KR20220018939A - 폐렴구균 다당류-세포벽 유래 물질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 - Google Patents
폐렴구균 다당류-세포벽 유래 물질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폐렴구균 다당류-세포벽 유래 물질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로, 각 접합체는 특정 혈청형의 폐렴구균 유래의 협막 다당류와 결합된 세포벽 유래 물질을 포함한다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 기존 백신 대비 더욱 증가된 면역 반응을 유도할 수 있다. 특히, 기존 폐렴구균 접합 백신에는 포함되어 있으나 항체가가 낮거나 OPA 역가가 낮아 전 세계적으로 유행하고 있는 특정 혈청형에 대해 뛰어난 효과를 가진다.
Description
본 발명은 폐렴구균 다당류-세포벽 유래 물질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로, 각 접합체는 특정 혈청형의 폐렴구균 유래의 협막 다당류와 결합된 세포벽 유래 물질을 포함한다.
스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 폐렴의 주요한 원인균이다. 통계청 「2010년 주요 사망 원인별 사망률 추이」에 의하면 2010년 폐렴으로 인한 사망률은 10만 명당 14.9 명으로 10대 사망원인의 하나이며, 2000년 대비 82.9% 증가한 것으로 나타났다. 또한 2012년 WHO에 따르면 2008년도에 전세계적으로 HIV 음성인 5세 이하 어린이 476,000명이 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염으로 사망했으며, 5세 이하 어린이 전체 사망자 중 5%가 이 균에 의한 질환으로 사망하였다.
폐렴구균에 의한 질환을 예방하기 위해 1977 년 Dr. Robert Austrian에 의해 14가 다당류 백신이 개발되었고, 이후 23가 다당류 백신으로 발전하였다. 다가 폐렴구균 다당류 백신은 노인 및 고위험 환자에서 폐렴구균 질환을 예방하는데 있어서 유용한 것으로 입증되었다. 그러나 유아 및 소아는 대부분의 폐렴구균 다당류에 대해 면역 반응이 잘 일어나지 않는데 이는 T-cell 비의존적 면역반응 현상 때문이다. 7가 폐렴구균 접합체 백신(프리베나, Prevnar®)은 가장 발생 빈도가 높은 7개 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)를 포함한다. 2000년 미국에서 최초로 승인된 이후 유아 및 소아에서 침습성 질환 및 중이염에 대해 면역원성이 높고 효과적인 것으로 입증되었다. 이 백신은 현재 전세계 약 80여 개 국가에서 승인되어 있다. 프리베나의 도입 이후에 수년간 축적된 감시(surveillance) 데이터에서는 예상된 바와 같이, 미국에서 프리베나에 포함된 혈청형에 의한 침습성 폐렴구균 질환이 명확히 감소하였다. 하지만 일부 지역에서는 혈청형 적용 범위에 한계가 있었으며, 프리베나에 포함되지 않은 혈청형으로 인한 침습성 폐렴구균 질환은 증가하였다.
프리베나에 포함되지 않은 혈청형으로 인한 폐렴구균 감염이 증가됨에 따라, 폐렴구균 혈청형의 추가에 대해서는 계속해서 연구가 진행되고 있었다. 하지만, 다가 주사에 접합체를 조합함으로 인해 상이한 구성성분들 사이에 경쟁(면역 간섭)이 일어날 수 있고 임의의 개별 접합체의 면역원성에 불리한 영향을 미칠 수 있기 때문에, 면역원성 조성물에 접합체를 추가하는 것에 어려움이 있어왔다.
이러한 면역 간섭 현상은 다가 백신에 포함될 수 있는 접합체의 수를 제한할 수 있다. 따라서, 매우 수많은 혈청형에 대한 보호가 상당한 가치가 있음에도 불구하고 조성물 중 접합체의 수를 제한하면서 이를 달성하기는 매우 어려웠다.
대부분의 폐렴구균 혈청형들은 Wzy 생성 회로(Wzy-dependent pathway 또는 O-antigen polymerase pathway로도 명명됨)에 의해 협막다당이 생성 되지만, 3번 혈청형 폐렴구균의 경우에는 이와 다른 별도의 회로(synthase dependent pathway)를 통해 협막다당을 생성한다. 해당 기작을 통해 생성된 협막다당은 펩티도글리칸(Peptidoglycan) 층과 공유결합을 구성하고 있지 않아, 세포벽과 약하게 결합되어 있다. 이에, 3번 혈청형을 배양하게 되면, 해당 협막다당이 폐렴구균으로부터 외부(배지)로 떨어져 나가게 된다. 폐렴구균 접합 백신에 이용되는 폐렴구균 혈청형은 보통 CPS(Capsular Polysaccharide), CWPS(Cell Wall Polysaccharide), LTA(Lipoteichoic acid), PG(Peptidoglycan) 등이 포함된 상태의 물질과 운반체 단백질(전달 단백질)이 결합된 형태이나 특정 혈청형, 예를 들면 3번 혈청형의 경우, 세포벽과 공유결합이 되지 않은 상태이므로 협막다당이 폐렴구균으로부터 분리되어 있는 형태로 존재한다. 이러한 현상은 배양 중 다른 혈청형 대비 3번 혈청형이 높은 점성을 쉽게 갖는 이유이기도 하다.
기존의 사멸화 백신, 불활성화 백신 등은, 면역원성이 기타 백신 형태(재조합 단백질, DNA)보다 높다고 알려져 있으며, 이는 여러 항원에 의한 부스팅 효과에서 기인함을 여러 논문에서 언급하고 있으며, 페렴구균의 주요 항원인 협막다당은 단독으로 사용 시, 장기 면역 유도 효능이 낮고, 영유아에 면역반응이 낮은 것으로 알려져 있다.
특정 혈청형, 예를 들면 3번 혈청형의 경우, 프리베나 13 (PCV13)에 포함되어 있는 혈청형이지만, 해당 혈청형은 백신 접종 이후, 방어율이 낮은 혈청형으로 알려져 있다. 다른 혈청형을 포함한 3번 혈청형의 경우, PCV13 접종 후, 항체가와 OPA 역가가 나타나지만, 3번 혈청형의 경우에는 실제 방어율이 낮으며, 유럽 및 미국의 발병 현황을 참고하면, 3번 혈청형의 발병율은 여전히 높게 유지되고 있다.
그람 양성균인 폐렴구균의 세포벽은 LTA (Lipoteichoic acid)와 CWPS (cell wall polysaccharide) CPS (capsular polysaccharide, PG (Peptidoglycan), 세포 멤브레인 이중층 등으로 구성되어 있으며, 백신 접합체의 면역원성을 올리기 위한 다양한 연구의 일환으로서 해당 구성성분들을 활용한 연구가 진행되기도 하였으나, 폐렴구균에서 특정 혈청형에 대해 면역원성을 증가시키는 연구는 현재까지 극히 제한적으로 진행된 바 있다.
이에 본 발명자들은 특정 혈청형의 기능적 항체가(OPA) 및 특이적 항체가(IgG)를 증가시키면서도 면역원성 조성물의 구조적 안정성을 유도하고자 폐렴구균의 세포벽 유래 물질을 폐렴구균 협막다당에 접합하였고, 해당 조성물의 뛰어난 효과를 최종 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 해결하려는 과제는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 접합체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질(cell wall derived material)의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 11A, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23F 및 35B 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 운반체 단백질의 접합체를 추가로 포함하며, 상기 협막 다당류는 혈청형 10A, 11A, 15B, 22F, 23A 및 35B로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 운반체 단백질의 접합체를 추가로 포함하며, 상기 협막 다당류는 혈청형 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C 및 23F로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 협막 다당류와 세포벽 유래 물질(cell wall derived material)의 접합체는 운반체 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체는 링커(linker)를 추가로 포함
할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 세포벽 유래 물질은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcuspneumoniae)로부터 분리된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 세포벽 유래 물질은 상기 협막 다당류와 공유결합으로 연결된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 세포벽 유래 물질은 LTA (Lipoteichoic acid), CWPS (Cell Wall Polysaccharide) CPS (Capsular Polysaccharide), PG (Peptidoglycan), LPS (Lipopolysaccharide) MDP (Muramyl Dipeptide), MTP (Muramyl tripeptide) 및 PC (Phosphatidyl Choline)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 세포벽 유래 물질은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcuspneumoniae)유래의 CWPS (Cell Wall Polysaccharide)일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 운반체 단백질은 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 대장균 유래 불화성화 독소, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래 불활성화 독소 및 세균 외막 단백질(OMP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 디프테리아 톡소이드는 CRM197, CRM173, CRM228 및 CRM45 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 링커는 ADH (adipic acid dihyrazied), Beta-프로피온아미도, 니트로페닐-에틸아민, 할로알킬 할라이드, 헥산 디아민, 6-아미노카프론산 및 글리코시드 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질은 하기 접합 순서 중 어느 하나로 접합된 구조임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물 일 수 있다:
a) 협막 다당류-운반체 단백질-세포벽 유래 물질;
b) 운반체 단백질-협막 다당류- 세포벽 유래 물질; 및
c) 협막 다당류-세포벽 유래 물질-운반체 단백질.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 세포벽 유래 물질은 운반 단백질과 직접적으로 결합하지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 접합 순서 a), b), 또는 c)의 각 구성성분 간에 링커를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 접합 순서 b)로 접합된 구조는 선형(linear) 또는 비선형(Non-linear) 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질 내 접합 방법은 CDAP 접합 방법, 리덕티브 아미네이션 방법 및 티올-말레마이드(Thiol-Malemide) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 a) 접합 순서는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 b) 접합 순서는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 세포벽 유래 물질에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 협막 다당류와 연결하는 단계;
ii) 운반체 단백질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 b) 접합 순서는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 운반체 단백질과 연결하는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 접합 순서 c)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 애주번트는 알루미늄 염일 수 있다. 상기 알루미늄 염은 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이드록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 0.1 내지 100 ㎍ 용량의 다당류를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 과제를 해결하고자, 본 발명은 상기 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 접합체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명의 또 다른 과제를 해결하고자, 본 발명은 상기의 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질은 하기 접합 순서 중 어느 하나로 접합될 수 있다.
a) 협막 다당류-운반체 단백질-세포벽 유래 물질;
b) 운반체 단백질-협막 다당류- 세포벽 유래 물질; 및
c) 협막 다당류-세포벽 유래 물질-운반체 단백질.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 접합 순서 a), b), 또는 c)의 각 구성성분 간에 링커를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질 내 접합 방법은 CDAP 접합 방법, 리덕티브 아미네이션 방법 및 티올-말레마이드(Thiol-Malemide) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 a) 접합 순서는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 b) 접합 순서는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 세포벽 유래 물질에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 협막 다당류와 연결하는 단계;
ii) 운반체 단백질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
또한, 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 접합 순서 b)가 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 운반체 단백질과 연결하는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
아울러, 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 접합 순서 c)가 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물은 기존 백신 대비 더욱 증가된 면역 반응을 유도할 수 있다. 특히, 기존 폐렴구균 접합 백신에는 포함되어 있으나 항체가가 낮거나 OPA 역가가 낮아 전 세계적으로 유행하고 있는 특정 혈청형에 대해 뛰어난 효과를 가진다.
도 1은 폐렴구균 다당류-세포벽 유래 물질 접합체 A 내지 C의 제조 과정 및 접합 순서를 나타낸 그림이다.
도 2는 폐렴구균 협막다당 3번 혈청형 특이 IgG 농도의 ELISA 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 19가 폐렴구균 백신 혈청형 및 신규 접합체 (3C)를 포함한 19가 폐렴구균 백신에 대한 IgG ELISA 결과를 나타낸 그림이다.
도 4 및 도 5는 19가 폐렴구균 백신 혈청형 및 신규 접합체 (3C)를 포함한 19가 폐렴구균 백신에 대한 혈청형 특이 IgG 농도 ELISA 및 기능적 항체가(면역원성) OPA 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 폐렴구균 협막다당 3번 혈청형 특이 IgG 농도의 ELISA 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 19가 폐렴구균 백신 혈청형 및 신규 접합체 (3C)를 포함한 19가 폐렴구균 백신에 대한 IgG ELISA 결과를 나타낸 그림이다.
도 4 및 도 5는 19가 폐렴구균 백신 혈청형 및 신규 접합체 (3C)를 포함한 19가 폐렴구균 백신에 대한 혈청형 특이 IgG 농도 ELISA 및 기능적 항체가(면역원성) OPA 결과를 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
그러나 본 기재는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 발명의 상세한 설명에 기재된 사항들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 협막 다당류는 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해서 제조될 수 있다. 협막 다당류는 점도를 감소시키고 활성화된 협막 다당류의 용해도를 함께 증가시키기 위해서 크기를 줄일 수 있다. 폐렴구균 접합체들은 별개의 과정에 의해서 제조되고 단일 투여 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 각 폐렴구균 다당류 혈청형을 대두-기제 배지에서 증식시키고, 이어서 개개의 다당류를 원심분리, 침전, 한외여과를 통해서 정제할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 11A, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23F 및 35B 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 협막 다당류는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 협막 다당류는 혈청형 3, 6A, 6B, 19A 및 19F로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류를 포함할 수 있다.
상기의 특정 혈청형들의 경우, 프리베나 13 (PCV13)에 포함되어 있는 혈청형이지만, 해당 혈청형은 백신 접종 이후, 방어율이 낮은 현상(면역원성이 낮음)이 보고된 바 있다. 다른 혈청형을 포함한 해당 혈청형들의 경우, PCV13 접종 후, 항체가와 OPA 역가가 나타나지만, 실제 방어율이 낮으며, 유럽 및 미국의 발병 현황을 참고하면, 해당 혈청형의 발병율은 여전히 높게 유지되는 것으로 알려져 있다. 이는 앞서 배경설명에서 기술한 바와 같이, 해당 특정 혈청형의 협막다당이 폐렴구균 세포벽과 공유결합을 형성하고 있지 않아 분리되어 있는 형태로 존재하기 때문이다.
또한, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 운반체 단백질의 접합체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 협막 다당류는 혈청형 10A, 11A, 15B, 22F, 23A 및 35B로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 운반체 단백질의 접합체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 협막 다당류는 혈청형 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C 및 23F로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 면역원성 조성물은 통상적인 협막 다당의 수로서 13개의 상이한 혈청형 내지 30개 이상의 상이한 혈청형 범위일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 면역원성 조성물은 폐렴구균 감염에 의해 유발되는 질환에 대해 사람에서 기능적 면역 반응을 유도한다. 보다 구체적으로는 일 구현예에서, 사람 대상체는 노인 대상체이며 질환은 폐렴 또는 침습성 폐렴구균 질환이다. 보다 구체적으로는, 일 구현예에서, 노인 대상체는 적어도 50세이다. 보다 구체적으로는, 일 구현예에서, 노인 대상체는 적어도 55세이다. 보다 구체적으로는, 일 구현예에서, 노인 대상체는 적어도 60세이다.
보다 구체적으로는, 일 구현예에서, 사람 대상체는 유아이고 질환은 폐렴, 침습성 폐렴구균 질환(IPD), 또는 급성 중이염(AOM)이다.
보다 구체적으로는, 일 구현예에서, 유아는 0 내지 2세 또는 2 내지 15개월령이다.
다른 실시형태에서, 사람 대상체는 6주령 내지 17세이며 질환은 폐렴, 침습성 폐렴구균 질환(IPD) 또는 급성 중이염(AOM)이다. 특정 실시형태에서, 사람 대상체는 6주령 내지 5세이다. 또 다른 실시형태에서, 사람 대상체는 5주령 내지 17세이다.
본 발명의 협막 다당류는 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해서 제조될 수 있다. 협막 다당류는 점도를 감소시키기 위해서 또는 활성화된 협막 다당류의 용해도를 증가시키기 위해서 크기를 줄일 수 있다.
본 발명은 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 14개 이상의 상이한 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 각각의 접합체가 운반체 단백질에 접합된 상이한 혈청형의 폐렴구균 유래의 협막 다당류를 포함한다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체는 운반체 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 운반체 단백질은 바람직하게는 무독성이고 비반응원성이며, 충분한 양 및 순도로 수득할 수 있는 단백질일 수 있다. 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 운반체 단백질은 바람직하게는 CRM197일 수 있다. CRM197은 카사미노산 및 효모 추출물-기제 배지에서 증식시킨 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 분리된 디프테리아 독소의 무독성 변이체(즉, 톡소이드)이다. CRM197은 한외여과, 암모늄 설페이트 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 통해서 정제된다. CRM197은 미국특허 제5,614,382호에 따라 유전자 재조합하여 제조될 수도 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 다른 디프테리아 톡소이드도 또한 운반체 단백질로서 사용될 수 있다. 다른 운반체 단백질은 디프테리아 톡소이드 외에도, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 대장균 유래 불화성화 독소 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래 불활성화 독소가 포함될 수 있다. 세균 외막 단백질, 예를 들면, 외막 복합체 c(OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴모리신, 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), 폐렴구균 어드헤신(adhesin) 단백질(PsaA), 그룹 A 또는 그룹 B 연쇄구균 유래의 C5a 펩티다제, 또는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 단백질 D도 또한 사용될 수 있다. 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD)와 같은 다른 단백질도 또한 운반체 단백질로서 사용될 수 있다. CRM173, CRM228, CRM45와 같은 디프테리아 독소의 변이체도 운반체 단백질로 사용 가능하다.
본 발명에 따른 운반체 단백질을 다른 구성과 접합하기 위해서는 기존에 공지된 접합 방법을 사용할 수도 있다. 예시로 리덕티브 아미네이션 또는 CDAP 접합 방법을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 운반체 단백질과 반응할 수 있는 당류를 제조하기 위하여, 정제된 다당류는 화학적으로 활성화시킬 수 있다. 일단 활성화되면, 각 협막 다당류를 운반체 단백질에 하나씩 접합시켜서 당접합체(glycoconjugate)를 형성한다. 본 발명에 따른 일 구현예에서, 각 협막 다당류를 동일한 운반체 단백질에 접합시킬 수도 있다. 다당류의 화학적 활성화 및 이어지는 운반체 단백질에의 접합은 공지의 방법에 의해 수행될 수도 있다(미국특허 제4,673,574호, 제4,902,506호 등).
상기의 방법으로 얻어진 운반체 단백질 접합체는 다양한 방법에 의해 정제할 수도 있다. 이들 방법의 예는 농축/투석여과 공정, 칼럼 크로마토그래피 및 다층 여과를 포함한다. 정제된 접합체들은 각각을 혼합하여 본 발명의 면역원성 조성물로 제제화하고, 이를 백신으로서 사용할 수 있다. 당업계에서 인정된 방법을 사용하여 본 발명의 면역원성 조성물의 제제화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 개개의 폐렴구균 접합체를 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 제형화하여 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 비히클의 예에는, 물, 완충 식염수, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체는 링커(linker)를 추가로 포함할 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 링커로는 ADH(adipic acid dihyrazied), Beta-프로피온아미도, 니트로페닐-에틸아민, 할로알킬 할라이드, 헥산 디아민, 6-아미노카프론산 및 글리코시드 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현에 따르면, 폐렴구균 협막 다당은 링커, 예를 들어, 기능성 링커를 통해 운반체 단백질 또는 세포벽 유래 물질에 접합될 수 있다. 링커는 예를 들어, 반응성 아미노기 및 반응성 카르복실산기, 2개의 반응성 아미노기 또는 두 개의 반응성 카르복실산기를 지니는 이종이기능성 또는 동종이기능성 링커일 수 있다. 링커는 예를 들어, 4 내지 20, 4 내지 12, 5 내지 10 개의 탄소 원자를 지닐 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 세포벽 유래 물질은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcuspneumoniae)로부터 분리된 것일 수 있고, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcuspneumoniae)유래의 CWPS (Cell Wall Polysaccharide)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 세포벽 유래 물질은 상기 협막 다당류와 공유결합으로 연결된 것일 수 있으며, 본 발명의 면역원성 조성물 내에 존재하는 모든 접합체는 임의의 공지된 접합 기술에 의해 제조될 수 있다. 접합 방법은 CDAP (1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)을 이용하여 협막 다당을 활성화시켜, 시아네이트 에스테르를 형성시키는 것일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 세포벽 유래 물질은 다당류-단백질 접합체 내의 단백질과는 직접적으로 결합된 것이 아닐 수 있으며 이는 그 해당 구성성분 사이에 기타 성분이 포함될 수도 있고, 혹은 간접 연결을 위한 링커 등이 포함될 수도 있음을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질은 하기 접합 순서 중 어느 하나로 접합될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
a) 협막 다당류-운반체 단백질-세포벽 유래 물질;
b) 운반체 단백질--협막 다당류- 세포벽 유래 물질; 및
c) 협막 다당류-세포벽 유래 물질-운반체 단백질.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 세포벽 유래 물질은 운반 단백질과 직접적으로 결합하지 않은 것일 수 있다.
상기 접합 순서 a), b) 또는 c)의 각 구성성분 간에 링커를 추가적으로 포함할 수 있고, 상기 접합 순서 b)로 접합된 구조는 선형(linear) 또는 비선형(Non-linear) 중 어느 하나일 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따른 협막 다당류 또는 세포벽 유래 물질은 직접적으로 또는 링커(간접방법) 등을 통해 운반체 단백질 상의 아미노기에 접합 될 수 있다. 임의로, 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민 또는 ADH와 함께 접합되고, 아미노-유도된 협막 다당은 운반체 단백질 상의 카르복실기를 통해 카르보디이미드(예를 들어, EDAC 또는 EDC) 결합을 통해 운반체 단백질과 접합될 수 있다.
협막 다당 상의 히드록실기(임의로 활성화딘 히드록실기, 예를 들어, 시아네이트 에스테르를 제조하기 위해 활성화된 히드록실기는 단백질 상의 아미노기 또는 카르복실기에 직접적 또는 간접적(링커)으로 연결될 수 있다. 링커가 존재하는 경우, 임의로 당류 상의 히드록실기는 예를 들어, CDAP 접합을 이용하여 링커 상의 아미노기에 연결될 수 있다. 링커 내의 한 추가 아미노기 (예를 들어, ADH)는 카르보디이미드 방식을 이용하여 운반체 단백질 상의 카르복실산기에 접합 될 수 있다. 폐렴구균 협막 다당은 링커가 운반체 단백질에 접합되기 전에 먼저 링커에 접합이 이루어진다.
본 발명자들은 13가 혹은 20가 이상의 다가 백신 제작에 직접 접합 방법을 사용하기도 하였으나, 본 명세서 내에서는 세포벽 유래 물질의 영향을 비교하기 및 제작하기 위해 간접 접합 방식을 사용하였다. 간접 접합 방법에 사용된 링커는 일반적으로 사용되는 ADH (adipic acid dihyrazied)를 사용하였으며, 동일한 링커를 하여, 접합 순서와 세포벽 유래 물질의 종류를 달리 하여, 평가 하였다. 결과적으로 동일한 링커와 동일한 세포벽 유래 물질을 사용하였음에도 접합 순서에 따라 면역원성(항체가 및 기능적 항체가)에 차이를 보이는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 한 구현예에서, 협막다당을 CDAP (1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 사용하여 활성화 시킨 후, 링커를 접합하였다. (1차 물질) 그리고 CWPS(cell wall polysaccharide, 세포벽 유래 폴리사카라이드)를 CDAP으로 활성화 한 후 CRM197 운반체 단백질을 접합하였다. (2차 물질) 1차 물질과 2차 물질을 카르보디이미드 결합 방식을 사용하여 최종 접합하였다. (본 발명의 실시예 A에 해당함, 도 1)
본 발명에 따른 한 구현예에서, 협막다당을 CDAP로 활성화 시킨 후, 운반체 단백질을 접합 시켰다. (1차 물질), 그리고 CWPS를 CDAP을 사용하여 활성화 시킨 후 링커를 접합시켰다. (2차 물질) 그 다음, 1차 물질과 2차 물질을 카르보디이미드 결합 방식을 사용하여 최종 접합하였다. (본 발명의 실시예 B에 해당함, 도 1)
본 발명에 따른 한 구현예에서, CWPS을 CDAP으로 활성화시킨 후, 링커를 부착시키고, EDC 결합 방식을 사용하여 협막다당과 접합시켰다. 이후 운반체 단백질을 CDAP 활성화를 통해 아미노기를 생성하고, CWPS-링커-CPS 접합체와 운반체 단백질을 접합하였다. (본 발명의 실시예 C에 해당함, 도 1)
본 발명에 따른 구현예에서, 상기 세포벽 유래 물질은 LTA (Lipoteichoic acid), PS (Polysaccharide) CPS (Capsular Polysaccharide), PG (Peptidoglycan), LPS (Lipopolysaccharide) MDP (Muramyl Dipeptide), MTP (Muramyl tripeptide) 및 PC (Phosphatidyl Choline)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을상기 방식으로 접합하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질 내 접합 방법은 CDAP 접합 방법, 리덕티브 아미네이션 방법 및 티올-말레마이드(Thiol-Malemide) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 접합 순서 a)는 하기 단계를 포함할 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 접합 순서 b)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 세포벽 유래 물질에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 협막 다당류와 연결하는 단계;
ii) 운반체 단백질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
또한, 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 접합 순서 b) 가 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 운반체 단백질과 연결하는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
아울러, 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 접합 순서 c)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물은 구성성분으로서 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 정의되는 '애주번트'는 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증가시키는데 사용되는 물질이다. 따라서, 애주번트는 종종 면역 반응을 부스터하기 위하여 제공되고 당업자에게 잘 알려져 있다. 조성물의 유효성을 증가시키기에 적당한 애주번트는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다:
본 발명에 따른 특정 구현예에서, 알루미늄 염이 애주번트로서 사용될 수있다. 상기 알루미늄 염은 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이드록사이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 그 형태로는 알루미늄-침전 백신(alum-precipitated vaccine)이거나 알루미늄-흡착 백신(alum-adsorbed vaccine)일 수도 있다. 알루미늄 염에는 수화된 알루미나, 알루미나 수화물, 알루미나 3수화물(ATH) 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 염화 알루미늄과 인산나트륨을 1:1의 비율로 혼합하면 알루미늄 히드록시포스페이트 설페이트가 침전된다. 믹서(High shear mixer)를 이용하여 침전물의 크기가 2~8㎛이 되도록 한 다음 생리식염수로 투석하고 멸균하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 특정 일 구현예에서, 상업적으로 이용가능한 Al(OH)3(예를 들어 알하이드로겔 또는 Superfos)를 사용하여 단백질을 흡착할 수 있다. 수산화알루미늄 1 mg당 50~200g의 단백질이 흡착될 수 있으며 이 비율은 단백질의 pI와 용매의 pH에 의존적이다. 낮은 pI의 단백질은 높은 pI를 가진 단백질에 비해 강하게 결합할 수 있다. 알루미늄 염은 2~3주간 서서히 항원을 방출하는 항원 저장소를 형성하여 비특이적으로 대식세포, 보체, 선천성 면역 메커니즘을 활성화시킨다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 0.1 내지 100 ㎍ 용량의 다당류를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 접합체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학 조성물(예를 들어, 백신 제제)을 제공한다.
본 발명에 따른 백신 제제는, 전신 또는 점막 경로로 투여함으로써, 폐렴구균에 감염되기 쉬운 사람을 보호 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 정의되는 '유효량'이란 폐렴구균에 감염될 확률 또는 감염의 심각성을 상당히 감소시킬 수 있을 정도의 항체를 유발하는데 필요한 투여량을 말한다. 투여에는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구강/소화관, 기도관 또는 비뇨생식관으로의 점막 투여가 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 폐렴 또는 중이염의 치료를 위하여 비내 투여가 사용되며, 이는 폐렴구균의 비인두 보균을 보다 효과적으로 예방하여, 초기 단계에서 감염을 약화시킬 수 있기 때문이다.
각 백신 용량에서 상기 접합체의 양은, 상당한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로 선택된다. 이러한 양은 폐렴구균의 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 각 용량은 0.1 내지 100 ㎍, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎍, 더욱 바람직하게는 1 내지 5㎍의 다당류를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 백신에 대한 성분의 최적량은 피험자에서 적당한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해서 확인될 수 있다. 예를 들어 동물실험 결과를 외삽하여 사람을 대상으로 한 백신접종 용량을 결정할 수 있다. 또한 경험적으로 용량을 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 2 ㎍의 각 당류, 협막다당 혈청형 4 ㎍; 약 34 ㎍의 CRM197 운반체 단백질; 세포외 유래 물질 2 ㎍; 0.125 mg의 알루미늄 원소(0.5 mg의 알루미늄 포스페이트) 애주번트; 및 부형제로서 염화나트륨 및 나트륨 석시네이트 완충액을 함유하도록 제제화된 면역원성 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 보존제 없이 단일 용량 주사기 속에 충전될 수 있다. 진탕하고 나면, 즉시 근육 내 투여할 수 있는 균질한 백색 현탁액의 백신이 된다.
본 발명의 조성물은 단회 투여 용량 바이알, 다회 투여 용량 바이알 또는 프리필드시린지 형태로 제제화할 수 있다.
본 발명의 제제(Formulation)은 계면활성제를 포함할 수 있으며, Tween 80 또는 Span 85와 같은 계면활성제의 혼합물을 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기의 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질은 하기 접합 순서 중 어느 하나로 접합될 수 있다.
a) 협막 다당류-운반체 단백질-세포벽 유래 물질;
b) 운반체 단백질--협막 다당류- 세포벽 유래 물질; 및
c) 협막 다당류-세포벽 유래 물질-운반체 단백질.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 접합 순서 a), b), 또는 c)의 각 구성성분 간에 링커를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질 내 접합 방법은 CDAP 접합 방법, 리덕티브 아미네이션 방법 및 티올-말레마이드(Thiol-Malemide) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 접합 순서 a) 는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 접합 순서 b) 는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
i) 세포벽 유래 물질에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 협막 다당류와 연결하는 단계;
ii) 운반체 단백질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
또한, 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 접합 순서 b) 가 하기 단계를 포함하는 방법으로도 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 운반체 단백질과 연결하는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
아울러, 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 접합 순서 c)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합될 수 있다.
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
본 발명에서 인용된 문헌 및 본 출원인이 기출원한 한국특허출원 제 10-2020-0089019호, PCT국제출원 PCT/KR2020/009474는 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
본원에 기재된 상기 각 특징들은 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 각 특징들이 특허청구범위의 서로 다른 종속항에 기재된다는 사실은 이들이 조합되어 사용될 수 없음을 나타내는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시에는 본 발명의 설명을 위한 것이며, 이들 실시예에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1. 폐렴구균 협막 다당류의 제조 및 정제
폐렴구균 배양과 협막 다당류의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해서 수행하였다. 폐렴 구균 각 혈청형은 수탁기관(ATCC Ameircan Type Culture Collection,, US)으로부터 입수할 수 있다. 협막과 비운동성, 그람 양성, Lancet-shaped 쌍구균, 혈액한천배지에서 알파용혈현상으로 폐렴 구균을 동정하였다. 혈청형은 특정한 항혈청을 이용한 Quellung Test를 바탕으로 확인하였다.
실시예 1-1. 세포 은행 제조
19 종의 각기 다른 혈청형(1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 11A, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23F 및 35B)을 가진 폐렴구균을 수탁기관인 미국 ATCC(Ameircan Type Culture Collection,, US)로부터 입수하였다.
폐렴구균 균주를 혈액 한천배지에 도말하여 단일 콜로니를 분리하였다. 10개 이상의 단일 콜로니 중 성장이 좋은 단일 콜로니를 선정한 후 동물 유래의 성분을 포함하지 않은 액상배지에 접종하여 배양한 후 합성 글리세롤을 함유한 연구용 세포 은행(Research Cell Bank, RCB)을 제조하였다
고유의 혈청형을 가진 다당류 발현이 확인 된 연구용 세포 은행 중 바이알 1 개를 꺼내어 동물 유래의 성분을 포함하지 않은 액상배지에 세포를 증식시킨 후 합성 글리세롤을 추가하여 마스터 세포은행을 제조하였으며, 마스터 세포 은행 중 바이알 1 개를 꺼내어 동물 유래의 성분들을 포함하지 않은 액상배지에 세포를 증식시킨 후 합성 글리세롤을 추가하여 제조용 세포 은행을 제조하였다. 제조된 세포 은행은 다음 단계에서 사용하기 위해 -70℃ 이하에서 보관하여 사용하였다.
실시예 1-2. 발효 및 다당류 분리
제조용 세포 은행 중 바이알 1 개를 해동하여 동물 유래의 성분을 포함하지 않은 액상배지에 접종하여 종 발효를 시작하였다. 일정 균체 농도(Optical Density, OD600)에 도달하여 중간-지수 증식기의 종말점에 도달할 때까지 무교반 상태로 37 ± 2℃에서 종배양을 실시 하였다. 종배양에서 얻은 배양액을 동물 유래의 성분을 포함하지 않은 액상배지를 함유하는 발효기에 접종하여 주 발효(Main Fermentation)를 시작하였다.
그 다음 37 ± 2℃에서 수산화 칼륨 용액으로 배지의 pH를 조절하면서 본 배양을 실시하였다. 2 시간 마다 최적의 세포 밀도와 배지에 포함된 글루코스 농도를 측정하였다. 발효는 배지 내 글루코스가 고갈되었을 때 종료하였다.
발효가 종료된 후, 12 % 소듐 데옥시콜레이트(Sodium Deoxycholate)를 최종 0.12 %가 되도록 배양물에 1시간동안 첨가하여 세포를 용해시키고 세포에 결합된 다당류를 유리시켰다.
실시예 1-3. 협막 다당의 정제
소듐 데옥시콜레이트가 처리된 샘플에 인산을 가한 뒤, 원심 분리를 통해 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 Depth Filter에 통과시킨 다음, 농축 및 인산 완충용액으로 버퍼 교환을 진행하였다. 버퍼 교환 후, 샘플을 탄소활성탄 필터(Active Carbon Filter)에 통과시킨 다음, 하기와 같은 두 가지 방법으로 불순물 제거를 진행하였다.
17 개의 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 10A, 11A, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23F 및 35B의 경우, CTAB(Cetyltrimethylammonium Bromide)와 이온 결합이 가능하므로 CTAB 공정을 진행하였다. CTAB 처리, 원심 분리, 염화나트륨(NaCl) 및 요오드화 나트륨(NaI) 처리, 및 원심 분리 과정을 수행하였다.
CTAB와 반응하지 않는 2 개의 혈청형 7F 및 14는 인산 알루미늄겔(Algel) 용액을 첨가하여 반응시킨 다음, 원심 분리를 통해 얻어진 상층액을 사용하였다.
상기 두 가지 형태의 불순물 제거 공정을 완료한 샘플은 Depth Filter 및 한외여과(UF/DF) 공정을 거친 다음, 에탄올과 염화나트륨의 양을 조절하며 원말 형태로 만들어 보관하였다.
실시예 1-4. 협막 다당류의 용해 및 가수분해
각각의 혈청형에서 유래한 협막 다당류 원말을 최종 농도 범위가 아래 기술된 범위가 되도록 주사용수에 용해하고 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
세부적으로 혈청형 1, 3 및 4의 경우 0.8 - 2.0mg/㎖의 범위로 용해하였고, 혈청형 5, 6B, 9V, 18C 및 19F 의 경우 4 - 8mg/㎖, 혈청형 6A 및 19A는 8 - 12mg/㎖, 혈청형 7F, 10A, 11A 및 23F의 경우 2 - 4mg/㎖로 용해하여 여과를 진행하였다. 또한, 혈청형 15B, 22F 및 35B의 경우 2 - 5mg/㎖의 범위로 용해하여 여과를 진행하였다.
혈청형 별로 아래 기술된 pH 및 온도 범위에서 용액을 항온 처리하여 진행하였다. 세부적으로 혈청형 1, 3, 5, 6B, 7F, 10A, 11A, 14 및 23F의 경우 밤새 70 - 80℃, 혈청형 6A 및 19F 경우 1 - 4시간 동안 70 - 80℃, 혈청형 9V 및 18C의 경우, 인산용액을 이용하여 1 - 3 시간 동안 pH 2.0, 65 - 80℃ 에서 항온처리 과정을 수행하였다. 혈청형 22F, 23A 및 35B의 경우 밤새 75 - 85℃, 혈청형 4, 15B, 19A의 경우 가수분해를 진행하지 않았다. 그 다음 21 내지 24℃로 냉각시키고 6.0 ± 1.0의 목표 pH로 수산화 나트륨을 첨가함으로써 가수분해를 중지시켰다.
실시예 2. 폐렴구균 협막 다당류와 CRM
197
단백질 운반체의 접합 및 정제
실시예 2-1. CRM
197
단백질 운반체의 준비
CRM197 단백질 운반체는 통상적인 생산 공정을 통해 준비하였다. 코리네박테리움 디프테리아 (ATCC 39255) 의 동결건조 시들 종균배지가 들어 있는 튜브에 접종한 후 36℃에서 48시간 배양 하였다. 배양 후 표면에 자란 디프테리아 균체를 그램 염샘하여 오염여부를 확인 하고, 본 배양 배을 수행하였다. 배양액을 여과한 후, TFF system을 이용하여 1차 정제를 하였고, 황산암모늄을 이용하여 침전시키는 과정을 반복하였다. 이 후, Capto Q (Anion exchange chromatography)를 통해 불순물을 정제하였고, 제형 조성을 포함한 버퍼를 이용하여 final TFF를 수행하여 CRM197 단백질 운반체를 준비하였다.
실시예 2-2. 협막 다당류와 CRM
197
의 직접 접합
모든 혈청형에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2 M NaCl 다당류 용액을 제조하였다. 각 혈청 별로 적절한 CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate)를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 세부적으로 혈청형 6A 및 14의 경우 다당 대비 CDAP 1 w/w%를, 혈청형 4의 경우 2 w/w%를, 혈청형 1, 3, 6B, 7F 15B 및 19A의 경우 3 w/w%를, 그 외 혈청형의 경우 4 w/w%의 무게비율로 용해하고 각각의 다당류 용액에 첨가하였다. 이어, 1 내지 3 분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내지 9.7로 상승시킨 후 다당류의 하이드록실기가 CDAP에 의해 충분히 활성화될 수 있도록 3 내지 7 분 동안 교반하였다. 다당 대비 CRM197 0.5 - 1.0 w/w%를 각 혈청형 다당 용액에 첨가하여 1 시간 내지 4 시간 동안 접합반응을 진행하였으며 HPLC-SEC을 이용하여 반응 전환율을 측정하였고 필요에 따라 CDAP를 추가 투입하였다.
실시예 2-3. 접합 반응 종료
모든 혈청형에 대해 첨가한 CDAP 1 몰 당량 대비 3 내지 6 몰 당량의 글리신 용액을 첨가하고 pH를 9.0으로 조정하여 반응을 종결하였다. 접합 용액을 21 내지 24℃에서 1시간 교반한 후 2 내지 8℃ 저온에서 밤새 보관하였다.
실시예 2-4. 한외 여과
희석된 접합 혼합물을 최소 20 용적의 완충액을 사용하여 한외여과필터에 농축 및 투석 여과시켰다. 여기서 완충액은 pH 5.5 내지 6.5의 범위를 유지하며, 0.9 % 염화나트륨을 포함한 완충액을 사용하였다. 한외여과필터의 분획 분자량은 모든 혈청형에서 300 kDa을 사용하여 실시하였고, 투과액은 폐기하였다.
실시예 2-5. 제균 여과
투석 여과 후의 잔류액을 완충액을 이용하여 다당함량 농도 기준으로 0.4 g/L 미만이 되도록 희석하여 0.22 ㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 여과된 산물에 대해 제조과정 중 제어 (당류 함량, 잔류 DMAP)를 실시하였다. 여과시킨 잔류액에 대해 제조과정 중 제어를 실시하여 추가적인 농축, 투석 여과 및/또는 희석이 필요한지의 여부를 결정하였다.
실시예 3. 폐렴구균 협막 다당류, CRM
197
운반체 단백질 및 세포벽 유래 물질의 접합 및 정제
실시예 3-1. 세포벽 유래 물질
Cell wall polysaccharide(CWPS, cat No. 3549)와 Lipo-teichoic acid (LTA, F-antigen, Cat No. 88840)는 SSI Diagnostica 업체로부터 구입 하였다.
실시예 3-2. 협막 다당류와 CRM
197
의 접합
모든 혈청형에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 다당류 용액을 제조하였다. 각 혈청 별로 적절한 CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate)를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 세부적으로 혈청형 6A 및 14의 경우 다당 대비 CDAP 1 w/w%를, 혈청형 4의 경우 2 w/w%를, 혈청형 1, 3, 6B, 7F 15B 및 19A의 경우 3 w/w%를, 그 외 혈청형의 경우 4 w/w%의 무게비율로 용해하고 각각의 다당류 용액에 첨가하였다. 이어, 1 내지 3 분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내지 9.7로 상승시킨 후 다당류의 하이드록실기가 CDAP에 의해 충분히 활성화될 수 있도록 3 내지 7 분 동안 교반하였다. 다당 대비 CRM197 0.5 - 1.0 w/w%를 각 혈청형 다당 용액에 첨가하여 1 시간 내지 4 시간 동안 접합반응을 진행하였으며 HPLC-SEC을 이용하여 반응 전환율을 측정하였고 필요에 따라 CDAP를 추가 투입하였다.
실시예 3-3. 세포벽 유래 물질의 접합
모든 혈청형에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 다당류 용액을 제조하였다. 각 혈청 별로 적절한 CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate)를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 세부적으로 혈청형 6A 및 14의 경우 다당 대비 CDAP 1 w/w%를, 혈청형 4의 경우 2 w/w%를, 혈청형 1, 3, 6B, 7F 15B 및 19A의 경우 3 w/w%를, 그 외 혈청형의 경우 4 w/w%의 무게비율로 용해하고 각각의 다당류 용액에 첨가하였다. 이어, 1 내지 3 분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내지 9.7로 상승시킨 후 다당류의 하이드록실기가 CDAP에 의해 충분히 활성화될 수 있도록 3 내지 7 분 동안 교반하였다. 다당 대비 CRM197 0.5 - 1.0 w/w%를 각 혈청형 다당 용액에 첨가하여 1 시간 내지 4 시간 동안 접합반응을 진행하였으며 HPLC-SEC을 이용하여 반응 전환율을 측정하였고 필요에 따라 CDAP를 추가 투입하였다.
실시예 3-4. 접합 종료 및 여과
접합체의 접합 반응 종료 여과는 상기 직접 접합을 하는 방식과 동일하게 수행하였다.
실시예 4. 폐렴구균-운반체 단백질 접합체 및 신규한 세포벽 유래 물질 포함 접합체의 특성
실시예 4-1. 세포벽 유래 물질
Cell wall polysaccharide(CWPS, cat No. 3549)와 Lipo-teichoic acid (LTA, F-antigen, Cat No. 88840)는 SSI Diagnostica 로부터 구입을 하였다.
실시예 4-2. A 형태의 접합 (CWPS-CRM
197
-ADH-CPS 3)
폐렴구균 협막다당 혈청형 3(CPS 3)에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 용액을 제조하였다. CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate)를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후, 7 분 후에 ADH (adipic acid dihydrazide, 링커)를 다당 대비 10 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 6-8 kDa dialysis sack 을 사용하여 PBS buffer (pH 7.4)하에서 정제하여 CPS 3-ADH 접합체를 얻었다.
CWPS(cell wall polysaccharide, 세포벽 유래물질)에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 용액을 제조하였다. CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 CRM197를 CWPS 대비 1 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 첨가한 CDAP과 같은 양의 2M glycine를 첨가하고 1시간 교반 후 필터하여 CWPS-CRM197 접합체를 얻었다.
CPS 3-ADH 접합체에 CWPS-CRM197 접합체를 무게 대비 1.5 w/w % 비율로 첨가한 후, EDC.HCl (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 용액을 (20 mg/mL in 0.1M Tris HCl pH 7.5)) Pn 3-ADH 접합체 대비 1 w/w% 비율로 첨가하였다. 0.1M HCl 용액을 첨가하여 pH 5로 낮춘 후, 상온에서 2시간 교반하였다. 그 후, 1M Tris HCl 용액을 첨가하여 pH 7로 상승시킨 후 상온에서 30분 교반 후, 탄젠셜 플로우 필터레이션 시스템으로 정제하여 CWPS-CRM197-ADH-CPS 3 접합체를 얻었다.
실시예 4-3. B 형태의 접합 (CWPS-ADH-CPS 3-CRM
197
)
CWPS(cell wall polysaccharide, 세포벽 유래물질)에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 용액을 제조하였다. CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 ADH를 다당 대비 10 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 6-8 kDa dialysis sack 을 사용하여 PBS buffer (pH 7.4)하에서 정제하여 CWPS 3-ADH 접합체를 얻었다.
폐렴구균 협막다당 혈청형 3(CPS 3)에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 용액을 제조하였다. CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 CRM197를 다당 대비 1 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 첨가한 CDAP과 같은 양의 2M glycine를 첨가하고 1시간 교반 후 필터하여 CPS 3-CRM197 접합체를 얻었다
CWPS-ADH 접합체에 CPS 3-CRM197 접합체를 무게 대비 1.5 w/w % 비율로 첨가한 후, EDC.HCl 용액(20 mg/mL in 0.1M Tris HCl pH 7.5)을 CWPS-ADH 접합체 대비 1 w/w% 비율로 첨가하였다. 0.1M HCl 용액을 첨가하여 pH 5로 낮춘 후, 상온에서 2시간 교반하였다. 그 후, 1M Tris HCl 용액을 첨가하여 pH 7로 상승시킨 후 상온에서 30분 교반 후, 탄젠셜 플로우 필터레이션 시스템으로 정제하여 CWPS-ADH-CPS 3-CRM197 접합체를 얻었다.
실시예 4-4. C 형태의 접합 (CWPS-ADH-CPS 3-CRM
197
)
CWPS(cell wall polysaccharide, 세포벽 유래물질)에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 용액을 제조하였다. CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 ADH를 다당 대비 10 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 6-8 kDa dialysis sack 을 사용하여 PBS buffer (pH 7.4)하에서 정제하여 CPS 3-ADH 접합체를 얻었다. CWPS-ADH 접합체에 폐렴구균 협막다당 혈청형 3(CPS 3)를 무게 대비 1.5 w/w % 비율로 첨가한 후, EDC.HCl 용액을 (20 mg/mL in 0.1M Tris HCl pH 7.5)) CWPS-ADH 접합체 대비 1 w/w% 비율로 첨가하였다. 0.1M HCl 용액을 첨가하여 pH 5로 낮춘 후, 상온에서 2시간 교반하였다. 그 후, 1M Tris HCl 용액을 첨가하여 pH 7로 상승시킨 후 상온에서 30분 교반 후, 탄젠셜 플로우 필터레이션 시스템으로 정제하여 CWPS-ADH-CPS 3 접합체를 얻었다.
그 후, CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 CRM 197을 다당 대비 1 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 첨가한 CDAP과 같은 양의 2M glycine를 첨가하고 1시간 교반 후 탄젠셜 플로우 필터레이션 시스템으로 정제하여 CWPS-ADH-CPS 3-CRM197 접합체를 얻었다.
실시예 4-5. E 형태의 접합 (LTA-ADH-CPS 3-CRM
197
)
LTA (Lipo-teichoic acid, Cat No. 88840)에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 용액을 제조하였다. CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 ADH를 다당 대비 10 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 6-8 kDa dialysis sack 을 사용하여 PBS buffer (pH 7.4)하에서 정제하여 LTA-ADH 접합체를 얻었다.
폐렴구균 협막다당 혈청형 3(CPS 3)에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 용액을 제조하였다. CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 CRM197를 다당 대비 1 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 첨가한 CDAP과 같은 양의 2M glycine를 첨가하고 1시간 교반 후 필터하여 CPS 3-CRM197 접합체를 얻었다
LTA-ADH 접합체에 CPS 3-CRM197 접합체를 무게 대비 1.5 w/w % 비율로 첨가한 후, EDC.HCl 용액(20 mg/mL in 0.1M Tris HCl pH 7.5)을 CWPS-ADH 접합체 대비 1 w/w% 비율로 첨가하였다. 0.1M HCl 용액을 첨가하여 pH 5로 낮춘 후, 상온에서 2시간 교반하였다. 그 후, 1M Tris HCl 용액을 첨가하여 pH 7로 상승시킨 후 상온에서 30분 교반 후, 탄젠셜 플로우 필터레이션 시스템으로 정제하여 LTA-ADH-CPS 3-CRM197 접합체를 얻었다.
실시예 4-6. F 형태의 접합 (LTA-ADH-CPS 3-CRM
197
)
LTA (Lipo-teichoic acid, Cat No. 88840)에 염화나트륨 분말을 첨가하여 2M NaCl 용액을 제조하였다. CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 ADH를 다당 대비 10 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 6-8 kDa dialysis sack 을 사용하여 PBS buffer (pH 7.4)하에서 정제하여 LTA-ADH 접합체를 얻었다. LTA-ADH 접합체에 폐렴구균 협막다당 혈청형 3(CPS 3)를 무게 대비 1.5 w/w % 비율로 첨가한 후, EDC.HCl 용액을 (20 mg/mL in 0.1M Tris HCl pH 7.5)) LTA-ADH 접합체 대비 1 w/w% 비율로 첨가하였다. 0.1M HCl 용액을 첨가하여 pH 5로 낮춘 후, 상온에서 2시간 교반하였다. 그 후, 1M Tris HCl 용액을 첨가하여 pH 7로 상승시킨 후 상온에서 30분 교반 후, 탄젠셜 플로우 필터레이션 시스템으로 정제하여 LTA-ADH-CPS 3 접합체를 얻었다.
그 후, CDAP를 50/50 아세토니트릴/주사용수 (v/v) 용액 100 ㎖ 당 CDAP 1 g의 비율로 용해하였다. 다당 대비 CDAP 10 w/w %의 무게 비율로 용해하고 3분 후 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH 9.4 내기 9.7로 상승시킨 후 7 분 후 CRM 197을 다당 대비 1 w/w %의 무게 비율로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 교반 후, 첨가한 CDAP과 같은 양의 2M glycine를 첨가하고 1시간 교반 후 탄젠셜 플로우 필터레이션 시스템으로 정제하여 LTA-ADH-CPS 3-CRM197 접합체를 얻었다.
상기에서 제작한 접합체들은 신규한 것으로서, 최종적으로 생성된 접합체 A B,C,E,F가 백신으로서 당 함량, 단백질 함량, 당/단백질 비율 및 농도 등에 문제가 없음을 아래 표 1과 같이 확인하였다. (폐렴구균 협막다당 혈청형 3(CPS 3)을 사용하여 제작함에 따라, 3A 내지 3C와 같이 기재하였음)
| 3A * | 3B * | 3C * | |
| PS titer (ug/mL) | 432.55 | 155.10 | 70.93 |
| Pr titer (ug/mL) | 816.13 | 262.88 | 161.20 |
| Ps/Pr ratio | 0.53 | 0.59 | 0.44 |
| Purity (%) | 82 | 80 | 82 |
*: 폐렴구균 협막다당 혈청형 3(CPS 3)을 사용하여 제작 하였으므로, 3A 내지 3C와 같은 방식으로 기재함
실시예 5. 혈청형 특이적 면역원성 측정
신규 세포벽 유래 물질의 접합에 따른 3번 혈청형(폐렴구균 협막다당, CPS 3)의 면역효과 확인을 위해, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 조성물을 달리하여 마우스 내 면역원성 유도 실험을 진행하였다. 6-8주령의 마우스에 2주간격으로 3회 면역을 하였고, 3회 면역 이후 2주 후 3번 혈청형 특이적인 IgG 농도와 기능적 항체가에 대한 OPA (Opsonophagocytic assay)를 측정하였다.
| Group | Name | Descriptions | Note |
| 1 | Negative control | PBS | N/A |
| 2 | Positive control (1) | Prevnar | PCV13 |
| 3 | Test group 1 (Pn_3)* | Full dose (2.2 ug) | CPS-CRM (기존 형태) |
| 4 | Test group 1 (Pn_3) | 1/4 dose (0.55 ug) | |
| 5 | Test group 2 (Pn_3A) | Full dose (2.2 ug) | CWPS-CRM197-ADH-CPS 3 |
| 6 | Test group 2 (Pn_3A) | 1/4 dose (0.55 ug) | |
| 7 | Test group 3 (Pn_3B) | Full dose (2.2 ug) | CWPS-ADH- CPS 3-CRM197 |
| 8 | Test group 3 (Pn_3B) | 1/4 dose (0.55 ug) | |
| 9 | Test group 4 (Pn_3C) | Full dose (2.2 ug) | CWPS-ADH-CPS 3-CRM197 |
| 10 | Test group 4 (Pn_3C) | 1/4 dose (0.55 ug) |
*: 이하, 폐렴구균 협막다당 3번 혈청형을 의미함
실시예 5-1. 3번 혈청형 특이 IgG 농도 ELISA 측정
각 혈청형에 대한 협막 다당류(PnPs)를 96-웰 플레이트 상에서 0.5 μg/웰(well) 내지 1 μg/웰로 피복시켰다. 등가량의 혈청을 각 대상체로부터 샘플링하고 그룹별로 모았다. 혈청 혼주물(pool)을 Tween 20 및 CWPS 5 μg/mL를 포함하는 항체 희석 완충액으로 2.5배까지 연속 희석시킨 다음 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척한 다음 예비-흡착되고 희석된 혈청 50 μl를 피복된 웰 플레이트에 첨가한 후, 실온에서 2시간 내지 18시간 동안 배양하였다. 웰 플레이트를 동일한 방식으로 세척한 다음 염소 항-마우스 IgG-알칼리성 포스파타제 접합체를 각 웰에 가한 후 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하고 기질로서 1mg/mL p-니트로페닐아민 완충액을 각 웰에 가한 다음 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 50 μl의 3 M NaOH를 첨가하여 반응을 켄칭(quenching)시키고 405 nm 및 690 nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교 실시예로서, 상업적으로 이용 가능한 13가 백신(PREVNAR13)을 동일한 과정에 적용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 PCV13 대비 Pn3C(3번 혈청형, 실시예 C)의 그룹이 약간 높은 3번 혈청형 특이적인 항체가가 발생 하였으며, Pn3A의 경우, 약간 높은 경향을 보였다. 하지만 Pn3B의 경우, 낮은 항체가를 보였다. 이는 동일한 세포벽 유래 물질인 경우에도 접합 순서와 방법에 따라 면역원성의 차이를 갖는 것을 의미한다(도 2)
실시예 5-2. 3번 혈청형 기능적 항체가 측정(OPA)
기능적 항체가는 OPA 검정으로 혈청을 시험함으로써 평가하였다. 각 균주의 농도가 약 50,000 CFU/mL로 되도록, -70℃ 이하에서 저장된 폐렴연쇄구균 MOPA 균주를 상응하는 최종 희석도로 희석시켰다. 등가량의 혈청을 각 대상체로부터 샘플링하고, 그룹별로 모으고, 20 μl의 혈청이 U-바닥 플레이트에 남도록 2배 연속 희석시켰다. 샘플을 희석한 후, 각 혈청형에 대해 제조된 10 μl의 균주를 희석된 샘플과 혼합하고, 폐렴연쇄구균과 항체가 잘 혼합되도록 혼합물을 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 예비-분화된 HL-60 세포와 보체의 혼합물을 첨가하고 CO2 배양기(37℃)에서 45분 동안 반응시켰다. 온도를 낮추어 식균 작용을 중단시키고 10 μl의 반응 용액을 30 내지 60분 동안 예비-건조된 한천 플레이트 상에 스폿팅(spotting)한 다음 건조될 때까지 20분 동안 플레이트 상에 흡수되도록 하였다. 25mg/mL TTC 스톡 용액을 제조된 오버레이 한천(overlay agar)에 첨가하고, 상응하는 균주에 적합한 항체를 이에 첨가하였다. 혼합물을 완전히 혼합한 다음 약 25 mL의 혼합물을 플레이트에 첨가하고 약 30분 동안 경화시켰다. 완전히 경화된 플레이트를 CO2 배양기(37℃)에서 12 내지 18시간 동안 배양한 다음 콜로니를 계수하였다. MOPA 역가는 50% 사멸이 관찰되는 희석률로 표현되었다. 비교 실시예로서, 상업적으로 이용 가능한, 13가 백신(PREVNAR13)을 동일한 과정에 적용하였다. 결과는 하기의 표 3 및 표 4에 나타내었다.
| 샘플명 | OI titer |
| PBS | 1 |
| PCV13 | 606 |
| Pn3 Full dose | 453 |
| Pn3 1/4 dose | 277 |
| Pn3A Full dose | 1517 |
| Pn3A 1/4 dose | 2229 |
| Pn3B Full dose | 1288 |
| Pn3B 1/4 dose | 30 |
| Pn3C Full dose | 5211 |
| Pn3C 1/4 dose | 17496 |
| 샘플명 | 샘플/PCV13 OI 역가 상대 비교 |
| PBS | 0 |
| PCV13 | 1.00 |
| Pn3 Full dose | 0.75 |
| Pn3 1/4 dose | 0.46 |
| Pn3A Full dose | 2.50 |
| Pn3A 1/4 dose | 3.68 |
| Pn3B Full dose | 2.13 |
| Pn3B 1/4 dose | 0.05 |
| Pn3C Full dose | 8.60 |
| Pn3C 1/4 dose | 28.87 |
상기 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, CWPS(세포벽 유래 물질)와 3번 혈청형을 접합한 그룹 (A-C) 모두 PCV13 대비 높은 기능적 항체가를 보였다. 특이적 항체가 (IgG) 결과와 유사하게, 접합 순서에 따라 동일한 CWPS를 접합을 하였지만 기능적 항체가에서는 차이를 보였으며, IgG와 유사하게 Pn3C 에서 PCV13 대비 8 내지 28 배 높은 기능적 항체가를 보였다. 이는 동일한 세포벽 유래 물질 의 경우에도 접합 순서와 방법에 따라 면역원성의 차이를 가짐을 기능적 항체가 실험을 통해 재 확인하였다. (표 3 및 표 4)
실시예 6. 혈청형 특이적 면역원성 측정
CWPS 이외의 세포벽 유래 물질의 접합에 따른 3번 혈청형(폐렴구균 협막다당, CPS 3)의 면역효과 확인을 위해, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 조성물을 달리하여 마우스 내 면역원성 유도 실험을 진행하였다. 6-8주령의 마우스에 2주간격으로 3회 면역을 하였고, 3회 면역 이후 2주 후 3번 혈청형 특이적인 IgG 농도를 측정하였다.
| Group | Name | Descriptions | Note |
| 1 | Negative control | PBS | N/A |
| 2 | Positive control (1) | Prevnar | PCV13 |
| 3 | Test group 1 (Pn_3)* | Full dose (2.2 ug) | CPS-CRM (기존 형태) |
| 4 | Test group 1 (Pn_3) | 1/4 dose (0.55 ug) | |
| 5 | Test group 2 (Pn_3F) | Full dose (2.2 ug) | LTA-CRM197-ADH-CPS 3 |
| 6 | Test group 2 (Pn_3F) | 1/4 dose (0.55 ug) | |
| 7 | Test group 3 (Pn_3E) | Full dose (2.2 ug) | LTA-ADH- CPS 3-CRM197 |
| 8 | Test group 3 (Pn_3E) | 1/4 dose (0.55 ug) | |
| 9 | Test group 4 (Pn_3C) | Full dose (2.2 ug) | CWPS-ADH-CPS 3-CRM197 |
| 10 | Test group 4 (Pn_3C) | 1/4 dose (0.55 ug) |
*: 이하, 폐렴구균 협막다당 3번 혈청형을 의미함
실시예 6-1. 3번 혈청형 특이 IgG 농도 ELISA 측정
3번 혈청형에 대한 IgG ELISA 분석은 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 진행하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 PCV13 대비 Pn3C(3번 혈청형, 실시예 C)의 그룹이 유사한 수준의 IgG 역가가 확인되었다. 하지만 동일한 접합 방법을 사용하고, 다른 세포벽 유래 물질인 LTA를 접합한 Pn3F의 경우, Pn3c 그룹보다 full dose에서 낮은 항체가를 확인되었다. 실시예 5에서 낮은 항체가를 보인 Pn3B와 동일한 접합 방법을 사용하고, LTA로 접합한 Pn3F의 경우, 상대적으로 낮은 항체가를 보였다. 이는 동일한 접합 순서 및 방법으로 제조되었음에도 불구하고 다른 세포벽 유래 물질을 접합함에 따라 항체가의 차이를 갖는 것을 보여준다.(도 3)
실시예 7. 19가 폐렴구균 백신의 면역원성
상기 실시예에서 제조한 각각의 폐렴구균 백신 조성물이 마우스 내에서 면역 반응 유도 능력을 가지는지 여부를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. Pn3(3번 혈청형)가 포함된 PCV19 제형과 Pn3에 CWPS를 접합한 PCV19 제형을 비교하고자 하였고, 대조군으로 프리베나13®을 면역하여 채취한 혈액 샘플을 같이 분석하였다.
실시예 7-1. 혈청형 특이 IgG 농도 ELISA 측정
상기 실시예 3에서 제조한 각각의 폐렴구균 백신 조성물이 마우스에서 면역 반응을 유도하는지 여부를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 면역원성은, 항원-특이적 ELISA를 통해 혈청 IgG 농도를 측정하여 확인하였다.
실험군을 제외하고 실시예 4-1에서와 동일한 방식으로 본 실험을 수행하였으며, 그 결과를 아래 표 6에 나타내었다. 하기 표에 기재된 'Prevnar13' 및 'PCV19-CRM197(Naive)'은 구체적으로 협막다당-CRM197 구조만을 포함하고 있는 기존 백신의 형태로써, 각각 13가 및 19가의 백신을 의미한다. 그러나 'PCV19-CRM197(CWPS Conjugate)'는 협막다당 3번 혈청형이 CWPS 및 운반체 단백질과 연결되어 있어 상기의 기존 백신 형태와 구조적 차이를 갖는다.
| 혈청형 | Prevnar13 |
PCV19-CRM
197
(Naive) |
PCV19-CRM
197
(3C conjugated) |
| 1 | + | + | + |
| 3 | + | + | + |
| 4 | + | + | + |
| 5 | + | + | + |
| 6A | + | + | + |
| 6B | + | + | + |
| 7F | + | + | + |
| 9V | + | + | + |
| 10A | N/A | + | + |
| 11A | N/A | + | + |
| 14 | + | + | + |
| 15B | N/A | + | + |
| 18C | + | + | + |
| 19A | + | + | + |
| 19F | + | + | + |
| 22F | N/A | + | + |
| 23A | N/A | + | + |
| 23F | + | + | + |
| 35B | N/A | + | + |
23A, 35B는 폐렴구균 다당 백신 (PPV, Pneumococcal polysaccharide vaccine)인 PPV23에 포함되지 않는 혈청형이며, 현재까지 폐렴백신에 사용되지 않는 혈청형으로 아시아와 유럽에 serotype replacement이후 도래한 혈청형 중 하나이다. 실험 결과, 23A, 35B가 포함된 PCV19-CRM197 모든 혈청형에 대해 우수한 수준의 혈청형 특이 IgG 농도를 갖는 것을 확인하였다. 3번 혈청형에 CWPS를 접합한 제형의 경우, PCV13 및 PCV19(naive)-CRM 대비, 유사한 수준의 항체가 형성을 확인하였다. PREVNAR13과 공통인 혈청형은 PREVNAR13과 유사하고, 추가된 혈청형 10A, 11A, 15B, 22F, 그리고 23A, 35B 각각 또한 우수한 수준의 혈청형 특이 IgG 농도를 보여주었다. (표 6, 도 4)
실시예 7-2. 기능적 항체가 (OPA)
상기 실시예 3에서 제조한 각각의 폐렴구균 백신 조성물이 마우스에서 면역 반응 유도 능력을 가지는지 여부를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 이러한 면역원성은 기능적 항체가 (OPA)를 통해 측정하였다. 실험군을 제외하고 실시예 4-1에서와 동일한 방식으로 측정하였으며, 그 결과는 아래 표 7에 나타내었다.
| 혈청형 | Prevnar13 |
PCV19-CRM
197
(Naive) |
PCV19-CRM
197
(3C conjugated) |
| 1 | + | + | + |
| 3 | + | + | + |
| 4 | + | + | + |
| 5 | + | ++ | ++ |
| 6A | + | + | + |
| 6B | + | + | + |
| 7F | + | + | + |
| 9V | + | + | + |
| 10A | N/A | ++ | ++ |
| 11A | N/A | ++ | ++ |
| 14 | + | + | + |
| 15B | N/A | + | + |
| 18C | + | + | + |
| 19A | + | + | + |
| 19F | + | + | + |
| 22F | N/A | +++ | +++ |
| 23A | N/A | ++ | ++ |
| 23F | + | + | + |
| 35B | N/A | + | + |
23A, 35B는 폐렴구균 다당 백신 (PPV, Pneumococcal polysaccharide vaccine)인 PPV23에 포함되지 않는 혈청형이므로 항생제 내성 균주가 존재하지 않는다. 이에 항생제 내성균주를 제작하여 MOPA 분석에 사용하였으며, 내성균주의 제작은 UAB항생제 내성 균주 제조방법(MOPA protocol)에 근거하여 진행하였고, 제작 후 균주 특성화 분석 및 동정을 통해 각 23A, 35B 혈청형의 특성을 확인하였다.
실험 결과, 10A, 11A, 15B, 22F, 23A, 35B가 포함된 PCV19-CRM197 (naive), PCV19-CRM197 (CWPS conjugate)의 모든 혈청형에 대해 우수한 수준의 혈청형 기능적 항체가가 확인되었다. PREVNAR13에 공통인 혈청형은 PREVNAR13과 유사한 수준의 기능적 항체가를 보였으며 새로 추가된 혈청형 10A, 11A, 15B, 22F, 그리고 23A, 35B 각각 또한 우수한 수준의 기능적 항체가를 보였다. 특히 CWPS를 접합한 PCV19 (3C Conjugated) 그룹에서는 3번 혈청형이 PCV13과 PCV19 (naive) 그룹과 유사한 수준의 기능적 항체가를 보였으며, 신규 접합 및 혈청형 증가에 의한 간섭효과가 PCV19 (na
ve) 및 PCV19 (3C conjugated) 그룹에서 확인되지 않았다. (표 7, 도 5) CWPS를 접합한 단가 실험에서는 navie 접합 형태 비해, 월등히 높은 항체가와 기능적 항체가가 확인되었지만, 다가 (PCV19) 실험에서는 유사한 수준의 기능적 항체가가 확인되었다.
Claims (37)
- 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 협막 다당류는
혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 10A, 11A, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23F 및 35B 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류를 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 협막 다당류는
혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류를 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 협막 다당류는
혈청형 3, 6A, 6B, 19A 및 19F로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류를 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제3항 또는 제4항에 있어서,
스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 운반체 단백질의 접합체를 추가로 포함하며,
상기 협막 다당류는
혈청형 10A, 11A, 15B, 22F, 23A 및 35B로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서,
스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 운반체 단백질의 접합체를 추가로 포함하며,
상기 협막 다당류는
혈청형 1, 4, 5, 7F, 9V, 14, 18C 및 23F로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 혈청형의 협막 다당류임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체는 운반체 단백질을 추가로 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체는 링커(linker)를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 세포벽 유래 물질은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 분리됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 세포벽 유래 물질은 상기 협막 다당류와 공유결합으로 연결됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 세포벽 유래 물질은 LTA (Lipoteichoic acid), CWPS (Cell Wall Polysaccharide), CPS (Capsular Polysaccharide), PG (Peptidoglycan), LPS (Lipopolysaccharide) MDP (Muramyl Dipeptide), MTP (Muramyl tripeptide) 및 PC (Phosphatidyl Choline)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 세포벽 유래 물질은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 CWPS (Cell Wall Polysaccharide)임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 운반체 단백질은 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 대장균 유래 불화성화 독소, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래 불활성화 독소 및 세균 외막 단백질(OMP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제13항에 있어서,
상기 디프테리아 톡소이드는 CRM197, CRM173, CRM228 및 CRM45 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 링커는 ADH (adipic acid dihyrazied), Beta-프로피온아미도, 니트로페닐-에틸아민, 할로알킬 할라이드, 헥산 디아민, 6-아미노카프론산 및 글리코시드 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질은 하기 접합 순서 중 어느 하나로 접합된 구조임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물:
a) 협막 다당류-운반체 단백질-세포벽 유래 물질;
b) 운반체 단백질-협막 다당류- 세포벽 유래 물질; 및
c) 협막 다당류-세포벽 유래 물질-운반체 단백질.
- 제16항에 있어서,
상기 세포벽 유래 물질은 운반 단백질과 직접적으로 결합하지 않음을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제16항에 있어서,
상기 접합 순서 a), b), 또는 c)의 각 구성성분 간에 링커를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제16항에 있어서,
상기 접합 순서 b)로 접합된 구조는 선형(linear) 또는 비선형(Non-linear) 중 어느 하나임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물
- 제16항에 있어서,
상기 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질 간 접합 방법은 CDAP 접합 방법, 리덕티브 아미네이션 방법 및 티올-말레마이드(Thiol-Malemide) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제16항에 있어서,
상기 접합 순서 a)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물:
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
- 제16항에 있어서,
상기 접합 순서 b)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물:
i) 세포벽 유래 물질에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 협막 다당류와 연결하는 단계;
ii) 운반체 단백질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
- 제16항에 있어서,
상기 접합 순서 b)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물:
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 운반체 단백질과 연결하는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
- 제16항에 있어서,
상기 접합 순서 c)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물:
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
- 제1항에 있어서,
애주번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제25항에 있어서,
상기 애주번트는 알루미늄 염임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제26항에 있어서,
상기 알루미늄 염은 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이드록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 0.1 내지 100 ㎍ 용량의 다당류를 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당류 접합체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학 조성물.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
- 제30항에 있어서,
상기 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당류(capsular polysaccharide)와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질은 하기 접합 순서 중 어느 하나로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법:
a) 협막 다당류-운반체 단백질-세포벽 유래 물질;
b) 운반체 단백질-협막 다당류-세포벽 유래 물질; 및
c) 협막 다당류-세포벽 유래 물질-운반체 단백질.
- 제31항에 있어서,
상기 접합 순서 a), b), 또는 c)의 각 구성성분 간에 링커를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
- 제31항에 있어서,
상기 협막 다당류와 세포벽 유래 물질의 접합체와 운반체 단백질 내 접합 방법은 CDAP 접합 방법, 리덕티브 아미네이션 방법 및 티올-말레마이드(Thiol-Malemide) 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
- 제31항에 있어서,
상기 접합 순서 a)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법:
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
- 제31항에 있어서,
상기 접합 순서 b)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법:
i) 세포벽 유래 물질에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 협막 다당류와 연결하는 단계;
ii) 운반체 단백질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 운반체 단백질의 히드록실기 또는 아미노기와 연결하는 단계.
- 제31항에 있어서,
상기 접합 순서 b)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법:
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 운반체 단백질과 연결하는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여 이를 활성화시키는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
- 제31항에 있어서,
상기 접합 순서 c)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 접합됨을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법:
i) 협막 다당류에 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트)를 가하여 이를 활성화시키는 단계;
ii) 세포벽 유래 물질에 CDAP를 가하여, 운반체 단백질과 연결하는 단계; 및
iii) 상기 i)의 협막 다당류를 상기 ii)의 세포벽 유래 물질과 연결하는 단계.
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