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CN118373914A - 抗人E-cadherin抗体、抗体偶联物和免疫检测试剂及其应用 - Google Patents

抗人E-cadherin抗体、抗体偶联物和免疫检测试剂及其应用 Download PDF

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CN118373914A CN202410625700.3A CN202410625700A CN118373914A CN 118373914 A CN118373914 A CN 118373914A CN 202410625700 A CN202410625700 A CN 202410625700A CN 118373914 A CN118373914 A CN 118373914A
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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人E‑cadherin抗体、抗体偶联物和免疫检测试剂及其应用。所述抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明提供的抗人E‑cadherin抗体具有高的抗原识别和结合活性以及良好的抗干扰能力，能够特异性识别重组表达以及人细胞或组织表达的天然E‑cadherin蛋白，应用于免疫检测尤其是流式细胞分析领域时具有检测准确性高、可靠性好、灵敏度高等优势，在细胞/组织等病例样本中E‑cadherin蛋白的临床诊断方面具有广泛的应用前景。

Description

抗人E-cadherin抗体、抗体偶联物和免疫检测试剂及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人E-cadherin抗体、抗体偶联物和免疫检测试剂及其应用。
背景技术
上皮型钙粘蛋白(Epithelial cadherin)，也被称为E-钙黏蛋白(E-Cadherin，E-Cad)、E-钙黏素、Cadherin-1、Uvomorulin、CAM 120/80或CD324，属于钙粘蛋白超家族，是一种钙依赖性的跨膜细胞黏附糖蛋白，由五个细胞外钙黏素(EC)重复序列(EC1-EC5)的胞外结构域、一个跨膜结构域和一个可结合p120-联蛋白和β-联蛋白的胞内结构域构成，预计分子量约为100kD。E-cadherin广泛表达于结肠、子宫、肝脏、角化细胞、脑、心、肌、肾、胰腺等上皮细胞以及红细胞，通过参与Ca2+依赖性细胞黏附力的调节而维持细胞间正常的粘附，保持上皮组织的结构和功能完整性，在胚胎发育、组织修复中扮演重要角色。
减少或异常的E-cadherin表达会影响细胞间的联系，降低组织内细胞粘附的强度，导致细胞运动性和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的增加。EMT是上皮细胞获得间充质细胞表型的关键形态发生过程，在该过程中，上皮细胞失去细胞极性和粘附性并向间充质细胞转化，获得间充质细胞侵袭和转移能力。EMT常见于胚胎发育、伤口愈合、器官纤维化和肿瘤转移。在人类医学中，钙粘蛋白已经在许多恶性肿瘤中被检测，如胰腺癌、黑色素瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、肺癌、食管癌、乳腺癌和胃癌。大多数人类实体瘤起源于上皮细胞，因此上皮细胞连接处的粘附分子在上皮来源肿瘤发生发展过程中至关重要。许多研究已经证实了E-cadherin是上皮来源肿瘤细胞侵袭、增殖及转移的有效抑制因子，其功能缺失或表达异常是导致肿瘤细胞发生侵袭和转移的重要因素，并且影响患者的预后。因此，检测E-cadherin的表达对于判断上皮来源肿瘤的恶性程度及预后有着重要的作用，是有价值的诊断靶点。
随着免疫学研究的快速发展，基于抗原-抗体特异性反应的免疫学检测技术为检测多种临床疾病中特定抗原提供了有效手段。然而，目前针对人E-cadherin的高灵敏度和可靠性的免疫检测技术并未得到有效研究和开发，尚未有满足流式细胞分析应用的优良抗体，主要是因为流式细胞检测过程中，目标抗原含量低且干扰因素多，抗体的特异性和/或亲和性偏低容易导致非特异性结合，使得背景噪音明显。因此，开发特异性强、抗干扰能力好的人E-cadherin单克隆抗体对于免疫检测E-cadherin蛋白具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术中抗人E-cadherin抗体的特异性差、难以用于免疫学检测尤其是缺乏流式细胞检测抗体等问题，本发明提供了一株抗人E-cadherin抗体及其抗体偶联物，并提供了该抗体和抗体偶联物在制备人E-cadherin免疫检测试剂中的应用以及相关免疫检测试剂。为实现前述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗人E-cadherin抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5所示；所述重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv和sc(Fv)2中的至少一种。
本发明第二方面提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的抗人E-cadherin抗体。
进一步地，所述重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，所述宿主细胞为人肾上皮细胞。
本发明第三方面提供了一种抗体偶联物，包含如上所述的抗人E-cadherin抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
本发明第四方面提供了如上所述的抗人E-cadherin抗体或抗体偶联物在制备人E-cadherin免疫检测试剂中的应用。
本发明第五方面提供了一种人E-cadherin免疫检测试剂，所述免疫检测试剂包括如上所述的抗人E-cadherin抗体或抗体偶联物。
进一步地，免疫检测方法为流式细胞分析法。
本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的抗人E-cadherin抗体具有高的抗原识别和结合活性以及良好的抗干扰能力，能够特异性识别重组表达以及人细胞或组织表达的天然E-cadherin蛋白，应用于免疫检测尤其是流式细胞分析领域时具有检测准确性高、可靠性好、灵敏度高等优势，在细胞/组织等病例样本中E-cadherin蛋白的临床诊断方面具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1采用酶联免疫吸附法检测抗原免疫后的兔血清的抗体效价结果图；
图2为本发明实施例1采用流式细胞法检测抗原免疫后的兔血清与阳性细胞人表皮癌细胞A431反应特异性的结果图，从左至右，血清稀释度分别为1：500和1：2000；
图3为本发明实施例1采用流式细胞法检测抗原免疫后的兔血清与阴性细胞人白血病慢性髓原细胞K562反应特异性的结果图，从左至右，血清稀释度分别为1：500和1：2000；
图4为本发明实施例1构建抗人E-cadherin兔单克隆抗体表达载体所用的哺乳动物pBR322载体的表达图谱，从左至右分别为预先携带抗体轻链恒定区和重链恒定区的载体；
图5为本发明实施例2采用流式细胞法检测抗人E-cadherin兔单克隆抗体与阳性细胞人表皮癌细胞A431反应特异性的结果图；
图6为本发明实施例2采用流式细胞法检测抗人E-cadherin兔单克隆抗体与与阴性细胞人白血病慢性髓原细胞K562反应特异性的结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“单克隆抗体”、“单抗”、“抗体”等类似词语具有相同含义，可互换使用，均指特异性结合人(Human)E-cadherin(又称CD324)的兔单克隆抗体。修饰词“兔”表示抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段(含有抗原结合区域)以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
抗体片段是全长抗体的一个或多个部分或片段，基本上保持与全长形式具有相同的生物学功能或活性，具体而言，抗体片段至少包括与全长抗体相同的CDR区，更优选地具有相同的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原(如IL-2)，尤其是结合于相同表位。在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2，这些抗体片段可通过本领域的常规技术获得。
(i)Fab：抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和第一恒定区)构成的单价片段，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc'片段。F(ab')2片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备scFv一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构。
(ii)F(ab)2：包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab构成的双价片段。
(iii)Fv：可变片段(Fv)位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整抗体。
(iv)(Fv)2：由两个共价连接在一起的Fv片段构成。
(v)scFv：单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)是由单一多肽链构成的Fv片段，由一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)通过柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接构成。
本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以来自单一物种，例如兔，或者可以是嵌合的或人源化的抗体，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自人FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如人兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到人类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。
术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能自然发生的少量突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，对抗原上的相同或基本相同的表位显示出单一的结合特异性和亲和力。修饰词“单克隆”表明抗体是从一个基本同质的抗体群体中获得的，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。该抗体可以通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明上述目的和优点能够更为明显易懂，下面对本发明具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种抗人E-cadherin抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，分别命名为CDR1、CDR2和CDR3，其中，轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示；重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明提供的抗人E-cadherin抗体具有高的抗原识别活性和与E-cadherin蛋白的亲和力，能够特异性识别重组表达以及细胞或组织表达的天然E-cadherin蛋白，通过流式细胞法检测表达E-cadherin蛋白的阳性细胞和不表达该抗原的阴性细胞样本时，仅在阳性细胞上观察到特异性的荧光信号跃迁，而阴性细胞中无反应，表明本发明的抗体具有优良的特异性和良好的抗干扰能力，并在较低的抗体浓度下仍能达到较高的检测灵敏度，适用于免疫检测尤其是流式细胞分析领域，有利于提高免疫检测E-cadherin蛋白的准确性和可靠性，降低检测成本，在细胞/组织等病例样本的临床诊断方面具有广泛的应用前景。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。本发明抗体的VL的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
可选地，本发明抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，其中，各抗体中CL和VL构成轻链，CH和VH构成重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。具体地，包含所述轻链恒定区的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含所述重链恒定区的所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
可选地，本发明抗体可以为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；该抗原结合区域指基本上保持与全长抗体相同的生物学功能或活性，具体而言，抗原结合区域包括如上所述的CDR区，更优选地具有如上所述的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合相同的抗原，尤其是结合相同表位。所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv或sc(Fv)2中的至少一种。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的抗人E-cadherin抗体。
核酸分子可以是DNA形式(如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。
核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。将所得核酸分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，并在特定条件下培养转染后的宿主细胞，即可表达获得本发明的抗体。
构建重组载体的原始载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件以允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体。此为公知技术，在此不再详细介绍。
编码本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以分别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，编码本发明兔源抗体的重链与轻链的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
本发明中重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2处理；也可通过显微注射、电穿孔或脂质体包装等。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电穿孔法、脂质体包装等。宿主细胞可以是原核或真核细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌，酵母，果蝇S2或Sf9细胞，哺乳动物CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转染或转化如上所述重组载体的宿主细胞后，在适合条件下培养，即可表达出抗体，再进行分离，得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明另一实施例提供了一种抗体偶联物，包含如上所述的抗人E-cadherin抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
检测标记用于产生可识别的信号变化，以根据所述信号变化识别本发明抗体，进而通过抗原抗体的特异性反应识别出待检样本中特定抗原的表达情况。检测标记包括但不限于：生物素、荧光染料(如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯)荧光蛋白(如异藻蓝蛋白、藻红蛋白、PerCP和藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、抗生物素蛋白)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
需要强调的是，本发明的抗体独自使用，也可以与检测标记结合或偶联形成抗体偶联物使用。在一些实施方案中，将本发明的抗体作为抗原结合抗体，其特异性识别和结合待检样本中的E-cadherin蛋白，之后通过与其连接的检测标记产生可识别的信号变化来实现定性或定量检测E-cadherin蛋白；在另一些实施方案中，不标记抗人E-cadherin蛋白的抗体(作为一抗或捕获抗体)，而将检测标记偶联可结合一抗的二抗(作为检测抗体)或其他分子，例如，如果抗人E-cadherin蛋白抗体是兔源IgG抗体，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联检测标记的二抗特异性结合本发明的抗体之后产生可识别信号的变化，从而实现定性或定量检测。
本发明再一实施例提供了如上所述的抗人E-cadherin抗体或抗体偶联物在制备人E-cadherin免疫检测试剂中的应用。
所述抗人E-cadherin抗体或抗体偶联物在制备人E-cadherin免疫检测试剂中的应用优势与如上所述的抗人E-cadherin抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
本发明的免疫检测试剂可以制备成本领域常规的产品形式，如试纸条或试剂盒。
基于相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种人E-cadherin免疫检测试剂，所述免疫检测试剂包括如上所述的抗人E-cadherin抗体或抗体偶联物。
免疫检测方法包括但不限于：酶免疫分析法(EIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)、免疫组织化学法(IHC)、免疫荧光法(IF)、免疫印迹法(WB)、免疫沉淀法(IP)和流式细胞分析法(FC)。优选地，免疫检测方法为FC法。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗人E-cadherin的兔单克隆抗体的制备
采用的免疫原为293F表达纯化得到的人重组E-cadherin蛋白155-707aa，具体而言，将E-cadherin蛋白第155至707位氨基酸(aa)片段对应的基因序列构建至pBR322载体中，在293F细胞中表达出具有生物活性的高质量重组Human E-cadherin成熟蛋白，所得蛋白纯度大于90％。其中，人CD324蛋白的氨基酸序列参见Uniprot编号P12830或NCBI登录号NP_004351.1，基因序列参见NCBI登录号NM_004360.5。
以表达得到的重组人E-cadherin蛋白作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，基于单个B淋巴细胞筛选和培养技术，从免疫抗原的兔脾脏细胞中先分选B淋巴细胞并进行培养，之后提取抗原特异性B淋巴细胞中的RNA，反转录成cDNA，经PCR扩增获得天然配对的编码兔源抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，之后查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)获得恒定区氨基酸序列，最后将完整轻链和重链基因分别装载至表达载体上，共转化或转染宿主细胞并培养宿主细胞，分离、纯化、筛选获得抗人E-cadherin蛋白的兔源单克隆抗体。抗体的氨基酸序列见表1，为描述方便，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。
表1本实施例兔单克隆抗体的序列信息
1.1、动物免疫：以重组人E-cadherin蛋白为免疫原，免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，取血清测定其针对人E-cadherin蛋白的滴度和反应特异性，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物，取脾脏。
免疫血清滴度检测采用酶联免疫吸附(ELISA)法，包括如下步骤：1)包被：用1×PBS缓冲液稀释人重组E-cadherin蛋白浓度为1μg/mL，在384孔板中按25μL/孔加入包被液，将384孔板配平后，短暂离心(rpm到达1000后停止)平板，4℃过夜；2)封闭：取出4℃中过夜的平板，用洗板机在每孔中加入75μL的洗涤缓冲液(PBS含0.05％(v/v)Tween-20)洗涤5次；使用排枪加入封闭缓冲液(含1％BSA、0.5％明胶和5％蔗糖的PBS)50μL/孔到平板内，并在室温下孵育1h，用于封闭不相关的结合位点；3)待测血清梯度稀释及加样：重复2)洗板过程清洗孔板，在96孔板中对待测血清进行梯度稀释，用稀释缓冲液(PBS含1％BSA)对血清以1：1000开始，进行三倍稀释，一共8个梯度，稀释比例可根据实际情况进行调整；4)二抗孵育：重复2)洗板过程清洗孔板，用稀释缓冲液对辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG进行稀释，稀释比为1：5000，使用排枪按照25μL/孔加入稀释好羊抗兔IgG-HRP到平板内，用于结合平板中的目的蛋白，并在室温下避光孵育1h；5)终止反应及显色：重复洗板过程清洗孔板，按照100μL/孔加入TMB显色，37℃避光10min，加100μL/孔0.5M草酸溶液终止反应，在450nm波长下测定吸光度值(OD450)，以免疫前兔血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
血清滴度检测图见图1，可见在第三次免疫和第四次加强免疫之后兔体内产生了较强的免疫反应，中和抗体的滴度较高，其第四次免疫的血清效价最优，可用于进一步分离抗体。
免疫血清抗体特异性检测采用流式细胞(FC)法，包括如下步骤：1)实验准备：紫外照射消毒超净工作台15-20min，开风机5min，准备无菌工作；2)染色方法：a)收集并洗涤培养的待检细胞，然后测定细胞总数，选择活力90％以上的细胞进行后续实验；用含0.5％BSA的PBS溶液(0.5％BSA/PBS)重悬细胞至约3×106-5×106细胞/mL，按每孔50μL将细胞分配到96孔V型板里；b)将用含0.5％BSA的PBS溶液稀释好的免疫血清(作为一抗)分配到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，混合振荡，室温反应20min；c)400g离心5min，弃上清，用200μL0.5％BSA/PBS洗涤2次；d)按每孔100μL，将用0.5％BSA/PBS按1：200稀释好的Alexa647AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Rabbit IgG(购自jackson，货号Cat#111-606-046)荧光二抗分配到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，混合；e)用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀20min；f)用200μL 0.5％BSA/PBS洗2次，最后用200μL 0.5％BSA/PBS重悬每孔细胞，避光保存；3)流式分析：按Beckman cytoflex流式分析仪使用与维护SOP-105-AND-CA-008操作进行分析。采用Rabbit IgG isotype control(来自ABclonal，货号AC042)作为同型对照。
FC待测细胞样本包括表达E-cadherin的人表皮癌细胞A431和不表达E-cadherin的人白血病慢性髓原细胞K562，免疫血清与阳性细胞A431和阴性细胞K562的FC检测结果分别见图2-3，图中，从左至右，血清稀释度分别为1：500和1：2000，横坐标表示相对荧光强度，纵坐标表示相对细胞个数，红色曲线为阴性对照，蓝色曲线为同型对照，黄色曲线为待测免疫血清。从图中可以看出，免疫血清与兔同型对照相比，在阳性细胞有明显的荧光跃迁，存在特异性结合，在阴性细胞无荧光跃迁，无非特异性结合，确定动物体内已产生可用于流式检测的高特异性和高亲和力抗体，可进入分离脾细胞阶段。
1.2、分离脾脏中B淋巴细胞和进行B淋巴细胞分选：采用常规方法分离脾脏中B淋巴细胞，并分选得到抗原特异性的B淋巴细胞，相关方法参见已公开专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日期：2019-07-16)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日期：2020-08-11)”。
1.3、编码兔源单克隆抗体基因的克隆：培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司，货号R1100-250)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，将扩增得到的cDNA进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，得到VL和VH的氨基酸序列。PCR反应体系包括：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×GloriaHiFi(来自武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20717)和6.5μL H2O。PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。扩增VL和VH基因的引物对序列(5'-3')如下所示，F和R分别表示正向和反向引物：
VL-F：tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC(见SEQ ID NO.11)；
VL-R：cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG(见SEQ ID NO.12)；
VH-F：tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG(见SEQ ID NO.13)；
VH-R：gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG(见SEQ ID NO.14)。
1.4、兔单克隆抗体的表达和规模化生产：将携带轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因的哺乳动物表达载体pBR322分别用XbaI和NheI限制性内切酶常规线性化处理，将上述PCR扩增的包含信号肽的VL和VH基因纯化后，采取同源重组的方式构建到前述表达载体中，得到含有完整轻链和重链基因表达载体，经测序验证表达载体构建成功。所使用的携带兔单克隆抗体轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因的哺乳动物表达载体pBR322图谱见图4，pBR322 origin和f1 origin为复制启动子，Ampcillin为抗性基因，CMV promoter为转录启动子，SV40 PAterminator为加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。
本实施例的信号肽采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”和专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”的轻链可变区上游信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
将含有轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的识别人E-cadherin的抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人E-cadherin蛋白的兔源单克隆抗体。使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度≥95％，将纯化抗体分装后于-20℃低温保存备用。
实施例2抗人E-cadherin抗体的流式细胞检测(FC)体系构建
兔单克隆抗体的FC检测方法包括：1)收集并洗涤培养的待检细胞，测定细胞总数，选择活力90％以上的细胞进行后续实验；2)用含0.5％BSA的PBS溶液(0.5％BSA/PBS)重悬细胞至约3×106-5×106细胞/mL，按每孔100μL将细胞分配到96孔V型板里，之后用1×PBS洗一遍；3)采用Live/Dead(Zombie NIR)试剂盒(购自biolegend，货号423105)对细胞染色，先将L/D staining solution用1×PBS按1：1500的比例稀释，按每孔100μL将L/Dstainingsolution分配到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞并混合均匀；之后将96孔V型板用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀15min，接着40g离心5min，弃上清，用1×PBS洗2次；4)将用1×PBS稀释好的E-cadherin抗体(一抗浓度2μg/mL)按每孔100μL分配到96孔V型板里，重悬孔中的细胞并混合均匀，之后将96孔V型板用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀15min，接着40g离心5min，弃上清，用1×PBS洗2次；5)将用1×PBS按1：200稀释好的Fluorescein(FITC)AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Rabbit IgG荧光二抗(购自jackson，货号Cat#111-096-046)按每孔100μL分配到96孔V型板里，每孔100μL，重悬每孔中的细胞并混合均匀；之后将96孔V型板用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀15min，接着40g离心5min，弃上清，用1×PBS洗2次；6)用200μL 1×PBS重悬每孔细胞，避光保存；7)使用流式细胞仪对前述细胞进行分析，按Beckman cytoflex流式分析仪使用与维护SOP-105-AND-CA-008操作。
图5-6分别示出了抗人E-cadherin抗体与阳性细胞A431、阴性细胞K562结合的流式细胞检测结果，其中，横坐标表示相对荧光亮度，纵坐标表示相对细胞个数，红色曲线为阴性对照，蓝色曲线为同型对照，黄色曲线为人E-cadherin抗体。从图中可以看出，本发明抗人E-cadherin抗体兔单克隆抗体在阳性细胞A431上有荧光跃迁，显示抗体与E-cadherin抗原特异性结合，在阴性细胞K562上无非特异性结合，证实其能够特异性识别人细胞中表达的E-cadherin，且具有良好的抗细胞组分干扰能力，有利于提高病理样本中E-cadherin蛋白检测的特异性和准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人E-cadherin抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5所示；所述重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的抗人E-cadherin抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求2所述的抗人E-cadherin抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的抗人E-cadherin抗体，其特征在于，所述抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv和sc(Fv)2中的至少一种。
5.一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项所述的抗人E-cadherin抗体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，其特征在于，所述重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，所述宿主细胞为人肾上皮细胞。
7.一种抗体偶联物，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的抗人E-cadherin抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
8.如权利要求1-4任一项所述的抗人E-cadherin抗体、或如权利要求7所述的抗体偶联物在制备人E-cadherin免疫检测试剂中的应用。
9.一种人E-cadherin免疫检测试剂，其特征在于，所述免疫检测试剂包含如权利要求1-4任一项所述的抗人E-cadherin抗体或如权利要求7所述的抗体偶联物。
10.根据权利要求9所述的人E-cadherin免疫检测试剂，其特征在于，免疫检测方法为流式细胞分析法。
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