JPH11507214A

JPH11507214A - Ｈｓｐ７０ファミリーに属する連鎖球菌の熱ショック蛋白質メンバー

Info

Publication number: JPH11507214A
Application number: JP9500026A
Authority: JP
Inventors: ジョゼハメル; ベルナードブロデゥアー; デニスマーティン; クレメントリオックス
Original assignee: バイオケムヴァシーンズインク．
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-17
Publication date: 1999-06-29
Also published as: CN1192241A; NO975752D0; AP9701163A0; AU700080B2; HUP0600442A2; AR003124A1; IL118329A0; BR9609399A; CZ394297A3; EP0832238A1; TR199701537T1; WO1996040928A1; AU5682896A; CA2224015A1; NO975752L; SK168497A3; KR19990022742A; EA199800046A1; HUP0600442A3; PL323781A1

Abstract

(57)【要約】 70-72キロダルトンの見かけ上の分子量を有するストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyrogenes）およびストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）の新規な熱ショック蛋白質、免疫学的に関連するポリペプチド、S．ニューモニアエ(S．Pneumoniae)のHSP72のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（配列番号4、配列番号5）、S．ピオゲネス(S．pyrogenes)のHSP70のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（配列番号19、配列番号20）、S．アガラクチアエ(S．agalactiae)のHSP70のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（配列番号21、配列番号22）、HSPに結合する抗体、HSPおよび免疫学的に関連するポリペプチドの組換えDNAによる製造方法を開示する。本発明のポリペプチド、DNA配列および抗体は連鎖球菌による疾病の診断、予防および／または治療の新規な手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 HSP70ファミリーに属する連鎖球菌の熱ショック蛋白質メンバー発明の技術分野本発明はストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）の新規な熱ショック蛋白質、および免疫学的にそれと関連するポリペプチドに関し、疾患の治療、予防、および診断に役立つ新しい免疫療法剤、予防剤、および診断剤の基礎を提供するものである。より詳しくは、本発明は、HSP70ファミリーのメンバーであり、70- 72キロダルトンの見かけ分子量を有する、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチアエの熱ショック蛋白質に関し、また対応するヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列にかかり、HSP70/HSP72および免疫学的にそれと関連するポリペプチドを生産するための組換えDNA法に関し、これらのHSPファミリーに結合する抗体に関し、また、ストレプトコッカス・ニューモニアエおよび関連するストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチアエのような細菌によって引き起こされる疾患の診断、予防、および治療のための方法、組成物に関する。発明の背景ストレプトコッカス・ニューモニアエは人間の疾患の重要な病原体であり、特に幼児、熟年および免疫無防備状態の人々ではそうである。それは世界的に高い罹患率と死亡率を持つ菌血症／敗血症、肺炎、および髄膜炎のような侵襲性疾患にかかった患者から屡々分離される細菌である。抗微生物薬剤の出現は肺炎球菌疾患からの全般的な死亡率を減少させたが、抵抗性を有する肺炎球菌類微生物の存在は今日世界の大きな問題となった。効果的な肺炎球菌ワクチンはストレプトコッカス・ニューモニアエ疾患に関わる罹患率および死亡率に対する大きな影響を及ぼした。そのようなワクチンはまた幼児および小児の中耳炎を予防するのに役立つ可能性がある。疾患の病因論では多数の肺炎球菌に関する因子が潜在的に重要であるのは明らかである［G.J.ブルノワ(Boulnois)、J.Gen.Microbiol.，138,249-259（1992）；C.J.リー(Lee)ら，Crit.Rev.Microbiol.,18,89-114（1991）］。肺炎球菌の被膜は毒性が欠如しているにも拘わらず肺炎球菌の毒力に関係ないとはいえないと考えられている。抗原性の差異にもとづいて80以上の肺炎球菌被膜の血清型が同定されている。抗体は防御のメカニズムであり、ストレプトコッカス・ニューモニアエに対する宿主の防御における抗被膜性抗体の重要性は十分に確証されている［R．オーストゥリアン(Austrian)，Am.J.Med.，67,547-549（1979）］。にもかかわらず、現在使用できる肺炎球菌ワクチンは、23の被膜性多糖類を含み、屡々病気を引き起こすが、被膜性多糖類の免疫原性の乏しさ、血清型の多様性、および時間、地理学的地域と年代グループにわたる血清型の分布における差異、のような重要な欠点を持っている。特に、現存ワクチンが多くの血清型から小さい子ども達を守るに十分でないことは他のストレプトコッカス・ニューモニアエ成分の検討評価に拍車をかけることとなった。幾つかの肺炎球菌蛋白質が防御と病原性の両面で積極的な役割を演じている可能性があることを示す証拠も増加しつつある［J.C.ペイトン(Paton),Ann.Rev.Microbiol.,47,89-115（1993）］。しかしこれまでのところ、ほんの少数のストレプトコッカス・ニューモニアエ蛋白質が研究されてきたにすぎない。これは蛋白質に特異的な抗体類の不足からくるものであろうし、この不足が防御と病原性の点での蛋白質抗原の役割についての研究を困難にしているのである。肺炎球菌性蛋白質抗原はあまり免疫原性がなく、また多くの抗体応答はホスホコリンと被膜性多糖類に対している、と信じられている［L.S．マクダニエル(McDaniel)ら，J.Exp.Med.，160,386-397（1984）;R.M .クラウゼ(Krause)，Adv.Immunol.，12,1-56(1970);D.G.ブラウン(Braun)ら，J. Exp.Med.，129,809-830（1969）］。糖質抗原に対してもまたホスホコリンに対しても応答性に乏しいが、蛋白質抗原に対しては比較的正常に応答する、Ｘ-伴性免疫不全マウスの研究において、肺炎球菌性蛋白質抗原と反応するモノクローナル抗体を得る頻度は10％以下であり、このことはストレプトコッカス・ニューモニアエ蛋白質が劣った免疫原である［マクダニエル(McDaniel)ら，上記］ことを示唆している。ストレプトコッカス・アガラクチアエはまたＢ群連鎖球菌(GBS)とも呼ばれ、敗血症（血液感染）および新生児の髄膜炎の極めて一般的な原因である。GBSはまた屡々新生児肺炎の原因でもある。米国では約8000人の乳児が毎年GBS疾患にかかり、これらの乳児の5％-15％が死亡する。生き残る乳児、特に髄膜炎を持つ乳児は、聴覚または視覚の喪失または学習障害のような長期にわたる問題を抱える可能性がある。妊婦においてはGBSは泌尿器領域の感染症、子宮感染症（羊膜炎、子宮内膜炎）、および死産を引き起こすことがあり得る。妊娠していない婦人および男子の間で、GBSによって引き起こされる最も普通の疾患は血液感染症、皮膚または柔組織感染症、および肺炎である。GBS疾患を持つ男子および妊娠していない婦人の約20％がこの疾患がもとで死亡する。新生児および成人のGBS 感染症は通常静脈内投与される抗生物質（例えばペニシリンまたはアンピシリン）で治療される。新生児の多くのGBS疾患は出産時に一定の妊婦に抗生物質を静脈内投与することによって防ぐことができる。GBS疾患を予防するワクチンは開発されつつある。将来、ワクチンを接種される婦人は、胎盤を経由する抗体を作って出生時および幼児初期に乳児を予防することが期待されている。ストレプトコッカス・ピオゲネスはまたA群連鎖球菌(GAS)とも呼ばれるが、19 80年代以降、微生物毒性の増大による重篤な疾患の原因として再浮上しつつある。GASは、普通“連鎖球菌のど”と呼ばれる咽頭炎、および皮膚感染症（膿痂疹、丹毒／蜂巣炎）を引き起こす。“連鎖球菌のど”および膿痂疹は糸球体腎炎（腎障害）に至る可能性がある。“連鎖球菌のど”感染症の約3％が結果としてリュウマチ熱（移動する関節炎）となり、その合併症は舞踏病（神経症状）、および、50％の場合、長期にわたる結果の可能性あるものとして心内膜炎を伴うリュウマチ性心疾患（心臓弁膜障害）、を含む。膿痂疹および“連鎖球菌のど”を抗生物質を用いて治療し合併症の展開を予防することは重要である。毒素生産菌株による感染は猩紅熱（広範囲の発疹と発熱）または非常に重篤な連鎖球菌性毒素ショック症候群(TSS；GASは‘肉食バクテリア’と呼ばれてきた)を結果として招来する可能性があり、後者はショックの速やかな広がりと器官系の多重機能不全が特徴である。TSSは、細菌感染病巣の除去と抗生物質療法を含む精力的な治療にも拘わらず30から70％の死亡率を持つ。TSSの発生率は100,000当たり10から20 症例である。GASに対するワクチンは現在利用できない。熱ショックまたはストレス蛋白質類（“HSPs”）は自然界に見いだされるものの内で極めて高く維持され、かつ豊富な蛋白質の一つである［F.C．ナイトハルト(Neidhardt)ら，Ann.Rev.Genet.,18,295-329(1984);S．リンドキスト(Lidnqui st),Ann.Rev.Biochem.55、1151-1191（1986）］。それらはさまざまな生理学的および非生理学的な刺激に応答するすべての細胞によって生産される。突然の温度上昇がHSPsの合成を誘発する熱ショック応答は、ストレス応答の内で最もよく研究されたものである。低いpH、鉄欠乏、過酸化水素のような他の環境条件もまたHSPsを誘起し得る。HSPsはそれらのサイズによって定義され、hsp90、hsp70、およびhsp60ファミリーのメンバーはすべての原核生物および真核生物中に見いだされる主要なHSPsの一つである。これらの蛋白質は、蛋白質の折り畳みと組み立てを助け、膜を横断する移動に手を貸すことによって多様なシャペロン機能を遂行する［C．ゲオルゴプロス(Georgopoulos)、W.J．ウェルチ(Welch)、Ann.Rev .Cell.Biol.，9，601-634(1993);D．アング(Ang)ら，J.Biol.Chem.266，24233-2 4236（1991）］。分子シャペロンとしてまた恐らくは他のメカニズムを介して、 HSPsはストレスの有害な影響から細胞を守るのに関係していると思われる。幾つかの毒性因子が環境条件によって調整されるという事実は微生物の病原性におけるHSPsの役割を示唆するものである［J.J．メカラノス(Mekalanos)、J.Bacterio l.，174，1-7（1992）;P.J．マレー(Murray)およびR.A．ヤング(Young)J.Bacter iol.174，4193-4196（1992）］。それに関連して、サルモネラ種に関する最近の研究は、ストレス応答が、感染を開始し持続する細胞内病原体の能力に密接に結びついていることを示唆している［N.A．ブクマイア(Buchmeir)およびF．ヘフロン(Heffron),Science，248，730-732(1990);K.Z．アプシャイア(Abshire)、F.C ．ナイトハルト(Neidhardt)、J.Bacteriol.，175，3734-3743(1993);B.B．フィンレー(Finlay)ら、Science，243，940-943（1989）］。他の人たちは、リステリアモノシトゲネス(L．monocytogenes)の重要な毒性因子であるリステリオリジンが熱ショック条件下で誘発されることを示した［Z．ソコロウィッツ(Sokolo vic)およびW．ゲーベル(Goebel)、Infect.Immun.，57，295-298（1989）］。 HSPが多くの病原体の主要な抗原であるという証拠は今集まりつつある。hsp60 ファミリーのメンバーは、その大腸菌のGroEL蛋白質に対する類似性のためにGro EL関連蛋白質とも呼ばれるが、これらは癩菌、ヒト型結核菌［D．ヤング(Young) ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，4267-4270(1988)］、レジオネラニューモフィラ（Legionella pneumophila）［B.B．プリンカイティス(Plikaytis)ら、J. Clin.Microbiol.，25，2080-2084（1987）］、ボレリアブルグドルフェリ（Po rrelia burgdorferi）［B.J．ルフト(Luft)ら、J.Immunol.，146，2776-2782（1 991）］、およびクラミジアトラコマティス (Chlamydia trachomatis)［E.A．ウェイガー(Wagar)ら、J.Infect.Dis.，162，922-927（1990）］を含むさまざまな細菌性病原体の主要な抗原である。この抗原は至る所に存在する“普通の抗原 ”の同族体であり、あらゆる細菌中に存在すると信じられている［J.E．ソール( Thole)ら、Microb.Pathogen.，4，71-83（1988）］．hsp70ファミリーのメンバー、またはDnak-関連蛋白質、に対する抗体類はまた、幾つかの細菌および寄生生物の感染症に関して記述されている［ヤング(Young)ら、上述；ルフト(Luft) ら、上述；D.M．エングマン(Engman)ら、J.Immunol.，144，3987-3991（１９９０）；N.M．ロートシュタイン(Rothstein)ら，Molec.Biochem.Parasitol.，33， 229-235（1989）；V．ヌッセンツヴァイク(Nussenzweig)およびR.S．ヌッセンツヴァイク(Nussenzweig)、Adv.Immunol.，45，283-334（1989）］。HSPsは強いB- およびT-細胞応答を誘い出すことができ、ヒト結核菌を接種されたマウスからの CD4+T-リンパ球の20％がhsp60蛋白質だけに対して反応性を有していることが示された［S.H.E．カウフマン(Kaufman)ら、Eur.J.Immunol.，17，351-357（1987 ）］。同様に、癩菌蛋白質に対する24のモノクローナル抗体コレクションの中の 7がhsp60上の抗原決定基を認識した［H.D．エンガース(Engers)ら、Infect.Immu n.，48，603-605（1985）］。ストレス蛋白質に対する免疫応答は感染症に対する防御に重要な役割を演じる可能性があるように思われる。微生物のHSPsと反応性ある抗体類およびT細胞は中和し、防御的活性を示す実例はそれと一致する［A ．ノル(Noll)ら、Infect.Immun.，62，2784-2791（1994）；S.L．ダニリション( Danilition)ら、Infect.Immum.，58，189-196（1990）］。ストレス蛋白質の免疫学的諸性質はそれらをワクチン成分として魅力あるものとし、幾つかのHSPsが現在、微生物感染を予防し、がんを治療する目的で考えられている。しかしながら現在のところ、研究はミコバクテリア、サルモネラ、クラミジアおよび幾つかの寄生生物のような細胞内病原体に焦点が絞られた。細胞外グラム陽性細菌中の熱ショック蛋白質抗原に関する情報の提供ははるかに少ない。ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエでは、いかなる熱ショック蛋白質もそれらの遺伝子構造も同定されてはいない。発明の開示本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエからの新規な熱ショック蛋白質、および免疫学的に関連したポリペプチド、を提供することによって上述の諸問題を解決するものである。上述のポリペプチドをコードするDNA配列、ポリペプチドを含むベクター、これらのベクターを用いて形質転換された単細胞宿主、および実質上純粋な組換えポリペプチドを製造する方法、もまた提供する。上述のポリペプチドに対して特異的な抗体も提供する。本発明のポリペプチド、DNA 配列および抗体は、疾患の検出、予防および治療のための新規な方法と薬剤組成物の基礎を提供するものである。特に本発明は、連鎖球菌株に特異的なこれらのポリペプチドの断片に基礎をおいた新規なワクチンを提供するものである。この新規な熱ショック蛋白質はストレプトコッカス・ニューモニアエの約72kD a熱ショック蛋白質（“HSP72”）（配列番号5）、ストレプトコッカス・ピオゲネスの約70kDa熱ショック蛋白質(“HSP70”)（配列番号20）およびストレプトコッカス・アガラクチアエの約70kDa熱ショック蛋白質（“HSP70”）（配列番号22 ）であり、類似体、同族体、およびその誘導体、および少なくとも一つの免疫原性エピトープを含有する上述のポリペプチドの断片を含むものである。HSP70/72 の好ましい断片はHSP70/72のC-末端部を含む。より詳しくは、それはＣ-末端169 -残基断片（“Ｃ-169”）（残基439-607、配列番号5）、Ｃ-末端151-残基断片（ “C-151”）（残基457-607、配列番号5）、およびC-169領域内のペプチドエピトープから成るより小さな断片、を含む。HSP72のC-169領域内の特に好ましい断片は、ペプチド配列GFDAERDAAQAALDD（配列番号5の残基527-541）およびAEGAQATGN AGDDVV（配列番号5の残基586-600）を含み、これはストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72に独占的なものである。更により好ましいのは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエに対しては免疫反応を誘い出すが人宿主に対しては自己免疫反応を引き起こさない断片である。そのような断片は次のペプチドから選んでもよい、すなわち、CS870、CS873、CS874、CS875、CS876、CS877、CS878、CS879、 CS880、CS882、MAP1,MAP2、MAP3およびMAP4（表-5を見よ、上述）。本発明の好ましい抗体は、F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3およびF2-Pn3.4モノクローナル抗体（“MAbs”）、でこれはHSP72に特異的である。更に好ましい抗体は、HSP70およびHSP72両方に特異的なF2-Pn3.2およびF2-Pn3.4 モノクローナル抗体である。更により好ましいのはストレプトコッカス・ニューモニアエに特異的なF1-Pn3.1抗体である。本発明の好ましいポリペプチドと抗体は、肺炎球菌性疾患の検出、予防および治療のための新規な方法および薬剤組成物、の基礎を提供するものである。図面の概要説明図1は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ蛋白質合成に対する熱ショックの影響を示すフロログラムを示す。パネルAの細胞抽出物は6型64株のストレプトコッカス・ニューモニアエである。パネルBの細胞抽出物は4型53株のストレプトコッカス・ニューモニアエである。奇数番号レーンの細胞抽出物は37℃で培養された。偶数番号レーンの細胞抽出物は45℃で5分間培養された。細胞抽出物はついで［35Ｓ］メチオニンを用い10分（レーン1，2および7，8）、30分（レーン3 ，4および9，10）、または60分（レーン5，6）標識された。分子量マーカーはキロダルトンで左に示されている。HSP80、HSP72およびHSP62の位置は各パネルの右側サイドに矢印で示されている。図2は、熱ショックを受けた（…）および受けない（―）の場合におけるストレプトコッカス・ニューモニアエ中の［³⁵Ｓ］メチオニン-標識蛋白質の電気泳動プロフィールの比較をグラフに示したものである。濃度変化は、標識蛋白質帯の移動度（Ｘ軸）に対する相対的吸光度によって測定された。図1、レーン1および2のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム） PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の濃度測定曲線が示されている。図3は、洗剤可溶性のストレプトコッカス・ニューモニアエ蛋白質抽出物で免疫化されたマウスの血清によって免疫沈降されたストレプトコッカス・ニューモニアエ蛋白質抗原を示すフロログラムである。37℃で生育し37℃で培養された（レーン3、5、7および9）または45℃で熱ショックを受けた（レーン4、6、8および10）、ストレプトコッカス・ニューモニアエからの［³⁵Ｓ］メチオニン-標識蛋白質は、マウス1（レーン3から6）またはマウス2（レーン7から10）の血清を用いて免疫沈降され、ついでSDS-PAGE およびフロログラフィーによって分析された。血清は第1回（レーン3、4および7、8）および第2回目（レーン5、6および 9、10）の免疫感作ののち試験された。［³⁵Ｓ］メチオニン-標識され、非熱ショックおよび熱ショックされたストレプトコッカス・ニューモニアエの細胞溶解物は、それぞれレーン1と2に示されている。HSPsの位置はフロログラムの左に矢印で示されている。図4は、加熱殺菌されたストレプトコッカス・ニューモニアエで免疫化されたマウスの血清によって免疫沈降されたストレプトコッカス・ニューモニアエ蛋白質抗原を示すフロログラムである。37℃で生育、37℃で培養された（レーン3、5 および7）または45℃で熱ショックを受けた（レーン4、6および8）ストレプトコッカス・ニューモニアエの［³⁵Ｓ］メチオニン-標識蛋白質は、マウス1（レーン 3、4）、マウス2（レーン5、6）またはマウス3（レーン7、8）からの血清を用いて免疫沈降され、ついでSDS-PAGEおよびフロログラフィーによって分析された。血清は第2回目の免疫感作後のみ試験された。［³⁵Ｓ］メチオニン-標識され、熱ショックを受けない-また熱ショックを受けたストレプトコッカス・ニューモニアエからの細胞溶解物は、それぞれレーン1と2に示されている。HSPsの位置は、フロログラムの左に矢印で示されている。図5は、ウエスタンブロット分析によって検出されたストレプトコッカス・ニューモニアエ抗原を示す写真である。全細胞抽出物は、加熱殺菌されたストレプトコッカス・ニューモニアエで免疫化された15のマウス（レーン1-15）の血清を用いて探索された。レーン16は、モノクローナル抗体(MAb)F1-Pn3.1によって検出されたHSP72蛋白質を示す。パネルAでは、血清は第2回の免疫感作後に試験された。パネルBでは、第1回の免疫感作後に試験された15の血清のうちの4つの反応性が示されている。53.5kDa-および47kDa-蛋白質帯の位置が左に棒線で示されている。HSP72の位置は各パネルの右に矢印で示されている。図6は、HSP72に対するMAb F1-Pn3.1の特異性を示すフロログラムである。熱ショックを受けない（レーン1、3および5）または受けた（レーン2、4および6）ストレプトコッカス・ニューモニアエの［³⁵Ｓ］メチオニン-標識蛋白質は、Ig2 a-制御MAb（レーン3、4）、またはF1-Pn3.1（レーン5、6）を用いて免疫沈降され,ついでSDS-PAGEおよびフロログラフィーによって分析された。［³⁵Ｓ］メチオニン-標識され、熱ショックを受けない-また熱ショックを受けたストレプトコッカス・ニューモニアエからの細胞溶解物は、それぞれレーン1と2に示されている。HSPs（3すべて）の位置は、フロログラムの左に矢印で示されている。図7、パネルAは、免疫ブロットであり、熱ショックを受けた、また熱ショックを受けない［³⁵Ｓ］メチオニン-標識されたストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞抽出物とMAbF1-Pn3.1の反応を示すものである。レーン1は熱ショックを受けた細胞溶解物（45℃）を含む。レーン2は熱ショックを受けない細胞溶解物（3 7℃）を含む。パネルBはパネルAに示された免疫ブロットのフロログラムを示したものである。図8は、ストレプトコッカス・ニューモニアエHPS72の細胞画分の局在部位を示すウエスタンブロットである。ストレプトコッカス・ニューモニアエの膜分画（レーン1）の蛋白質15μgを含む試料および細胞質分画（レーン2）はSDS-PAGE上で電気泳動にかけられ、ニトロセルローズに移動され,MAb F1-Pn3.1を用いて探索された。図9は、ストレプトコッカス・ニューモニアエHPS72のC-169領域を含む組換え融合蛋白質の、MAb F1-Pn3.1 との反応性を示す免疫ブロットの写真である。レーン1は、HSP72-特異的なMAb F1-Pn3.1を用いて探索されたストレプトコッカス・ニューモニアエ細64株からの全細胞抽出物を含む。レーン2と3は、IPTG（イソプロピルチオガラクトシド）の存在下（+）または不存在下（-）で培養された λJBD17に感染した大腸菌からのファージ溶解物を含む。レーン4と5は、IPTGの存在下（+）または不存在下（-）で培養されたλJBD7に感染し、HSP72-特異的な MAb F1-Pn3.1を用いて探索された大腸菌からのファージ溶解物を含む。分子量マーカーは左に示されている。74kDa- および160kDa-反応蛋白質は左と右にそれぞれ示されている。図10は、HSP72(DnaK)とフコースの位置の制限酵素地図および組換えクローンの挿入配列の模式図である。DNA断片の間の関係はお互いに関連して示されている。図10Aおよび10Cは、HSP72(DnaK)とフコースそれぞれの位置の制限酵素地図である。図10Bは、実施例3に記述されたさまざまなファージおよびプラスミドの挿入配列を示す。H(HindIII);E(EcoRI);V(EcoRV);P(PstI);およびX(XhoI)は制限エンドヌクレアーゼ部位を示すものである。HSP72／DnaK上のDNA断片の位置(■) ;フコースの位置(///);およびサザンブロット分析でプローブとして用いられる断図11は組換え74kDa蛋白質のSDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析を示す。プラスミドpJBD179（レーン1）、pJBDf51（レーン2および3）およびpJBDf62（レーン4および5）を用いて形質転換され、IPTGの存在下（+）または不在下（-）で培養された大腸菌からの全細胞抽出物は10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた。蛋白質はついでHSP-特異的なMAb F1-Pn3.1を用いてクーマッシーブルー染色(A)またはウエスタンブロッティング(B)により視覚化された。分子量マーカーはキロダルトンで左に示されている。各パネルの左側の矢印は74kDa蛋白質マーカーを記している。図12はウエスタンブロット分析による天然および組換えHSP72抗原の検出を示したものである。プラスミドpJBDk51（レーン1および3）およびpJBD291（レーン 2）を用いて形質転換された大腸菌からの全細胞溶解物およびストレプトコッカス・ニューモニアエ64株からの細胞溶解物は、10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付され、ニトロセルローズに電気移動された。免疫ブロットはHSP72-特異的なMAb F1-Pn3.1を用いて探索された。図13A-13Dはストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72のオープンリーディングフレーム(HSP72 SPNEU)の推定アミノ酸配列と、次のようなHSP70/DnaK蛋白質に対して以前に報告された配列との比較を示している；ECOLI，大腸菌；BORBU, ボレリアブルグドルフェリ(ヒトLyme病);BRUOV，ブルセラオヴィス；CHLPN ，肺炎クラミジア；BACME，巨人菌；BACSU，枯草菌；STAAU，黄色ブドウ球菌；L AC LA，乳酸球菌；およびMYCTU，ヒト結核菌。ミスマッチアミノ酸だけが示されている。一致したアミノ酸および保持されたアミノ酸はそれぞれ枠で囲み、また陰をつけて表している。図14は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製された組換えストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72を示すSDS-PAGEの写真を描いたものである。大腸菌(pJBDk51)溶解物からの浮遊分画（レーン2）および免疫親和-精製されたHSP72rec（レーン3）20μgが10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた。蛋白質はクーマシー染色によって視覚化された。レーン1は分子量マーカーの移動(106kDa，80kDa，49.5kDa，32.5kDa，27.5kDa，および18.5kDa)を示す。図15は、封入体の可溶化によって精製された組換えストレプトコッカス・ニューモニアエC-169断片を示すSDS-PAGEの写真である。さまざまな量の精製されたC -169蛋白質（レーン1，5μg；レーン2，2.5μg；およびレーン3，1μg）およびプラスミドpDELTA1（レーン4）およびpJBDΔ1（レーン5）を用いて形質転換された大腸菌からの全細胞溶解物が10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた。蛋白質はついでクーマシーブルー染色によって視覚化された。図16は、HSP72recを用いた免疫感作によってストレプトコッカス・ニューモニアエ感染から保護されたBalb/cマウスの生存曲線を表すグラフである。データは実験グループ当たり10匹のマウスの全体に対する14日の期間を越えた生存率（％）として示されている。図17は、C-169recを用いた免疫感作によってストレプトコッカス・ニューモニアエ感染から保護されたBalb/cマウスの生存曲線を表すグラフである。データは実験グループ当たり10匹のマウスの全体に対する14日の期間を越えた生存率（％）として示されている。図18は、ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72のカルボキシ末端の151 個のアミノ酸のコード領域であるC-151recを含むプラスミドpURV3の地図である；AmpiR，アンピシリン-抵抗コード領域；ColE1 ori，複製起点；cI857，バクテリオファージλ cI857 温度-感受性リプレッサー遺伝子；λPL,バクテリオファージλ転写プロモーター；T1，T1転写ターミネーター。転写の方向は矢印で示されている。Bg1IIおよびBamHIは、ストレプトコッカス・ニューモニアエのHS P72のC -151recのコード領域を挿入するのに用いられる制限部位である。図19は、HSP72recを用いて免疫化されたBalb/cマウスの血清中の抗-ストレプトコッカス・ニューモニアエタイターの分布を示している。血清は、1μg(○) または5μg（●）のHSP72recを用いた第1回，第2回および第3回の注射後に収集され、ELISAにより抗-ストレプトコッカス・ニューモニアエ抗体について個々に評価された。タイターは、A410値（光学密度）がバックグラウンド値上0.1である最高希釈として定義された。実線は各グループのマウスの抗体タイターの逆数の中央値を示し、他方、破線は免疫前血清の中央値を示す。図20は、C-169recを用いて免疫化されたBalb/cマウスからの血清中の抗-ストレプトコッカス・ニューモニアエタイターの分布を示している。血清は1μg(○ )または5μg（●）のC-169recを用いた第1回，第2回および第3回の注射後に収集され、ELISAにより抗-ストレプトコッカス・ニューモニアエ抗体について個々に評価された。タイターは、A410値がバックグラウンド値上0.1である最高希釈として定義された。実線は各グループのマウスの抗体タイターの逆数の中央値を示し、他方、破線は免疫前血清の中央値を示す。図21は、C-151recを用いて免疫化されたBalb/cマウスからの血清中の抗-ストレプトコッカス・ニューモニアエタイターの分布を示している。血清は1μg(○ )または5μg（●）のC-151recを用いた1回目，2回目および3回目の注射後に収集され、ELISAにより抗-ストレプトコッカス・ニューモニアエ抗体について個々に評価された。タイターは、A410値がバックグラウンド値上0.1である最高希釈として定義された。実線は各グループのマウスの抗体タイターの逆数の中央値を示し、他方、破線は免疫前血清の中央値を示す。図22は、組換えHSP72抗原を用いて免疫化されたサイノモルガスモンキーの抗体応答を示す。2匹のサルのグループがHSP72recかまたはC-169rec蛋白質を用いて1日、22日および77日に免疫化された。血清は免疫感作が進行する間規則的に収集され、ウエスタンブロット分析によって肺炎球菌性HSP72に特異的な抗体について個々に評価された。タイターはHSP72帯が可視化される最高希釈として定義された。図23は、固相ELISAでのペプチドに対する高度免疫血清の結合を示す。HSP72re cまたはC-169rec蛋白質を用いて免疫化されたウサギ、マウスおよびサルの血清のペプチドに対する反応性を調べた。1：1000希釈された血清を用いて得られたペプチドMAP2に対するウサギ血清の反応性ならびにペプチドMAP2およびMAP4に対するネズミ血清の反応性に対応する吸光度を除き、1：100希釈で試験された血清を用いて得られた。図24はストレプトコッカス・ニューモニアエ(spn-orf)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(sga-orf)およびストレプトコッカス・アガラクチアエ(sgb-orf)の hsp70/dnak オープンリーディングフレームのDNA配列から確立されたコンセンサス配列を示し、各々の種に特異的なヌクレオチドの置換および挿入配列を示す。図25は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(spn-prot)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(sga-prot)およびストレプトコッカス・アガラクチアエ(sgb-pro t)のHsp70の蛋白質配列から確立されたコンセンサス配列を示し、それぞれの種に特異的なアミノ酸の置換および挿入配列を示す。図26は、ストレプトコッカス・アガラクチアエの蛋白質合成に対する熱ショックの影響、およびMAb F2-Pn3.4により免疫沈降されたストレプトコッカス・アガラクチアエ蛋白質抗原、を示すフロログラムである。37℃で生育し37℃で培養された（奇数番号レーン）、または43℃で熱ショックを受けた（偶数番号レーン）ストレプトコッカス・アガラクチアエからの［³⁵Ｓ］メチオニン-標識蛋白質から得た細胞溶解物は、SDS-PAGE およびフロログラフィーによって分析された。レーン3および4はMAb F2-Pn3.4を用いて得られた免疫沈降体を示す。発明の詳細な説明本発明の一形態は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエの新規な熱ショック蛋白質、その類似体、同族体、誘導体および少なくとも一つの免疫原性エピトープを含む断片、を提供する。本明細書において“熱ショック蛋白質”とは、熱ストレス条件下で優先的な転写を意味する、天然に産出する蛋白質である。本発明の熱ショック蛋白質は天然起源であってもよく、またはは組換え技術または従来の化学合成技術を応用して得られてもよい。本明細書において“免疫原性の”とは、免疫応答を誘い出す能力を持つことを意味する。本発明の新規な熱ショック蛋白質は、連鎖球菌感染に対して、より詳しくは致命的なストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエに対して、防御的な免疫応答を誘起するそれらの能力によって特徴づけられる。本発明は特に、配列番号5の推定アミノ酸配列を持つ、約72kDa（“HSP72”）のストレプトコッカス・ニューモニアエ熱ショック蛋白質、および類似体、同族体、誘導体および少なくとも一つの免疫原性エピトープを含むその断片、を提供するものである。本明細書においてHSP72の“類似体”とは、類似体蛋白質の機能と免疫原的諸性質が全体として保持されるという条件で、HSP72のアミノ酸配列（配列番号5）中の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置き換えられているようなストレプトコッカス・ニューモニアエ蛋白質を意味する。そのような類似体は、自然に産出するものであってもよいか、または合成的に作成されてもよいし、また組換えDNA技術によって、例えば、HSP72配列の突然変異誘導技術によってもよい。HSP72の類似体は、HSP72、例えばストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエ、と反応する抗体を誘起する能力のある抗原を少なくとも一つは有するであろう。本明細書においてHSP72の“同族体”とは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはストレプトコッカス・アガラクチアエ以外の連鎖球菌種、または連鎖球菌以外の属由来の蛋白質であって、HSP72 のアミノ酸配列（配列番号5）中の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置き換えられていて、同族体体蛋白質の機能と免疫原的諸性質が全体として保持されているものをいう。そのような同族体は、天然に産出するものであってもよいか、または合成的に作成されてもよいし、また組換えDNA技術によってもよい。HSP72の同族体は、HSP72、例えばエンテロコッカスフェカリスと反応する抗体を誘起する能力ある抗原を少なくとも一つを有するであろう。本明細書において“誘導体”とは、一つ或いはそれ以上の物理的、化学的、または生物学的諸性質が変えられてしまったようなポリペプチドを意味する。そのような変化は、アミノ酸置換、修飾、付加または欠失；脂質化、グリコシル化またはホスホリル化のパターンの変更；ポリペプチド中に存在するアミノ酸残基の遊離のアミノ、カルボキシル、またはヒドロキシ側基の、他の有機または非有機分子との反応；およびそのいずれも一次、二次または三次構造の変化を招く可能性があるその他の変更を含むが、それに限られるものではない。本発明の“断片”は、少なくとも一つの免疫原性エピトープを有する。“免疫原性エピトープ”とは免疫応答を誘起するのに役立つエピトープを意味する。本発明の好ましい断片は感染、例えばストレプトコッカス・ニューモニアエ感染の厳しさを防ぐかまたは軽減するに十分な免疫応答を誘起するだろう。HSP72の好ましい断片はポリペプチドのC-末端領域を含む。より好ましい断片は、C-末端の 169-残基断片（“C-169”）（配列番号5、残基439-607）、C-末端の151-残基（ “C-15”）（配列ID NO’5、残基457-607）およびC-169領域内のペプチドエピトープから成るより小さな断片、を含む。HSP72のC-169領域内のとりわけ好ましい断片は、ペプチド配列 GFDAERAAQAALDD（配列番号5 の残基527-541）およびAEGA QATGNAGDDVV（配列番号5 の残基586-600）、これらはストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72に独占的であるか、またはストレプトコッカス・ピオゲネスまたはストレプトコッカス・アガラクチアエからの対応する変性断片である。更により好ましいのは、連鎖球菌株に対する特異的な免疫反応を誘起する断片である。そのような断片は次のペプチドから選んでもよい；CS870、CS873、CS874 、CS875、CS876、CS877、CS878、CS879、CS880、CS882,MAP1、MAP2、MAP3、およびMAP4（表 5を見よ、上述）、またはその同族体。本発明の更なる形態において、我々はHSP70／72に免疫学的に関連するポリペプチドを提供する。本明細書において“免疫学的に関連する”ポリペプチドとは、次の諸性質の一つまたはそれ以上によって特徴づけられるものをいう； a)ストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞によるほ乳類宿主の感染によって生成される抗体と免疫学的に反応し、その抗体はHSP72(配列番号5)およびHSP70 （配列番号20および配列番号22）と免疫学的に反応する； b)HSP72(配列番号5)およびHSP70（配列番号20および配列番号22）と免疫学的に反応する抗体を誘起する能力を有する； c)HSP72（配列番号5）を用いたほ乳類の免疫感作によって誘起された抗体と免疫学的に反応する。 HSP70／72の類似体、同族体および誘導体は、定義により、免疫学的に関連するポリペプチドである。更に、すべての免疫学的に関連するポリペプチドは少なくとも一つのHSP70／72抗原を含む。したがって、“HSP70／72 抗原”はHSP70／ 72それ自身、または免疫学的に関連するポリペプチド中に見いだされる可能性がある。本発明の更なる形態において、HSP72に免疫学的に関連するポリペプチドを提供する。本明細書において“免疫学的に関連する”ポリペプチドとは、次の諸性質の一つまたはそれ以上によって特徴づけられるものをいう； a)ストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞によるほ乳類宿主の感染によって生成される抗体と免疫学的に反応し、その抗体はHSP72(配列番号5)と免疫学的に反応する； b)HSP72(配列番号5)と免疫学的に反応する抗体を誘起する能力を有する； c)HSP72（配列番号5）を用いたほ乳類の免疫感作によって誘起された抗体と免疫学的に反応する。 HSP72の類似体、同族体および誘導体は、定義により、免疫学的に関連するポリペプチドである。更に、すべての免疫学的に関連するポリペプチドは少なくとも一つのHSP72抗原を含む。したがって、“HSP72 抗原”はHSP72それ自身、または免疫学的に関連するポリペプチド中に見いだされる可能性がある。本明細書において“関連する細菌”とは、HSP72と反応する抗体を誘起する能力のある抗原を有する細菌を意味する。関連する細菌の例は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカスミュータンス、ストレプトコッカス・サングイス、ストレプトコッカス・アガラクチアエおよびエンテロコッカス・フェカリスを含む。本発明の実施例に従うことによって、当業者は、ある特定の類似体、同族体、誘導体、免疫学的に関連するポリペプチド、または断片が、疾患の診断、予防または治療に役立つかどうかを、過度の実験をすることなく決定できることが理解されるであろう。有用なポリペプチドおよび断片は、HSP72（実施例4）と免疫反応性を有する抗体を誘起するだろう。好ましくは、有用なポリペプチドおよび断片は、致命的な細菌感染に対して防御的な免疫応答を誘起する能力を示すだろう（実施例5）。本発明のポリペプチドの重合型も含まれる。これらの重合型は例えば、アビジン／ビオチン、グルタルデヒドまたはジメチルスベルイミデートのような架橋試薬で架橋された一つあるいはそれ以上のポリペプチドを含む。そのような重合型はまた、組換えDNA技術によって作成された多重シストロン性mRNAから生じた、一つ或いはそれ以上の縦並びまたは反転隣接した蛋白質配列を含むポリペプチド、も含有する。本発明は実質的に純粋なHSP72および免疫学的に関連するポリペプチドを提供する。“実質的に純粋な”という語句は、本発明のポリペプチドおよびそれらをコードするDNA配列が、細菌起源の他の蛋白質を実質的に含んでいない、ことを意味する。実質的に純粋な蛋白質試料は、さまざまな従来方法、例えば実施例3 および5に述べられた手順によって得てもよい。一つの形態において、本発明は、初めて、ストレプトコッカス・ニューモニアエの熱ショック蛋白質をコードするDNA配列、具体的には、HSP72（配列番号4、ヌクレオチド682-2502）を提供するものである。本発明のDNA配列は、またHSP72の類似体および同族体ポリペプチドをコードするDNA配列、免疫学的に関連するポリペプチドをコードするDNA、および上述のDN A配列のいずれに対しても変性しているDNA配列およびすべての上述のDNA配列の断片を含む。当業者ならば、ひとたびポリペプチドが同定され分離されれば、従来のDNA配列決定技術を用いて、本発明のポリペプチドすべてのDNA配列を決定できるだろうことは容易に認められよう。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子から導き出されるオリゴヌクレオチドプライマーおよび他の核酸プローブはまた、ストレプトコッカス・ニューモニアエおよび関連細菌からの他の関連する蛋白質を分離しクローンするのに用いてもよく、この関連細菌は本発明のDNA配列に相同的であるDNA細菌の範囲を含んでもよい。加えて、本発明のDNA配列はPCR反応において生物試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌の存在を検出するのに用いてもよい。本発明のポリペプチドは、例えば、イオン交換およびゲルクロマトグラフィーおよび電気泳動のような従来の分離技術を使って、または組換えDNA技術を用いて、適当な細胞抽出物から蛋白質分画により、さまざまな方法から調製してもよい。組換えDNA技術の使用は、本発明による実質的に純粋なポリペプチドを調製するのに特に適している。本発明の更なる形態は、HSP72、免疫学的に関連するポリペプチド、およびその断片の製造方法を提供する。これは、(1)上述のポリペプチドまたは断片をコードするDNA配列、およびそのDNA配列に有効に連結した一つまたはそれ以上の発現制御配列を含むベクターを用いて形質転換された単細胞宿主微生物を培養、(2 )実質的に純粋なポリペプチドまたは断片を回収するという段階を含む。技術的にはよく知られているように、宿主中でDNA感染された遺伝子のハイレベルの発現を得るためには、遺伝子は、選ばれた発現宿主中で機能している転写および翻訳の発現制御配列に有効に連結していなければならない。好ましくは、発現制御配列、および問題の遺伝子は、一つの発現ベクターに含まれ、ベクターは更に一つの細菌性選択マーカーと複製起点を含むことになろう。もし発現宿主が真核生物の細胞であるならば、発現ベクターは更に真核生物の発現宿主中で有効な発現マーカーを含むべきである。発明のポリペプチドをコードするDNA配列はシグナル配列をコードしてもしなくてもよい。もし発現宿主が真核ならば、成熟した蛋白質が真核生物の宿主から分泌されるようにシグナル配列がコードされるのが一般的には好ましい。アミノ末端メチオニンは、本発明の発現されたポリペプチド上に存在してもしなくてもよい。もし末端メチオニンが発現宿主によって切り取られなければ、それはもし望ましければ、標準技術によって化学的に除去してもよい。本発明のDNA配列を発現するに当たっては、広くさまざまな宿主／ベクターの組合せを用いてもよい。真核宿主に対する有用な発現ベクターは、例えば，SV40 （サル空胞ウイルス）からの発現制御配列を含むベクター、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ-関連ウイルス、、サイトメガロウイルス、およびレトロウイルスを含む。細菌宿主に対する有用な発現ベクターは、pBluescript、p GEX2T、pUCベクター、col E1、pCR1、pBR322、pMB9、およびその誘導体を含む大腸菌からのそれのような細菌性プラスミド、RP4、ファージDNAs、例えば、ファージラムダの多数の誘導体、例えば、λgt10およびλgt11、NM989のようなより広い宿主範囲のプラスミド、Ｍ13および線維状単鎖DNAファージのような他のDNAファージ、を含む。酵母細胞に対する有用な発現ベクターは、2μ プラスミドおよびその誘導体を含む。昆虫細胞に対する有用なベクターはpVL 941を含む。加えて、広くさまざまな発現制御配列のいずれもが本発明のDNA配列を発現するためにこれらのベクターで使用できる。有用な発現制御配列は、前述の発現ベクターの構造遺伝子と結びついた発現制御配列を含む。.有用な発現制御配列の例は、例えば、SV40またはアデノウイルスの初期および末期のプロモーター、la c系、trp系、TACまたはTRC系、ラムダファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域であるT3および T7プロモーター、fd被膜蛋白質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばPho5、酵母のアルファー交配系プロモーター、および原核または真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することで知られる他の構成的および誘導性プロモーター配列、およびそれらのさまざまな組合せ、を含む。T7 RNAポリメラーゼプロモーターΦ10は、大腸菌のHSP72 の発現に特に有用である（実施例3）。前述のベクターで形質転換された宿主細胞は本発明の更なる形態である。広範なさまざまな単細胞宿主細胞が本発明のDNA配列発現に有用である。これらの宿主はよく知られた真核および原核生物宿主を含んでもよく、例えば、大腸菌、シュードモナス、バシルス、ストレプトマイセス、カビ、酵母の株、スポドプテラフルギペルダ(SF9)のような昆虫細胞、CHO およびマウス細胞のような動物細胞、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC40、およびBMT 10 のようなアフリカミドリザル細胞、ヒト細胞、組織培養中の植物細胞など。より好ましい宿主生物は大腸菌および枯草菌のような細菌類、および組織培養中のほ乳類細胞を含む。本発明のDNA配列を発現するに必ずしもすべてのベクターと発現制御配列が等しく十分に機能する訳ではないことは、勿論理解されねばならない。同じ発現系を用いてもすべての宿主が等しくよく機能するものではない。しかしながら、当業者ならば、不適切な実験も無くまた本発明の範囲から離れることなく、これらのベクター、発現制御配列および宿主の選択をすることができるであろう。例えば、ベクターを選ぶに当たっては、宿主が考慮されねばならない、というのはベクターは宿主中で複製しなければならないからである。ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーのようなベクターによってコードされたすべての他の蛋白質の発現、もまた考慮されねばならない。発現制御配列を選択するに当たってはまた、さまざまな因子が考慮されねばならない。これらは例えば、配列の相対的強度、その制御能、特に潜在的な二次構造に関するような、本発明のDNA配列とのホモロジー、を含む。単細胞宿主は、選ばれたベクターとのホモロジー、本発明のDNA配列によってコードされた産物の毒性、その分泌特性、蛋白質を正しく折り畳むその能力、その発酵または培養条件、および本発明によってコードされた産物を宿主から精製する容易さ、を考慮して選択されねばならない。これらのパラメーターの範囲内で、当業者であれば、発酵または大規模動物飼育にあたり、本発明のDNA配列を発現する色々なベクター／発現制御配列／宿主組合せを選ぶことができるであろう。本発明のDNA配列によってコードされたポリペプチドは、発酵または細胞培養から分離し、次のようなさまざまな従来の方法のいずれかを用いて精製してもよい、すなわち；高速液クロマトグラフィー、高速蛋白液クロマトグラフィーなどのような通常または逆相液体クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー（無機の配位子またはモノクローナル抗体によるような）；サイズ排除クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動；など。当業者であれば、本発明の範囲から離れることなく、最も適切な分離、精製技術を選択できるであろう。加えて、本発明のポリペプチドは幾つかの化学的技術のいずれかによって作ってもよい。例えば、それらはもともとはメリフィールド、“固相ペプチド合成．Ｉ．テトラペプチドの合成”（J.Am.Chem.Soc.，83，2149-54（1963））、によって述べられた固相合成技術を用いて調製してもよく、またはそれらは溶液中合成によって調製してもよい。ペプチド合成技術の概要はグロス、マインホファー、4 ペプチド；分析、合成、生物学，；ペプチドとアミノ酸分析についての近代技術、ジョンワイリーアンドサンズ（1981）およびボダンスキー、ペプチド合成の原理、スプリンガーフェルラーク（1984）に記載されている。発明の好ましい組成物と方法は増強した免疫原性を持つポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドは、その天然の形のポリペプチドであっても、またはその断片が意図された受容体中で免疫原性を増強するために修飾されるか処理を受けたものであってもよい。好ましいポリペプチドは天然のポリペプチドのC-末端部分から選ばれた断片のような連鎖球菌種に特異的な断片である。数多くの技術が使用可能であって、当業者にはよく知られており、その技術は、ここに開示されたポリペプチドの免疫原性を実質的に増強するために、過度の実験をすることなく用いられよう。例えばポリペプチドは、ジニトロフェニル基またはアルサニール酸（ｐ−アミノベンゼンアルソン酸）に結合することにより、または熱および／またはSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）での変性によって修飾してもよい。特にもしそのペプチドが化学的に合成された小さいポリペプチドならばそれらを免疫原担体に結合するのが望ましいかもしれない。勿論結合は、ポリペプチドまたは担体のいずれもが適切に機能する能力を妨げてはならない。結合方法戦略における検討については、抗体、実験室マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ハーロー、レーン編（1988）参照。有用な免疫原担体が技術的によく知られている。そのような担体の例はキーホールリムペットヘモシアニン(KLH)；ウシ血清アルブミン(BSA)および卵白アルブミンのようなアルブミン、PPD（ツベルクリンの精製蛋白質誘導体）；赤血球細胞；破傷風トキソイド；アガロースビーズ；活性炭またはベントナイトを含む。脂質化状態を変えるために、ここに開示されたポリペプチドのアミノ酸配列を修飾することは、その免疫原性および生化学的性質を増強するのに使用する方法でもある。例えば、ポリペプチドまたはその断片は脂質部分の付加を指令するシグナル配列によりまたはそれなしで発現してもよい。本発明において、天然のポリペプチドをコードするDNAのインビトロ操作とその後の修飾DNAの発現による、または誘導DNA配列の化学合成による、または発現アミノ酸配列の化学的または生物学的操作による、場合を含み、様々な方法によって、ポリペプチドの誘導体を調製してもよい。例えば、誘導体は、一つ或いはそれ以上のアミノ酸を異なった天然のアミノ酸、アミノ酸誘導体、非天然アミノ酸、で置換することによって作成してもよく、保存的な置換が好ましい場合は、例えばヒスチジンの代わりに3-メチルヒスチジンが置換され、プロリンの代わりに4-ヒドロキシプロリンが、リジンの代わりにヒドロキシリジンが置換されてよい。保存性に乏しいアミノ酸置換を引き起こして、例えば電荷、コンホメーション、および他の生物学的性質を変化させることによって、望ましい誘導体を作成することもできる。そのような置換は、例えば、疎水性残基の代わりに親水性残基の置換、別の残基の代わりにシステインまたはプロリンの置換、大きな側鎖を持つ残基の代わりに小さな側鎖を持つ残基の置換、または正味の陰電荷を持つ残基の代わりに正味の陽電荷を持つ残基の置換、を含むであろう。与えられた置換の結果を確実に予見できない場合は、ここに開示された方法に従って、望ましい特性の有無を決定するためにその誘導体を容易に検定することができよう。ポリペプチドはまた、安定性を増す、または分子を精製および調製によりなじみやすいようにする、目的を持って調製してもよい。一つのそのような技術は、別のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは非-ストレプトコッカス・ニューモニアエの配列を含む融合蛋白質としてそのポリペプチドを発現することである。本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質が例えば、その融合をコードする核酸分子を組み立て、宿主細胞をその分子で形質転換し、その細胞が融合蛋白質を発現するように誘導し、その融合蛋白質を細胞培養から回収することによって、 DNAレベルで作成されることが好ましい。他方、融合蛋白質は既知の方法により遺伝子発現によって作成してもよい。本発明の融合蛋白質の例は下記の実施例3 の FucI/HSP72（C-169）蛋白質である。本発明のポリペプチドはまた、大きな多重結合分子の部分であってもよく、これは組換えによって作成してもよくまたは化学的に合成してもよい。そのような多重結合体はまた、融合ポリペプチドを含むか、または脂質および糖質を含む、アミノ酸以外の部分と結合してもよい。本発明のポリペプチドは抗体の生成に、また疾患に対する防御応答の展開に、特によく適している。従って、本発明の別の形態において、HSP72と免疫学的に反応性ある抗体、またはその断片を提供する。本発明の抗体は、HSP72または免疫学的に関連するポリペプチドを用いて免疫感作により誘起されるかまたはHSP7 2または免疫学的に関連するポリペプチドとの反応性によって同定される。本発明の抗体は、自然発生したストレプトコッカス・ニューモニアエによる感染に対して動物中に正常に誘起された抗体、およびそれが誘起された動物中から除去されていないかまたは動物中で変化した抗体を含むものではないと理解されねばならない。本発明の抗体は、技術的にF(v)、Fab、Fab’および F(ab')2 として知られている断片を含む、完全な抗原結合部位を含む完全な免疫グロブリンまたはその断片であってもよい。抗体はまた遺伝学的に設計されてもよく、または合成的に作成されてもよい。抗体または断片は、動物起源、具体的にはほ乳類起源、より具体的にはマウス、ラット、サル、またはヒト起源であってもよい。それは天然の抗体または断片、または望ましければ、組換え抗体または断片であってもよい。抗体または抗体断片は、多クローン性、または好ましくは、モノクローナル性起源であってもよい。それらは多数のエピトープに対して特異的であってもよいが一つのエピトープに対して特異的であるのが好ましい。具体的に好ましいのは以下の実施例2のモノクローナル抗体,F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3およびF2-Pn3 .4 である。当業者ならば、本発明のポリペプチドを使用して、繊細な動物を免疫化するのに用いたときストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチアエまたは他の連鎖球菌関連細菌の感染に対して防御するその能力をスクリーニングすることができよう。ひとたびモノクローナル抗体が防御することが見いだされれば、そのときはその抗体によって認識される特定のエピトープを同定することができよう。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作成す方法は当業者にはよく知られている。そのような方法については、抗体、実験室マニュアル、上述、およびイェルトンら、Ann.Rev.ofBiochem.，50，657-80（1981）参照。本発明のポリペプチドを用いる免疫活性の測定は、免疫ブロット検定法、およびELISAによる場合を含み、技術的にはよく知られた幾つかの方法のいずれによって行ってもよい。本発明の抗体は、異なった種（例えばマウスとヒト）由来または同じ種の免疫グロブリン軽鎖および重鎖配列の部分由来の免疫グロブリンから形成された混成分子であってもよい。それは当業者に知られた多数の技術のいずれか一つによって調製された2官能抗体のような多重な結合特異性を持つ分子であってもよい、その技術は；ハイブリッドハイブリドーマの生産；ジスルフィド交換；化学的架橋；2モノクローナル抗体間のペプチド架橋剤の添加；ある特定の細胞系に2セットの重軽鎖免疫グロブリンの導入；等々を含む。本発明の抗体はまた、例えば不死化ヒト細胞により、ヒト重症複合免疫不全症マウス若しくは“ヒト”抗体生産能ある他のヒト以外の動物により、またはクローン化されたヒト免疫グロブリン遺伝子の発現により、生産されるヒトモノクローナル抗体、であってもよい。要するに、当業者ならば、本発明の開示より、ある与えられた抗体分子の安定性または半減期、免疫原性、毒性、親和性、若しくは収率を増減する方法を含む、本発明の抗体の生物学的諸性質を変更、またはある特定の応用のためにそれをより適したものにする何らかの他の方向に変更するのに用いられるさまざまな方法を利用できることになる。本発明のポリペプチド、DNA配列および抗体は疾患の予防、治療および診断ための予防、治療および診断用組成物に有用である。標準的免疫学的技術は本発明のポリペプチドおよび抗体を免疫原としておよびワクチンとして使用するためにそれらを利用してもよい。特に、適当な宿主は何であれ薬学的に有効な量のポリペプチドを注射してモノクローナルまたは多価の抗体を生成する、または疾患に対して免疫学的な防御応答の展開を誘導してもよい。好ましくは、ポリペプチドは、HSP72（配列番号5）、HSP70（配列番号20 および配列番号22）またはその断片からなるグループから選ばれる。本明細書においてポリペプチドまたは抗体の“薬学的有効量”とは、患者に投与されたとき、連鎖球菌または関連細菌の感染を防ぐもしくはその厳しさを軽減するのに有効な免疫応答を誘起する量のことである。本発明のポリペプチドまたは抗体の投与は、以下の実施例10に述べられた方法のいずれによって行われてもよく、またはさまざまな他の標準技術によって行われてもよい。この技術の詳細な議論については、抗体、実験室マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ハーロー、レーン編（1988）参照。もしポリペプチドが用いられるならば、好ましくは、完全または不完全フロイントアジュバント,RIBI（ムラミルジペプチド）もしくはISCOM（免疫刺激複合体）のような薬学的に許容されるアジュバントと共に投与されるだろう。好ましくは、その組成はアジュバントとして油中水エマルジョンまたは水酸化アルミニウムを含み、筋肉内投与されるだろう。ワクチン組成物は一時にまたは治療期間にわたって患者に投与してもよい。最も有効な投与および投与計画は、免疫原性のレベル、そのものの組成および／または治療に用いられるアジュバント、推測される感染の厳しさと経過、これまでの療法、患者の健康状態と免疫感作への応答、および治療する医師の判断、によることとなろう。例えば、免疫能ある患者では、ポリペプチドの免疫原性が高ければ高いほど、投与量と必要な免疫感作回数は低くなる。同様に、もしポリペプチドがアジュバントと共に投与されれば、投与量と必要な治療時間は減少するだろう。一般に投与は、患者あたり HSP72抗原、約0.01から10 mg、そして好ましくは０.１から１.０mg、多くは恐らくはアジュバントと共に、の初期注射、続いて大抵は1回またはそれ以上の追加投与、からなることとなろう。好ましくは、追加投与は初回注射後 1および6ヶ月時に投与されるだろう。本発明のポリペプチドはいずれも薬学的に許容される塩の形で用いられてもよい。本発明のポリペプチドと塩を形成できる適する酸および塩基は当業者にはよく知られており、無機および有機の酸および塩基を含む。本発明のポリペプチドおよび抗体を、ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌によって引き起こされる疾患に対して防御するその能力、またはそのような感染の重い症状を軽減するその能力、についてスクリーニングするためには、当業者ならば、多数の動物モデルが使用されることを認めるだろう。ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌での感染を受けやすい動物はすべて用いられるかもしれない。以下の実施例5のBalb/c マウスは能動的免疫防御スクリーニングのための望ましい動物モデルであり、実施例5の重症複合免疫不全マウスは受動スクリーニングのための望ましい動物モデルである。かくして、ある特定のポリペプチドまたは抗体をこれらの動物モデルに投与することによって、当業者は、過度の実験をすることなくポリペプチドまたは抗体が本願請求の範囲の方法および組成物で役に立つかどうかを決定することができるだろう。本発明の一つの態様として、本発明のポリペプチドのいずれかの薬学的有効量を含むワクチンを用い、連鎖球菌または関連細菌の感染を防ぎまたはその重い症状を、ある期間、軽減するに十分な方法で患者を治療する、数段階からなる方法を提供する。また、そのような方法での使用に好ましいポリペプチドはHSP70／7 2、またはその断片である。本発明のポリペプチド、DNA配列および抗体はまた、診断方法の基礎および病原微生物検出用キットを形成できる。幾つかの診断法が可能である。例えば、本発明は、生物試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチアエまたは関連細菌を検出するための方法を提供するものであり、・患者から生物試料を単離する；・本発明の抗体またはその断片を生物試料と共に培養し、混合物を形成する：・ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチアエまたは関連細菌の存在を示す混合物中の特異的に結合した抗体または断片を検出するという段階からなる。この方法での使用に対して好ましい抗体は、モノクローナル抗体 F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3 .3およびF-Pn3.4を含む。一方、本発明は生物試料内のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌の検出法を提供し、・患者から生物試料を分離する；・本発明のポリペプチドまたはその断片を生物試料と共に培養し混合物を形成する、；・ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌に特異的な抗体の存在を示す混合物中の特異的に結合したポリペプチドを検出するという段階からなっている。HSP72（配列番号5）、そのC-169断片（配列番号5の残基439-607）、そのC-151断片（配列番号5の残基457-607）およびペプチド断片GFDAERDAAQAALDD （配列番号5の残基527-541）および AEGAQATGNAGDDVV（配列番号5の残基586- 600）が上の方法において抗体の検出に好ましいポリペプチドである。当業者ならばこの診断試験は、酵素-結合免疫ソルベント検定法（ELISA）、放射免疫検定法、またはラテックス凝集検定法を含む幾つかの形をとってもよいことがわかるだろう。診断薬はキットに含まれてもよく、キットは使用取り扱い説明書および適当な試薬、好ましくは、ペプチドまたは抗体が結合したとき検出するための手段、を含んでもよい。例えば、ポリペプチドまたは抗体は、ポリペプチドが抗体に結合したときのポリペプチドの検出、または抗体がストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌に結合したときの抗体の検出、を可能にする検出手段によって標識されてもよい。検出手段は、フルオレッセインイソシアネート(FIC)、フルオレッセインイソチオシアネート（FITC）等々のような螢光標識試薬、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、グルコースオキシダーゼ等々の酵素、γ 線を放射する¹²⁵I または⁵¹Crのような放射性元素、または試験溶液中に存在する電子と遭遇するとγ線を生ずる陽電子を放射する¹¹Ｃ，¹⁵Ｏ、または¹³Ｎのような放射性元素であってもよい。結合はまた、例えば、アビジン-ビオチン複合体を介するような他の方法により検出してもよい。検出手段の結合は技術的にはよく知られている。例えば、ハイブリドーマによって作られたモノクローナル抗体分子が培地中で放射性元素-含有アミノ酸の取り込みによって代謝的に標識されてもよく、ポリペプチドが活性官能基を介して検出手段と結合または連結されてもよい。本発明のDNA配列はストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌の存在の検出に使用するためのDNAプローブの設計に用いられる。本発明のプローブ- ベース検出法は・患者から生物試料を分離する；・本発明のDNA配列を持つDNAプローブを生物試料と共に培養して混合物を形成し；ついで・ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌の存在を示す混合物中の特異的に結合したDNAプローブを検出するという段階からなっている。本発明のDNAプローブはまた、ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連細菌感染の診断法として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、試料中の循環する核酸の検出にも用いてもよい。プローブは従来技術を用いて合成してもよく、または固相中で固定化してもよく、または検出可能な標識で標識してもよい。この用途のための好ましいDNAプローブはHSP72（配列番号4、ヌクレオチド 68 2-2502）の少なくとも約6個の隣接したヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴマーである。本発明のポリペプチドはまた、例えば抗原カラム上で抗体の免疫親和精製法を用いて蛋白質上に存在するエピトープに向かった抗体を精製するのに用いてもよい。本発明の抗体または抗体断片は、例えば、抗原カラム上で抗体の免疫親和精製法を用いて、本発明に従った実質上純粋な蛋白質を調製するのに使用してもよい。実施例本発明をよりよく説明するために次の実施例が示す。これらの実施例は例示の目的のためだけであって、決して発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。実施例は1は本発明による免疫反応性熱ショック蛋白質たるHSP72の同定を述べている。実施例2はHSP72のエピトープに対するモノクローナル抗体の分離を述べている。実施例3は本発明による組換えHSP72およびHSP72の断片の調製を述べている。実施例4はHSP72に向かったモノクローナル抗体の抗原的特異性と免疫反応性、および本発明による免疫学的に関連した蛋白質の同定を述べている。実施例5は実質的に純粋なHSP72を調製する方法、および実験的なストレプトコッカス・ニューモニアエ感染を防御するためにHSP72またはそれに対する抗体の使用を述べている。実施例6は本発明によるHSP72の組換えC-151断片の調製を述べている。実施例7は本発明による組換えHSP72またはHSP72断片を用いた免疫感作の結果として起こる体液性免疫応答を述べている。実施例8はHSP72上の線状B-細胞エピトープの局在位置を述べている。実施例9はストレプトコッカス・アガラクチアエおよびストレプトコッカス・ピオゲネスからのｈｓｐ70遺伝子およびHSP70蛋白質を述べている。実施例10はヒトワクチンでのHSP72抗原の使用を述べている。実施例１−免疫反応性ストレプトコッカス・ニューモニアエ熱ショック蛋白質の同定Ａ．手順特に記さない限り、次の手順を本発明の実施例を通して用いるものとする。 1．細菌ストレプトコッカス・ニューモニアエ株は、ラボラトワールドラサントプブリークドケベック、サンタンヌドベルビュによって供給された。ストレプトコッカス・ニューモニアエ株は4型53株、および6型64株を含んでいた。特に記さない場合は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ6型64株を用いた。細菌株は一晩37 ℃、5％ＣＯ₂中チョコレート寒天プレート上で生育した。 2．抗原調製色々なストレプトコッカス・ニューモニアエ抗原が免疫感作および免疫検定のために調製された。加熱殺菌された全細胞抗原は細菌懸濁液を水浴上で56℃20分間培養して得られた。洗剤-可溶性蛋白質はストレプトコッカス・ニューモニアエから次のようにして抽出された・加熱殺菌した細菌は10mM ヘーペスバッファー（４−（２−ヒドロキシエチル）-1-ピペラジノエタン−スルホン酸）（ベーリンガーマンハイム、独）中 pH 7.4で懸濁し、20,000Kz/秒で4回30秒、超音波処理した。完全な細胞と大きな残骸は1,700 ｇで20分間遠心分離によって除去した。浮遊液は集められ,100,000 ｇ60分間遠心分離した。ペレットは１ml ヘーペスバッファーに懸濁、1 mlの2％ N-ラウロイルザルコシン（シグマ化学、セントルイス、モンタナ）を添加した。混合物は30分間室温で培養、洗剤可溶分画は100,000g 60分間遠心分離によって得られた。 3．熱ショック温度ストレプトコッカス・ニューモニアエ（4型53株および6型64株）はメチオニンを欠くイーグル氏最小必須培地(ICN バイオケミカルズ、コスタメサ、加）中に再懸濁、1 ％ BIO-ＸＲ（ケラブラボラトリーズ、モントリオール、加）を補い15分間、37℃に保ち、ついで等容量のの2分画に分けた。試料は37℃または45 ℃、5分間培養、ついで37℃で10、30、または60分間、100 μCi/ml［³⁵Ｓ］メチオニン(ICN)により標識した。細菌を集菌し、細胞抽出物は上述のトリス-塩酸溶解バッファー、または SDS-PAGE 試料バッファーを用いて調製された。 4．マウスの免疫感作雌のBalb/c マウス（チャールスリバーラボラトリー、セントコンスタント、ケベック、加）がストレプトコッカス・ニューモニアエ抗原で免疫化された。ストレプトコッカス・ニューモニアエ6型64株に対する免疫血清は2-週間間隔で、1 07個の加熱殺菌細菌または水酸化アルミニウムアジュバント（アルヒドロゲルＲ；セダレーンラボラトリー、ホーニー、オンタリオ、加）に吸着された 20 μ gの洗剤可溶性連鎖球菌蛋白質を皮下注射することによって免疫化されたマウスから得られた。血液試料は免疫感作に先だって、また第１回および第２回の免疫感作後7日目に、集められた。 5．SDS-PAGE および免疫検定細胞抽出物が、SDS-PAGE、ウエスタンブロット分析および放射免疫沈降検定のためにトリス-塩酸溶解バッファー(50mMトリス、150ｍＭ NaCl、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、2％トリトンＲ X-100 、100μg/ml フェニルメチルスルホニルフロリド、および2μg/ml アプロチニン )中でpH 8.0で30分間、氷上で細菌懸濁液を培養して調製された。溶解細胞は遠心分離で清澄化され浮遊液は分離、-70℃で凍結された。 SDS-PAGEは10％ポリアクリルアミドゲル上でレムリ［ネイチャー、227、680-6 85（1970）］の方法に従い、ミニプロテアンシステム（バイオラドラボラトリーズ、ミッシサウガ、加）を用いて行われた。試料は、2％2-メルカプロエタノール、を含む試料バッファー中で5分間煮沸して変性された。蛋白質はポリアクリルアミドゲルをファストゲルブルーＲ（ファルマシアバイオテック、バイドゥルフェ、加）染色して分別された。放射標識された産物はフロログラフィーで視覚化された。フロログラムはレーザー濃度計を用いてスキャンされた。免疫ブロット法はトウビンら［Proc,Natl,Acad.Sci.USA，76，4350-4354（197 9）］の方法に従って行われた。抗体との反応性を有する抗原の検出は、ペルオキシダーゼ-標識された抗-マウス免疫グロブリンおよびo−ジアニシジンカラー基質を用いて間接的抗体免疫検定法によって行われた。放射免疫沈降検定法はウィリーら［J.Virol.，66,5744-5751（1992）］によって述べられたようにして行われた。手短に言えば、血清またはハイブリドーマ培養浮遊液は等量の［³⁵Ｓ］メチオニンを含む放射標識された試料に添加された。混合物は90分間4℃で常時撹拌下に培養に付された。免疫複合体はついでウシ血清アルブミン-処理された蛋白Ａセファロース（ファルマシア）で1時間、4℃で沈降分離された。ビーズはペレット化され、3回トリスバッファー化した生理食塩水中でpH 8.0で洗滌され、ついで抗原複合体は試料バッファー中で煮沸して解離された。抗原はSDS-PAGE上で電気泳動により分析された。ゲルは固定され、アンプリファイＲ（アマシャム・カナダ、オークビル、オンタリオ、加）を用いてフロログラフィー用に増幅され、乾燥、ついでＸ線フィルムに曝露された。Ｂ．ストレプトコッカス・ニューモニアエにおける熱ショック応答の特性 37℃から45℃へのシフト前後の蛋白質合成のパターンを調べることによってストレプトコッカス・ニューモニアエの熱ショック応答を研究した・図1はストレプトコッカス・ニューモニアエ6型64株（パネルＡ）および4型53株（パネルＢ）が37℃で生育し、37℃（レーン1、3、5、7および9）または45℃（レーン2、4、6 、8および10）5分間培養され、ついで［35Ｓ］メチオニンで10分間（レーン1、2 および7、8）、30分間（レーン3、4および9、10）、または60分間（レーン5、6 ）標識された時の結果を示す。 SDS-PAGEから導き出されたフロログラムは、温度上昇によって少なくとも3つの蛋白質の合成が増加したことを示した（図1）。最も顕著に誘導された蛋白質は約72kDa(HSP72)であり、他方、他の2つは大略80kDa(hsp80)および 62kDa(HSP6 2)であった。蛋白質合成の増加は10分間の標識化後（図1、レーン1、2および7 、8）既に明らかであり、標識期間が30分（図1、レーン、3、4および9、10）、および60分間（図1、レーン5、6）に伸ばされた時より著しくなった。2つの異なったストレプトコッカス・ニューモニアエ株の蛋白質合成プロフィルに対する温度上昇の効果は、同様の分子量のHSPsが合成されて、類似していた。（図1のパネルＡ（6型64株）をパネルB（4型53株）と比較）。蛋白質合成プロフィルの走査の濃度測定記録の分析は蛋白質の相対量の見積もりを可能にした。例えば、熱ショックを受けたストレプトコッカス・ニューモニアエ6型64株に関しては、10分間の標識後HSP80およびHSP62は、37℃の0.1％以下に比べ、それぞれ標識蛋白質の2.9％および6.8％を占めた（図2）。72kDaの見かけ分子量をもつ標識蛋白質は37℃と45℃両条件下で検出された（図2）。しかしながら放射免疫沈降検定法が明らかにしたところによれば,HSP72は37℃では検出されなかった（上述；および図.3、4および6）、このことは図2からのピーク9はHS P72と共に移動する蛋白質成分（ｓ）に相当することを示している。この物質の標識化において変化がないと仮定すれば、これらの結果はHSP72の量は熱ショック処理後の全標識細胞蛋白質の8.7％に当たる、ことを示唆するものといえよう。ピーク4、10、13、17、19、および21・相等する細胞蛋白質は熱ショック処理に関係なくほとんど同じ速度で合成されていた（図2）、ことは濃度測定記録の比較から明かとなった。しかしながら、幾つかの蛋白質（ピーク1、2、3、15、2 0、22、24、および26）の合成は熱ショックに応答してかなり低下した。Ｃ．ストレプトコッカス・ニューモニアエHSPに対する免疫応答肺炎球菌性HSPsによる抗体応答を検討評価するために、マウス血清が最初に放射免疫沈降法により効力検定された。ストレプトコッカス・ニューモニアエ抗体で免疫化されたマウスの血清によって認識された標識蛋白質の全範囲は図3および4に示されている。図3は洗剤可溶性蛋白質調製に関わっている。図4は加熱殺菌標本に関わっている。多くのバンド（帯）が多くの抗血清によって検出されたが、HSP72が主要な沈降産物であった。熱ショック産物のみに属する蛋白質（図3 、レーン4、6、8、および10；図4、レーン4、6および8）の検出によってHSP72 に対する抗体の特異性が示された。興味あることに、免疫化されたマウスはすべて一致してHSP72を認識した。起源の異なるストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72で強い反応性が観察されたので、HSP72との反応性を有する抗体は免疫感作の間に使用された株に特異的ではなかった。HSP72に加えて1つの血清が37℃ と45℃両方で標識された共に移動する産物を沈降したことは注目しなければならない（図4、レーン4）。この72kDa-産物は恐らくは図2のピーク9からの成分に相当し、免疫ブロットでは検出されなかった。HSP62はある血清によっては沈降するが必ずしもすべての血清によって沈降しない今一つの免疫ターゲットである（図3、レーン6および図4、レーン4および6）。試験した血清はいずれもHSP80とは反応しなかった。この研究に用いられたマウスから採取された免疫前血清が標識産物と反応する抗体の存在について試験されたとき沈降する蛋白質はなかった。図3および5に描かれているように、HSP72に対する抗体は、ストレプトコッカス・ニューモニアエの洗剤可溶性蛋白質かまたは全細胞抽出物のいずれかで一度の免疫感作後にHSP72に対する抗体が検出できた。加えて、２回目免疫感作後にHSP 72に対する抗体応答の著しい増大が観測された（図3、レーン4および6、およびレーン8および10を比較せよ）。加熱殺菌されたストレプトコッカス・ニューモニアエによって免疫化された15 匹のマウスの免疫ブロットパターンは、既に述べた放射免疫沈降検定法の結果と著しい一致を示した。抗体応答変化はさまざまな蛋白質に対して生じているが,H SP72は最初の免疫感作後に8（53％）陽性血清を持つ主要な免疫反応性抗原であった（図5）。HSP72に対する抗体は第２回免疫感作後に試験された15免疫血清のうちの13（87％）で検出された。見かけの分子量53.5および47kDaを持つ2つの他の目立つ抗原それぞれ5（33％）および7（47％）で検出された（図5）。72kDa- 反応性バンドは、免疫ブロット検定法において組換えHSP72抗原（以下の実施例3 ）を用い、連鎖球菌性HSP72であると確認された。実施例２−HSP72 のエピトープに対するモノクローナル抗体の分離Ａ．手順 1．マウスの免疫感作と融合雌のBalb/cマウス（チャールスリバーラボラトリーズ）がストレプトコッカス・ニューモニアエ抗原を用いて免疫化された。1組のマウス（融合実験1）が、フロイント氏完全アジュバント中に懸濁したホルマリン殺菌された107の細菌MTL 株の全細胞抗原を用い、腹膜注射により免疫化され、同じ抗原で、ついでフロイント氏不完全アジュバント中の加熱殺菌細菌からの超音波処理体で、2週間間隔で抗原追加された。第2のグループのマウス（融合実験2）は、3週間間隔で3回、 64株（6型）から抽出された洗剤可溶性連鎖球菌性抗原75μg（キルAアジュバント25μg中（セダーレーンラボラトリーズ、ホーニー、オンタリオ、加））を用いて免疫化された。融合3日前、すべてのマウスはPBS（リン酸緩衝生理食塩水）単独中に懸濁したそれぞれの抗原を腹膜内注射された。ハイブリドーマは、以前ハメル［J.Med.Microbiol.，23、163-170（1987）］によって述べられた非分泌性SP2/0ミエローマ細胞と脾臓細胞の融合によって産出された。特異性ハイブリドーマは、逐次限界希釈によってクローンされ、拡大され、液体窒素中で凍結された。モノクローナル抗体のクラス、サブクラス、および軽鎖型は、マーチンら［Eur.J.Im munol.，18，601-606（1988）］によって述べられたようにELISAにより、サザンバイオテクノロジーアソシエイト（バーミンガム、アラバマ）から得られた試薬を用いて決定された。 2．細胞以下の分画肺炎球菌は、ピアスら［Mol.Microbiol.，9,1037-1050)19930］に記されている方法により細胞以下の分画に分けられた。手短に言えば、ストレプトコッカス・ニューモニアエ64株（6型）は、0.5(w/v)％酵母抽出物を補ったトッドヒュウイット培養液中6時間、37℃で生育、遠心分離で分離された。細胞ペレットは、2 5mM トリス-塩酸緩衝液 pH8.0、1 mM EDTA、1mM フェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)、中に再懸濁し、15秒のバーストを伴い4分間超音波処理された。細胞残骸は遠心分離で除かれた。細菌膜および細胞質内容物は98,000 ｇ4時間遠心分離によって分離された。細胞質（浮遊液）および膜分画は、1 mlあたり 1 m gに調節され、SDS-PAGEおよび免疫ブロット分析にかけられた。Ｂ．ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72に対するMAbsの同定と特性ハイブリドーマの培養浮遊液は、初めマーチンら（上述）に述べられた手順に従いストレプトコッカス・ニューモニアエ65株（4型）の全細胞を用いて斑点酵素免疫検定法によってスクリーニングされた。陽性ハイブリドーマはついで、HS P72と反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを同定するために免疫ブロッティングにより再試験された。免疫ブロットで抗-ストレプトコッカス・ニューモニアエ反応性を持つ26のハイブリドーマのうち4つが,72kDa の見かけ分子量を持った蛋白質バンド上に存在するエピトープを認識することが見いだされた。4つのハイブリドーマは、F1-Pn3.1（融合実験1から）およびF2-Pn3.2、 F2-Pn3.3およびF2-Pn3.4（融合実験2から）と呼称された。アイソタイプ分析により明らかになったところによれば、ハイブリドーマF1-Pn3.1（融合実験1から）は免疫グロブリンIｇG2kを分泌するのに対して、ハイブリドーマF2-Pn3.2、F2 -Pn3.3、およびF2-Pn3.4（融合実験2から）はすべてIｇG1kを分泌する。HSP72に対するモノクローナル抗体の特異性は、37℃で培養された培養液から得られた［³⁵ Ｓ］メチオニン-標識ストレプトコッカス・ニューモニアエ蛋白質に対する放射免疫沈降活性の欠如、および45℃で培養された熱ショック由来の溶解物を用いた72kDa-蛋白質の免疫沈降、によって示された。図6（レーン5および6）は、モノクローナル抗体F 1-Pn3.1に対して得られた結果を示している。モノクローナル抗体F2-Pn3.2、F-P n3.3およびF2-Pn3.4で同様の結果が得られた。非熱ショックおよび熱ショックストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞からの［³⁵Ｓ］メチオニン-標識された溶解物は、モノクローナル抗体でプローブされ、SDS-PAGEゲル上で電気泳動に付され、ついでウエスタンブロット分析にかけられた。結果として得られた免疫ブロットは、両試料中のHSP72抗原の存在を明らかにした。図7、パネルA、はモノクローナル抗体f1-Pn3.1について得られた結果を示す。同様の結果がモノクローナル抗体F2-Pn3.2、F-Pn3.3およびF2-Pn3.4 で得られた。したがって、熱ショックストレスは抗-HSP72モノクローナル抗体の反応性を大きくは増加しなかった。しかしながら、免疫ブロットのフロログラフは、熱ショック応答が生じたことを明らかに示した（図7、パネルB）。ストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72の合成速度は熱ショックに応答して増加するが、HSP72の絶対量は熱ショック後増加してはいない、ことをこれらの実験は明らかにした。Ｃ．HSP72 の細胞内の位置 HSP72の細胞内位置を研究するためにストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞溶解物は、示差遠心分離によって分画され、溶解分画および膜蛋白質に富んだ微粒子分画を生じた（上述）。ストレプトコッカス・ニューモニアエの膜分画の15 μg蛋白質を含む試料（レーン1）および細胞質分画（レーン2）は、SDS-PAGE上で電気泳動に付され、ニトロセルローズに移され、モノクローナル抗体F1-Pn3.1 を用いて探索された。結果として生じたウエスタンブロット中において,HSP72は両分画中に見いだされ、その蛋白質の大半は、細胞質分画と結びついていることが見いだされた（図8）。実施例３−HSP72 抗原をコードする遺伝子の分子クローニング、配列決定および発現Ａ．手順 1．株およびプラスミドこの研究に用いられた株およびプラスミドは、表 1に列挙されている。大腸菌（E.coli）をL培地またはL寒天培地で37℃で生育させた。必要であれば、培地にアンピシリンを最終濃度50μg／mlになるように加えた。Magic/Wizard 登録商標Mini-Perps Kit（Promega，Fisher Scientific，Ottawa，Canada）を用いてプラスミドを分離精製した。２．一般的組換えDNA技術制限酵素、T4 DNAリガーゼ、及び標準DNA分子量はBiotech Mannheim Canada， Laval，QuebecまたはPharmacia Biotec,Uppsala，Swedenから購入した。制限酵素によるDNAの切断、及びDNAのライゲーションは、J．Sambrookら（Molecular C loning．A laboratory manual．Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.(1 989)）によって記述された方法を用いて行った。DNA断片のアガロースゲル電気泳動はBiotech Mannheimから購入したTAE緩衝液（0.04M Tris-acetate、0.002M EDTA）を用いて、J．Sambrookら（前記）によって記述された手順に従って行った。Prep-A-Gene登録商標 DNA Purification kit（Bio-Rad laboratories Ltd., Mississauga，Ontario）を用いてアガロースゲルからDNA断片を精製した。the G ene Pulser登録商標（Bio-Rad）を用いてエレクトロポーレーションで形質転換を行い、その手順は製造会社によるプロトコールに従った。３．ゲノムライブラリーの構築及びスクリーニングストレプトコッカス・ニューモニアエ（S.pneumoniae）ゲノムのDNAライブラリーは、バクテリオファージの発現ベクターλgt11（λgt11クローニングシステム、Amersham）に組み込んで作製した。その方法は、製造会社に示された手順に従った。J．C．Patonらの手順（Infect．Immun.，54，pp．50〜55(1986)）に従って、ストレプトコッカス・ニューモニアエ 6型64株の染色体DNAを調製した。ストレプトコッカス・ニューモニアエの染色体DNAは、EcoRIを用いて部分的な消化を行い、アガロースゲルで４〜７kbの断片を分離した。これらの断片をλgt11 のアームにライゲーションし、パッケイジングを行い、得られたファージの混合液を大腸菌 Y1090株への感染に使用した。HSP72蛋白質に特異的なモノクローナル抗体F1-Pn3.1（前記）を用いて、組換え体HSP72蛋白質の抗原を発現しているプラークの免疫選択を行った。モノクローナル抗体F1-Pn3.1で認識されるペプチドを発現しているプラーククローンを分離精製した。溶菌液を調製し、製造会社の取扱説明書（一般的なDNA精製法）に従って、Promega LambdaSorb ファージ吸着体からDNAを精製した。４．サザンブロット解析この試料では、Boehringer Mannheimから得た非放射性DIG DNA Labeling and Detectionキットを使用して、サザンブロット解析を行った。プローブとして使用するDNA断片（後記）をアガロースゲル電気泳動を用いて精製し、ジゴキシゲニン(DIG)-11-dUTPでラベルした。J．Sambrookら（前記）によって記載された方法で、ストレプトコッカス・ニューモニアエの染色体DNAをHindIIIで切断し、切断したものを0.8％ SDS-PAGEゲル電気泳動を用いて分離し、正に荷電したナイロン膜（Boehringer Mannheim）に移した。製造会社のプロトコールに従って、D IGでラベルしたDNAプローブを用いてナイロン膜をブロットした。５．DNA 塩基配列決定および塩基配列の解析この試料について、塩基配列の解析を行ったDNA断片をまず、プラスミドpDELT A1（GIBCO BRL Life Technologies，Burlington，Ontario）にクローニングした。供給会社による手順に従って、インビボにおけるTn1000トランスポゾン転位（ Deletion Factory System，GIBCO BRL）を用いて、重なり合った一連の欠失を生じさせた。これらの欠失の大きさをアガロース電気泳動で測定し、F．Sangerら( Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74，pp.5463〜5467(1977))のジデオキシヌクレオチドチェーンターミネイティング法を用いて、適当な欠失誘導体を選択した。欠失鋳型間のギャップの塩基配列を調べるために、オリゴヌクレオチド合成機392 （ABI，Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA）を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencingキット(ABI)を用いたP CR(DNA Thermal Cycler 480登録商標，Perkin Elmer)でシーケンシング反応を行い、自動DNAシーケンサー373A（ABI）でDNAの電気泳動を行った。６．大腸菌のT7 RNA ポリメラーゼ／プロモーターシステムにおけるクローニングした遺伝子の発現大腸菌のバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ／プロモーターシステムを利用することによって、この実施例における、クローニングした遺伝子の高レベル発現が達成された。組換え体蛋白質を特定するDNA断片を、プラスミドpT5-7またはpT7-6(S．Tabor and C．C．Richardson，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82，p p.1074〜1078(1985))に、発現される遺伝子がT7ファージのRNAポリメラーゼに特異的なプロモーターΦ10の制御下に置かれるように適した向きになるように、ライゲーションした。生じたプラスミドを大腸菌BL21(DE3)株（F．W．Studier，an d B．A．Moffatt，J．Mol．Biol.，189，pp．113〜130（1986））に形質転換した。この菌株は染色体上に、誘導可能なlacUV5プロモーターの支配下にあるT7 R NAポリメラーゼの構造遺伝子を有する。IPTG添加によりBL21(DE3)株の形質転換体内で誘導されたT7 RNAポリメラーゼは特異的に、T7プロモーターΦ10支配下の遺伝子を転写した。過剰発現させた組換え蛋白質を、ウエスタンブロッティングまたは、クーマシーブルー染色によって視覚化した。７．HSP72 蛋白質のN末端のアミノ酸配列の解析 L．S．Danielsら（Microb．Pathogen.，1，pp．519〜531（1986））によって記載されている方法で調製したストレプトコッカス・ニューモニアエ64株の細胞壁抽出試料を抗原とし、モノクローナル抗体F1-Pn3.1（前記）による免疫沈降を行い、ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72蛋白質を精製した。免疫沈降物をSDS-PAGEで分離し、次にP．Matsudaira（J．Biol．Chem.，262，pp．10 035〜10038（1987））の方法により、ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜に移した。PVDF膜をクーマシーブルーで染色しHSP72蛋白質のバンドを切り出し、標準的な手順に従って蛋白質自動シーケンサー（ABI）で解析した。Ｂ．C-169 に相当するストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72遺伝子断片を含むプラスミドの構築 HSP72に特異的なモノクローナル抗体F1-Pn3.1を用いて、λgt11ストレプトコッカス・ニューモニアエゲノムDNAライブラリーのスクリーニングを行った。合計1500個のファージをテストして、１７個の免疫活性のあるクローンを分離精製した。組換え体ファージによって発現している蛋白質の特異性を確認するために、組換え体ファージ溶菌液のウエスタンブロット解析を行った。モノクローナル抗体F1-Pn3.1によって認識された１７個の陽性クローンは二つのグループに同定された。さらなる特徴の解析のためにそれぞれをλJBD7およびλJBD17と名付けた。図９に示されているように、ストレプトコッカス・ニューモニアエ64株の全細胞抽出物（レーン１）および、IPTGの存在下（+）または非存在下（-）で培養したλJBD17を感染させた大腸菌のファージ溶菌液（レーン２および３）または λJBD7（レーン４および５）を、10％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに電気的に移した。HSP72に特異的なモノクローナル抗体（MAb） F1-Pn3.1をプローブとして、免疫ブロットを行った。クローンλJBD17は2.4kbおよび2.3kbの二つのEcoRI-EcoRI挿入断片を有しており（図１０）、SDS-PAGEゲル上の見かけの分子量が74kDaのキメラな組換え蛋白質を発現していた（図９、レーン２および３）。クローンλJBD7は2.3kbのEcoRI挿入断片を含み、LacZおよびクローンλJBD17から発現している74kDaキメラ蛋白質とで構成されていると思われる融合蛋白質を、生産していることが分かった。この融合蛋白質はSDS-PAGEで 160kDaの見かけの分子量を持つ（図９、レーン５）。ファージλJBD17によってコードされているキメラの組換え蛋白質の発現は、ITPGによる誘導には非依存的であったが（図９、レーン２および３）、ファージλJBD7によってコードされている組換え融合蛋白質の発現はlacプロモーターの誘導に依存的であった（図９、レーン４および５）。 HSP72遺伝子をサブクローニングする試みにおいて、クローンλJBD17由来のストレプトコッカス・ニューモニアエDNA挿入断片を取り出し、精製し、低コピープラスミドpWSK29（R．F．Wang and S．R．Rushner，Gene，100，pp．195〜199 （1991））に連結し、プラスミドpJBD171を作製した。pJBD171の挿入断片を制限マッピングによって特徴を明らかにし（図１０B）、モノクローナル抗体F1-Pn3. 1に反応する抗原をコードしている遺伝子の境界を明らかにするために、一連のサブクローニングおよび免疫ブロッティングを行った。74kDaのキメラ蛋白質の発現の原因となった領域は、3.2kbのEcoRI-EcoRV断片上に位置していることが分かった。この断片は正常な2.4kb EcoR-EcoRI断片および2.3kb EcoRI-EcoRI断片のうちの0 .8kb EcoRI-EcoRVの部分から構成されていた。3.2kbのEcoRI-EcoRV挿入断片を含むプラスミドはpJBD179と名付けた。Ｃ．C-169 をコードするキメラ遺伝子の発現およびDNA配列の解析 3.2kb EcoRI-EcoRV断片上の74kDaキメラ蛋白質をコードしている遺伝子の転写方向を決定するため、および、免疫学的研究の目的のための74kDaキメラ蛋白質の生産を増加させるために、本発明者らは大腸菌のT7 RNAおよびT7プロモーターシステムを用いて74kDaキメラ蛋白質を発現させることにした。pJBD179由来の 3.2kb EcoRI-EcoRV断片をプラスミドpT7-5およびpT7-6にライゲーションした。このプラスミドのマルチクローニングサイトは、T7 RNAポリメラーゼ特異的T7プロモーターφ10に対して逆向きに位置している。このライゲーション液は、大腸菌JM109株を形質転換させるために用い、モノクローナル抗体F1-Pn3.1に反応する陽性の形質転換体を、J．Sambrookら（前記）によって記載されているコロニーリフティング法を用いて同定した。その結果得られた、pT7-5およびpT7-6由来の組換え体プラスミドをそれぞれpJBDf51およびpJBDf62と名付けた。これらの組換え体プラスミド上の正常な3.2kb EcoRI-EcoRV断片および、それらの向きを制限マッピングを用いて決定した。74kDaキメラ蛋白質を過剰発現するために、pJB Df51およびpJBDf62を、別々に大腸菌BL21（DE3）株に形質転換した。形質転換体をIPTG（1mM）で３７℃で３時間誘導した。細胞を集め、洗浄し、1％SDSに懸濁し、１０分間煮沸した。次に、溶菌液をSDS-PAGEに用い、免疫ブロット解析を行った。予想された通り、両方の形質転換体が74kDaキメラ蛋白質を生産し、MAb F 1-Pn3.1を用いたウエスタンブロッティングで容易に検出された（図11）。しかしながら、ITPG誘導条件下では、形質転換体BL21（DE3）株（pJBDf51）のみが74 kDaキメラ蛋白質を過剰発現し（図１１AおよびB、レーン２）、3.2kb EcoRI-Eco RV断片上の遺伝子の転写方向が、EcoRI末端からEcoRV末端への方向であることが示唆された（図１０A）。 3.2kb EcoRI-EcoRV断片をプラスミドpDELTA1にクローニングし、プラスミドpJ BDΔ1を作製した。重なり合った一連の欠失が生成し、DNAシーケンシングの鋳型として用いた。3.2kb EcoRI-EcoRV挿入断片の全DNA配列は配列番号：１である。二つのオープンリーディングフレーム（「ORFs」）が見い出され、それらの向きを図１０Bに示した（[ORF27」および「FucI-HSP72（c-169）」）。これらの二つのORFの前方に推定上のリボゾーム結合部位が同定された（配列番号：１、ヌクレオチド18〜21および760〜763）。明らかな-10および-35プロモーター配列は見い出されなかった。ORF27はヌクレオチド30〜755（配列番号：１）にわたり、 242アミノ酸蛋白質をコードし、計算上27,066Daの分子量を持つ。この蛋白質の推測されるアミノ酸配列は、配列番号：２である。本発明者らはこの遺伝子をor f27と名付け、他の既知の遺伝子と比較した。相同な遺伝子および蛋白質は見い出されなかった。大きいORF（ヌクレオチド771〜2912、配列番号：１）は714アミノ酸の蛋白質をコードし、その分子量は79,238Daと予想される。この蛋白質の推測されるアミノ酸配列は配列番号：３である。このORFと他の既知の配列との比較を行い、他のアミノ酸配列との関係を決定した。この解析により、コードされている蛋白質が、大腸菌のフコースイソメラーゼ（FucI）の配列、およびDnaK 遺伝子群としても知られるいくつかのHSP70遺伝子ファミリーと高い類似性があることが明らかになった。配列番号：３、ならびに大腸菌のFucIおよびHSP70（D naK）蛋白質のアミノ酸配列を並べてみると、74kDaキメラ蛋白質のアミノ酸1から545（配列番号：３）に対応するN末端の部分は、大腸菌のFucIに高い相同性が見られ、また、アミノ酸546から714（配列番号：３）に対応するC末端の部分はH SP70（DnaK）蛋白質に類似していることが明らかになった。74kDa 蛋白質遺伝子のこれらの二つの部位の接合部分にEcoRI制限部位が存在することは注目に値する（配列番号：１、ヌクレオチド2404および2405の間）。他の制限部位はヌクレオチド971および972間（Pst I）、ヌクレオチド1916および1917間（Pst I）、ヌクレオチド1978および1979間（Xho I）、ならびにヌクレオチド3164および3165 間（EcoRV）に存在する。これらのデータから、本発明者らは、74kDa 蛋白質はS.ニューモニアエ染色体DNA二つの断片、FucI 相同遺伝子由来の2.4kb EcoRI- EcoRI 断片、およびHSP72遺伝子由来の2.3kb EcoRI-EcoRI 断片によってコードされたキメラ蛋白質であると椎論した。Ｄ．サザンブロット解析 74kDa 蛋白質はキメラ蛋白質であることを確認するためにサザンブロットを行い、ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72全遺伝子のクローニングを試みた。染色体ストレプトコッカス・ニューモニアエ DNAをHindIIIで完全に消化し、0.8％アガロースゲルで分離し、２枚の正に荷電したナイロン膜（Boehringe r Mannheim）上に移した。2.3kb EcoRI-EcoRI 断片由来の0.8kb EcoRI-EcoRVプローブ、または2.4kb EcoRI-EcoRI 断片から得られた1kb PstI-PstIプローブのいずれかを用いて膜をブロットした。両方のプローブはあらかじめジゴキシゲニンdUTPでラベルしておいた。これらの二つのプローブは、サイズの異なる二つのそれぞれのHindIII断片とハイブリダイゼーションした（図１０Bおよび１０C）。0.8kb EcoRI-EcoRVプローブは3.2kb HindIII断片を認識し、1kb PstI-PstIプローブは4kb HindIII断片と反応した。この結果からさらに74kDaキメラ蛋白質の発現の原因となっている遺伝子が、二つのEcoRI断片の読み枠の合う融合によって生じたことが示唆された。二つのEcoR断片の片方はストレプトコッカス・ニューモニアエのFucI相同体の５’側の部分を含む断片に由来し、もう片方はストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72遺伝子のC-169断片を含む断片に由来していた。0.8kb EcoRI-EcoRVプローブが3.2kb 断片単独でハイブリダイゼーションしたという事実からHSP72遺伝子のコピーはストレプトコッカス・ニューモニアエに１コピーのみ存在することが示唆された。Ｅ．組換え体HSP72産物染色体DNAのHindIIIによる消化物のプールを、2.8〜3.7kbの大きさの範囲でプラスミドpWSK29／HindIIIにライゲーションさせることにより、ストレプトコッカス・ニューモニアエの部分的なゲノムライブラリーを作製した。このライゲーション液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、その形質転換体を0.8kb EcoRI-E coRVプローブを用いたハイブリダイゼーションを行ってスクリーニングした。４つの陽性ハイブリダイジングクローン由来のプラスミドをpJBD291と名付けた。挿入断片の制限解析、および形質転換体の細胞溶菌液のウエスタンブロットを行って、プラスミドpJBD291が実際に、組換え体HSP72蛋白質を発現しているHSP72 遺伝子を含む3.2kb HIndII断片を有していることを確認した（図１０B）。形質転換体（pJBD291）によって発現されたHSP72蛋白質は、SDS-PAGEゲル上で元のHS P72蛋白質と同じ位置に泳動した（図１２）。全HSP72遺伝子をシーケンスするために、および完全な長さのHSP72蛋白質を過剰発現するために、3.2kb HindIII断片をプラスミドpJBD291から分離し、プラスミドpDELTA１およびpT7-5にサブクローニングし、それぞれpJBDΔ4およびpJBDk51と命名した。プラスミドpJBDΔ4上の全3.2kb HindIII DNA断片、およびpJBD177上の2.3kb E coRI-EcoRI DNA断片をシーケンスした。全体でヌクレオチド配列は4320塩基対から成り、二つのORFが現われた（配列番号：４）。ヌクレオチド682番目から開始しヌクレオチド 2502番目で終了する最初のORF（配列番号：４）は、ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72遺伝子であることが同定された。二番目のORF はヌクレオチド3265番目からヌクレオチド 4320番目にわたり（配列番号：４）、HSP72の構造遺伝子の764塩基対下流に位置し、ストレプトコッカス・ニューモニアエのDnaJ遺伝子の５’側の部分であることが同定された。推定上のリボゾーム結合部位（「AGGA」）はHSP72構造遺伝子の開始コドンの９塩基対上流に位置し、典型的なリボゾーム結合部位（「AGGA」）は、DnaJ構造遺伝子の開始コドンの66塩基対上流に見い出された。これらの二つの遺伝子の前方には典型的な５' 制御領域は同定されなかった。ヌクレオチド1および2間（HindIII）、ヌクレオチド1318および1319間（EcoRI）、ヌクレオチド1994および1995間（EcoRI）、ヌクレオチド3343および3344間（HindIII）、およびヌクレオチド4315および4316 間（EcoRI）に制限部位が位置する。ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP 72（DnaK）およびDnaJの遺伝子組織は、いくつかの他のグラム陽性菌（Wetzstei n，M.ら J. Bacteriol．174，3300〜3310（1992））ばかりでなく、大腸菌のそれ（Saito，H and Uchida，Mol．Gen．Genet．164，1〜8（1978））とも類似している。しかしながら、ストレプトコッカス・ニューモニアエの内部遺伝子の領域は著しく大きく、HSP72（DnaK）構造遺伝子の上流にgrpE遺伝子のORFは見い出されなかった。予測されるHSP72蛋白質は、607個のアミノ酸で分子量64755Daと算出され、SDS -PAGEで概算された72kDaの分子に相当する。予測されるHSP72蛋白質は等電点（p I）4.35で酸性である。ストレプトコッカス・ニューモニアエ64株から抽出した精製された元のHSP72蛋白質を、自動エドマン分解した結果、この蛋白質N末端の 19アミノ酸配列がSKIIGIDLGTTN-AVAVLEであることが明らかになった。アミノ末端のメチオニンは検出されなかったが、これはおそらく、多くの蛋白質において起こることが知られているように、インサイチュープロセシングに起因するものであろう。13番目のアミノ酸残基は同定されなかった。元のHSP72蛋白質から得られたN末端の19アミノ酸配列は、組み換えストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：５）から推定されるN末端19アミノ酸配列と完全に一致し、クローニングが確認された。このN末端配列はラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のDnaK蛋白質と完全に一致し、大腸菌のDnaK蛋白質とは68.4％の一致を示した。同様に、HSP72蛋白質の予測されるアミノ酸配列（配列番号：５）と、他の細菌のHSP70（DnaK）蛋白質のアミノ酸配列を整列させても、高い相同性が見られた（図13A〜13D）。例えば、HSP72 蛋白質は大腸菌のDnaK蛋白質と54％の相同性を示した。グラム陽性細菌ラクトコッカス・ラクチスとの比較により、HSP72と85％の一致という高い相同性の値が得られた。グラム陰性細菌由来のDnaK蛋白質と比較すると、HSP72は他のグラム陽性細菌のHSP70蛋白質と同様にアミノ末端近傍の24アミノ酸を欠いている（図1 3A〜13D）。 HSP72蛋白質は、他の生物由来のHSP70（DnaK）蛋白質と相同性が見られたにもかかわらず、いくつかの特徴を有している。HSP70（DnaK）蛋白質の配列の多様性は主として二つの領域に位置される（244〜330および510〜602残基、配列番号：５）。さらに特徴的であることは、GFDAARDAAQAALDD（527〜541残基、配列番号：５）およびAEGAQATGNAGDDVV（586〜600残基、配列番号：５）のペプチド配列が、HSP72蛋白質に限られていることである。HSP72蛋白質のC末端の部分が高度に変化しているという事実から、この部分がストレプトコッカス・ニューモニアエに特異的な抗原決定部位を有していることが示唆された。この仮説に一致して、HSP72蛋白質C-169断片に対するモノクローナル抗体（前記）は、HSP72蛋白質に類似したDnaK蛋白質を発現することで知られている大腸菌およびS．アウレウスでは反応しなかった。ストレプトコッカス・ニューモニアエの途中までで切れているDnaJ蛋白質（配列番号：６）は352個のアミノ酸であり、L．lactisのDnaJ蛋白質の相当する部分（72％一致）および大腸菌DnaJ蛋白質（51％一致）と高い類似性を示す。予測される途中で切れたDnaJ蛋白質はグリシンを高い含有量で含む（15％）。ストレプトコッカス・ニューモニアエのDnaJ蛋白質の148から212番目のアミノ酸の間に、 DnaJ蛋白質に特有なCys-X-X-Cys-X-Gly-X-Glyモチーフ（P．A．Silver and J．C ．Way，Cell，74，pp．5〜6（1993））、Gly-Cys rich 繰り返し配列が４つ同定された（配列番号：６）。N末端の近傍に三つのGGFGG繰り返し配列（75〜79、81 〜85、および90〜94残基）が見い出された。Ｆ．組換え体抗原に対するモノクローナル抗体の反応性 HSP72蛋白質に特異的な四つのモノクローナル抗体（F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2- Pn3.3、およびF2-Pn3.4、前記）HSP72配列を含む組換え体ファージで感染、およびプラスミドで形質転換させた大腸菌で発現している蛋白質に対する反応性についてテストした。４つのそれぞれのMAbは、クローンλJBD7で発現されているlac Z-HSP72融合蛋白質と反応し、C末端169残基に対するこれらのMAbによって認識されるエピトープに局在している。驚くべきことに、λJBD7およびλJBDΔ1のストレプトコッカス・ニューモニアエの挿入断片にコードされている蛋白質は、４つのうちの３つのみのMAbによって認識された。これらの結果から、λJBD7および λJBD17で感染させた大腸菌で合成されたC-169断片は、同じ一次構造を有するのにもかかわらず、異なる高次構造をとっていることが示唆された。MAb F2-Pn3.2 といくつかの組換え蛋白質との反応性の欠如により、この特異的なモノクローナル抗体がさらに複雑なエピトープを認識する可能性が生じた。合体でありながら、F2-Pn3.2エピトープは依然として、ウエスタンブロットで認識が可能である。組換え体プラスミドλJBDΔ4を含む大腸菌で発現された完全なHSP72rec蛋白質は、４つすべてのMAbと反応した。実施例４−HSP72 蛋白質特異的モノクローナル抗体の抗原特異性および反応性ストレプトコッカス・ニューモニアエの16種の、きょう膜血清型（1、2、3、4 、5、6、8、9、10、11、12、14、15、19、20、および22型）を代表する20菌株、ならびに表２に示したストレプトコッカス・ニューモニアエ以外の17菌株について、D．Martinら（前記）によって記載されているドット酵素免疫アッセイおよび免疫ブロッティングを用いて、MAb F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、およびF2 -Pn3.4の反応性をテストした。ドット酵素免疫アッセイのために、チョコレート寒天プレート上で細菌を一晩培養し、pH7.4のPBSに懸濁した。約10⁹CFU/ml含まれる懸濁液を5μl、ニトロセルロース紙に塗布し、3％牛血清アルブミンを含むPBS でブロックし、続けてモノクローナル抗体およびペロキシダーゼでラベルした２次抗体と一緒に培養した。細菌の試料緩衝懸濁液を5分間煮沸して、全細胞抽出物をウエスタンブロット解析のために調製した。ドット酵素免疫アッセイでテストした際、各々のモノクローナル抗体(MAb)はストレプトコッカス・ニューモニアエのそれぞれの菌株とは反応したが、ストレプトコッカス・ニューモニアエ以外の分離体とはいずれも反応しなかった。HSP7 2蛋白質は他の細菌の既知のHSP70（DnaK）蛋白質、例えば大腸菌およびS．アウレウスのそれと非常に類似していることが比較研究から明らかなっていたため、これらの結果は予測されていなかった。次に免疫ブロットを行って、本発明者らのMAbの免疫反応性について調べた。表３に示したようにそれぞれのMAbはいくらかの反応性を示した。大腸菌のアミノ酸配列およびHSP72蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：５）の類似性は54％であるのにもかかわらず、四つのHSP72特異的M Abは大腸菌のHSP70（DnaK）蛋白質を認識しなかった。同様に、HSP72特異的MAb は、56％のアミノ酸配列がHSP72蛋白質のアミノ酸配列と一致するC．トラコマティスのHSP70（DnaK）蛋白質とは反応しなかった。アミノ酸配列の高い相同性はH SP72蛋白質およびグラム陽性細菌種由来のHSP70（DnaK）蛋白質の間で観察される。しかしながら、再度、HSP72特異的MAbはスタフィロコッカス・アウレウス（ S．aureus）、またはバシルスグラム陽性種のいずれとも反応しなかった。これらは、それぞれ、HSP72蛋白質と74％および76％のアミノ酸配列相同性を示す。これらのデータから、HSP70（DnaK）蛋白質は構造的にはHSP72蛋白質と関連があるかもしれないにかかわらず、免疫学的には別個のものであることが明らかである。少なくとも一つのMAbと反応した、ストレプトコッカス・ニューモニアエ以外の純粋培養体は、ストレプトコッカス・ピオゲネス、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis），ストレプトコッカス・ミュタンス（S．mu tans）、およびストレプトコッカス・サングイス（S．sanguis）であり、これらはすべて、ストレプトコッカスまたはストレプトコッカス関連エンテロコッカス属に属する。これまで、これらのストレプトコッカスおよびエンテロコッカス種において、HSP70の蛋白質または遺伝子構造のいずれも同定されていない。これらの観察から考え合わせてみると、HSP70（DnaK）蛋白質内の非常に可変的なアミノ酸配列または残基が、抗原性に関与していることが示唆された。興味深いことに免疫ブロッティング解析によって、ストレプトコッカス・ニューモニアエの純粋培養体および免疫反応性なストレプトコッカス・ニューモニアエ以外の純粋培養体の両方のHSP70（DnaK）蛋白質の分子量に関して、著しい変化は見られないことが明らかになった。実施例５−HSP72 蛋白質の精製およびS.ニューモニアエの致死感染を防ぐ免疫原としてのHSP72蛋白質の使用Ａ．手順１．精製された組換え体HSP蛋白質および組換え体C-169の調製大腸菌のバクテリオファージ T7 RNAポリメラーゼ／T7 プロモーターシステムを利用することにより、HSP72遺伝子の高レベルの単独な発現が可能になった。3 .2kb HindIII断片をプラスミドpT7-5のT7 プロモーターφ10の前方に両方向にクローニングした。その結果得られたプラスミドpJBDk51を大腸菌BL21（DE3）株に形質転換した。最終濃度1mMになるようにIPTGを添加した後、抗生物質を加えた培地で3時間培養することにより、組換え体HSP72蛋白質（HSP72_rec）の過剰発現を誘導した。HSP72_rec蛋白質を高レベルで発現している大腸菌を遠心分離操作で濃縮し、0.2mg／mlのリゾチームを含む50mM Tris-Cl（pH8.0）、1mM EDTA、および10 0mM NaCl 溶菌緩衝液にて緩やかな超音波破砕により溶菌した。細胞溶菌液を12, 000gで15分間遠心分離し、上清を集めた。セファロース4B ビーズ（Pharmacia）に固定したモノクローナル抗体（MAb）F1-Pn3.1を用いた免疫親和性によってHSP 72rec蛋白質を精製した。SDS-PAGE で溶出液の純度を評価した。組換えC-169蛋白質（C-169rec）をプラスミドpJBDΔ1で形質転換させた大腸菌 JM109株内で、可溶性封入体の形で発現させた。蛋白質封入体を前述した超音波破砕により崩壊し沈殿した細菌細胞から回収した。沈殿をを1mM デオキシチョコレートを含む溶解緩衝液で洗浄し、汚染物質を除き、尿素6Mに溶解した。蛋白質溶液100,000gで遠心分離し、透明な上清を回収しリン酸緩衝生理食塩水に対して透析した。精製後、蛋白質含有量をBio-Rad 蛋白質アッセイ（Bio-Rad Laborato ries，Mississauga，Ontario，Canada）を用いて測定した。２．活性免疫蛋白質の研究メスのBalb／cマウス（Charles River Laboratories）10匹ずつの二つのグループを、二週間おきに皮下に３回、精製したHSP72recおよびC-169rec抗原をアルヒドロゲルアジュバントに溶かしたもの0.1mlで免疫した。抗原の投与量を1および 5μgの２つの点でテストした。三つ目のグループは対照実験のマウス10匹であり、アルヒドロゲルアジュバント単独で同じ手順を通して全く同じようにして免疫した。各々の免疫に先立ち洞様血管から血液試料を採取し、三回目の注射の5 〜7日後に血液試料を採取した。その後、これらのマウスに約10⁶CFUの３型ストレプトコッカス・ニューモニアエ WU2株を接種した。ストレプトコッカス・ニューモニアエの接種物の試料をチョコレート寒天にプレートしてCFUを測定し、接種量を確認した。感染後最初の３〜４日は６時間おきに死亡を記録し、その後 14日間は24時間おきに記録した。14または15日後、生き残ったマウスを犠牲にして、ストレプトコッカス・ニューモニアエ生菌の存在の有無について血液試料を調べた。組換えHSP蛋白質抗原に反応した抗体について実施例７に記述した。３．受動免疫保護の研究精製したC-169rec蛋白質をアルヒドロゲルアジュバントに溶かしたもの約50 μg、NZW ウサギ（Charles River Laboratories）の皮下の多数の部位に免疫した。このウサギは２週間おきに同じ抗原で３回予防接種し、最後の免疫の7〜14日後に血液試料を採取した。血清標本をプールし、抗体を40％飽和硫酸アンモニウムを用いて析出させ、精製した。 5000および880CFUの３型ストレプトコッカス・ニューモニアエWU2株の静脈内投与の１時間前に、重篤な免疫不全SCID マウスにウサギの精製した抗体を0.25m l皮下注射した。滅菌した緩衝液、および、免疫していないウサギの血清から精製した抗体を、対照のSCID マウスに注射した。ストレプトコッカス・ニューモニアエの接種物の標本をチョコレート寒天にプレートしてCFUを測定し、接種量を確認した。 SCID マウスはストレプトコッカス・ニューモニアエに非常に感染しやすいので実験材料に選択された。接種の24時間後に得られた血液試料（20 μlずつ）をチョコレート寒天にプレートしてストレプトコッカス・ニューモニアエ生菌の存在の有無について調べた。検出のレベルは50CFU／mlであった。５日にわたって死亡を２４時間おきに記録した。Ｂ．結果完全な、および部分的な（C-169）HSP72蛋白質をコードするストレプトコッカス・ニューモニアエ DNA挿入断片がクローニングされ、大腸菌内で組換え蛋白質の発現を利用することによりHSP72蛋白質のウィルス遺伝性の潜在性の研究に有益な精製蛋白質の獲得が可能になった。HSP72recおよびC-169recの両蛋白質は、クーマシーブルーで染色したSDS ポリアクリルアミドゲル上で検出される汚染も見られず、比較的純粋な状態で得られた（それぞれ、図14および15）。 HSP72蛋白質のウィルス遺伝性の潜在性を評価するために、本発明者らは最初にHSP72rec蛋白質の保護的な免疫応答を引き出す能力について調べた。マウス１０匹のグループを完全長のHSP72rec蛋白質で免疫し（1μgあるいは5μg投与）、 4.2百万 CFUの３型ストレプトコッカス・ニューモニアエWU2株を接種した。 HS P72rec蛋白質1μgで免疫したマウスの80％が接種後も生存し、HSP72rec蛋白質5 μg投与したマウスでは50％が生存した。抗原なしのアルヒドロゲルアジュバント単独で免疫したマウスは１匹も生存しなかった（図１６）。感染して１４または１５日間後も生存していたマウスから採取した血液試料はいずれも、ストレプトコッカス・ニューモニアエ生菌が検出されなかった。 HSP72rec蛋白質が、３型ストレプトコッカス・ニューモニアエに対する防御を引き起こすことが観察されたことから、６型株から抽出したDNA由来のHSP72蛋白質が、異なるきょう膜型を有する異種の菌株に対して、防御を引き出す能力のあるエピトープを含んでいることが示唆された。本発明者らはさらに、キメラなfucI-HSP72遺伝子を形質転換した大腸菌で発現した組換え体蛋白質断片を用いて、HSP72蛋白質に対する免疫応答についてテストした。精製したC-169rec蛋白質で免疫したマウスは、致死感染から守られ、このことから、防御を引き起こすエピトープのいくつかは全てではないが、HSP7 2蛋白質の後部の169残基を含むC末端領域に存在することが示された 10匹のマウスのグループをC-169rec蛋白質で免疫（1μgあるいは5μg投与）し、600万CFUのストレプトコッカス・ニューモニアエ３型 WU2株を接種した。 C- 169rec蛋白質1μgで免疫したマウスの 60％が生存し、C-169rec蛋白質を5μg投与したマウスでは70％生存した（図１７）。反対に、C-169rec蛋白質を投与しなかったマウスは接種後２日間で全て死亡した。それゆえ、ストレプトコッカス・ニューモニアエHSP蛋白質のC末端部分は、DnaK蛋白質における最大に差異が見られる領域を含んでおり、防御免疫応答のターゲットである。下記の表４に示したように、二つの独立した実験により、ウサギの抗C-169rec 抗体で受動転移したSCIDマウスはストレプトコッカス・ニューモニアエ WU2株の致死感染から防御され、反対に、15匹の対照のマウスは一匹も生存しないことが示された。対照のマウスには、免疫していないウサギ由来の抗体、または滅菌緩衝液のみを投与した。加えて、対照グループの全てのマウスが接種後24時間で陽性のストレプトコッカス・ニューモニアエ血液培養液を有していたが、免疫した SCIDマウスのうちストレプトコッカス・ニューモニアエ生菌が検出されたのは全 10匹中2匹のみであった。実験1および2（表４）では、それぞれ5000および880CFUの３型ストレプトコッカス・ニューモニアエ WU2株をマウスに接種した。表４の結果は、マウスの接種後の生存数、またはストレプトコッカス・ニューモニアエ陽性を示した数について、それぞれのグループの全マウス数と比較して表わした。組換え体HSP72およびC-169蛋白質を免疫して得られた抗体の抗-HSP72特異性は、抗原としてストレプトコッカス・ニューモニアエの細胞溶解液を用いたウエスタンブロット解析によって証明された。HSP72に相当する１本のバンドはウサギおよびマウスのテストしたすべての抗血清で検出された。これらの血清学的な結果から、組換え蛋白質の免疫後に生じる蛋白質が、ストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72 蛋白質と反応する抗体の生産によるものであることが示唆された。実施例６−HSP72 蛋白質のC-151末端部分の高レベル産生のための熱誘導発現システム A．ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72蛋白質のC末151アミノ酸をコードしている領域を含むプラスミドpURV3の構築ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72蛋白質のC末151アミノ酸をコードしているDNA領域はlPLプロモーターの下流につなぎ、翻訳ベクターp629(H．J ．George et al.，Bio/Technology 5，pp．600〜603(1987))へ挿入した。このベクターは、機能的PRプロモーターが欠失したバクテリオファージl cI857 温度感受性リプレッサー遺伝子のカセットを含んでいる。３０度〜３７度の範囲から３７度〜４２度への範囲への温度上昇によるcI857蛋白質の不活性化が、lPL支配下にある遺伝子の誘導につながる。温度シフトによる大腸菌細胞中の遺伝子の発現の誘導は大規模な発酵にとって有利である。なぜなら現在使われている発酵素によって容易に行なわれ得るからである。しかしながら、大腸菌は本明細書に記載された実験で選択された微小生物ではあるが、酵母のような他の宿主生物も本発明の範囲内に含まれ得るということは、理解されるべきものである。ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72遺伝子の2050から2506番目の457 塩基対の領域を含む477ヌクレオチドのDNA断片は、オリゴヌクレオチドプライマーOCRR26(5'- GGCAGATCTATGAAGGCCAAAGACCTTGGAAC)およびプライマーOCRR27(5'- CGCGGATCCTTACTTTTCCGTAAACTCTCCGT)を用いて、ストレプトコッカス・ニューモニアエ６型株64ゲノムDNAから、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅された。染色体DNAは、Jayaraoらの方法（J．Clin．Microbiol.，29，pp.2774〜2778 （1991））を用いてハートインフュージョン培地中で、ストレプトコッカス・ニューモニアエの対数増殖期の細胞培養液90mlから調製した。 DNA増幅反応は、パーキンエルマーSan Jose，CAのDNAサーマルサイクラーを用いて行なった。OCR R26では、ATG開始コドンがC末151のアミノ酸末端領域をコードしている領域のちょうど上流のフレームのなかに存在する。プライマーOCRR26およびOCRR27は各々 BglII（AGATCT）およびBamHI(GGATCC)認識部位を含む。このため、p629の脱リン酸化した制限部位BglII およびBamHIへのPCR産物のクローニングが容易になる。 PCR産物はフェノールフリーズ法（S．A．Benson，Biotechniques 2，pp．67〜 68（1984））によってアガロースゲルから精製し、制限酵素BglII およびBamHI で消化した。その後、471塩基対のBglII-BamHI断片は、p629の脱リン酸化したBg lII およびBamHI認識部位へライゲーションした。こうして作製したプラスミドp URV3の部分的地図は、図18に示した。このプラスミドはSimanis法（Hanahan，D. D．M．Glover編，DNA Cloning，pp．109〜135，(1985)）を用いてStratagene ，La Jolla，CAから得た大腸菌株XLI Blue MRF'（D(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-m rr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F’proAB lacI^qZDM15 T n10(Tet^r)]c）へ形質転換した。 37度で培養した形質転換体は、C-169recに反応するMAb F1-Pn3.1 を用いて、コロニー免疫ブロット法（J．Sambrookら（前記））によって選択した。プラスミドDNAは、選択された形質転換体から精製し、D NA挿入断片はApplied Biosystems Inc.（ABI）のTaq Dye Deoxy Terminator Cyc le Sequencing キットを用いたPCRそして、自動DNAシーケンサー377A(ABI)を用いた電気泳動によって塩基配列を決定した。このDNA挿入断片のヌクレオチド配列は、HSP72遺伝子のC末151コード領域のヌクレオチド配列と完全に一致した。（参照配列番号：25 および、配列番号：26に相当するアミノ酸配列）このプラスミドはC-151recの生成のため、大腸菌の元株W3110へ形質転換した。 B．C-151rec の発現および抗体の調製組み換え体C-151recは、プラスミドpURV3を保持する大腸菌株W3110で、アミノ末端のメチオニンと共に合成された。大腸菌細胞はA₆₀₀が0.6になるまで、100mg /mlのアンピシリンを含むLB培地中30度で培養した。そして、C-151rec蛋白質の生成の誘導のため、この細胞を40度で18時間培養した。半ば精製したC-151rec蛋白質は次の手順で調製した。細菌の細胞は、遠心機で集菌し、生じた沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し溶解させた。リゾチームを加え、パルス超音波処理による細胞破壊の前に、細胞を氷中で15分間培養した。細胞溶解液は遠心によって不純物を落とし、上清を集め、Amiconの超ろ過装置(stirred cells series 80 00，Amicon Canada Ltd Oakville，Ontario)を使用して分離させた。 YM30膜で保持されない超ろ液を回収し、SDS-PAGEで分析し、クーマシーブルーR-250で染色した。蛋白質濃度は、C-151rec蛋白質の染色強度と予め濃度の分かっている大豆トリプシン阻害薬の染色強度を比較することによって測定した。 C．C-151rec に対するMAbの反応性ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72蛋白質との反応性で選択した10 のモノクローナル抗体のパネルを、前記したようにして調製されたYM30-超ろ液を用い、ウェスタンブロット解析によって、C-151recに対する反応性をもとにテストを行った。MAbには、HSP72rec蛋白質に対して生じた一連の６つのモノクローナル抗体(F3-Pn3.5からF3-Pn3.10)、もしくはモノクローナル抗体F1-Pn3.1，F 2-Pn3.2，F2-Pn3.3，F2-Pn3.4が含まれていた。F1-Pn3.1，F2-Pn3.3，F2-Pn3.4 の３つのMAbはC-169recと反応するが、C-151rec断片をも認識した。他のすべてのMAbは、HSP72recとのみ反応性が見られた。このことは、HSP72蛋白質のアミノ末端にあるエピトープに対するものであることを示唆している。実施例７ Balb/c マウスおよびMacaca-Fascicularis(cynomolgus)サルの、組み換え体HSP72抗原に対する抗体の反応 A．手順 1．動物の免疫 10匹のメスBalb/cマウスのグループを実施例５で記述したように、HSP72recまたはC-169recのいづれかで皮下免疫させた。C-151recに対する抗体反応を評価するために、６匹のマウスからなるグループを、アルヒドロゲルアジュバントに溶かした0.5mgのC-151recを２週間の間隔をおいて３回腹腔内接種し、免疫させた。免疫前および３回目の免疫後４日から７日後に取られた血液試料からの血清を、ストレプトコッカス・ニューモニアエの細胞壁抽出物でコートしたプレートを用いたELISAによって、ストレプトコッカス・ニューモニアエとの抗体反応性をテストした。メスのcynomolgusサルに、アルヒドロゲルアジュバントに溶かした150mgの精製したHSP72recまたはC-169rec抗原を含んだ0.5mlを、1,22,77日目に腹腔内接種し、免疫させた。血液試料をそれぞれ免疫前および免疫後に定期的に集め、その血清をウェスタンブロット法によって、ストレプトコッカス・ニューモニアエHS P72蛋白質との抗体反応性をテストした。生成したストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72蛋白質の抗体の特異性を、ストレプトコッカス・ニューモニアエの細胞壁抽出物および精製した組み換え抗原に対するウェスタンブロット法によって確認した。 B．結果実施例５で前に記述した結果は、抗体の反応の保護的状態が、組み換えHSP72 抗原での次の免疫を引き出したことを、明瞭に示している。ここで我々は、免疫計画中マウス（図19,20および21）ならびにサル（図22）の血清抗体の反応の出現を検査した。両方の種とも３回目の接種後、平均タイター1:64000の免疫原として用いた組み換えHSP72蛋白質の全長、および途中までのHSP72蛋白質に対して強く反応した。個々の血清の詳細な解析から、それぞれの動物は、各々ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72蛋白質と反応する発達途上の抗体での免疫に対して、応答することが示された。C-169recで免疫したマウスにおいて、２つの投与量、すなわち1および5mgでテストした投与は、類似の抗体のタイターの誘導の点で、同じように有効だった（図20）。強い２回目の反応は、３回目の接種後の抗体のタイターの上昇を伴わず、C-169recの２回目の接種後に観察された。これに反し我々は、HSP72recに対する免疫反応が、投与量に依存していることを観察した。特異的な抗体のタイターの上昇は、HSP72recまたはC-151recのいづれかを、２回目および３回目の接種後に、観察された（図19および21）。サルの免疫反応の研究から、組み換えHSP72抗原の免疫原性は、ウサギおよびマウスのようなげっ歯類に限定されないことが示された。各々の抗原による２回目の接種につづいておこる体液反応は、抗体のタイターの検出可能な減少を伴わず２、３週間維持できる、HSP72特異的抗体のタイターの強い上昇によって、特徴づけられる（図22）。さらに特異的血清抗体は、組み換え抗原の１回の接種後に、各々のサルの血清中で検出できた。実施例８−HSP72 ストレス蛋白質のB細胞エピトープのマッピング実施例3では、HSP72蛋白質の最初の配列の中の重要な変化が、ストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72蛋白質の244から330、および510から607までのアミノ酸配列に相当する２つの領域に、主として位置していた。これらの可変領域は、実施例4で報告した抗原のヘテロ遺伝子性に反応するB細胞エピトープを含み得る。この可能性を調べるために、ストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72蛋白質のポリクローナルおよび、モノクローナル抗体の反応性を、これらの領域を含むように選んだ１４のペプチドに対してテストを行った。 A．手順 14から30アミノ酸配列の14個のペプチドを合成した。蛋白質におけるこのペプチドの配列および位置は、表5にまとめてある。ペプチドCS870，CS873，CS874， CS875，CS876，CS877，CS878，CS879，CS880 およびCS882は、自動ペプチド合成機を使用し、Biochem Immunosystem Inc．(Montreal，Canada)によって、合成された。ペプチドMAP1，MAP2，MAP3およびMAP4は、de Sequence de Peptides de l'Est du Quebec，Centre de recherche du CHUL(Sainte-Foy，Canada)の供給による複合抗原ペプチド（MAP）として、リジンを芯とする側鎖上へ合成した。ペプチドは逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。ペプチドCS874 およびCS876は、少量の6Mグアニジン塩酸または、ジメチルスルオキシドいずれかに溶かしたものを蒸留水で1mg/mlに調製した液体に溶解し、残りのペプチドは蒸留水に溶解した。ペプチドELISAは、J．Hamelら（前記）によって記述された手順に従って、50m g/mlの濃度で、Immunolon 4 microtitratonプレート（Dynatech Laboratories， Inc.，Chantilly，VA）上へコーティングした合成ペプチドによって行った。ペプチドとのMAbの反応性を確認するために、流動相ペプチドの、固形HSP72蛋白質へのMAb結合阻害能を測った。結合阻害能測定実験において、microtitratonプレートは、ストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞壁抽出物でコートした。 HSP72特異的MAbを含むハイブリドーマ培養液上清を、ペプチド濃度をいくつかに分けて、４度で一晩培養した。それから処理したペプチドおよび対照の上清を、上記したようELISAでテストを行った。免疫上清は、組み換えHSP72抗原で３回免疫した動物から得た。実施例5で記述した免疫プロトコールに従って、１匹のラットを37.5mgの精製したHSP72recで免疫した。ネズミ科の血清プールは、実施例5からHSP72recで免疫した３匹のBalb/ cマウスから得た。そしてサル血清プールは、HSP72recまたはC-169recのいずれかで免疫した２匹の動物のグループから得た。 B．直鎖状B細胞エピトープの同定および局在図23で示された結果から、多くの免疫学的反応性が、HSP72蛋白質のC末151断片に相当するアミノ酸配列457および607の中に位置したペプチドに見られた。組み換えHSP72recまたはC-169recのいずれかで免疫した動物から得たラビット、マウスおよびサルの血清抗体は、ペプチドMAP2およびMAP4の両方と反応する。興味深いことに、ペプチドMAP2およびMAP4の配列は、データバンクを利用したHSP70 蛋白質との比較に基づいて、ストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72蛋白質に唯一存在する配列GFDAERDAAQAALDD（配列527から541）および配列AEGAQATGNAG DDVV（配列586から600）を含む、C末端超可変領域に渡って存在する。このようにして我々のデータから、両ペプチド配列が、直鎖状B細胞エピトープを含むことが示された。さらに、ペプチドMAP4単独でもMAb F1-Pn3.1によって認識された。この反応性は流動相阻害実験で確かめられた。このなかで、10mg/mlのMAP4は、F1-Pn 3.1のHSP72蛋白質との結合を完全に阻害した。完全な組み換えHSP72蛋白質で免疫した動物からのポリクローナル抗血清もまた、ペプチドCS875，MAP1およびMAP 3上に位置したB細胞エピトープを認識した。これらのデータ全てから、HSP72蛋白質C末151超可変領域断片が、B細胞の反応を刺激し、HSP72蛋白質の免疫的優性領域を構成し得ることが示唆される。合成ペプチドとのMAb F2-Pn3.3 およびF2- Pn3.4の反応性の欠如から、こられがHSP72蛋白質C末端に存在する構造決定部位と反応することを示している。C末151領域の保護エピトープの存在は、実施例5 で強く示された。そこでは、精製したC-169recで免疫したマウスは、ストレプトコッカス・ニューモニアエの悪性株での致命的な感染から守られ、このことから HSP72蛋白質C末169もしくはC末151または、それのさらに小さい断片ですら、将来のワクチンの開発にとって非常に有効であることが示される。アミノ酸配列244から330からなる可変領域もまた、抗原ドメインを構成している。重なり合って存在するペプチドCS877（アミノ酸257から271）およびCS878（アミノ酸268から281）、ペプチドCS880（アミノ酸286から299）およびCS882（アミノ酸315から333）上の直鎖状エピトープは超免疫血清によって同定された。実施例９−ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエから得たHSP70(DnaK)：クローニングおよびHsp70遺伝子の塩基配列；ヌクレオチドおよび蛋白質の配列解析；ストレプトコッカス・ニューモニアエとの抗原性の関係；熱に応答し上昇するストレプトコッカス・アガラクチアエ HSP 70蛋白質の合成 A．手順 1．菌株およびプラスミドベクターこの研究で用いたストレプトコッカス・ピオゲネス(グループA 連鎖球菌)およびストレプトコッカス・アガラクチアエ（グループB 連鎖球菌）の菌株は、t he Laboratoire de la Sante Publique du Quebec(LSPQ)，Sainte-Anne de Bel levue，Quebec，Canadaから分与された。ストレプトコッカス・アガラクチアエ type II株V8はATCC株12973に相当する。ストレプトコッカス・ピオゲネス株Brun oはATCC株19615に相当する。大腸菌株XLI Blue MRF'はStratageneから得た。連鎖球菌株は5%CO₂培養器の中で、３７度で培養した。連鎖球菌は5%羊血液を含むトリプティック大豆プレート（Les Laboratories Quelab．Montreal，Canad a）に塗布し、液体培養液は振とうしないで、ハートインフュージョン培地（Dif co Laboratories，Detroit，MI）中で培養した。大腸菌株はL培地で37度で250rp mの振とう培養または、L寒天培地で培養した。一般的なクローニングファージミドpBluescript KS(-)は、Stratageneから購入した。 2．組換えDNA技術制限酵素、T4 DNAリガーゼ、および子牛腸リン酸化酵素は、供給会社(Pharmac ia（Canada）Inc.，Baie d'Urfe，Canada; およびNew England Biolabs Ltd.，M ississauga，Canada)で推奨しているものを用いた。セシウム-臭化エチジウム平衡密度勾配遠心によるプラスミドの調製、DNA断片のアガロースゲル電気泳動、サザンハイブリダイゼイション、およびコロニーDNAハイブリダイゼイションは、J．Sambrookら（上記）によって記載された方法で行った。連鎖球菌の染色体D NAは、B．M．Jayaraoら（J．Clin．Microbiol.，29，pp.2774〜2778(1991)）の手順を、90mlの菌培養液に適用して、調製した。迅速なプラスミドの調製は、D ．Ish-Horowiczら（Nucl．Acids Res．9，pp.2989〜2998(1981)）に従って行った。DNAの塩基配列の決定に用いたプラスミドは、Qiagen Inc．（Chatsworth，C A）から購入したプラスミドキットを用いて精製した。 DNA断片は、フェノールフリーズ法(S．A．Benson，Biotechniques 2，pp.67〜68(1984))によって、アガロースゲルから精製した。DNAプローブは、Boehringer Mannheim(Laval，Canada )のランダムプライマーラベルリングキットを用いて、³²P-dCTPまたはジゴキシゲニン（DIG）-11-dUTPでラベルした。プラスミドの形質転換体は、Simanis(H anahan，D．In D．M．Glover(ed.)，DNA Cloning，pp．109〜135，(1985))の方法で行われた。プラスミドの遺伝子DNA挿入断片の塩基配列は、合成オリゴヌクレオチドを用いて決定された。塩基配列の決定反応は、Taq Dye Deoxy Term inator Cyc le Sequencing kit(ABI)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で行い、DNA電気泳動は、自動DNAシーケンサー 373A(ABI)で行った。 DNA塩基配列の組み立ては、Gene Codes Corporation(Ann Arbor，MI)からでているSequencer3.0プログラムを用いて実行した。DNA塩基配列およびそれからコードされるポリペプチドの解析は、Intelligenetics，Inc.(Mountain View，CA)からでているプログラム Gene Works version2.45を用いて実行した。DNA増幅反応は、Perkin ElmerのDNA Thermal Cycler 480を用いて行った。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成機model394(ABI)で合成した。 3．S. アガラクチアエおよびS．ピオゲネスの遺伝子hsp70/dnakの分子クローニング S．アガラクチアエおよびS．ピオゲネス由来の染色体DNAを、回文配列のヘキサヌクレオチドを認識する配列を有するさまざまな制限酵素で完全に消化した。 S. ニューモニアエのHSP72遺伝子のATG開始コドンよりも332塩基下流から開始する782塩基対領域に相当するDNAプローブを、PCRで増幅したものを標識して用いたサザンハイブリダイゼーションで、消化物を解析した(配列番号4を参照)。このDNA領域が選ばれたのは、hsp70遺伝子の中でも既知のグラム陽性細菌で比較的よく保存されているためである。オリゴヌクレオチドOCRR2(5'-AAGCTGTTATCACAG TTCCGG)およびOCRR3(5'-GATACCAAGTGACAATGGCG)を用いて、S．ニューモニアエのゲノムDNAのPCR増幅を行った。ハイブリダイズしているゲノムの制限断片のうち、70 kDaポリペプチド(> 1.8 kb)をコードするのに適当な大きさのものについて、アガロースゲルから相当する大きさのゲノム断片を抽出し、一部精製した。精製したゲノム制限断片中のhsp70遺伝子の存在を証明するため、標識した782 bp のS．ニューモニアエ DNAプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。精製したゲノムDNA制限断片を、pBluescript KS(-)脱リン酸化されて適合する制限部位にクローニングし、E．coli株XLI Blue MRF'へ形質転換させた。782 bp のS．ニューモニアエDNAプローブを標識して用いたDNAハイブリダイゼーションでコロニーをスクリーニングした。抽出されたプラスミドはさまざまな制限酵素で消化して、挿入配列の大きさを評価し、782 bpのS.ニューモニアエDNAプローブを標識して用いたサザンハイブリダイゼーションによってhsp70遺伝子の存在を証明した。プラスミドpURV5は、S.アガラクチアエのゲノムDNAの4.2 kb HindIII挿入配列を含む。プラスミドpURV4は、S．ピオゲネスのゲノムDNAの3.5 kb HindII I断片を含む。 4．熱ショックと蛋白標識 S．アガラクチアエの熱ショックに対するストレス反応を、実施例1で前述したように、[³⁵S]メチオニンでパルス標識することによって分析した。SMAN(メチオニン分析培地で、メチオニン1 mg/l、イソビタレックス1 %(v/v)、およびコリンクロライド1 mg/lを含有する)で一晩発育させたS.アガラクチアエ細菌を、遠心分離してペレットにした後、メチオニンを含まないSMAN培地に再懸濁させた。該細菌は37 ℃で1時間インキュベートした後、体積で二等分した。試料はどちらも 37℃または43 ℃で10分間インキュベートした後、100μCi/ml[³⁵S]メチオニンで 30分間37 ℃で標識した。細菌はPBSでよく洗浄し、細胞抽出物をDNA Isolation( M．Jayarao et al.，前出)に記載されているようにムタノリジンおよびライソザイムにて処理して調製し、超音波処理を行った。 5．免疫学的特徴 HSP72rec蛋白と反応する6種のモノクローナル抗体のシリーズ(F3-Pn3.5からF3 -Pn3.10まで)およびモノクローナル抗体F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、F2-Pn3 .4をS．ピオゲネスおよびS．アガラクチアエ由来のHSP70抗原に対する反応性について、ウエスタンブロット解析で調べた。S．ピオゲネスおよびS.アガラクチアエ由来の細胞溶解物をムタノリジンおよびライソザイムでの処理(M．Jayarao et al.，前出)、超音波処理、ならびにSDS-PAGE試料緩衝液中での煮沸によって入手した。pURV4またはpURV6のいずれかで形質転換され、切断されて短くなった S．oyrjgenes HSP70抗原を産生するE．coli由来の細胞溶解物を、SDS-PAGE試料緩衝液中で煮沸した後に調べた。 B．ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、およびストレプトコッカス・ニューモニアエのhsp70/dnak遺伝子のDNA配列解析プラスミドpURV5の4.2 kb HindIII挿入配列における2438塩基の領域の配列を決定した。この配列は、609アミノ酸のポリペプチドをコードし、1830ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、分子量は64907である(配列番号7 参照)。ORFは248番目のATG開始コドンから始まり、2077番目のTAA終止コドンで終わる。ATG開始コドンの前には、237番目の位置から始まるGAGG配列があり、これは16S rRNAと相補的であり、大腸菌のリボゾーム結合部位として知られている (G．D．Stormoら.，Nucleic Acids Res．10，pp．2971〜2996(1982))。ストレプトコッカス・アガラクチアエのHSP70蛋白質のORFおよびポリペプチドは、ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72蛋白質のORFおよびポリペプチドに対して、それぞれ85%および95%が一致する。ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72蛋白質との予備的な塩基配列の比較から、プラスミドpURV4上の3.5-kb HindIII挿入断片は、ストレプトコッカス・ピオゲネスのhsp70遺伝子の3'-末端コード領域が欠けていることが分かった。ストレプトコッカス・ピオゲネスのhsp70遺伝子の全コード領域を含む3-kb Sa lI遺伝子断片のクローニングを試み、この遺伝子の5'-末端コード領域が欠けた3 .1-kbの挿入断片含むプラスミドpURV6を得た。プラスミドpURV4もしくはpURV6上のhsp70遺伝子領域の解析により、分子量が64847で608個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする1824塩基対のORFを含む2183ヌクレオチドであることが分かった（参照配列番号：20）。204番目の位置のATG開始コドンから始まり、 2030番目に位置するTAA終止コドンで終わる。ストレプトコッカス・アガラクチアエのhsp70遺伝子と類似して、ATG開始コドンの前に、193番目に位置した推定上のリボゾーム結合配列GAGGが存在する（G．D．Stormo，上記）。ストレプトコッカス・ピオゲネスのhsp70遺伝子のORFおよびそこにコードされているポリペプチドは、ストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP72蛋白質のORFおよびポリペプチドに対して、それぞれ85%および94%が一致する。プラスミドpURV4のORFは、ストレプトコッカス・ピオゲネスのHSP70蛋白質のC末端41アミノ酸をコードする 125塩基対が欠けている。このORFはHSP70蛋白質N末端の567アミノ酸(N-567rec) をコードしている。プラスミドpURV6のORFは、ストレプトコッカス・ピオゲネスのHSP70蛋白質N末端の38アミノ酸をコードする114塩基対が欠けている。このORF はHSP70蛋白質C末端の570アミノ酸(C-570rec)をコードしている。ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチアエおよびストレプトコッカス・ニューモニアエのHSP70/DnaK蛋白質のDNAオープンリーディングフレーム(図24)およびアミノ酸配列（図25）の大規模な比較から、それぞれ82%および93%が一致していることが分かった。 C．熱に応答したストレプトコッカス・アガラクチアエのHSP70蛋白質合成の上昇 [³⁵S]メチオニンでパルスラベルした熱ショック、および対照のストレプトコッカス・アガラクチアエの細胞抽出物の１次元SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の解析から、70kDa蛋白質の合成は、熱ストレス後に顕著に上昇することが示された（図26，レーン1および2）。放射線免疫沈降解析から、熱誘発する70kDa 蛋白質は、モノクローナル抗体F2-Pn3.4を用いて43度で容易に検出できることが示された。このことは、この蛋白質が熱ショック蛋白質70（hsp70/DnaK）ファミリーに属していることを示している（図26、レーン3および4）。 D．ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエにおけるHSP70蛋白質の抗原性の関与この研究で、MAbのパネルを、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクチアエおよびストレプトコッカス・ニューモニアエHSP70蛋白質の抗原性の関与の点で研究してきた。10中8つのMAbは３つ全ての連鎖球菌種反応し、このことから、いくつかのB細胞エピトープはストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびストレプトコッカス・アガラクチアエに広く存在していることが示唆される。ストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72蛋白質の584から607番目のアミノ酸に位置するエピトープと親和性のあるMAb F1-Pn3.1は、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはストレプトコッカス・アガラクチアエのいづれのHSP70抗原とも反応しない。３つの連鎖球菌種のこの領域の比較から、589から596番目のアミノ酸の間に位置する5から8アミノ酸で違いが見られた。C-151領域に存在するエピトープにも親和性があるMAb F2-Pn3.3は、ストレプトコッカス・アガラクチアエとは反応するが、ストレプトコッカス・ピオゲネスとは反応しない。これらの結果から、連鎖球菌種からの HSP70蛋白質は、構造的にもしくは免疫学的に関係が見られることが、明瞭に示している。しかし、免疫学的な差異は見られる。途中で切れている組換えストレプトコッカス・ピオゲネスHSP70蛋白質とのMAb F3-Pn3.5，F3-Pn3.6，F3-Pn3.7およびF3-Pn3.10の反応性の解析から、ストレプトコッカス・ニューモニアエHSP72蛋白質のアミノ末端近くの抗原領域が同定された。これらのMAbは、N末567アミノ酸を発現している構造体とは反応したが、C -570断片を発現している構造体とは反応しなかった。これらのデータから、MAbs F3-Pn3.5、F3-Pn3.6、F3-Pn3.7、およびF3-Pn3.10によって認識されたエピトープが、HSP72蛋白の残基1と38の間に位置することを示した。実施例10 ヒトのワクチンとしてのHSP70/HSP72の使用ヒトが使用できるようにワクチンを調製するには、本明細書に記載したポリペプチドの中から適当なHSP72抗原が選択されよう。例えば、当業者はHSP70/HSP72 ポリペプチドまたはそのフラグメントを中心に免疫原性のエピトープを含むワクチンをデザインできよう。実質的に純粋な組み換え抗原を調製するためには、分子生物学の技術の使用が特に適している。ワクチンの組成は様々な形式をとりうる。これらには例えば、パウダー、水溶液または懸濁液、およびリポソームのような、固体、半固体、および液体の投与形態が含まれる。本発明のHSP70/HSP72抗原は、ヒトに投与された際に防御的免疫反応を誘導するだろうという本発明者らの考えに基けば、本発明の組成物は、例えばテタヌスやジフテリアのような、ヒトを免疫するために使用されている他の蛋白と同様になるだろう。したがって、本発明の組成物は、好ましくは薬剤学的に許容されるアジュバントを含む。それらには例えば、不完全フロイトアジュバント、水酸化アルミニウム、ムラミルペプチド、w/o型エマルジョン、リポソーム、ISCOMまたはCTB、あるいはコレラ毒素由来の非毒性Bサブユニットなどがある。もっとも好ましくは、該組成物はw/o型エマルジョンまたは水酸化アルミニウムをアジュバントとして含む。該組成物はさまざまな薬剤学的に許容される形態で患者に投与されよう。それらには、筋肉内、皮内、皮下、または局所投与が含まれる。好ましくは、ワクチンは筋肉内投与される。一般に、用量はアジュバントとともにHSP72抗原の患者1人あたりおよそ0.01から10 mg、好ましくは0.1から1.0 mgの初回の投与からなり、後に1回またはそれ以上の追加投与を行う。好ましくは、追加投与は初回投与後1ヶ月目と6ヶ月目に行う。肺炎球菌ワクチンの開発に関して重要なことは、粘膜免疫の問題である。理想的な粘膜ワクチンは、安全に経口または鼻腔内で1回または2、3回の用量で摂取され、全身的な免疫に応じて適当な体表面に防御抗体が誘導される。粘膜ワクチンの組成はアジュバント、不活性な粒子状のキャリア、または生きた組み換えベクターを含むだろう。本発明の抗HSP72抗体は、S.ニューモニアエ、S.ピロゲネス、S．アガラクチアエ、または関連した細菌に感染したヒトの受動免疫療法および免疫予防に有用である。このような受動免疫のための投与形態および治療計画は、他の受動免疫療法と同様であろう。本発明による抗体は、American Type Culture Collection In Rockville，Mar yland，USAに1995年7月21日に寄託された、MAb F1-Pn3.1を産生するハイブリドーマによって例証され、ネズミハイブリドーマ細胞株F1-Pn3.1として同定される。本寄託の寄託番号はHB 11960である。本発明者らは本明細書において本発明のいくつかの態様を記載しているが、本発明者らの基本的な態様が、本発明の組成および手順を有用にするような他の態様を提供すべく変更されうることは明らかである。したがって、本発明の見地が前述の本明細書および添付した請求の範囲において定義された態様の変更および変化をすべて包含することが推奨される。そして本発明は、本明細書において実施例として提示された特定の態様に限定されない。

【手続補正書】【提出日】１９９７年１２月１１日【補正内容】請求の範囲 1．(a) 配列番号：5のアミノ酸配列を有するHSP72 ポリペプチド、 (b) 配列番号：20のアミノ酸配列を有するHSP70(Dnak)ポリペプチド、 (c) 配列番号：22のアミノ酸配列を有するHSP70(Dnak)ポリペプチド、および (d) HSP70/72ポリペプチドのC末端部分の断片からなる群より選択されるポリペプチド。 2．(d)項の断片が、配列番号：5のアミノ酸439〜607（C-169）、配列番号：5のアミノ酸457〜607（C-151）、配列番号：5のアミノ酸527〜541、および配列番号：5のアミノ酸586〜600 からなる群より選択される、請求項1記載のポリペプチド。 3．配列番号：5のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 4．配列番号：20のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 5．配列番号：22のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 6．配列番号：26のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 7．配列番号：7のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 8．配列番号：8のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 9．配列番号：9のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 10．配列番号：10のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 11．配列番号：11のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 12．配列番号：12のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 13．配列番号：13のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 14．配列番号：14のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 15．配列番号：15のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 16．配列番号：16のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 17．配列番号：17のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 18．配列番号：18のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 19．配列番号：23のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 20．配列番号：24のアミノ酸配列、またはその類似体もしくは誘導体を有する、請求項1記載のポリペプチド。 21．ストレプトコッカス菌株に特異的な免疫反応を示す、請求項1 〜20のいずれか一項に記載のポリペプチド。 22．(a) 配列番号：5のアミノ酸配列を有するHSP72ポリペプチド、および (b) 単独であるかまたは融合蛋白を形成するために他のポリペプチドと結合している、上記ポリペプチドの断片からなる群より選択される、請求項1記載のポリペプチド。 23．(b)項の断片が、配列番号：5のアミノ酸439〜607（C-169）、配列番号：5のアミノ酸527〜541、および配列番号：5のアミノ酸586〜600 からなる群より選択される、請求項22記載のポリペプチド。 24．(b)項の融合蛋白が配列番号：3のアミノ酸配列を有するフコース異性化HSP7 2(C-169)蛋白である、請求項22記載のポリペプチド。 25．(a) 配列番号：4のHSP72 DNA配列、 (b) 配列番号：19のHSP70（DnaK）DNA配列、 (c) 配列番号：21のHSP70（DnaK）DNA配列、 (d) 上記DNA配列のいずれかに対する縮退DNA配列、および (e) 単独であるかまたは融合DNA配列を形成するために他のDNA配列と結合している、上記DNA配列のいずれかの断片からなる群より選択されるDNA配列。 26．配列番号：4のヌクレオチド682〜ヌクレオチド2502の式を含む、請求項25記載のDNA配列。 27．配列番号：4のヌクレオチド1996〜ヌクレオチド2502の式を含む、請求項25 記載のDNA配列。 28．配列番号：4のヌクレオチド2050〜ヌクレオチド2502の式を含む、請求項25 記載のDNA配列。 29．配列番号：4のヌクレオチド2260〜ヌクレオチド2304の式を含む、請求項25 記載のDNA配列。 30．配列番号：4のヌクレオチド2437〜ヌクレオチド2481の式を含む、請求項25 記載のDNA配列。 31．配列番号：19のヌクレオチド204〜ヌクレオチド2027の式を含む、請求項25 記載のDNA配列。 32．配列番号：21のヌクレオチド248〜ヌクレオチド2074の式を含む、請求項25 記載のDNA配列。 33．配列番号：25のヌクレオチド4〜ヌクレオチド456の式を含む、請求項25記載のDNA配列。 34．請求項1 〜20のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするDNA配列。 35．以下の(a)〜(c)からなる群より選択される、請求項25記載のDNA配列： (a) 配列番号：4のHSP72 DNA配列； (b) 上記DNA配列に対する縮退DNA配列；および (c) 単独であるかまたは融合DNA配列を形成するために他のDNA配列と結合している、上記DNA配列のいずれかの断片。 36．(c)項の断片が、配列番号：４のヌクレオチド1996〜2502(C-169)（アミノ酸 439〜607）、配列番号：４のヌクレオチド2260〜2304（アミノ酸527〜541）、および配列番号：４のヌクレオチド2437〜2481（アミノ酸586〜600）からなる群より選択される、請求項35記載のDNA配列。 37．(c)項の融合DNA配列が、配列番号：１（ヌクレオチド771〜2912）のフコース異性化HSP72(C-169)DNA配列である、請求項35記載のDNA配列。 38．プロモーターに機能的に結合した請求項35記載のDNA配列を少なくとも一つ含む発現ベクター。 39．請求項25 〜34のいずれか一項に記載のDNA配列と、DNA配列に機能的に結合した一つまたは複数の発現制御配列とを含む、組換えDNA分子。 40．発現制御配列が誘導可能な発現ベクターである、請求項39記載の組換えDNA 分子。 41．発現ベクターがλ PLプロモーターを含む、請求項40記載の組換え分子。 42．pURV3、pURV4、pURV5、pURV6、pJBD291、pJBDΔ4、pJBDk51、pJBD171、pJBD 177、pJBD179、pJBDΔ1、pJBDf51、およびpJBDf62からなる群より選択されるプラズミドを含む、請求項39記載の組換え分子。 43．請求項38記載の発現ベクターで形質転換された単細胞宿主。 44．請求項39記載の組換えDNA分子で形質転換された単細胞宿主。 45．大脳菌菌株 XLI Blue MRF'、W3110、JM109、Y1090、およびBL21（DE3）からなる群より選択される、請求項44記載の単細胞宿主。 46．請求項43 〜45のいずれか一項に記載の単細胞宿主を培養する段階と上記ポリペプチドまたは断片を分離する段階とを含む、ポリペプチドまたはその断片の作製方法。 47．請求項46記載の方法により得られる実質的に純粋な形態のポリペプチド。 48．請求項1 〜20のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。 49．モノクローナル抗体 F1-Pn3.1により認識されるエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片。 50．モノクローナル抗体である、請求項48記載の抗体または断片。 51．ネズミ由来である、請求項50記載のモノクローナル抗体または断片。 52．IgGタイプである、請求項51記載のモノクローナル抗体または断片。 53．モノクローナル抗体 F1-Pn3.1。 54．以下の段階を含む、請求項48記載の抗体を単離する方法： (a) 請求項1 〜20のいずれか一項に記載のポリペプチドの調製物を哺乳動物へ導入する段階；および (b) 該抗体を含む哺乳動物から血清を単離する段階。 55．以下の段階を含む、請求項50記載のモノクローナル抗体を単離する方法： (a) 請求項1 〜20のいずれか一項に記載のポリペプチドの調製物を哺乳動物の抗体産生細胞へ導入する段階； (b) ハイブリドーマ細胞を作製するために該抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させる段階、および (c) ハイブリドーマ細胞から該モノクローナル抗体を単離する段階。 56．請求項1 〜20のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。 57．ワクチンである請求項56記載の薬学的組成物。 58．薬学的に許容される一つまたは複数の賦形剤をさらに含む、請求項56記載の薬学的組成物。 59．請求項48記載の一つまたは複数の抗体またはその断片を含む、薬学的組成物。 60．ワクチンである、請求項59記載の薬学的組成物。 61．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項60記載の薬学的組成物。 62．抗体がF1-Pn3.1である、請求項60 または61記載の薬学的組成物。 63．薬学的有効量の請求項57 、60、または61記載のワクチンを投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌による患者の感染を予防する方法。 64．薬学的有効量の請求項57、60、または61記載のワクチンを投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクティエによる患者の感染を予防する方法。 65．薬学的有効量の請求項60 または61記載のワクチンを投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌に感染した患者または感染した可能性のある患者に対する治療方法。 66．以下の段階を含む、生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌を検出する方法： (a) 混合物を形成するよう、請求項48記載の抗体または断片を生物学的試料と共にインキュベーションする段階；および (b) ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌の存在を示す、混合物中の特異的に結合した抗体または断片を検出する段階。 67．抗体がF1-Pn3.1である、請求項66記載の方法。 68．以下の段階を含む、生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌に特異的な抗体を検出する方法： (a) 混合物を形成するよう、請求項2 または22記載のポリペプチドを生物学的試料と共にインキュベーションする段階；および (b) ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌に特異的な抗体の存在を示す、混合物中の特異的に結合したポリペプチドを検出する段階。 69．以下の段階を含む、生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌を検出する方法： (a) 混合物を形成するよう、請求項35記載のDNA配列を有するDNAプローブを生物学的試料と共にインキュベーションする段階；および (b) ストレプトコッカス・ニューモニアエおよび関連する細菌の存在を示す、混合物中の特異的に結合したDNAプローブを検出する段階。 70．DNAプローブが、請求項35記載のDNA配列のうち隣接する少なくとも約6個のヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマーである、請求項69記載の方法。 71．(a) ポリメラーゼ連鎖反応法のプライマーであり、かつ標的領域の側面に位置する一連のオリゴマーの提供；および (b) ポリメラーゼ連鎖反応法による標的領域の増幅をさらに含む、請求項70記載の方法。 72．(a) 混合物を形成するよう、請求項48記載の抗体または断片を生物学的試料と共にインキュベーションする段階；および (b) ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエの存在を示す、混合物中の特異的に結合した抗体または断片を検出する段階、を含む生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエを検出する方法。 73．(a) 混合物を形成するよう、請求項1または21記載のポリペプチドを生物学的試料と共にインキュベーションする段階；および (b) ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエに特異的な抗体の存在を示す、混合物中の特異的に結合したポリペプチドを検出する段階、を含む生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエに特異的な抗体を検出する方法。 74．(a) 混合物を形成するよう、請求項25 または34記載のDNA配列を有するDNA プローブを、生物学的試料と共にインキュベーションする段階；および (b) ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエの存在を示す、混合物中の特異的に結合したDNAプローブを検出する段階、を含む生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエを検出する方法。 75．DNAプローブが、請求項25 または34記載のDNA配列の隣接する少なくとも約6 個のヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマーである、請求項74記載の方法。 76．(a) ポリメラーゼ連鎖反応法のプライマーであり、かつ標的領域の側面に位置する一連のオリゴマーの提供；および (b) ポリメラーゼ連鎖反応法による標的領域の増幅をさらに含む、請求項75記載の方法。 77．予防、診断、免疫治療、または治療を目的とする、請求項1または21記載のポリペプチドの使用。 78．連鎖球菌のヒトへの感染の子防を目的とする、薬学的有効量の請求項1または21記載のポリペプチドの使用。 79．連鎖球菌のヒトへの感染を予防するための医薬品の製造を目的とする、請求項1または21記載のポリペプチドの使用。 80．連鎖球菌のヒトへの感染を予防するためのワクチンの製造を目的とする、請求項1または21記載のポリペプチドの使用。 81．連鎖球菌のヒトへの感染を検出および診断するためのキットの製造を目的とする、請求項1または21記載のポリペプチドの使用。 82．連鎖球菌のヒトへの感染を予防するためのワクチンの製造を目的とする、請求項46記載の方法の使用。 83．連鎖球菌のヒトへの感染を検出および診断するためのキットの製造を目的とする、請求項46記載の方法の使用。 84．予防、診断、免疫治療、または治療を目的とする、請求項48記載の抗体の使用。 85．連鎖球菌のヒトへの感染の予防を目的とする、薬学的有効量の請求項48または53 記載の抗体の使用。 86．連鎖球菌のヒトへの感染を予防するための医薬品の製造を目的とする、請求項48または53記載の抗体の使用。 87．連鎖球菌のヒトへの感染を予防するためのワクチンの製造を目的とする、請求項48または53記載の抗体の使用。 88．連鎖球菌のヒトへの感染を検出および診断するためのキットの製造を目的とする、請求項48または53記載の抗体の使用。 89．連鎖球菌のヒトへの感染を予防するためのワクチンの製造を目的とする、請求項54または55記載の方法の使用。 90．連鎖球菌のヒトへの感染を検出および診断するためのキットの製造を目的とする、請求項54または55記載の方法の使用。 91．連鎖球菌のヒトへの感染の治療を目的とする、薬学的有効量の請求項48または53記載の抗体の使用。 92．連鎖球菌のヒトへの感染を治療するための医薬品の製造を目的とする、請求項48または53記載の抗体の使用。 93．予防、診断、免疫治療、または治療を目的とする、請求項25〜34のいずれか一項に記載のDNA配列の使用。 94．連鎖球菌のヒトへの感染を検出および診断するためのキットの製造を目的とする、請求項25〜34のいずれか一項に記載のDNA配列の使用。 95．連鎖球菌の感染が、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクティエにより引き起こされる、請求項77〜94のいずれか一項に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 21/08 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/569 33/569 Ｅ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者マーティンデニスカナダ国ケベック州セイント−オーガスティン−デゥ−デマウレギャボリーストリート 4728−ジー (72)発明者リオックスクレメントカナダ国ケベック州ビルデゥカプ −ルージュジーンチャールズキャンティン 1012

Claims

【特許請求の範囲】１．(a) 配列番号5のアミノ酸配列を有するHSP72 ポリペプチド； (b) 配列番号20のアミノ酸配列を有するHSP70(Dnak)ポリペプチド； (c) 配列番号22のアミノ酸配列を有するHSP70(Dnak)ポリペプチド； (d) ストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞の哺乳動物宿主への感染により生じる抗体と免疫学的反応を示すポリペプチドであって、その抗体が(a)、( b)、または(c)項のポリペプチドと免疫学的反応を示すもの； (e) (a)、(b)、または(c)項のポリペプチドと免疫学的反応を示す抗体を産生し得るポリペプチド； (f) (a)、(b)、または(c)項のポリペプチドの免疫により生じる抗体と免疫学的反応を示すポリペプチド；および (g) 単独であるかまたは融合蛋白を形成するために他のポリペプチドと結合している、上記ポリペプチドのいずれかの断片；からなる群より選択されるポリペプチド。２．請求項第１項に記載のポリペプチドにおいて、(d)項のポリペプチドがストレプトコッカスおよびエンテロコッカス属のポリペプチドからなる群より選択される(d)項のポリペプチド。３．請求項第１項に記載のポリペプチドにおいて、(d)項のポリペプチドがストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ミュタンス、ストレプトコッカス・サングイス、およびエンテロコッカス・ファエカリス種のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。４．請求項第１項に記載のポリペプチドにおいて、(d)項のポリペプチドがストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、およびストレプトコッカス・ピオゲネス種のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。５．請求項第１項に記載のポリペプチドにおいて(g)項の断片が、配列番号5(C-1 69)のアミノ酸439-607、配列番号5(C-151)のアミノ酸457-607、配列番号5 のアミノ酸527-541、および配列番号5 のアミノ酸586-600からなる群より選択されるポリペプチド。６．配列番号5のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。７．配列番号20のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。８．配列番号22のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。９．配列番号26のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 10．配列番号7のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 11．配列番号8のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 12．配列番号9のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 13．配列番号10のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 14．配列番号11のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 15．配列番号12のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 16．配列番号13のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 17．配列番号14のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 18．配列番号15のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 19．配列番号16のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 20．配列番号17のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 21．配列番号18のアミノ酸配列、その類似物、同族体および誘導体を有するポリペプチド。 22．請求項第１から21および100-101項のいずれか一つに記載のポリペプチドにおいて、該ポリペプチドはストレプトコッカス菌株に特異的な免疫反応を示すことを特徴とするポリペプチド。 23．(a) 配列番号5のアミノ酸配列を有するHSP72ポリペプチド； (b) ストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞の哺乳動物宿主への感染により生じる抗体と免疫学的反応を示すポリペプチドであって、その抗体が(a)項のHSP72ポリペプチドと免疫学的反応を示すもの； (c) (a)項のHSP72ポリペプチドと免疫学的反応を示す抗体を産生し得るポリペプチド； (d) (a)項のHSP72ポリペプチドとの免疫により生じる抗体と免疫学的反応を示すポリペプチド；および (e) 単独であるかまたは融合蛋白を形成するために他のポリペプチドと結合している、上記ポリペプチドのいずれかの断片；からなる群より選択されるポリペプチド。 24．請求項第23項に記載のポリペプチドにおいて、(b)項のポリペプチドがストレプトコッカスおよびエンテロコッカス属のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。 25．請求項第23項に記載のポリペプチドにおいて、(b)項のポリペプチドはストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ミュタンス、ストレプトコッカス・サングイス、およびエンテロコッカス・ファエカリス種のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド。 26．請求項第23項に記載のポリペプチドにおいて、(e)項の断片が配列番号5(C-1 69)のアミノ酸439-607、配列番号5 のアミノ酸527-541、配列番号5 のアミノ酸5 27-541、および配列番号5 のアミノ酸586-600からなる群より選択されるポリペプチド。 27．請求項第23項に記載のポリペプチドにおいて、(e)項の融合蛋白が配列番号3 のアミノ酸配列を有するフコース異性化HSP72(C-169)蛋白であることを特徴とするポリペプチド。 28．(a) 配列番号4のHSP72 DNA配列； (b) 配列番号19のHSP70（Dnak） DNA配列； (c) 配列番号21のHSP70（Dnak） DNA配列； (d) ストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞の哺乳動物宿主への感染により生じる抗体と免疫学的反応を示すポリペプチドをコードするDNA配列であって、その抗体がHSP72ポリペプチド（配列番号5）と免疫学的反応を示すもの； (e) HSP72ポリペプチド（配列番号5）と免疫学的反応を示す抗体を産生し得るポリペプチドをコードするDNA配列； (f) HSP72ポリペプチド（配列番号5）の免疫により生じる抗体と免疫学的反応を示すポリペプチドをコードするDNA配列； (g) 上記DNA配列のいずれかに対する縮退DNA配列；および (h) 単独であるかまたは融合DNA配列を形成するために他のDNA配列と結合している、上記DNA配列のいずれかの断片；からなる群より選択されるDNA配列。 29．請求項第28項に記載のDNA配列において、(d)項のDNA配列がストレプトコッカスおよびエンテロコッカス属のDNA配列からなる群より選択されるDNA配列。 30．請求項第28項に記載のDNA配列において、(d)項のDNA配列がストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ミュタンス、ストレプトコッカス・サングイス、およびエンテロコッカス・ファエカリス種のDNA配列からなる群より選択されるDNA配列。 31．請求項第28項に記載のDNA配列において、(d)項のDNA配列はストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、およびストレプトコッカス・ピオゲネス種のDNA配列からなる群より選択されるDNA配列。 32．HSP72をコードするヌクレオチド682からヌクレオチド2502の配列番号4の配列、またはその誘導体のDNA配列。 33．HSP72の断片C-169をコードするヌクレオチド1996からヌクレオチド2502の配列番号4の配列、またはその誘導体のDNA配列。 34．HSP72の断片C-151をコードするヌクレオチド2050からヌクレオチド2502の配列番号4の配列、またはその誘導体のDNA配列。 35．ヌクレオチド2260からヌクレオチド2304の配列番号4の配列、またはその誘導体のDNA配列。 36．ヌクレオチド2437からヌクレオチド2481の配列番号4の配列、またはその誘導体のDNA配列。 37．ストレプトコッカス・アガラクチアエのHSP70をコードするヌクレオチド204 からヌクレオチド2027の配列番号19の配列、またはその誘導体のDNA配列。 38．ストレプトコッカス・ピオゲネスのHSP70をコードするヌクレオチド248からヌクレオチド2074の配列番号21の配列、またはその誘導体のDNA配列。 39．HSP72のＣ末端残基断片(C-151)をコードするヌクレオチド4からヌクレオチド456の配列番号25の配列、またはその誘導体のDNA配列。 40．請求項第１-21項および100-101項のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードするDNA配列。 41．以下の(a)−(f)からなる群より選択されるDNA配列： (a) 配列番号4のHSP72DNA配列； (b) ストレプトコッカス・ニューモニアエ細胞の哺乳動物宿主への感染により生じる抗体と免疫学的反応を示すポリペプチドをコードするDNA配列であって、その抗体がHSP72ポリペプチド（配列番号5）と免疫学的反応を示すもの； (c) HSP72ポリペプチド（配列番号5）と免疫学的反応を示す抗体を産生し得るポリペプチドをコードするDNA配列； (d) HSP72ポリペプチド（配列番号5）の免疫により生じる抗体と免疫学的反応を示すポリペプチドをコードするDNA配列； (e) 上記DNA配列のいずれかに対する縮退DNA配列；および (f) 単独であるかまたは融合DNA配列を形成するために他のDNA配列と結合している、上記DNA配列のいずれかの断片。 42．請求項41のDNA配列において、(b)項のDNA配列がストレプトコッカスおよびエンテロコッカス属のDNA配列からなる群より選択されるDNA配列。 43．請求項41のDNA配列において、(b)項のDNA配列が、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ミュタンス、ストレプトコッカス・サングイス、およびエンテロコッカス・ファエカリス種のDNA配列からなる群より選択されるDNA配列。 44．請求項41のDNA配列において、(f)項の断片が配列番号4(C-169)のヌクレオチド1996-2502（アミノ酸439-607）；配列番号4 のヌクレオチド2260-2304（アミノ酸527-541）；および配列番号4 のヌクレオチド2437-2481（アミノ酸586-600 ）からなる群より選択されるDNA配列。 45．請求項41のDNA配列において、(f)項の融合DNA配列が、配列番号1のフコース異性化HSP72(C-169)DNA配列であることを特徴とするDNA配列。 46．プロモーターに機能的に連結した請求項41に従うDNA配列を少なくとも一つ含む発現ベクター。 47．請求項28に記載から40のいずれか一つに記載のDNA配列と、DNA配列に機能的に連結した一つまたはそれ以上の発現制御配列とを含む組換えDNA分子。 48．請求項47の組換えDNA分子において、上記発現制御配列が誘導可能の発現ベクターであることを特徴とする組換えDNA分子。 49．請求項48の組換え分子において、上記発現ベクターがλ PLプロモーターを含むことを特徴とする組換え分子。 50．pURV3、pURV4、pURV5、pURV6、pJBD291、pJBDΔ4、pJBDk51、pJBD177、pJBD 171、pJBD177、pJBD179、pJBDΔ1、pJBDf51、およびpJBDf62からなる群より選択されるプラズミドを含む、請求項47に記載の組換え分子。 51．請求項46の発現ベクターで形質転換された単細胞宿主。 52．請求項47の組換えDNA分子で形質転換された単細胞宿主。 53．請求項52に記載の単細胞宿主において、該宿主が E.coli 種 XLI Blue MRF 、W3110、JM109、およびBL21（DE3）からなる群より選択される単細胞宿主。 54．請求項51の単細胞宿主を培養する段階と上記ポリペプチドまたは断片を分離する段階とを含むポリペプチドまたは断片の製造方法。 55．請求項23に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。 56．モノクローナル抗体 F1-Pn3.1により認識されるエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片。 57．モノクローナル抗体である請求項55の抗体または断片。 58．ネズミ由来の請求項57のモノクローナル抗体または断片。 59．IgGタイプである請求項58のモノクローナル抗体または断片。 60．F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、およびF2-Pn3.4からなる群より選択される請求項59のモノクローナル抗体。 61．モノクローナル抗体 F1-Pn3.1。 62．(a) 請求項23に記載のポリペプチドの調製物の哺乳動物への導入；および (b) 上記の抗体を含む哺乳動物から血清の単離を含む請求項55の抗体を単離する方法。 63．(a) 請求項23に記載のポリペプチドの調製物の哺乳動物における抗体産生細胞への導入； (b) 抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合することによるハイブリドーマ細胞の作製、および (c) ハイブリドーマ細胞からの上記モノクローナル抗体の単離を含む請求項57のモノクローナル抗体を単離する方法。 64．請求項23に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。 65．ワクチンである請求項64の薬学的組成物。 66．薬学的に許容される一つまたはそれ以上の賦形剤をさらに含む請求項64の薬学的組成物。 67．薬学的有効量の請求項65のワクチンを投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌による患者の感染を予防する方法。 68．請求項55の一つまたはそれ以上の抗体またはその断片を含む薬学的組成物。 69．ワクチンである請求項68の薬学的組成物。 70．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む請求項69の薬学的組成物。 71．請求項69の薬学的組成物において、抗体がF1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、およびF2-Pn3.4からなる群より選択される薬学的組成物。 72．請求項69の薬学的組成物において、抗体がF1-Pn3.1であることを特徴とする薬学的組成物。 73．薬学的有効量の請求項69のワクチンを投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌に感染したまたは感染していると推定される患者に対する治療方法。 74．(a) 患者からの生物学的試料の単離； (b) 請求項55の抗体または断片の生物学的試料とのインキュベーションによる混合物の形成；および (c) ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌の存在を示す混和物中の特異的に結合した抗体または断片の検出を含む生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌を検出する方法。 75．請求項74の方法において、抗体が F1-Pn3.1、F2-Pn3.2、F2-Pn3.3、およびF 2-Pn3.4からなる群より選択される方法。 76．請求項74において、抗体がF1-Pn3.1であることを特徴とする方法。 77．(a) 患者からの生物学的試料の単離； (b) 請求項23に記載のポリペプチドの生物学的試料とのインキュベーションによる混合物の形成；および (c) ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌に特異的な抗体の存在を示す、混合物中の特異的に結合したポリペプチドの検出を含む、生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌に特異的な抗体を検出する方法。 78．(a) 患者からの生物学的試料の単離； (b) 請求項41のDNA配列を有するDNAプローブの生物学的試料とのインキュベーションによる混合物の形成；および (c) ストレプトコッカス・ニューモニアエおよび関連する細菌の存在を示す、混合物中の特異的に結合したDNAプローブの検出を含む、生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌を検出する方法。 79．請求項78の方法において、DNAプローブが請求項41のDNA配列のうち隣接する少なくとも約６個のヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマーである方法。 80．(a) ポリメラーゼ連鎖反応法のプライマーであり、かつ標的領域の側面に位置する一連のオリゴマーの提供；および (b) ポリメラーゼ連鎖反応法による標的領域の増幅をさらに含む請求項79の方法。 81．ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌のヒトへの感染の予防を目的とした薬学的有効量の請求項23に記載のポリペプチドの使用。 82．ストレプトコッカス・ニューモニアエまたは関連する細菌のヒトへの感染の予防を目的とした薬学的有効量のHSP72に特異的な抗体の使用。 83．請求項52または53の単細胞宿主を培養し、上記のポリペプチドまたは断片を単離する工程を含む、ポリペプチドまたはその断片の製造方法。 84．請求項83の方法により得られるような実質的に純粋な形のポリペプチド。 85．請求項１または22のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。 86．(a) 請求項１または22に記載のポリペプチドの調製物の哺乳動物への導入；および (b) 上記の抗体を含む哺乳動物からの血清の分離を含む請求項86の抗体を分離する方法。 87．請求項１または22のポリペプチドを含む薬学的組成物。 88．ワクチンである請求項87の薬学的組成物。 89．一つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む請求項87の薬学的組成物。 90．薬学的有効量の請求項88のワクチンを投与することを含む、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエによる患者への感染を防ぐ方法。 91．請求項１または22のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。 92．(a) 患者からの生物学的試料の分離； (b) 請求項91の抗体または断片の生物学的試料とのインキュベーションによる混合物の形成；および (c) ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエの存在を示す、混合物中の特異的に結合した抗体または断片の検出、を含む生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエを検出する方法。 93．(a) 患者からの生物学的試料の分離； (b) 請求項１または22のポリペプチドの生物学的試料とのインキュベーションによる混合物の形成；および (c) ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエに特異的な抗体の存在を示す、混合物中の特異的に結合したポリペプチドの検出、を含む生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエに特異的な抗体を検出する方法。 94．(a) 患者からの生物学的試料の分離； (b) 請求項28に記載のDNA配列の生物学的試料とのインキュベーションによる混合物の形成；および (c) ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエの存在を示す、混合物中の特異的に結合したDNAプローブの検出、を含む生物学的試料中のストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエを検出する方法。 95．請求項94の方法において、DNAプローブが請求項28のDNA配列の隣接する少なくとも約６個のヌクレオチドに相補的な配列を示すオリゴマーである方法。 96．(a) ポリメラーゼ連鎖反応法のプライマーでありかつ標的領域の側面に位置する一連のオリゴマーの供給；および (b) ポリメラーゼ連鎖反応法による標的領域の増幅をさらに含む請求項95の方法。 97．ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエのヒトへの感染の予防を目的とした薬学的有効量の請求項１または22のポリペプチドの使用。 98．ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、またはストレプトコッカス・アガラクチアエのヒトへの感染の予防を目的とした薬学的有効量のHSP72に特異的な抗体の使用。 99．連鎖球菌のヒトへの感染の予防を目的とした薬学的有効量の請求項2から21 のいずれか一つのポリペプチドの使用。 100．配列番号23のアミノ酸配列、その類似物、同族体または誘導体を有するポリペプチド。 101．配列番号24のアミノ酸配列、その類似物、同族体または誘導体を有するポリペプチド。