蛋白D)可作为本发明的又一方面。
实施例10-来源于流感嗜血菌b的多糖-PD结合物的制备
流感嗜血菌b是2岁以下儿童患有脑膜炎的主要病因之一。结合在破伤风类毒素上的流感嗜血菌荚膜多糖(PRP)结合物已为人们所熟知(利用J.Robbins开发的化学方法进行结合)。CDAP是一种改进的化学方法。以下是摸索的将PRP与，优选的为，PD结合的最佳CDAP条件。
可影响结合反应的因素如下：
·多糖的起始浓度(可对游离多糖的最终含量以及过滤除菌步骤产生双重影响)。
·载体蛋白的起始浓度。
·多糖与多糖的最初比率(可对游离多糖的最终含量以及过滤除菌步骤产生双重影响)。
·所用CDAP的量(通常为大大过量)。
·反应温度(可影响多糖分解、反应动力学以及反应基的分解)。
·活化及结合的pH值。
·淬灭的pH值(影响残留DMAP的量)。
·活化、结合及淬灭的时间。
本发明人发现，优化终产物质量的3个最关键因素是：多糖/蛋白的最初比率；多糖的初始浓度；和结合的pH值。
因此，以上述3个条件为3个轴绘制立体反应坐标。这些轴的中点(和实验值范围)为：PS/蛋白比率-1/1(±0.3/1)；[PS]＝5mg/ml(±2mg/ml)；和结合pH值＝8.0(±1pH单位)。
以下为重要性较低的因素的设定值：所用多糖为30mg；温度25℃；[CDAP]＝0.75mg/mg PS；pH调节使用0.2M NaOH；活化pH＝9.5；活化温度＝1.5分钟；结合温度-1小时；[蛋白]＝10mg/ml；淬灭pH＝9.0；淬灭温度＝1小时；将PS溶解在溶剂中的温度＝在2M NaCl中溶解1小时；在Sephacryl S-400HR上的纯化用150mM NaCl洗脱，流速12cm/小时；过滤除菌使用SAROLAB P20，速度5ml/分钟。
为建立最佳产物制备条件而需在上述立体反应坐标中考察的数据有：过滤后的最大产量、结合的最大蛋白量；以及产物质量的数据——最终PS/蛋白比率、游离PS水平、游离蛋白水平、最低的残留DMAP(CDAP的分解产物)水平。
过滤后的产量
起始[PS]与结合pH值及最初PS/蛋白比率之间的相互作用是能够影响过滤后产量的因素。在低[PS]的情况下，后两种因素之间的相互作用很小，并且总是会获得良好的滤过性(所有产物都达到约95％)。但在高浓度情况下，若提高pH和最初比率会使滤过性降低(高[PS]、最低比率、最低pH＝99％的滤过率；但高[PS]、最高比率及pH＝19％的滤过率)。
蛋白结合的水平
PS/蛋白的最终比率与最初比率的比可作为结合效率的衡量标准。在高[PS]条件下，pH不影响两种比率的比值。但最初比率会影响该比值(低最初比率时为1.75，高最初比率时为1.26)。在低[PS]条件下，两种比率的比值多半会降低，但此时pH值的影响更大(低pH低比值时＝0.96；低pH高比值时＝0.8；高pH低比值时＝1.4；高pH高比值时＝0.92)。
最终的PS/蛋白比率
最终比率取决于最初比率和[PS]。高最初比率与高[PS]相结合可获得最高的最终比率。pH对最终比率的影响不象低[PS]那样明显。
游离蛋白D的水平
在高pH及高[PS]条件下观测到的游离蛋白D的量最少(水平接近0.0)。当pH很低时，高[PS]的影响变得特别明显。提高最初比率可导致游离蛋白D的少量增加。
残留DMAP
最初比率的影响不明显。但DMAP的水平可随[PS]的提高而提高，并随pH的提高而降低。
结论
因此，最优选的结合条件如下：结合pH＝9.0；[PS]＝3mg/ml；并且最初比率＝1/1。由这些条件获得的终产物的特性如下：
  最终PS/蛋白比率   过滤后的PS产量(％)   比率的比值   游离蛋白D(％)   DMAP水平(ng/10μg PS)
  值   范围   值   范围   值   范围   值   范围   值   范围
  1.10   0.91-1.30   92.6   50-138   1.16   1.03-1.29   0.71   0-10.40   4.95   2.60-7.80
因此，可由上述的改进(优化)CDAP方法获得的PRP结合物(不考虑载体蛋白，但优选的为蛋白D)可作为本发明的又一方面。
实施例11：以蛋白D为抗原——将其与3D-MPL配制后如何提高其抗未分类流感嗜血菌的防护效率
用11价肺炎球菌多糖-蛋白D结合物疫苗对雌性Balb/c小鼠(每组10只)进行免疫(肌内方式)，20周龄(D0)时进行第一次免疫，2周后(D14)进行第二次免疫。第二次免疫后第7天取血。根据IgG1型、IgG2a型及IgG2b型抗体的量测定蛋白D抗体的效价。
制备冻干的11价疫苗(无AlPO4)，方法是在结合物中加入15.75％的乳糖，室温下搅拌15分钟，将pH调至6.1±0.1，然后冻干(冻干周期一般从-69℃开始，逐渐调至-24℃，耗时3小时，然后保持该温度18小时，再逐渐调至-16℃，耗时1小时，然后保持该温度6小时，再逐渐调至+34℃，耗时3小时，最后保持该温度9小时)。
表13显示制剂的成分以及冻干物的重构剂。
目前已知道，测量Th1型细胞介导的免疫应答产生与否的最典型方法与IgG2a抗体的水平有关。由这些数据可发现，若将蛋白D与一种Th1佐剂(此时为3D-MPL)一同冻干，则会使IgG2a出现惊人的大幅度提高。
表13：制剂(每人类剂量)的成分以及抗体(1/10剂量)在小鼠体内的抗蛋白D效价
  物理状态   PS(/500μl)  AlPO4(/500μl)   免疫刺激剂   粘结剂   防腐剂   重构剂   IgG1   IgG2a   IgG2b   IgG1   IgG2a   IgG2b
  μg/ml   ％
  液体形式   1μg   500μg   无   无   2-PE3   无   76   0.425   0.24   99.1   0.554   0.313
  液体形式   5μg   500μg   无   无   2-PE   无   66   0.284   0.176   99.3   0.427   0.265
  液体形式   1μg   0μg   无   无   2-PE   无   6.6   0.207   0.036   96.4   3.02   0.526
  液体形式   5μg   0μg   无   无   2-PE   无   5.2   0.169   0.043   96.1   3.12   0.795
  冻干形式   1μg   0μg   无   乳糖3.15％   无   NaCl 150mM1   5.2   0.147   0.046   96.4   2.73   0.853
  冻干形式   5μg   0μg   无   乳糖3.15％   无   NaCl 150mM1   11.1   0.11   0.168   97.6   0.967   1.477
  冻干形式   1μg   0μg   无   乳糖3.15％   无   AlPO4500μg2   45   1.86   0.075   95.9   3.96   0.160
  冻干形式   5μg   0μg   无   乳糖3.15％   无   AlPO4500μg2   19   0.077   0.119   99.0   0.401   0.620
  冻干形式   1μg   0μg   无   乳糖3.15％   无   MPL 50μg1   45   2.6   3.5   88.1   5.09   6.849
  冻干形式   5μg   0μg   无   乳糖3.15％   无   MPL 50μg1   135   25   5.1   81.8   15.1   3.089
  冻干形式   1μg   0μg   MPL(50μg)   乳糖3.15％   无   缓冲液   43   22   5.7   60.8   31.1   8.062
  液体形式   1μg   500μg   MPL(50μg)   无   2-PE   无   441   7.1   9.1   96.5   1.55   1.990
  液体形式   5μg   500μg   MPL(50μg)   无   2-PE   无   299   1.4   0.899   99.2   0.465   0.298
1注射前；2注射前±2小时，32-苯氧乙醇

Claims (12)

1.一种免疫原性组合物，该组合物含有至少11种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖抗原、至少一种肺炎链球菌蛋白抗原和一种佐剂，该佐剂是TH1应答的优先诱导剂。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中的蛋白抗原是肺炎链球菌的一种外表面蛋白或分泌蛋白。
3.权利要求1的免疫原性组合物，其中的蛋白抗原是肺炎链球菌的一种毒素或粘附素。
4.权利要求1的免疫原性组合物，其中的蛋白抗原选自：肺炎球菌溶血素、PspA或其跨膜区缺失变体、PspC或其跨膜区缺失变体、PsaA或其跨膜区缺失变体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及CbpA或其跨膜区缺失变体。
5.权利要求1的免疫原性组合物，其中的多糖抗原以多糖-蛋白载体结合物形式提供。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其中的载体蛋白选自：白喉类毒素、破伤风类毒素、钥孔血兰素、结核菌素蛋白衍生物，以及流感嗜血菌(H.influenzae)蛋白D。
7.权利要求6的免疫原性组合物，其中的载体蛋白是CRM197。
8.权利要求1的免疫原性组合物，其中的佐剂至少含有下列中的一种：3-O-脱酰基单磷酰脂A、一种皂甙免疫刺激物或一种免疫刺激性CpG寡核苷酸。
9.权利要求8的免疫原性组合物，其中的佐剂含有一种载体，该载体选自水包油型乳剂、脂质体以及铝盐。
10.权利要求1的免疫原性组合物在制备用于预防或改善高龄人及幼龄儿童的肺炎球菌性疾病的药物中的用途。
11.一种疫苗，该疫苗含有权利要求1的免疫原性组合物。
12.一种用来制备权利要求1的免疫原性组合物的方法，该方法的步骤包括：
选择11种或更多种肺炎链球菌多糖抗原；
选择一种或多种肺炎链球菌蛋白抗原；
选择TH1应答的优先诱导剂；和
将所述多糖抗原和蛋白抗原和佐剂与一种适当的赋形剂相混合。
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