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CN118561999A - 抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体、抗体对及其应用 - Google Patents

抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体、抗体对及其应用 Download PDF

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CN118561999A CN202410839174.0A CN202410839174A CN118561999A CN 118561999 A CN118561999 A CN 118561999A CN 202410839174 A CN202410839174 A CN 202410839174A CN 118561999 A CN118561999 A CN 118561999A
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Abstract

本发明属于抗体技术领域，尤其涉及抗人粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子抗体、抗体对及其应用。所述抗体为第一抗体或第二抗体，第一抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示；第二抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13‑15所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18‑20所示。本发明提供了对人GM‑CSF特异性好、亲和力高的抗体，可以有效提高免疫检测结果的准确性、可靠性和灵敏度，为检测GM‑CSF蛋白水平提供了更为精准、可靠的抗体工具。

Description

抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体、抗体对及其应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，特别涉及抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体、抗体对及其应用。
背景技术
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)，也称为集落刺激因子2(CSF-2)，是一种具有多效性细胞因子功能的单体糖蛋白，分子量30kDa，由各种激活的免疫、间充质和上皮类型细胞分泌，并以可变糖基化的单体形式循环。在生理稳态下，GM-CSF诱导髓系干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞，单核细胞离开循环并迁移到组织中，成熟为巨噬细胞和树突状细胞。GM-CSF还能充当中性粒细胞和树突状细胞的趋化剂，刺激成熟的粒细胞和巨噬细胞活化，增强对细菌的吞噬、杀伤能力，从而增强机体的免疫防御功能。此外，它还能促进造血干细胞的增殖、分化，增加血细胞数量(包括白细胞、红细胞和血小板)，提高相关细胞的存活和功能，并在组织修复、血管生成以及调节适应性免疫反应中发挥作用。
在许多病理情况下，GM-CSF的表达和活性异常升高，这可能导致或加剧炎症反应和自身免疫疾病。在炎症反应过程中，GM-CSF主要由致病性T细胞(主要是Th1)产生，T细胞来源的GM-CSF通过刺激巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞分泌IL-1和IL-23等介导炎症发生，IL-1和IL-23又促进T细胞进一步分泌GM-CSF，从而形成一个信号强化回路。此外，T细胞产生的GM-CSF还可作为"信使"，促进巨噬细胞极化为促炎的M1表型来增强炎症反应。研究表明，GM-CSF的促炎效应参与了一系列炎症性疾病，例如，在类风湿性关节炎(RA)患者中，关节滑液中的GM-CSF水平显著升高，GM-CSF促进滑膜组织中的单核细胞分化为炎症性树突细胞，并诱导Th1细胞产生IL-17等促炎因子，促进疾病进展，且GM-CSF水平与疾病的活动性和严重程度有关。因此，评估GM-CSF浓度对于理解炎性疾病的发展进程、实施精准诊断、评估病情以及预测患者预后具有核心价值。
在健康个体的血清中，GM-CSF自然含量极低，通常以pg/mL计量，这一微小的基线水平增加了测量生物样本中该指标的难度。因此，研发一种能高灵敏度检测人血清中GM-CSF含量的方法显得极为迫切和重要。目前多使用酶联免疫吸附法、免疫荧光法等测定GM-CSF水平，不同方法都需要针对GM-CSF的特异性单克隆抗体。兔单克隆抗体在亲和力、特异性、抗原表位覆盖以及人源抗原交叉反应性等方面的显著优势，使其在免疫检测试剂中成功弥补了鼠单克隆抗体的局限性。然而，目前尚未有针对GM-CSF的高性能抗体。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对人GM-CSF蛋白特异性好、亲和力高的兔源单克隆抗体，用于免疫检测时可以有效提高免疫检测结果的准确性、可靠性和灵敏度，为科学研究、临床诊断与治疗监测GM-CSF蛋白水平提供了更为精准、可靠的抗体工具。本发明还提供了前述抗体和抗体对在制备人GM-CSF检测试剂或试剂盒中的应用，并提供了含有前述抗体和抗体对的检测试剂或试剂盒。本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体，选自第一抗体或第二抗体，其中：所述第一抗体轻链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.3-5所示，重链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；所述第二抗体轻链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18-20所示。
进一步地，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
进一步地，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
进一步地，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv或sc(Fv)2。
本发明第二方面提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体或第二抗体。
进一步地，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
进一步地，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
本发明第三方面提供了一种抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。
本发明第四方面提供了如上所述的抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体或抗体对在制备人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明第五方面提供了一种人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子检测试剂或试剂盒，包括如上所述的抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体或抗体对。
进一步地，所述检测试剂或试剂盒为双抗夹心法酶联免疫检测试剂或试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，且所述第一抗体作为捕获抗体，修饰有检测标记的所述第二抗体作为检测抗体。
与现有技术相比，本发明的优点及积极效果为：
1、本发明的第一抗体和第二抗体对人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)具有超高的亲和力、良好的特异性、高度的专一性，用于免疫检测时可以有效避免假阳性或假阴性结果，提高免疫检测结果的准确性、可靠性和灵敏度，为科学研究、临床诊断与治疗监测GM-CSF蛋白水平提供了更为精准、可靠的抗体工具。
2、本发明的第一抗体和第二抗体可以识别人GM-CSF蛋白的不同抗原表位，以二者配对建立双抗体夹心酶联免疫吸附检测体系，对人GM-CSF的检测限低至0.01pg/mL，可实现待检样本中衡量人GM-CSF蛋白的高精度、高特异性和高灵敏性检测，在临床诊断和科研应用上具有重要意义且具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。
图1为本发明实施例1构建兔源单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为携带轻链恒定区和重链恒定区的pBR322载体图谱；
图2为本发明实施例2单克隆抗体1G1与人GM-CSF蛋白结合的亲和力曲线图；
图3为本发明实施例2单克隆抗体8H9与人GM-CSF蛋白结合的亲和力曲线图；
图4为本发明实施例3基于单克隆抗体1G1和8H9建立的双抗体夹心酶联免疫吸附体系检测人GM-CSF蛋白的标准曲线；
图5为本发明实施例4基于兔单克隆抗体1G1和8H9建立的双抗体夹心酶联免疫吸附体系的特异性测定结果图；
图6为本发明实施例5基于兔单克隆抗体1G1和8H9建立的双抗体夹心法酶联免疫吸附体系的热稳定性测定结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式做出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B以及(iii)A和B。术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，应该理解这样的使用在适当情况下可以互换。
术语“单克隆抗体”、“抗体”和“单抗”等类似词语具有相同含义，可互换使用，如非特殊说明，在本发明中均指特异性结合人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的兔源抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区来源于兔源免疫球蛋白序列。术语“人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”、“Human GM-CSF”等类似词语具有相同含义，可以互换使用。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。抗体片段可以是全长抗体的一个或多个部分或片段，保留该抗体与目标抗原特异性结合的能力。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(frameworkregion，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
抗体片段是全长抗体的一个或多个部分或片段，基本上保持与全长形式具有相同的生物学功能或活性，具体而言，抗体片段至少包括与全长抗体相同的CDR区，更优选地具有相同的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2，这些抗体片段可通过本领域的常规技术获得。
(i)Fab：抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和第一恒定区)构成的单价片段，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc'片段。F(ab')2片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备scFv一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构。
(ii)F(ab)2：包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab构成的双价片段。
(iii)Fv：可变片段(Fv)位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整抗体。
(iv)(Fv)2：由两个共价连接在一起的Fv片段构成。
(v)scFv：单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)是由单一多肽链构成的Fv片段，由一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)通过柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接构成。
术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能自然发生的少量突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，对抗原上的相同或基本相同的表位显示出单一的结合特异性和亲和力。修饰词“单克隆”表明抗体是从一个基本同质的抗体群体中获得的，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。该抗体可以通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的和优点更为明显易懂，下面对本发明具体实施方式做详细说明。
本发明一实施例提供了一种抗人GM-CSF抗体，选自第一抗体或第二抗体，所述第一抗体和所述第二抗体均包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，分别命名为CDR1、CDR2和CDR3；其中：
所述第一抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
所述第二抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。
本发明提供的兔源抗体对人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)具有超高的亲和力、良好的特异性、高度的专一性，能够高效结合人GM-CSF蛋白，为科学研究、临床诊断与治疗监测GM-CSF蛋白提供了更为精准、可靠的抗体工具，将本发明的抗体用于免疫检测生物样本中GM-CSF蛋白能够显著提升检测结果准确性、灵敏性、稳定性和可靠性，减少假阴性或假阳性结果。而且，本发明提供的两株抗体识别人GM-CSF蛋白表面的不同抗原表位，以第一抗体作为捕获抗体、第二抗体作为检测抗体构建双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)检测体系，对人GM-CSF的检测限低至0.01pg/mL，可实现待检样本中痕量人GM-CSF蛋白的高精度、高特异性和高灵敏性检测，在临床诊断和科研应用上具有重要意义且具有良好的应用前景。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。所述第一抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述第二抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
可选地，所述第一抗体和所述第二抗体还包括轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)，各抗体CL和VL构成轻链(FL)，CH和VH构成重链(FH)。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。具体地，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
可选地，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体(具有典型的Y型分子结构)或为所述全长抗体的抗原结合区域；该抗原结合区域是指基本上保持与抗体全长形式具有相同生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗原结合区域包括如上所述的CDR区，更优选地具有如上所述的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。可选地，所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv和sc(Fv)2中的至少一种。这些抗原结合区域可通过本领域的常规技术获得。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
核酸分子可以是DNA形式(如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。
核酸分子的序列依据抗体AA序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。将所得核酸分子插入表达载体内，然后导入宿主细胞，并在特定条件下培养，即可表达获得抗体。
示例性地，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
示例性地，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
构建重组载体的原始载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒(例如pBR322、pUC系列、pET系列、pGEX系列)、病毒载体、噬菌体(例如λgt4λB、λ-Charon、λΔz1和M13)、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件以允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体。
编码本发明抗体FL与FH的核酸分子可以分别插入到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，抗体FL与FH的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2处理；也可通过显微注射、电穿孔或脂质体包装等。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电穿孔法、脂质体包装或粒子轰击等方式实现基因导入。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。可用于本发明的原核宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌(例如DH5α、JM109、BL21、W3110)、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)以及肠杆菌科菌株(例如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌)和假单胞菌属。可用于转化的真核宿主细胞的实例包括但不限于酵母、昆虫细胞和动物细胞，例如果蝇S2或Sf9细胞，哺乳动物CHO、CHO DG44、CHO-S、COS-7、293系列细胞、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK和HEK293细胞系。在获得转染或转化如上所述重组载体的宿主细胞后，在适合条件下培养，即可表达出抗体，再进行分离，得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明另一实施例提供了一种抗人GM-CS抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。
本发明的第一抗体和第二抗体结合人GM-CSF的不同抗原表位，用于开发双抗体夹心酶联免疫吸附检测体系，具有特异性高、检测灵敏度高和抗干扰能力强等优点。
本发明再一实施例提供了如上所述的抗人GM-CSF抗体或抗体对在制备人GM-CSF检测试剂或试剂盒中的应用。
所述抗人GM-CSF抗体或抗体对在制备人GM-CSF检测试剂或试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人GM-CSF抗体或抗体对相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
基于上述相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种人GM-CSF检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
需要强调的是，第一抗体和第二抗体可以分别单独使用，也可以共同使用，或者配对使用。在检测时，如分开使用或共同使用时，将第一抗体和/或第二抗体作为一抗或捕获抗体，将待检样本与本发明抗体接触，之后检测该抗体。在一些实施方案中，可以将第一抗体和/或第二抗体偶联检测标记，通过分析检测标记产生的可识别信号的变化来实现定性或定量检测GM-CSF。在另一些实施方案中，不标记抗人GM-CSF的抗体(作为一抗或捕获抗体)，而将检测标记偶联可结合一抗的二抗(作为检测抗体)或其他分子，例如，如果抗人GM-CSF抗体是兔源IgG抗体，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联检测标记的二抗产生可识别信号的变化。如配对使用时，则将第一抗体和第二抗体其中之一作为一抗或捕获抗体，另一者作为二抗或检测抗体。
上述所述的检测方法采用通常的免疫学方法，包括但不限于：酶免疫分析法(EIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)、免疫组织化学法(IHC)、免疫荧光法(IF)、免疫印迹法(WB)和流式细胞术(FC)。检测对象包括重组表达的GM-CSF蛋白、细胞分泌的GM-CSF蛋白或人血清中的GM-CSF蛋白。检测样品包括但不限于血清、血浆、尿液或细胞培养液。
优选地，所述检测试剂或试剂盒为双抗体夹心法酶联免疫检测试剂或试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体作为捕获抗体(或一抗)，修饰有检测标记的所述第二抗体作为检测抗体(或二抗)。
上述用于产生可识别信号变化的检测标记包括但不限于：生物素、荧光染料(如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯)荧光蛋白(如异藻蓝蛋白、藻红蛋白、PerCP和藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、抗生物素蛋白)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
在较佳的实施方式中，所述检测标记为生物素。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗人GM-CSF兔单克隆抗体的制备
采用人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(来自ABclonal，货号RP00094)为抗原免疫新西兰大白兔，分选出单个抗原特异性B淋巴细胞，之后基于PCR技术扩增出该细胞中的抗体编码基因，进行重组表达，得到候选抗体。最后通过亲和力测试和抗原表位鉴定等方法筛选得到目标抗体1G1和8H9株。抗体测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，抗体的氨基酸(AA)和核苷酸(DNA)序列分别见表1-2，表中LCDR1-3分别表示轻链互补决定区CDR1-3，HCDR1-3分别表示重链互补决定区CDR1-3。
表1本实施例兔单克隆抗体1G1的序列信息
表2本实施例兔单克隆抗体8H9的序列信息
兔单克隆抗体1G1和8H9的制备方法具体包括以下步骤：
1、动物免疫：每只大白兔免疫200μg GM-CSF蛋白，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次；三次免疫后采集兔血清样本，用ELISA方法测定血清效价，取效价高的兔子，用200μg免疫原在皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物并取脾脏。
2、分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基(RPMI Medium1640basic+1％Pen Strep；RPMI 1640购自Gibco，货号C11875500BT；PenStrep购自Gibco，货号15140-163)，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
3、分离脾脏中B淋巴细胞和进行B淋巴细胞分选：采用常规方法分离脾脏中B淋巴细胞，相关方法参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日期：2019-07-16)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日期：2020-08-11)”。
4、编码兔单克隆抗体基因的克隆：将培养的B淋巴细胞上清用GM-CSF包被的ELISA来鉴定阳性克隆，得到抗原特异性B淋巴细胞；按Quick-RNATMMicro Prep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取细胞的总RNA，反转录成cDNA；以cDNA为模板，通过PCR将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来并进行测序。PCR反应体系包括：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL2×Gloria HiFi(来自ABclonal，货号RK20717)和6.5μL H2O；PCR扩增程序包括：98℃30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s进行40次循环，最后72℃5min，得到的反应液置于4℃保存。其中，扩增VL和VH基因的引物序列见表3，F和R分别表示正向引物和反向引物。
表3扩增本实施例兔单克隆抗体的引物序列信息
引物名称 序列信息
VL-F 5’-tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC-3’(见SEQ ID NO.29)
VL-R 5’-cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG-3’(见SEQ ID NO.30)
VH-F 5’-tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG-3’(见SEQ ID NO.31)
VH-R 5’-gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG-3’(见SEQ ID NO.32)
5、兔单克隆抗体的规模化生产和纯化：将装载有携带轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因的哺乳动物表达载体pBR322分别用XbaI和NheI限制性内切酶常规线性化处理，将上述PCR扩增的包含信号肽的VL和VH基因纯化后，采取同源重组的方式构建到前述表达载体中，得到轻链基因和重链基因表达载体，经测序验证表达载体构建成功。所用载体表达图谱见图1，pBR322 origin和f1 origin为复制启动子，Ampcillin为抗性基因，CMVimmearly promoter为转录启动子，SV40 PAterminator为加尾信号，Light chainconstant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。CL、CH基因通过查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma Creign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。
本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”和专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”的轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
将测序验证正确的含有轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的识别人GM-CSF的兔单克隆抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)纯化出目的抗体，于-20℃保存备用。
实施例2兔单克隆抗体1G1和8H9的亲和力测试
使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对抗体1G1和8H9进行亲和力鉴定，所用探针为Pro1探针。将待测1G1、8H9抗体株分别固化在Pro1探针上，固化浓度为3μg/mL；然后针对待测抗体分别用150nM、70nM两个浓度的人GM-CSF蛋白去结合，获得亲和力曲线，如图2-3所示，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示结合时间，深灰色曲线为实时结合数值曲线，浅灰色曲线为拟合平均值曲线。通过曲线拟合计算得到的亲和力常数见表4。
表4兔单克隆抗体的亲和力相关参数测定结果
抗体 Koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M)
1G1 5.58×10-4 6.79×105 8.22×10-10
8H9 1.78×10-3 1.02×106 1.75×10-9
解离系数Koff用于表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数Kon用于表征抗体与其靶标结合速度的常数，亲和常数KD为Koff/Kon的比，表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数。结果显示抗体1G1和8H9对人GM-CSF的解离系数分别为5.58×10-4、1.78×10-3，结合系数分别为6.79×105、1.02×106，亲和常数为8.22×10-10(M)、1.75×10-9(M)；显示出抗体与人GM-CSF蛋白具有较高的亲和力。
实施例3基于抗体1G1和8H9建立双抗体夹心酶联免疫吸附法及其灵敏度测试
抗体8H9生物素标记：将抗体8H9与生物素(购自优逸兰迪，货号：B5064)按质量比10：1进行混合，放置2-8℃冰箱反应16-20h后即可使用。
将抗体1G1作为捕获抗体、生物素标记的抗体8H9作为检测抗体，建立双抗体夹心法酶联免疫吸附(ELISA)法，步骤如下：
1)包被捕获抗体1G1：将抗体1G1用1×PBS稀释成4μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于2-8℃冰箱孵育16-20h；
2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST(1×PBS含0.05％Tween-20)洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；
3)封闭：将封闭液(1×PBS中含2％BSA、5％蔗糖、0.05％Tween 20和0.1％proclin300，pH7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h，取出备用；
4)加抗原蛋白：将人GM-CSF蛋白(购自RD，货号：215-GM-010)用稀释液(1×PBS中含2％BSA、0.05％Tween 20、0.1％proclin 300，pH7.2)进行梯度稀释，稀释浓度：50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125和0pg/mL，然后将不同浓度以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；
5)洗板：同步骤2)；
6)加检测抗体8H9：将用生物素标记的抗体8H9(8H9-biotin)用稀释液稀释成0.1μg/mL，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；
7)洗板：同步骤2)；
8)加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00001-0)浓缩液)用稀释液100倍稀释，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；
9)洗板：同步骤2)；
10)加显色液：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液(购自四正柏，货号4ATMB1000)以100μL/孔加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；
11)读数：孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪在OD450nm进行读数。
以人GM-CSF蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标作图，得到标准曲线(见图4)。以16个稀释液空白孔的吸光值平均值与2倍的标准偏差之和为灵敏度的吸光度信号值，将吸光度信号值代入标准曲线中，回算浓度得到该抗体对的灵敏度为0.01pg/mL(见表5)。
表5基于抗体1G1和8H9建立双抗体夹心酶联免疫吸附法的灵敏度测试数据
实施例4基于抗体1G1和8H9建立双抗体夹心酶联免疫吸附体系的特异性测试
交叉反应测试蛋白分别为：Human G-CSF(来自ABclonal，货号RP01722)、Human M-CSF(来自ABclonal，货号：RP01221)、Human IL-3(来自ABclonal，货号RP01903)、Human IL-4(购自RD，货号DY204)、Mouse IL-4(购自RD，货号DY404)、Human IL-5(购自RD，货号：205-IL-005)和Mouse IL-5(购自RD，货号：DY405)，稀释浓度1000pg/mL；人GM-CSF蛋白进行梯度稀释，稀释浓度：50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125和0pg/mL。检测方法同实施例3，结果见图5。结果显示，仅有人GM-CSF能够引起吸光度值的升高，表明基于抗体1G1和8H9建立的双抗体夹心ELISA体系对除目标蛋白外的其它蛋白均无明显交叉反应，抗体1G1和8H9具有高度的抗原识别特异性，专一性识别和结合人GM-CSF蛋白。
实施例5基于抗体1G1和8H9建立双抗体夹心酶联免疫吸附体系的热稳定性测试
将包被好捕获抗体1G1的酶标板、冻干的人GM-CSF蛋白、100×浓缩的检测抗体8H9分别置于2-8℃、37℃密封保存7d后取出，按照实施例3的方法测试吸光度值。根据比较不同温度处理的抗体样品所建立的标准曲线，比较双抗体夹心ELISA体系的热稳定性，结果见图6。结果显示，将本发明的抗体在37℃热破坏7d与低温保存下的标准曲线的变异系数CV为6.45％，检测体系具备良好的热稳定性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体，其特征在于，为第一抗体或第二抗体，其中：
所述第一抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
所述第二抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQID NO.14和SEQ ID NO.15所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.7所示；
所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
3.根据权利要求2所述的抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示。
4.根据权利要求1所述的抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体，其特征在于，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；
所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv或sc(Fv)2。
5.一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项所述的抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体，所述抗体为第一抗体或第二抗体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
7.根据权利要求6所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示。
8.一种抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体对，其特征在于，由如权利要求1-4任一项所述的第一抗体和第二抗体组成。
9.一种人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子检测试剂或试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体或如权利要求8所述的抗人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗体对。
10.根据权利要求9所述的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒为双抗体夹心法酶联免疫检测试剂或试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，且所述第一抗体作为捕获抗体，修饰有检测标记的所述第二抗体作为检测抗体。
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