CN110520154B - 多价肺炎链球菌疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)疫苗组合物，更具体来说提供了一种疫苗组合物，其包含：(i)荚膜多糖‑蛋白偶联物；(ii)2‑苯氧基乙醇(2‑PE)；和(iii)甲醛(HCHO)，并提供了制备所述疫苗组合物的方法。

Description

多价肺炎链球菌疫苗组合物

技术领域

本发明涉及针对肺炎球菌(肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))的疫苗组合物，更具体来说，涉及一种疫苗组合物，其包含(i)荚膜多糖-蛋白偶联物，(ii)2-苯氧基乙醇(2-PE)和(iii)甲醛(HCHO)，以及制备所述疫苗组合物的方法。

背景技术

肺炎球菌(肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia))是一种革兰氏阳性且溶血的链球菌菌株，并且在全世界是婴儿、儿童和老年人中脑膜炎、肺炎和严重的侵袭性感染的主要原因。每年有超过160万人死于肺炎球菌疾病(2008，世界卫生组织(InternationalHealth Organization)数据)，尤其是，在免疫力低的5岁以下的儿童和65岁以上的老年人中，由肺炎球菌引起的侵袭性感染疾病的发病率高。

肺炎球菌根据包围其外部(细胞膜)的作为主要毒力因子的荚膜多糖的结构和免疫学特征，被分类为大约超过90种血清型，并且它们中的约20种已知与人类中80～90％的致病性相关。肺炎球菌的唯一宿主是人类，并且它们通常聚居于健康的正常鼻咽(20～40％的婴儿，5～10％的成年人)。在2005年，疾病预防和控制中心(Centers for DiseaseControl and Prevention)(CDC)报告，仅在发展中国家每年就有大约210万5岁以下的儿童死于肺炎，他们中的120万人死于肺炎球菌感染，并且在美国，每年由肺炎球菌造成的脑膜炎和败血症分别发生约3,000和50,000例(Peters TR,Poehling KA等，侵袭性肺炎球菌疾病(Invasive pneumococcal disease)，JAMA 2007；297:1825-6)。此外，根据作为肺炎球菌疾病的数据库的pneumoACTION数据库，在2000年，在韩国在儿童中肺炎球菌感染的发病数为每年24,047例，并且他们中的47例死亡(www.pneumoadip.org)。此外，根据由疾病预防和控制中心(Centers for Disease Control and Prevention)发布的最新的“韩国儿童和青少年中肺炎球菌的血清型分析的研究”(study on the serotype analysis ofpneumococcus in children and adolescents in the country)，肺炎球菌是3个月～59个月之间的婴儿中最常见的(43.7％)侵袭性感染原因。对于引起全世界侵袭性感染疾病的肺炎球菌来说，除了青霉素之外，对三种以上药物表现出耐药性的多药耐药性细菌增加，并因此使肺炎球菌感染性疾病的治疗更加困难。

因此，对在具有肺炎球菌感染性疾病的高风险的儿童和老年人中进行针对肺炎球菌的疫苗接种，始终存在着需求。

为了预防肺炎球菌感染性疾病，从1977年起已开发并批准了多价肺炎球菌多糖疫苗，并且这些荚膜多糖疫苗已被证实对于在老年人和高风险患者中预防肺炎球菌疾病来说是有用的。然而，由于婴儿和儿童中免疫系统的成熟性低于成年人，在仅仅给药多糖疫苗的情况下，期待起到疫苗的作用是困难的，因为免疫系统不能将多糖抗原识别为外部侵袭性因子。为了解决多糖疫苗在婴儿和儿童等中降低免疫原性的这种问题，已开发并使用了7价肺炎球菌偶联物疫苗(7vPnC，)，这是一种将提高免疫原性的载体蛋白偶联到多糖抗原的荚膜多糖-蛋白偶联物疫苗，并且在许多参考文献中已报道它对于在婴儿和儿童中预防中耳中的侵袭性疾病和炎症来说是有效的。然而，所述7价疫苗的使用引起由用于所述疫苗的疫苗血清型引起的侵袭性疾病的减少，但此外还表现出由部分非疫苗血清型引起的肺炎球菌疾病相对增加的现象。因此，目前已开发并可商购10价荚膜多糖-蛋白偶联物疫苗/>和其中向/>的基础血清型添加了6种血清型的13价肺炎球菌偶联物疫苗/>但对于被包含的某些血清型来说，已报道了它们作为疫苗的药效不足的可能性[Andrews NJ等，(2014)Lancet Infec Dis(14)839；Prevenar 13的EMEA评估报告(EMEA Assessment Report for Prevenar 13)，(2009)EMA/798877/2009]，因此，对显示出更高和更稳定的阈值的新的疫苗制剂的开发，始终存在着需求。

同时，疫苗注射剂型应该使用防腐剂来防止微生物的污染。对于由UN等出口到欠发达国家的混合疫苗产品来说，由于国家的环境、配送方法、成本等，其中包含防腐剂的多剂产品是优选的。存在硫柳汞、2-苯氧基乙醇(2-PE)、苯酚等作为用于疫苗产品的防腐剂，并存在本领域中常用的防腐剂的量。例如，硫柳汞以10μg/mL的浓度使用，2-PE以5mg/mL的浓度使用，并且包含它们的多剂疫苗产品如果通过了EP-B(欧洲药典B类)或USP(美国药典)标准的杀细菌能力测试，则可以被商业化。

硫柳汞(merthiolate)是一种乙基汞衍生化合物，自从1930年代早期以来已被用作多剂疫苗注射剂的防腐剂。硫柳汞已被用于在疫苗产品的储存和使用期间防止污染微生物的生长和维持无菌条件的目的，并且许多获得WHO PQ(预审合格)的5价液体混合疫苗(包括D、T、P、Hib、HBsAg)含有这种硫柳汞作为防腐剂。

2-苯氧基乙醇(2-PE)被用作化妆品和经皮药物的防腐剂，并且也用作疫苗注射剂的防腐剂。

然而，由于用于实现疫苗的杀细菌活性的这些防腐剂组分的量可能足以引起毒性和/或副作用，因此对降低它们的使用量并提供足够的杀细菌活性的技术的开发，存在着需求。

发明内容

[技术问题]

一个实例提供了一种肺炎球菌疫苗组合物，其包含(i)肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖-蛋白偶联物，(ii)2-苯氧基乙醇(2-PE)，和(iii)甲醛(HCHO)。所述疫苗组合物可以是用于多次给药的多剂量疫苗组合物。

另一个实例提供了一种用于预防或治疗肺炎球菌感染疾病的药物组合物，其包含所述肺炎球菌疫苗组合物。所述用于预防或治疗的药物组合物可以是用于多次给药的多剂量药物组合物。

其他实例提供了一种用于制备具有提高的稳定性和/或防腐能力(或杀细菌活性)的肺炎球菌疫苗组合物的方法，所述方法包括制备肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的荚膜多糖-蛋白偶联物的步骤，和将所述荚膜多糖-蛋白偶联物与2-苯氧基乙醇(2-PE)和甲醛(HCHO)混合的步骤；以及一种用于提高肺炎球菌疫苗的稳定性和/或防腐能力(或杀细菌活性)的方法。所述疫苗组合物可以是用于多次给药的多剂量疫苗组合物。所述制备荚膜多糖-蛋白偶联物的步骤可以包括执行氰基化方法以将所述荚膜多糖和蛋白通过-O-C(NH)-NH-连接的步骤。

[技术方案]

一个实施方式提供了一种肺炎球菌疫苗组合物或肺炎球菌免疫原性组合物，其包含下述组分或基本上由下述组分构成：

(i)荚膜多糖-蛋白偶联物，其中所述荚膜多糖源自于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，

(ii)2-苯氧基乙醇(2-PE)，和

(iii)甲醛(HCHO)。

在本文中，肺炎球菌免疫原性组合物意味着诱导针对肺炎球菌的免疫应答的组合物，并且除非另有指明，否则以与肺炎球菌疫苗组合物相同的含义使用。

本文提供的肺炎球菌疫苗组合物可以是具有提高的稳定性和/或防腐能力(杀细菌能力)的免疫原性组合物，其中通过包含肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖和作为防腐剂的2-苯氧基乙醇和甲醛，诱导针对肺炎球菌的免疫应答的效能(免疫原性)得以长时间维持。

所述荚膜多糖可以是源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖。具体来说，所述荚膜多糖可以是源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型的2种以上例如5种以上、7种以上、9种以上、11种以上、13种以上或14种以上血清型的荚膜多糖。在一个实施方式中，所述荚膜多糖可以包含源自于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型的13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种血清型的荚膜多糖。例如，所述荚膜多糖可以包含源自于选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种血清型的荚膜多糖。在一个实施方式中，所述荚膜多糖可以包含源自于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的13种荚膜多糖，源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的14种荚膜多糖，源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和12F的15种荚膜多糖，或源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和15B的15种荚膜多糖，或源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的17种荚膜多糖，但不限于此。

所述荚膜多糖-蛋白偶联物可以是上面提到的源自于2种以上血清型的荚膜多糖通过常用方法例如通过共价键分别单独地与蛋白偶联的荚膜多糖-蛋白偶联物。在一个实施方式中，所述偶联物可以具有其中使用氰基化方法将每个荚膜多糖(具体来说，多糖的羟基)与蛋白(具体来说，蛋白的氨基)通过-O-C(NH)-NH-连接的结构([多糖]-O-C(NH)-NH-[蛋白])。当所述荚膜多糖和蛋白使用氰基化方法来偶联时，它可以有利地在偶联后维持免疫原性，因为与其他方法(例如还原胺化方法等)相比不太可能发生荚膜多糖的结构修饰。例如，已报道尽管当通过还原胺化方法将某些血清型(19F等)与蛋白偶联时，根据反应组合六糖环结构被切开并因此可能形成开放结构，从而降低免疫原性，但当通过氰基化方法将它与蛋白偶联时，不可能出现这种问题。

所述蛋白可以是载体蛋白，例如可以是表现出无毒性和无反应性并且可以以足够的量和纯度收集的蛋白。源自于各种不同血清型的荚膜多糖可以分别与相同或不同的蛋白例如相同蛋白偶联。

在一个实施方式中，所述蛋白可以是CRM197蛋白。CRM197蛋白是从白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(CRM197，例如生长在酪蛋白氨基酸和酵母提取物基础培养基中)的培养基分离的白喉毒素的一种无毒性变体，即一种类毒素。CRM197蛋白可以通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换层析从白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7培养基纯化，或者通过常用方法重组获得，例如参考美国专利号5,614,382(包含在本文中作为参考)中公开的方法。在一个实施方式中，CRM197蛋白可以包含GenBank登记号1007216A的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有90％以上、95％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上或99.9％以上的同源性的氨基酸序列。

此外，源自于白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7之外的白喉杆菌的类毒素，可用作载体蛋白。

除此之外，可用的载体蛋白可以是选自下述的至少一者：

失活的细菌毒素，例如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如在国际专利申请公布号WO2004/083251中所公开的)、源自于大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(E.coli)LT、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)ST和铜绿假单胞菌(Psendomonasaeruginosa)的外毒素A；

细菌外膜蛋白，例如外膜复合物c(OMPC)、膜孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、源自于A组或B组链球菌的C5a肽酶、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)蛋白D；

卵清蛋白、钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)；

白喉毒素的变体(类毒素)例如CRM197、CRM173、CRM228、CRM45等。

所述荚膜多糖-蛋白偶联物可以是多价多糖-蛋白偶联物，包括其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型的2种以上例如5种以上、7种以上、9种以上、11种以上、13种以上或14种以上血清型的荚膜多糖中的每一者与上面提到的载体蛋白例如CRM197蛋白偶联的偶联物。在一个实施方式中，所述荚膜多糖-蛋白偶联物可以是13价至24价、13价至19价、13价至17价、13价至15价、14价至24价、14价至19价、14价至17价或14价至15价多糖-蛋白偶联物，其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型的13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种血清型的荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197蛋白偶联。例如，所述荚膜多糖-蛋白偶联物可以是13价至24价、13价至19价、13价至17价、13价至15价、14价至24价、14价至19价、14价至17价或14价至15价多糖-蛋白偶联物，其中源自于选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种血清型的荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197偶联。在一个实施方式中，所述荚膜多糖-蛋白偶联物可以是：13价多糖-蛋白偶联物，其包含源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的13种荚膜多糖中的每一者和载体蛋白例如CRM197；14价多糖-蛋白偶联物，其包含源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的14种荚膜多糖中的每一者和载体蛋白例如CRM197；15价多糖-蛋白偶联物，其包含源自于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和12F的15种荚膜多糖中的每一者和载体蛋白例如CRM197；15价多糖-蛋白偶联物，其包含源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和15B的15种荚膜多糖中的每一者和载体蛋白例如CRM197；或17价多糖-蛋白偶联物，其包含源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的17种荚膜多糖中的每一者和载体蛋白例如CRM197，但不限于此。

本文中提供的肺炎球菌疫苗组合物是包含所述荚膜多糖-蛋白偶联物的肺炎球菌偶联物疫苗(PCV)。所述肺炎球菌疫苗组合物可以是多价肺炎球菌疫苗组合物，所述组合物包含其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型的2种以上例如5种以上、7种以上、9种以上、11种以上、13种以上或14种以上血清型的荚膜多糖中的每一者与上面提到的载体蛋白例如CRM197蛋白偶联的多糖-蛋白偶联物。在一个实施方式中，所述肺炎球菌疫苗组合物可以是13价至24价、13价至19价、13价至17价、13价至15价、14价至24价、14价至19价、14价至17价或14价至15价肺炎球菌疫苗组合物，所述组合物包含13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种多糖-蛋白偶联物，其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型的13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种血清型的荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197偶联。例如所述肺炎球菌疫苗组合物可以是13价至24价、13价至19价、13价至17价、13价至15价、14价至24价、14价至19价、14价至17价或14价至15价肺炎球菌疫苗组合物，所述组合物包含其中源自于选自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种血清型的荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197蛋白偶联的多糖-蛋白偶联物。

在一个实施方式中，所述肺炎球菌疫苗组合物可以是：

(1)13价肺炎球菌疫苗组合物，其包含13种多糖-蛋白偶联物，其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的13种荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197蛋白偶联；

(2)14价肺炎球菌疫苗组合物，其包含14种多糖-蛋白偶联物，其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的14种荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197蛋白偶联；

(3)15价肺炎球菌疫苗组合物，其包含15种多糖-蛋白偶联物，其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和12F的15种荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197蛋白偶联；

(4)15价肺炎球菌疫苗组合物，其包含15种多糖-蛋白偶联物，其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和15B的15种荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197蛋白偶联；或

(5)17价肺炎球菌疫苗组合物，其包含17种多糖-蛋白偶联物，其中源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的17种荚膜多糖中的每一者与所述载体蛋白例如CRM197蛋白偶联。

与常规开发的多价疫苗(例如13价疫苗)相比，本文中提供的多价肺炎球菌疫苗组合物例如上述组成的13价至24价、13价至19价、13价至17价、13价至15价、14价至24价、14价至19价、14价至17价、或14价至15价肺炎球菌疫苗具有显著出色的阈值，并且可以预期非常出色的预防和/或治疗肺炎球菌感染性疾病的效果。

所述肺炎球菌疫苗组合物可以是被配制成用于单次给药的单剂或用于多次给药的多剂的组合物。当在本文中使用时，“多剂”可以意味着包含可以给药(接种)到1位给药(接种)个体超过一次(例如2次以上)的疫苗剂量或可以给药(接种)到2位以上给药(接种)个体一次或超过一次(例如2次以上)的疫苗剂量的制剂单元。

除了2种以上血清型的肺炎球菌荚膜多糖-蛋白偶联物之外，所述肺炎球菌疫苗组合物还可以包含防腐剂。可以在所述疫苗组合物(例如注射制剂)中使用的防腐剂可以是选自2-苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞、苯基硝酸汞等的至少一者。

在一个实施方式中，作为上面提到的多价肺炎球菌疫苗组合物例如上面提到的13价至24价、13价至19价、13价至17价、13价至15价、14价至24价、14价至19价、14价至17价或14价至15价肺炎球菌疫苗组合物的优化形式，所述防腐剂可以包含2-苯氧基乙醇和甲醛。同样地，通过包含2-苯氧基乙醇和甲醛作为防腐剂，使用的2-苯氧基乙醇的量减少，从而降低了毒性和/或副作用，并通过两种组分的协同作用实现了更加改进的防腐效果。

包含在本发明的多价肺炎球菌疫苗组合物中的2-苯氧基乙醇的含量可以低于10mg/ml、低于7mg/ml、6mg/ml以下或5mg/ml以下，例如4mg/ml以上并低于10mg/ml、4mg/ml至7mg/ml、4mg/ml以上并低于7mg/ml、4至6mg/ml、4.5mg/ml至6mg/ml、5mg/ml至6mg/ml、4至5mg/ml或4.5mg/ml至5mg/ml(当在本文中使用时，在数值范围中使用的术语“至”是指在下限值以上与上限值以下之间的范围)。所述疫苗组合物中2-苯氧基乙醇的含量优选为所述范围的下限值以上，以表现出显著的防腐效果，并且优选地小于所述范围的上限值或所述范围的上限值以下，以确保没有或可接受的毒性和/或副作用。

包含在本发明的多价肺炎球菌疫苗组合物中的甲醛的含量可以为90至200μg/mL、90至190μg/mL、90至180μg/mL、90至170μg/mL、100至200μg/mL、100至190μg/mL、100至180μg/mL或100至170μg/mL。包含在所述疫苗组合物中的甲醛的含量优选为所述范围的下限值以上，以表现出显著的防腐效果，并且优选地为所述范围的上限值以下，以确保没有或可接受的毒性和/或副作用。

所述疫苗组合物的特征在于在常用储存条件下，例如在2℃至8℃、20℃至25℃或约37℃的温度条件下稳定约3个月以上、约6个月以上、约1年以上、约1.5年以上、约2年以上或约2.5年以上。在这里，疫苗组合物的稳定性可以意味着所述疫苗组合物将原始抗原性(免疫原性)维持在等同的水平，和/或每种组分得以维持而没有降解或损失，和/或没有感染例如细菌/病毒等。

其他实施方式提供了一种用于预防或治疗肺炎球菌感染或肺炎球菌感染性疾病的药物组合物，其包含上面提到的多价肺炎球菌疫苗组合物。其他实施方式提供了一种用于预防或治疗肺炎球菌感染或肺炎球菌感染性疾病的方法，所述方法包括向需要肺炎球菌感染或肺炎球菌感染性疾病的预防或治疗的个体给药药学有效剂量的上面提到的多价肺炎球菌疫苗组合物。包含在所述药物组合物中的肺炎球菌疫苗组合物或用于所述预防或治疗方法的肺炎球菌疫苗组合物可以是用于单次给药的单剂药物组合物或用于多次给药的多剂药物组合物。

肺炎球菌感染性疾病意味着由肺炎球菌感染引起的所有疾病，并且可以是肺炎、中耳中的炎症、鼻窦炎、菌血症等。“肺炎”是一种肺实质的急性感染性疾病，它的感染源主要是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。具体来说，肺炎球菌肺炎占所有肺炎的约50％，并且是其中出现严重的寒战、发烧、咳嗽和胸痛并且痰液通常出血的疾病，并且可能引起并发症例如胸膜炎、脑膜炎、心内膜炎、腹膜炎等(Diagn.Microbiol.Infect.Dis.,2001,39:181-185)。

在本文中，术语“肺炎球菌”是指肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，并且总的来说，是一种定殖于人类鼻咽黏膜表面的共生生物体。当宿主的因素允许所述生物体接近下呼吸道时，随后发生强烈的炎性应答，并因此在肺泡腔填充渗出液时引起致密的固结，从而引发肺炎。肺炎球菌可以合成90种以上结构独特的荚膜多糖，并且根据荚膜多糖的这些结构和免疫学特征，对肺炎球菌的血清型进行分类。因此，当使用肺炎球菌的荚膜多糖制备用于疫苗的制剂时，根据荚膜多糖的种类、即荚膜多糖所源自的肺炎球菌的血清型，可能显示出不同的免疫应答。

由于所述荚膜多糖在被给药到体内时被识别为抗原，从而允许产生针对它的抗体，因此允许使用它来产生用于预防肺炎球菌(或肺炎球菌感染性疾病)的疫苗组合物。在本文中，术语“抗原”意味着当侵入身体时可以特异性引起免疫应答的物质。在一个实施方式中，源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的13种至24种荚膜多糖可以分别充当抗原。

其他实施方式提供了一种用于制备具有提高的稳定性和/或防腐(或杀细菌能力)的肺炎球菌疫苗组合物的方法，或一种用于提高肺炎球菌疫苗的稳定性和/或防腐能力(或杀细菌能力)的方法。所述方法可以包括：

(1)制备肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖-蛋白偶联物的步骤，和

(2)将所述荚膜多糖-蛋白偶联物与2-苯氧基乙醇(2-PE)和甲醛(HCHO)混合的步骤。

荚膜多糖、蛋白、偶联物以及2-苯氧基乙醇和甲醛的含量与上文描述的相同。

在所述方法中，所述荚膜多糖可以通过本领域技术人员公知的标准技术来制备，并且不被特别限于所述方法。所述荚膜多糖可以通过水解来减小其尺寸，以降低黏度并诱导有效的免疫原性。

所述制备荚膜多糖-蛋白偶联物的步骤(1)可以包括通过执行氰基化方法将所述荚膜多糖与蛋白通过-O-C(NH)-NH-连接的步骤。

在一个实施方式中，所述制备荚膜多糖-蛋白偶联物的步骤(1)可以包括：

(i)从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)分离或分离并纯化荚膜多糖的步骤；

(ii)溶解和/或水解所分离的荚膜多糖的步骤；和

(iii)通过执行氰基化方法将所述荚膜多糖与蛋白通过-O-C(NH)-NH-连接的步骤。

在其他实施方式中，所述制备荚膜多糖-蛋白偶联物的步骤(1)可以在通过执行氰基化方法将所述荚膜多糖与蛋白通过-O-C(NH)-NH-连接的步骤之后，进一步执行选自超滤步骤、除菌过滤步骤和吸附步骤的一个或多个步骤。所述氰基化方法可以使用CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)或CNBr来进行。

在本发明的一个特定实例中，使用脱氧胆酸钠分别溶解具有13种或15种各自不同的血清型的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，并释放出连接到细胞的多糖。然后，通过执行CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)方法来纯化源自于21种血清型1、2、3、4、5、6A、6B、9V、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F和23F的多糖，因为在它们与CTAB之间可以形成离子键，并使用磷酸铝凝胶(Algel)来纯化不与CTAB反应的3种血清型7F、14和33F。所述与CTAB的反应可以通过向反应物添加0.5至5重量％或1至3重量％(例如对于23F来源的多糖来说2至3重量％，对于源自于23F之外的血清型的多糖来说1至2重量％)的量的浓度为1至20％(w/v)或5至15％(w/v)的CTAB来进行，但不限于此。在与CTAB反应后，可以进一步进行离心后的沉淀回收、使用氯化钠溶液(例如约100至500mM)重悬浮所述沉淀和使用碘化钠除去CTAB离子中的一个或多个步骤，但不限于此。所述磷酸铝凝胶反应可以通过向反应物添加1至20重量％或5至15重量％的量的磷酸铝凝胶溶液来进行，但不限于此。

由于在使用仅利用所述荚膜多糖的疫苗组合物时，与成年人相比具有较低免疫系统的婴儿和儿童不能将它识别为抗原，因此可能不发生免疫应答，所以在本发明中制备并使用了其中将载体蛋白与所述荚膜多糖组合的偶联物的形式。

“载体蛋白”是指可以通过与荚膜多糖共价结合来提高所述多糖抗原的免疫原性的蛋白，并且具体种类与上述相同。在一个特定实施方式中，可以使用CRM197。所述载体蛋白可以通过标准偶联方法与所述荚膜多糖偶联，并且通过它形成的荚膜多糖-载体蛋白偶联物可以是一个或多个荚膜多糖被偶联到一个载体蛋白的荚膜多糖-载体蛋白偶联物。

用于制备荚膜多糖和载体蛋白偶联物的公知的方法都可以包括在本发明的范围之内，并且所述偶联物具有其中使用氰基化方法将所述荚膜多糖和载体蛋白通过-O-C(NH)-NH-基团连接的结构。所述氰基化方法可以由本领域技术人员通过公知的方法适合地进行，例如可以通过使用CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)或CNBr来进行，但不限于此。

作为用于制备荚膜多糖和载体蛋白偶联物的一个实例，可以通过化学活化纯化的荚膜多糖并将每个化学活化的荚膜多糖一个接一个地偶联到所述载体蛋白来形成糖偶联物。使用CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)处理进行的氰基化活性可以将荚膜多糖的羟基改变成氰酸酯基团，并通过使用它来与载体蛋白CRM197的氨基形成共价键。通过CDAP进行的氰基化反应具体来说可以通过与1摩尔当量的CDAP相比添加3摩尔当量的甘氨酸溶液并将pH调整到9.0来终止，但不限于此，并且本领域技术人员可以根据目的适合地控制反应溶液和反应条件。

收集的荚膜多糖-载体蛋白偶联物可以通过各种不同的方法来纯化。那些方法的实例包括浓缩/渗滤方法、柱层析和多层过滤。通过将纯化的多糖-蛋白偶联物分别混合来配制并使用本发明的疫苗组合物。例如，可以通过将13种个体荚膜多糖-载体蛋白偶联物与生理上可接受的介质进行配制来制备组合物。这种介质的实例可以是水、缓冲盐水溶液、注射用水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)或右旋糖溶液，但不限于此。

在本发明的一个特定实例中，13种荚膜多糖-载体偶联物通过进行下述步骤来制备：1)13种荚膜多糖的溶解和水解，2)通过使用CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)来进行的每种荚膜多糖与CRM197的偶联反应过程，3)偶联反应的终止，4)超滤，5)除菌过滤和6)吸附步骤。

在本文中，术语“疫苗”是为活体提供免疫力的含有抗原的生物制剂，并意味着通过给药到人类或动物而在活体中产生免疫力的用于预防感染性疾病的免疫原或抗原性物质。

所述疫苗组合物还可以包含选自佐剂、防腐剂、缓冲剂、冷冻保护剂、盐、二价阳离子、非离子型去污剂和自由基氧化抑制剂的一者或多者。

在本文中，术语“佐剂”意味着用于提高本发明的免疫原性组合物的免疫原性的物质。通常，提供所述佐剂是为了增强免疫应答，并且它对于本领域技术人员来说是公知的。适合于提高本发明的疫苗组合物的功效的佐剂可以包括选自下述的至少一者：

(1)铝盐(矾)(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等)；

(2)油包水类型的乳液制剂(含有或不含其它特异性免疫刺激物如胞壁肽(在下文中定义)或细菌细胞壁组分)，例如(a)MF59(No.WO90/14837)：含有5％(w/v)角鲨烯，0.5％(w/v)吐温80和0.5％(w/v)Span 85(随机地还含有各种不同量的MTP-PE)，并使用微射流机如110Y型微射流机(Microfluidics,Newton,MA)配制成亚微米粒子，(b)SAF：含有10％(w/v)角鲨烯，0.4％(w/v)吐温80，5％(w/v)普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP(参见下文)，并通过微射流将大粒子尺寸的乳液形成为亚微米乳液或空腔，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Corixa,Hamilton,MT)：含有来自于下述的一种或多种细菌细胞壁组分：2％(w/v)角鲨烯，0.2％(w/v)吐温80和美国专利号4,912,094中公开的3-O-脱酰基化单磷酰脂质A(MPL^TM)(Corixa)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选为MPL+CWS(Detox^TM)；

(3)皂苷佐剂如Quil A或STIMULON^TM QS-21(Antigenics,Framingham,MA，美国专利号5,057,540)或由其形成的粒子(例如ISCOM(免疫刺激性复合物))；

(4)细菌脂多糖，合成的脂质A同系物(例如：氨基烷基葡萄糖胺磷酸酯化合物(AGP))或其衍生物或同系物(这可以从Corixa购买并公开在美国专利号No,6,113,918中；所述AGP的一个实例是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，并且它也被称为529(以前也被称为RC529)，并且它被配制成水性形式或稳定的乳液；

(5)合成的多核苷酸(例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646))；

(6)细胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL 12、IL-15、IL-18等)、干扰素(如γ干扰素)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、辅助刺激分子B7-1和B7-2等；

(7)野生型霍乱毒素(CT)或例如其中位于第29氨基酸位置中的谷氨酸被其他氨基酸特别是组氨酸替换的突变的霍乱毒素(WO-2002/098368和WO-2002/098369)，百日咳毒素(PT)或大肠埃希氏杆菌的不耐热的毒素(LT)，特别是细菌ADP-核糖基化毒素的脱毒的变体例如LT-K63、LT-R72、CT-S109、PTK9/G129(WO-93/13302和WO-92/19265)；和

(8)补体例如补体组分C3d的三聚体，

但不限于此。

所述胞壁肽可以包含N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异葡萄糖胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等，但不限于此。

所述铝盐佐剂可以是明矾沉淀的疫苗或明矾吸附的疫苗。所述铝盐可以包含水合氧化铝、氧化铝水合物、三水合氧化铝(ATH)、水合铝、三水合铝、铝胶、syperfos、氢氧化铝凝胶、氢氧化铝、硫酸羟基磷酸铝(磷酸铝佐剂(APA))、无定形氧化铝等，但不限于此。APA意味着羟基磷酸铝的悬液。它可以如下制备：将氯化铝与磷酸钠以1:1的比率(以体积计)混合以便沉淀硫酸羟基磷酸铝，并使所述沉淀物的尺寸为2～8μm，然后将它用盐水溶液透析并除菌。作为一个实施方式，使用可商购的Al(OH)₃(例如铝胶或superfos)来吸附蛋白。每1mg氢氧化铝可以吸附50～200g蛋白，并且所述比率取决于蛋白的pI和溶剂的pH。具有低pI的蛋白比具有高pI的蛋白更强地结合。所述铝盐可以通过形成缓慢释放抗原2～3周的抗原储存点，非特异性地活化巨噬细胞、补体、先天性免疫机制。

在本文中，术语“抗菌剂(或防腐剂)”意味着抑制所述疫苗组合物中微生物的增殖的抗病毒和/或抗微生物物质，并且可以是例如硫柳汞、2-苯氧基乙醇、甲醛或其混合物，但不限于此，并且可以使用本领域中使用的所有常见防腐剂。

此外，所述疫苗组合物可以包含一种或多种生理上可接受的缓冲剂。例如，当所述疫苗组合物是输注液或注射液时，所述缓冲剂可以在pH 4.0至10.0、特别是pH 5.0至9.0、更特别是pH 6.0至8.0具有缓冲能力。所述缓冲剂可以是选自TRIS、乙酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐、三乙醇胺缓冲剂的至少一者。

具体来说，当本发明的疫苗组合物旨在肠胃外给药时，所述缓冲剂可以在适合于USP的缓冲剂中选择。例如，所述缓冲剂可以是选自一元酸如乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甘油酸、乳酸，二元酸如乌头酸、己二酸、抗坏血酸、碳酸、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸，碱如氨、二乙醇胺、甘氨酸、三乙醇胺、TRIS的至少一者。

此外，本发明的疫苗组合物可以包含非离子型去污剂。例如，它可以包含表面活性剂如聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80，特别是聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(通常被称为吐温)；氧化乙烯(EO)、氧化丙烯(PO)和氧化丁烯(BO)的共聚物(如DOWFAXTM)；分别具有乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基团的不同重复数的oxtoxinol，特别是oxtoxinol-9(Triton-100)；乙基苯氧基聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；壬基苯酚乙氧化物如NP系列；从月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇、油醇产生的聚氧乙烯脂肪酸醚(Brij表面活性剂)，特别是三乙二醇单月桂基醚(Brij 30)；被称为SPAN的失水山梨糖醇醚，特别是失水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)，但不限于此。

吐温80可以被包含在乳液中，并且可以使用具有非离子型去污剂如吐温80/Span85的混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯如吐温80和oxtoxinol如Triton X-100的组合是适合的，并且Laureth 9与吐温或oxtoxinol的组合也是有用的。具体来说，0.01％(w/v)至1％(w/v)、特别是0.1％(w/v)的聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(如吐温80)；0.001％(w/v)至0.1％(w/v)、特别是0.005％(w/v)至0.02％(w/v)的辛基苯氧基聚氧乙醇或壬基苯氧基聚氧乙醇(如Triton X-100)；和0.1％(w/v)至20％(w/v)、优选地0.1％(w/v)至10％(w/v)、特别是0.1％(w/v)至1％(w/v)或约0.5％(w/v)的聚氧乙烯醚(如laureth9)。

本发明的疫苗组合物可以被配制成单剂瓶、多剂瓶或预装注射器的形式。因此，一个实施方式提供了包含单剂或多剂例如超过一次剂量的所述疫苗组合物的小瓶或预装注射器。所述疫苗组合物还可以包含生理上可接受的载体。

在本文中，“多剂”可以意味着可以向1位给药(接种)个体给药(接种)超过一次的疫苗药剂，或可以向2位以上给药(接种)个体给药(接种)一次以上的疫苗药剂。

作为用于液体制剂的生理上可接受的载体，存在着水性或非水性溶剂、悬液、乳液和油。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇和油酸乙酯。所述水性载体包括水、醇性/水性溶剂、乳液或悬液、盐水溶液和缓冲溶液。油的实例包括合成油如植物或动物油、花生油、大豆油、葵花籽油、肝油和海生动物油，以及从奶或蛋获得的脂质。本发明的疫苗组合物可以是等渗、高渗或低渗的，并且通过输注或注射给药的药物组合物可以优选为等渗的，但不限于此。同时，等渗或高渗对于所述组合物的储存来说可以是有利的。当所述疫苗组合物为高渗时，可以在给药前将它稀释以便成为等渗。所述等渗剂可以是离子型等渗剂如盐或非离子型等渗剂如糖类。所述离子型等渗剂包括氯化钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁等，但不限于此。所述非离子型等渗剂包括山梨糖醇、甘油等，但不限于此。

每种疫苗药剂中偶联物的量可以被选择成诱导免疫保护应答而没有显著副作用的量，并且这种量可以根据肺炎球菌的血清型而变化。具体来说，以源自于血清型1的荚膜多糖的重量计，所述疫苗组合物可以包含0.8至1.2或0.9至1.1重量比(也就是说0.8至1.2重量份或0.9至1.1重量份)的源自于血清型2、3、4、5、6A、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖，并且可以包含1.6至2.4、1.8至2.2或1.9至2.1重量比(也就是说1.6至2.4重量份、1.8至2.2重量份或1.9至2.1重量份)的源自于血清型6B的荚膜多糖，但不限于此。

作为用于制备所述偶联物的一个实例，每种偶联物可以包含0.1至100μg、特别是0.1至10μg、更特别是1至5μg的多糖。

此外，最特别地，除了源自于血清型6B的荚膜多糖之外的其他多糖，也就是说源自于血清型1、2、3、4、5、6A、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖，可以以2至2.4μg或2.1至2.3μg例如约2.2μg的量被包含，并且所述源自于血清型6B的荚膜多糖可以以4至4.8μg、4.2至4.6μg或4.3至4.5μg例如约4.4μg的量被包含，但不限于此。

用于某些疫苗的组分的优化量可以通过标准研究来证实，所述标准研究包括在对象中观察适合的免疫应答。例如，用于人类的疫苗接种剂量可以通过外推动物实验的结果来确定。此外，本领域技术人员可以根据现场要求凭经验确定剂量。

所述疫苗组合物还可以包含铝元素和氯化钠，但不限于此。

通过经全身或粘膜途径给药药学有效的量，本发明的疫苗组合物可用于保护可能被肺炎球菌感染的个体并预防肺炎球菌疾病。本发明的术语“预防”意味着通过本发明的疫苗组合物的给药来抑制或延迟由肺炎球菌引起的感染的所有行为。本发明中定义的“药学有效量”意味着以显著降低被肺炎球菌感染的可能性或感染的严重性的水平产生抗体所需的剂量。本发明的术语“给药”意味着通过某些适合的方法将处方物质引入到个体。本发明的疫苗组合物可以通过口、鼻、直肠、经皮或经由气溶胶吸入的途径给药，但不限于此。所述给药可以选自通过肌肉内、腹膜内、真皮内或皮下途径注射，或通过口腔/消化道、气道或生殖泌尿道的粘膜给药。作为一个实施方式，鼻内给药可用于治疗肺炎或中耳中的炎症，并且在这种情况下，通过更有效地预防鼻咽肺炎球菌载体，可以在早期阶段减弱所述炎症。

本发明的疫苗组合物或药物组合物的给药对象“个体”可以意味着致病细菌可以在其中感染的活的生物体或从其分离的细胞、组织或其培养基，并且所述生物体可以是高等脊椎动物，更具体来说可以是哺乳动物如人类等，但不特别限于此。

在本发明的其他实施方式中，本发明的组合物可以通过单次接种来给药，或以适合的间隔给药两次、三次、四次或更多次，但不限于此。例如，用于婴儿和新生儿的用于由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)引起的侵袭性疾病的定期接种日程表可以是2、4、6和12至15月龄。

此外，所述组合物还可以包含源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的一种或多种蛋白。作为适合于被包含的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)蛋白的实例，不仅WO-2002/053761中公开的蛋白，而且WO-2002/083855中鉴定到的蛋白，都可以被包括在本发明的范围之内。

在本发明的一个特定实例中，说明了一种多价例如13价至24价、13价至19价、13价至17价、13价至15价、14价至24价、14价至19价、14价至17价或14价至15价肺炎球菌疫苗组合物，其在总共0.5mL疫苗组合物中包含2.2μg每种多糖，但源自于6B的多糖为4.4μg，约29.3μg CRM197载体蛋白，0.5mg铝元素(2mg磷酸铝)佐剂，约4.25mg(在不包含防腐剂的情况下)或约3.5mg(在包含防腐剂的情况下)氯化钠，约295μg琥珀酸盐缓冲溶液，以及约3mg2-苯氧基乙醇和约60μg甲醛。

在本发明的另一个特定实例中，在其中接种有所述疫苗组合物的兔的血清中，血清型特异性IgG浓度比水平更高(表1)。此外，证实了它表现出比更出色的效果，即使是在对它进行的功能性免疫原性确认试验(调理细胞吞噬测定法)中(表2)。因此，可以看出本发明的疫苗组合物对预防肺炎球菌疾病的用途来说具有非常出色的效果。

本发明的其他方面是一种针对肺炎球菌的免疫原性组合物，其包含13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种荚膜多糖-载体蛋白偶联物。所述偶联物和肺炎球菌与上文描述的相同。

本发明的包含13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种荚膜多糖-载体蛋白偶联物的组合物包含源自于具有13种至24种、13种至19种、13种至17种、13种至15种、14种至24种、14种至19种、14种至17种或14种至15种各自不同的血清型的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖，并且当在体内给药时将它识别为抗原，从而引起免疫应答以便产生针对它的抗体，并且因此它可以用作针对肺炎球菌的免疫原性组合物。

本发明的其他方面是一种通过向需要的个体给药所述疫苗组合物或免疫原性组合物来预防肺炎球菌疾病的方法。

本发明的其他方面提供了包含13种荚膜多糖-载体蛋白偶联物的组合物在制备用于预防肺炎球菌疾病的疫苗组合物中的用途，其中所述13种偶联物是将源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的13种荚膜多糖中的每一者共价偶联到所述载体蛋白的偶联物，并且所述载体蛋白是CRM197蛋白，并且所述偶联物具有其中使用氰基化方法将所述荚膜多糖和载体蛋白通过-O-C(NH)-NH-基团连接的结构。

疫苗组合物、免疫原性组合物和肺炎球菌疾病的预防等与上文描述的相同。

本发明的其他方面是一种用于制备所述免疫原性组合物的方法，所述方法包括将源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的13种分离的荚膜多糖中的每一者偶联到载体蛋白CRM197的步骤，使得所述荚膜多糖和载体蛋白具有通过-O-C(NH)-NH-基团连接的结构。

免疫原性组合物及其制备方法与上文描述的相同。

[有益效果]

本发明的多价肺炎球菌疫苗组合物包含具有独特偶联结构的荚膜多糖-蛋白的多价偶联物，并在其中包含作为防腐剂的2-苯氧基乙醇和甲醛的优化的组合和含量，从而维持出色的免疫原性并具有出色的稳定性和/或防腐能力。因此，本发明的疫苗组合物和免疫原性组合物可以更安全且有用地用于在婴儿、儿童和成年人中预防由肺炎球菌引起的疾病。

[本发明的方式]

在下文中，将通过下述实施例更详细地描述本发明。然而，给出这些实施例是出于说明的目的，并且不打算限制本发明的范围。

制备例1：荚膜多糖的制备

1-1.细胞库的制备

从委托组织US CDC(美国疾病控制和预防中心)获得具有16种各自不同的血清型(1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、12F和15B)的肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，并通过下述方法制备细胞库。

将肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)菌株涂布在血琼脂培养基上以确认肺炎球菌并除去存在的培养基组分。在选择10个以上单菌落的生长良好的单菌落后，将它接种在其中不包含动物来源的组分的液体培养基(大豆蛋白胨(Kerry Bio-Science)或酵母提取物(Bio-springer)来源的培养基)中，培养并增殖，然后添加合成的甘油，从而制备含有所述合成甘油的研究细胞库(RCB)。

在取出1瓶具有固有血清型的多糖的表达已被证实的研究细胞库并将细胞在不含动物来源的组分的液体培养基中增殖之后，添加合成甘油，由此制备主细胞库，并在取出1瓶主细胞库并将细胞在不含动物来源的组分的液体培养基中增殖之后，添加合成甘油，由此制备用于制备的细胞库。

将所制备的细胞库以超冷冻状态储存在-70℃或更低温度下，以将其用于下面的试验。

1-2.发酵和多糖分离

将1瓶用于制备的细胞库融化并接种在不含动物来源的组分的液体培养基中。所述种子培养在不搅动条件下在37±2℃进行，直至达到恒定的细胞浓度(光密度，OD 600)。在确认完成所述种子培养的培养液是否被污染后，将它接种在含有不包含动物来源的组分的液体培养基(大豆蛋白胨(Kerry Bio-Science)或酵母提取物(Bio-springer)来源的培养基)的发酵罐内(OD600＝2.5±0.2)。

然后在最低搅拌条件下在37±2℃，使用除菌的氢氧化钾溶液将培养基的pH维持到7.2±0.2，进行主培养。通过从培养开始后2小时起取样，测量所述培养液中细胞的浓度和所述培养基中包含的葡萄糖的浓度。当所述培养基中的葡萄糖被耗尽时，培养完成。

在所述培养完成后，制备适合量的除菌的12％(w/v)脱氧胆酸钠使其终浓度为0.12％(w/v)，然后将它添加到培养物，由此裂解细胞并释放出与所述细胞结合的多糖。

1-3.荚膜多糖的纯化

在向制备例1-3中获得的用脱氧胆酸钠处理的样品长时间添加磷酸并将pH滴定到3.5±0.3，然后通过静置15小时±3小时使其反应后，通过离心收集上清液(17,000xG，室温，1小时)。将收集的上清液通过深层滤器(0.55–9.0um)并浓缩，并进行使用磷酸缓冲液的缓冲液替换。

在所述缓冲液替换后，将样品通过活性炭滤器，然后通过下述两种方法进行杂质的去除：

1)由于对于血清型1、2、3、4、5、6A、6B、9V、12F、15B、18C、19A、19F和23F共14种血清型来说与CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)的离子键合是可用的，因此进行了CTAB方法，具体来说，用10重量％CTAB溶液以过程溶液的重量计1.5重量％(在除了23F之外的情况下)或2.5％(在23F的情况下)的量进行处理，以使它反应1小时±10分钟。然后通过以17,000xG的速率离心1小时来收集沉淀物。随后，为了用氯化钠(NaCl)和碘化钠(NaI)处理，使用200～300mM氯化钠(NaCl)溶液将通过CTAB处理收集的沉淀物重悬浮，并使用对应于所使用的CTAB的量的50重量％的碘化钠(NaI)除去CTAB离子。然而，对于血清型3来说，使用350mMNaCl溶液。在用氯化钠和碘化钠处理后，通过离心收集上清液并用于后续的过程。2)对于血清型7F和14这两种不与CTAB反应的血清型来说，添加磷酸铝凝胶(Algel)溶液并反应，然后用以总过程溶液计为10重量％的磷酸铝凝胶溶液处理并反应1小时。收集从离心(在17,000xG条件下离心1小时)获得的上清液并将其用于后续过程。

将两种类型的杂质去除方法完成后的样品通过深层滤器和超滤(UF/DF)过程，然后通过控制乙醇和氯化钠的量将它们制造成粉剂形式并储存。

制备例2：肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖-蛋白偶联物的制备

2-1：还原胺化法和氰基化法的偶联方法的比较

使用血清型9V的纯化多糖和CRM197载体蛋白(GenBank登记号1007216A；SEQ IDNO：1；mgaddvvdssk sfvmenfssy hgtkpgyvds iqkgiqkpks gtqgnydddw kefystdnkydaagysvdne nplsgkaggv vkvtypgltk vlalkvdnae tikkelglsl teplmeqvgt eefikrfgdgasrvvlslpf aegsssveyi nnweqakals veleinfetr gkrgqdamye ymaqacagnr vrrsvgsslscinldwdvir dktktkiesl kehgpiknkm sespnktvse ekakqyleef hqtalehpel selktvtgtnpvfaganyaa wavnvaqvid setadnlekt taalsilpgi gsvmgiadga vhhnteeiva qsialsslmvaqaiplvgel vdigfaaynf vesiinlfqv vhnsynrpay spghktqpfl hdgyavswnt vedsiirtgfqgesghdiki taentplpia gvllptipgk ldvnkskthi svngrkirmr craidgdvtf crpkspvyvgngvhanlhva fhrsssekih sneissdsig vlgyqktvdh tkvnsklslf feiks)，尝试还原胺化和氰基化的偶联方法，以比较两种偶联方法的偶联得率。具体的偶联方法如下所述。

2-1-1.还原胺化

将11.7mg高碘酸钠添加到血清型9V的多糖的未稀释溶液，在21至25℃搅拌以活化所述多糖。在使用100KDa超滤滤器和WFI(注射用水)将氧化的多糖浓缩并渗滤后，将保留的残余多糖与CRM197蛋白以糖/CRM197＝0.5的比率(重量比)混合并冷冻干燥。将所述冷冻干燥的复合物融化并在21至25℃稳定化(平衡)。在通过将所述平衡的复合物在磷酸钠(Na₃PO₄)缓冲液中以0.1M/20g糖的比例等温处理(37±2℃)以将它裂解后，加入氰基硼氢化物(100mg/mL)，由此引发所述蛋白与糖之间的偶联反应。在37±2℃下等温处理约44至52小时后，将温度降低到23±2℃，并向反应器添加1mL 0.9％(w/v)NaCl溶液。添加硼氢化钠溶液(100mg/mL)以使每1摩尔糖的硼氢化钠为1.8至2.2摩尔当量，并将得到的反应混合物在搅拌下等温处理，由此还原所述糖中存在的任何未反应的醛。向得到的糖-蛋白偶联混合物添加5mL 0.9％(w/v)氯化钠溶液以稀释它，并使用100kDa MWCO膜对所述稀释的偶联混合物进行透析和过滤。

2-1-2.氰基化

向未经水解处理过程制备的血清型9V的多糖的未稀释溶液添加氯化钠粉末，以制备2M NaCl多糖溶液。为了活化所述多糖，在向血清型9V多糖溶液添加CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)溶液，使得浓度以所述多糖计为0.5％(w/w)后，通过搅拌15分钟来诱导多糖活化反应。在向得到的反应过的混合物添加氢氧化钠溶液并将pH提高到9.5±0.1后，将它搅拌3分钟，使得多糖的羟基被CDAP充分活化。向通过多糖活化过程的所述多糖添加CRM197，使得CRM197与多糖的比率为1.0％(w/w)(CRM197重量/多糖重量)，由此在室温下将偶联反应进行1小时。

通过以1摩尔当量的CDAP计添加3摩尔当量的2M甘氨酸溶液，将pH调整到9.0并将它温育过夜，来完成所述偶联反应。将完成的偶联物在超滤滤器中浓缩并通过含有0.9％(w/w)氯化钠的缓冲溶液进行渗滤。

作为结果，证实了通过氰基化方法制备的偶联物的得率是通过还原胺化方法制备的偶联物的得率的4倍以上。因此，本发明的发明人通过使用氰基化方法使用荚膜多糖和CRM197制备偶联物。

2-2.偶联和偶联物的纯化

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖和CRM197的偶联物的制备通过下述过程步骤来进行。

步骤1.荚膜多糖的溶解和水解

将源自于每种血清型的荚膜多糖粉末分别溶解在注射用水中，使得最终浓度范围在下文提到的范围之内，并通过0.45μm滤器过滤：

1)在血清型1、2和4的情况下，0.8至2.0mg/ml的范围，

2)在血清型5、6B、9V、18C和19F的情况下，4至8mg/ml的范围，

3)血清型6A、12F和19A为8至12mg/ml的范围，并且

4)在血清型3、7F、14、15B和23F的情况下，2至4mg/ml的范围。

所述溶液的等温处理的过程在下文按照血清型提到的pH和温度范围内进行：

1)在血清型1、2、4、5、6B、7F、14和23F的情况下，70至80℃过夜，

2)在血清型6A和19F的情况下，70至80℃0.5至4小时，

3)在血清型3、9V、12F和18C的情况下，等温处理过程使用磷酸溶液在pH 2.0和65至80℃下进行0.5至4小时，

4)在血清型15B、19A的情况下，不进行水解。

然后，将它冷却到21℃至24℃并添加氢氧化钠至目标pH，由此停止水解。

步骤2.荚膜多糖和CRM197的偶联反应过程

向所有血清型添加氯化钠粉末，由此制备2M NaCl多糖溶液。将适合于每种血清型的CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)以每1ml 1/1乙腈/注射用水(v/v)溶液100mg CDAP的比例溶解，将所述溶液以下文按照血清型提到的量添加。详细来说，

将它以下述比例溶解

1)在血清型6A、9V和14的情况下，与多糖相比CDAP为1至1.5(w/w)，

2)在血清型2和4的情况下，与多糖相比CDAP为2(w/w)，

3)在血清型1、3、7F、15B、19F和19A的情况下，与多糖相比CDAP为3(w/w)，

4)在血清型5、6B、18C、23F的情况下，与多糖相比CDAP为4(w/w)，并且

5)在血清型12F的情况下，与多糖相比CDAP为5(w/w)，

并添加到每种多糖溶液。

随后，添加氢氧化钠溶液并将pH升高到9.5，然后将它搅拌3至7分钟，使得多糖的羟基被CDAP充分活化。以与多糖相比CRM197为0.75(w/w)的量将CRM197添加到每种血清型多糖溶液，由此进行2小时的偶联反应。然后，使用SE-HPLC测量反应的转化率，并且如有必要进一步添加CDAP。

步骤3.偶联反应终止

对于所有血清型来说，添加与所添加的1摩尔当量的CDAP相比为3至6摩尔当量的甘氨酸溶液，并将pH调整到9.0，由此终止反应。在将所述偶联溶液在21℃至24℃搅拌1小时后，将它在2至8℃的低温下储存过夜。

步骤4.超滤

将所述稀释的偶联混合物在超滤滤器中浓缩，并使用最少20倍体积的缓冲溶液(包含150mM NaCl的5mM琥珀酸盐缓冲溶液(pH 5.8))渗滤。在这里，使用维持pH 5.5至6.5的范围并包含0.9％(w/w)氯化钠的缓冲溶液作为缓冲溶液。对于所有血清型来说使用片段分子量为300kDa的超滤滤器，并且透析溶液被破坏。

步骤5.除菌过滤

将渗滤后残留的溶液用缓冲溶液(包含150mM NaCl的5mM琥珀酸盐缓冲溶液(pH5.8))稀释至以多糖内含物的浓度计为0.4g/L以下，然后将它通过0.22μm滤器过滤。在制备过程中对过滤过的产品进行控制(糖含量、残留DMAP)。在制备过程中对过滤过的残余溶液进行控制，由此确定是否需要另外的浓缩、渗滤和/或稀释。

步骤6.吸附

向除菌过滤的溶液添加铝盐(磷酸铝)使得最终浓度以铝离子计为1mg/mL，并吸附，添加额外的盐以维持5.5至6.5的pH范围。对完成吸附的未稀释的溶液进行质量检查，由此确认质量适合性，并将它在2至8℃冷藏直至使用。

实施例1.多价肺炎球菌偶联物疫苗的配制

从制备例2中制备的源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、12F和15B的荚膜多糖中的每一者和CRM197蛋白偶联的荚膜多糖-蛋白偶联物，制备了多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物的下述组合：

(1)13价偶联物：血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；

(2)15价A偶联物：血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和12F；

(3)15价B偶联物：血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和15B。

偶联物本体溶液的需求量在批料体积和偶联物未稀释溶液的多糖浓度的基础上计算。与制备例2的步骤6相同，在向每种血清型的偶联物本体溶液添加磷酸铝后，添加0.85％(w/w)盐水溶液和5mM琥珀酸盐缓冲溶液(pH 5.8)，由此制备含有0.85％氯化钠、5mM琥珀酸盐缓冲溶液(pH 5.8)和1mg/mL铝元素(磷酸铝中铝元素的浓度)的每种偶联物的本体溶液。最后，作为防腐剂，添加硫柳汞(85或100ug/ml)或2-苯氧基乙醇(2-PE)(0、5.0或10.0mg/ml)和甲醛(0、10、25、40、50、80、100、120或170ug/ml)并缓慢混合，作为上面提到的血清型组合，由此制备配制的多价肺炎球菌偶联物疫苗组合物。此时，所述多价疫苗组合物的每种血清型荚膜多糖的浓度为4.4μg/mL(只有血清型6B为8.8μg/mL)。检查pH，如果需要，调整到pH 5.8。将所制备的配制的最终疫苗组合物未稀释溶液装入1型硼硅酸盐玻璃瓶。将所述装瓶的疫苗组合物储存在2至8℃。

实施例2：多价肺炎球菌偶联物疫苗的免疫原性的估算

选择在总共0.5mL疫苗制剂中含有2.2μg每种荚膜多糖(只有血清型6B荚膜多糖为4.4μg)、约29.3μg CRM197载体蛋白、0.5mg铝元素(2mg磷酸铝)佐剂、约4.25mg氯化钠、约295μg琥珀酸盐缓冲溶液、约3mg 2-苯氧基乙醇和约60μg甲醛的多价肺炎球菌疫苗组合物(被命名为LBVE013)作为在实施例1中制备的疫苗组合物中的13价(血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)疫苗，由此确认它是否具有在兔中诱导免疫应答的能力。这种免疫原性在血清型IgG浓度的情况下通过抗原特异性ELISA来证实并且在抗体功能的情况下通过调理细胞吞噬测定法(OPA)来证实。

将疫苗组合物LBVE013或用作阳性对照组的在第0周、2周和4周，以计划的人类临床剂量(每种多糖2.2μg，例外的是6B 4.4μg)免疫接种在新西兰白兔的肌肉中，并在接种后以2周的时间间隔收集血清。使用ELISA为收集的血清获得的IgG测量结果示出在表1中。详细描述如下。

2-1.血清型特异性IgG浓度测量

将总共13种的每种血清型的荚膜多糖以5μg/孔的量在96孔板上处理，由此将它在室温下包被16小时。为了使血清的非特异性抗原-抗体反应最小化，以相同的量收集每只个体的血清，从而合并相同组的血清。在将所述血清合并物与333.3μg/mL C-PS(细胞壁多糖；SSI(staten Serum Institute))和333.3μg/mL血清型22F的荚膜多糖(PnPs22F)在室温反应30分钟以吸附它之后，将它用包含吐温20的用于抗体稀释的缓冲溶液以适合的稀释率(约1:100～1:40000)稀释。将包被的板用清洗用缓冲溶液清洗4次，并将吸附并稀释好的血清50μl置于包被的孔板中，然后将它在室温下反应1小时。将反应过的板孔通过相同的方法清洗4次，并将山羊抗兔IgG抗体-HRP偶联物(1:20000)置于每个孔中，然后将它在室温反应30分钟。将板通过相同的方法清洗4次，并将100μl稳定化的TMB底物溶液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺；Sigma,St.Louis,MO,USA)在室温下置于每个孔中，然后将它在室温反应15分钟。在通过放置100μl 1N硫酸溶液停止反应后，使用650nm作为参比波长，测量在450nm处的吸光度。为了对免疫原性进行客观估算，通过相同的方法分析使用作为对照组的收集的血液样品。

结果公开在下面的表1中。

[表1]

如表1中所示，证实了多价(13价)肺炎球菌疫苗组合物(LBVE013)的根据血清型的免疫原性反应模式确定地不同于的模式。与/>相比，在接种本实施例的13价疫苗组合物(LBVE013)的兔中在所有血清型中展示了较高的阈值水平，特别是血清型1、6B、7F、9V、14和19F显示出比/>高2～6倍的效果。

2-2.功能性免疫原性确认试验(调理细胞吞噬测定法，OPA)

通过对从兔获得的血清进行OPA分析，评估了由血清型诱导的抗体的功能。

具体来说，从每个个体收集相同量的血清，由此合并相同组的血清。将每种血清型的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)在THY培养基(Todd-Hewitt肉汤，含有2w％酵母提取物)中培养，并使用调理缓冲液稀释到200至300CFU/10μl。将20μl稀释的血清和10μl稀释的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)混合，并在室温反应30分钟。然后，添加50μl的分化好的HL-60细胞和补体的混合物(细胞：补体＝4:1)，并在CO₂培养基中(37℃)反应45分钟。

通过降低温度停止细胞吞噬，并将10μl反应溶液涂布在已干燥30至60分钟的琼脂培养基中。然后，将它在CO₂培养基中(37℃)培养12至18小时，并对菌落数目进行计数。OPA阈值被表示为观察到50％死亡时的稀释率。

得到的结果示出在下面的表2中：

[表2]

在表2中，例如，OPA滴度被表示为2187是即使在最稀的部分中与阴性对照组相比也未达到50％水平的情况，并且它意味着阈值显著地高。通过上述试验结果，证实了本实施例的多价肺炎球菌疫苗组合物与相比具有显著出色的血清IgG阈值。因此，本实施例的多价肺炎球菌疫苗组合物可以被非常有用地用于预防由肺炎球菌引起的疾病。

参考例：疫苗杀细菌能力试验的流程和标准

疫苗的杀细菌能力试验按照EP-B标准来进行，所述标准是本实施例中美国药典(USO)和欧洲药典(EP)的世界卫生组织(WHO)对疫苗产品所要求的标准。

如果具体概述所述试验的内容，将2种细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC No.9027,PA)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCCNo.6538,SA)、酵母菌白假丝酵母(Candida albicans)(ATCC No.10231,CA)和真菌黑曲霉(Aspergillus niger)(ATCC No.16404,AN)共四种病菌的10⁵至10⁶CFU/mL(CFU；菌落形成单位)分别在0时接种到所述疫苗组合物。通过在24小时、7天、14天和28天取样并将其在固体培养基中培养，在3至5天对菌落数目进行计数。

对于根据上述方法的结果来说，EP-B和每个国家的药典的杀细菌能力的标准示出在下面的表3中。

[表3]

*NR：未回收

**NI：未增加

正如可以在表3中看到的，EP要求比美国药典(USP)或日本药典(JP)更加严格，并根据制剂分为A和B类，并且WHO对疫苗产品要求的水平是EP-B(EP 5.1.3.抗微生物剂的防腐功效(Efficacy of antimicrobial perserbation)，USP 37-51，抗微生物剂有效性试验(Antimicrobial effectiveness testing))。

在本实施例中，为了开发多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗，添加本领域中常用的疫苗防腐剂硫柳汞和2-PE，由此执行杀细菌能力试验，并证实了在单独使用硫柳汞或低浓度2-PE的情况下不满足所述杀细菌能力的标准。

此外，由于其他公司已对使用高浓度2-PE(7mg/mL以上)的情况提交了专利申请，因此它不能在我们公司使用。

因此，作为进行中的实验的结果，本发明的发明人获得了下述结果，从而开发可以使2-PE的含量最小化并提高杀细菌效果以便满足所述杀细菌能力标准而不违反其他公司的专利的新的组合物，作为多价肺炎球菌蛋白偶联物疫苗的防腐剂。

实施例3：多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗的杀细菌能力的筛选

在2种细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC No.9027,PA)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC No.6538,SA)、酵母菌白假丝酵母(Candidaalbicans)(ATCC No.10231,CA)和真菌黑曲霉(Aspergillus niger)(ATCC No.16404,AN)共四种病菌中，选择公知的不容易被2-PE杀死的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC No.6538,SA)作为用于筛选杀细菌能力的细菌。进行实验的目的是通过使用在24小时时取样的样品估算杀细菌能力，来选择满足EP-B的2-PE与甲醛的组合。因此，所述试验按照EP-B的试验方法来进行。

具体来说，通过参考实施例1的多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗的制备方法，通过按照表2添加硫柳汞或2-PE和/或甲醛来制备疫苗组合物1至12的多价肺炎球菌蛋白偶联物疫苗组合物，并将10⁵至10⁶CFU/mL(CFU＝菌落形成单位)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC No.6538,SA)病菌在0时接种到这些制剂。通过在0时和24小时取样并在固体培养基中培养，在3至5天对菌落数目进行计数，由此计算菌落减少的对数(Log)。结果示出在下面的表4中。

[表4]

正如可以在表4中看到的，来自于2-PE 5.0mg/mL与甲醛100μg/mL的组合的SA的杀细菌能力通过EP-B标准。在所述结果的基础上，证实了约5.0mg/mL 2-PE与100μg/mL以上甲醛的组合适合于多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗的防腐剂。

实施例4：多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗1的杀细菌能力试验

所述杀细菌试验按照EP-B的试验方法来进行。将2种细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC No.9027,PA)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(ATCC No.6538,SA)、酵母菌白假丝酵母(Candida albicans)(ATCC No.10231,CA)和真菌黑曲霉(Aspergillus niger)(ATCC No.16404,AN)共四种病菌的10⁵至10⁶CFU/mL(CFU；菌落形成单位)分别在0时接种到疫苗组合物13至15的多价肺炎球菌蛋白偶联物疫苗制剂。通过在0时、24小时、7天和28天取样并将其在固体培养基中培养，在3至5天对菌落数目进行计数，由此计算菌落减少的对数。真菌和酵母在0时、14天和28天取样并在固体培养基中培养，然后在3至5天对菌落数目进行计数，由此计算菌落减少的对数。结果示出在表5中。

[表5]

*NR：未回收

**NI：未增加

如表5中所示，作为在其中包含13价、15价A和15价B的每种血清型的多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗组合物13至15中确认2种细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC No.9027,PA)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCCNo.6538,SA)、酵母菌白假丝酵母(Candida albicans)(ATCC No.10231,CA)和真菌黑曲霉(Aspergillus niger)(ATCC No.16404,AN)共四种病菌的杀细菌能力的结果，不论血清型如何，在所有13价、15价A和15价B中对4种病菌的杀细菌能力满足EP-B标准。从所述结果证实，在多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗的防腐剂包含约5mg/mL 2-PE和约100μg/mL甲醛的情况下，满足EP-B标准的杀细菌能力。

在本领域中，肺炎球菌蛋白偶联物疫苗通常使用7mg/mL以上的2-PE作为防腐剂，但所述结果与实施例3的结果一起显示了在添加100μg/mL以上的量的甲醛的情况下，2-PE的含量低至5mg/mL，也可以实现EP-B的杀细菌能力。因此，在本发明中可以提供多剂组合物，其中使用了2-苯氧基乙醇(2-PE)与甲醛(HCHO)的优化的组合作为多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗的防腐剂，并且维持了强且有效的杀细菌能力。

实施例5：多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗组合物的稳定性

基于实施例4的结果，制备了多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗组合物16的新的组合物。具体来说，所述疫苗组合物16通过下述方法制备：放置14种多糖-蛋白偶联物(血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F)和1mg/mL磷酸铝(以铝浓度计)并搅拌以充分混合。将5mM琥珀酸盐和0.85％(w/v)氯化钠溶解在注射用蒸馏水中，由此混合除菌过滤过的缓冲液。在最后通过添加6.0mg/mL浓度的2-PE和120μg/mL浓度的甲醛进行均化后，将最终pH调整到5.8。制备的疫苗组合物中每种血清型的浓度同样为4.4μg/mL(只有6B为8.8μg/mL)。

作为在将所述制备的疫苗组合物16在2至8℃储存6个月后测试防腐剂的含量的结果，证实了2-PE和甲醛的含量回收率稳定地维持在90至110％的范围内，没有防腐剂的损失。

概括来说，证实了在本发明的实施例中说明的2-PE与甲醛的组合是长时间有效维持多价肺炎球菌多糖-蛋白偶联物疫苗的杀细菌活性的出色的组合物，并且它可以有用地用于提供其中多价多糖-蛋白偶联物疫苗的杀细菌能力得以提高或维持所述杀细菌能力的时间长度得以延长的多剂组合物。

从上述描述，本领域技术人员应该理解，本发明可以以其他特定形式体现而不背离其技术精神或本质属性。就此而言，上面描述的实施例在所有方面应该被当作是说明性而非限制性的。本发明的范围应该由随附的权利要求书而不是上述描述指明，并且落入权利要求书的含义和等同性范围之内的所有改变因此被意欲包含在本发明的范围内。

<110> 株式会社LG化学（LG CHEM, LTD.）

<120> 多价肺炎链球菌疫苗组合物

<130> OPP20180151KR

<150> KR 10-2017-0032643

<151> 2017-03-15

<160> 1

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 536

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CRM197蛋白

<400> 1

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu

1 5 10 15

Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile

20 25 30

Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp

35 40 45

Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala

50 55 60

Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

65 70 75 80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys

85 90 95

Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr

100 105 110

Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe

115 120 125

Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly

130 135 140

Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

145 150 155 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln

165 170 175

Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val

180 185 190

Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp

195 200 205

Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His

210 215 220

Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser

225 230 235 240

Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu

245 250 255

Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro

260 265 270

Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln

275 280 285

Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala

290 295 300

Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly

305 310 315 320

Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu

325 330 335

Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val

340 345 350

Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu

355 360 365

Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly

370 375 380

His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn

385 390 395 400

Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly

405 410 415

His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly

420 425 430

Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys

435 440 445

Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala

450 455 460

Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val

465 470 475 480

Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser

485 490 495

Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val

500 505 510

Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu

515 520 525

Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

530 535

Claims (12)

1.一种针对肺炎球菌的多价疫苗组合物，其包含：

(i)荚膜多糖-载体蛋白偶联物，

(ii)5mg/mL以上并少于6mg/mL的2-苯氧基乙醇(2-PE)，和

(iii)100μg/mL至170μg/mL的甲醛(HCHO)，

其中所述荚膜多糖包含13至24种源自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型的荚膜多糖。

2.权利要求1的针对肺炎球菌的多价疫苗组合物，其中所述荚膜多糖包含选自以下的13至24种荚膜多糖：源自于肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的荚膜多糖。

3.权利要求2的针对肺炎球菌的多价疫苗组合物，其中所述荚膜多糖包含

源自于肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的13种荚膜多糖；

源自于肺炎链球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的14种荚膜多糖；

源自于肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和12F的15种荚膜多糖；

源自于肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、2和15B的15种荚膜多糖；或

源自于肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F和33F的17种荚膜多糖。

4.权利要求1的针对肺炎球菌的多价疫苗组合物，其中所述载体蛋白是CRM197蛋白。

5.权利要求1的针对肺炎球菌的多价疫苗组合物，其中所述荚膜多糖-载体蛋白偶联物具有其中使用氰基化方法将所述荚膜多糖和载体蛋白通过-O-C(NH)-NH-基团连接的结构。

6.权利要求5的针对肺炎球菌的多价疫苗组合物，其中所述氰基化方法使用CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐)或CNBr来进行。

7.权利要求1的针对肺炎球菌的多价疫苗组合物，其包含：

以1重量份的源自于血清型1的荚膜多糖计，

0.9至1.1重量份的每种源自于血清型2、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、12F和15B的荚膜多糖，和

1.8至2.2重量份的源自于血清型6B的荚膜多糖。

8.权利要求1至7任一项的针对肺炎球菌的多价疫苗组合物，其用于多次给药。

9.一种用于预防肺炎球菌感染或肺炎球菌感染疾病的药物组合物，其包含权利要求1至7任一项的针对肺炎球菌的多价疫苗组合物。

10.权利要求9的药物组合物，其中所述肺炎球菌感染疾病是肺炎。

11.一种用于制备针对肺炎球菌的多价疫苗组合物的方法，所述方法包括：

(1)制备肺炎链球菌的荚膜多糖-蛋白偶联物，和

(2)将所述荚膜多糖-蛋白偶联物与2-苯氧基乙醇(2-PE)和甲醛(HCHO)混合，

其中所述荚膜多糖包含13至24种源自于肺炎链球菌血清型的荚膜多糖，并且

使用的2-苯氧基乙醇的量为5mg/mL以上并少于6mg/mL，并且甲醛的量为100μg/mL至170μg/mL。

12.权利要求11的用于制备针对肺炎球菌的多价疫苗组合物的方法，其中制备荚膜多糖-蛋白偶联物的步骤(1)包括执行氰基化方法以将所述荚膜多糖和蛋白通过-O-C(NH)-NH-连接的步骤。