CN119638830A - 针对人s100a7蛋白的抗体、抗体对和试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及针对人S100A7蛋白的抗体、抗体对和试剂盒及其用途。所述抗体为第一抗体或第二抗体，第一抗体轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示；第二抗体轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13‑15所示，重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18‑20所示。本发明提供了一对特异性强、亲和力高的抗人S100A7蛋白抗体，基于前述抗体开发的双抗夹心酶联免疫检测体系检测人S100A7具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、准确性和可信度好等优点。

Description

针对人S100A7蛋白的抗体、抗体对和试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及针对人S100A7蛋白的抗体、抗体对和试剂盒及其用途。

背景技术

S100A7(S100 calcium binding proteinA7)属于钙离子结合蛋白S100超家族，最初是从银屑病异常增生的角化细胞中分离得到的，故也被称为Psoriasin，即银屑素S100A7，分子量约为11kDa，包含两个EF-hand结构域，这些结构域负责结合钙离子，从而影响蛋白质的构象和功能，进而参与细胞内外多种重要的生命活动。研究表明，S100A7蛋白在皮肤屏障功能和免疫防御中扮演着重要角色，特别是在表皮的分化和成熟过程中；它通过调节角质形成细胞的增殖和分化，帮助维持皮肤的完整性和屏障功能。此外，S100A7还具有抗菌活性，可以抑制某些细菌的生长，保护皮肤免受感染；这种抗菌作用使其在皮肤的先天免疫防御中具有重要意义。此外，S100A7蛋白还参与了肿瘤的发生和发展，其表达水平在多种癌症中都明显增加，与癌细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关。例如，在银屑病、原位及浸润乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、膀胱鳞状细胞癌和肺癌中观察到S100A7的表达上调；S100A7这种分泌和表达特征被认为是银屑病的生物标志物之一，并作为某些恶性肿瘤的候选标志物用于疾病的早期诊断和预后判断。

为了研究S100A7在生理和病理过程中的作用，多种检测方法被广泛应用，其中，酶联免疫吸附测定(ELISA)是常用的定量检测S100A7的方法，适用于细胞培养上清液、血清或组织提取物。为了提高ELISA检测方法的特异性和灵敏度，需要开发高性能的抗人S100A7的单克隆抗体。但是，目前市售的抗人S100A7 ELISA检测试剂盒均采用鼠抗人S100A7单克隆抗体，其亲和力和特异性较低，检测灵敏度较差，易产生假阳性或假阴性结果，导致检测结果的可信度有待提高。并且，所使用的鼠单抗体依赖于传统的杂交瘤方法开发和生产，制备工艺相较于重组单抗更为复杂，也存在较大批间差。因此，利用鼠单抗所开发的ELISA检测试剂盒存在着稳定性较差、灵敏度不高、结果可信度低等挑战。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了2株抗人S100A7蛋白单克隆抗体及其组成的抗体对，以及含有前述抗体或抗体对的试剂盒及其用途。本发明提供的抗体对人S100A7蛋白的特异性强、亲和力高，用于开发双抗夹心酶联免疫检测体系检测人S100A7蛋白具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、准确性和可信度好等优点。

为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种针对人S100A7蛋白的抗体，为第一抗体或第二抗体，其中：所述第一抗体轻链可变区上互补决定区CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示，重链可变区上互补决定区CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；所述第二抗体轻链可变区上互补决定区CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链可变区上互补决定区CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18-20所示。

进一步地，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

进一步地，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

进一步地，所述第一抗体或所述第二抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab片段、F(ab)₂片段、Fv片段、(Fv)₂片段、scFv片段和sc(Fv)₂片段中的至少一种。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，编码如上所述的第一抗体或第二抗体。

进一步地，所述第一抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.22所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.24所示或是与之互补的序列。所述第二抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.26所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.28所示或是与之互补的序列。

进一步地，所述第一抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.21所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.23所示或是与之互补的序列。所述第二抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.25所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.27所示或是与之互补的序列。

本发明第三方面提供了一种针对人S100A7蛋白的抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。

本发明第四方面提供了一种用于检测人S100A7蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的针对人S100A7蛋白的抗体或如上所述的针对人S100A7蛋白的抗体对。

进一步地，所述试剂盒为双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体作为捕获抗体，所述第二抗体作为检测抗体且所述第二抗体偶联有检测标记。

本发明的优点及积极效果为：本发明提供了一对特异性强、亲和力高的抗人S100A7蛋白单克隆抗体，亲和常数在nM级别，且2株单克隆抗体结合于人S100A7蛋白的不同抗原表位，因此进一步基于前述抗体开发了针对人S100A7蛋白的双抗夹心酶联免疫检测体系，用于检测人S100A7蛋白时，具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、准确性和可信度好等优点，检测限低至162.44pg/mL，在人血清、尿液、细胞、组织等生物样本中S100A7蛋白的高效检测领域具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为携带轻链恒定区和重链恒定区的pRB322载体图谱；

图2为本发明实施例1单克隆抗体A与人S100A7蛋白结合的亲和力曲线图；

图3为本发明实施例1单克隆抗体B与人S100A7蛋白结合的亲和力曲线图；

图4为本发明实施例1单克隆抗体A和B识别人S100A7蛋白的抗原表位曲线图；

图5为本发明实施例2基于单克隆抗体A和B建立的人S100A7蛋白双抗夹心酶联免疫检测体系的标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。

术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B以及(iii)A和B。

术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，应该理解这样的使用在适当情况下可以互换。

术语“兔单克隆抗体”、“兔源抗体”和“兔单抗”等类似词语具有相同含义，如非特殊说明，均指特异性结合人(Human)S100A7蛋白的兔源抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。术语“人S100A7”、“Human S100A7”、“HumanPsoriasin”等类似词语具有相同含义，可以互换使用。

抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。抗体片段可以是全长抗体的一个或多个部分或片段，保留该抗体与目标抗原特异性结合的能力。

典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(frameworkregion，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。

轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的，可通过查询IMGT数据库获得。

全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。

抗体片段是全长抗体的一个或多个部分或片段，基本上保持与全长形式具有相同的生物学功能或活性，具体而言，抗体片段至少包括与全长抗体相同的CDR区，更优选地具有相同的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、F(ab)₂、Fab’、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv、sc(Fv)₂，这些抗体片段可通过本领域的常规技术获得。

(i)Fab：抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和第一恒定区)构成的单价片段，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)₂、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)₂片段和一个pFc'片段。F(ab')₂片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备scFv一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构。

(ii)F(ab)₂：包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab构成的双价片段。

(iii)Fv：可变片段(Fv)位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整抗体。

(iv)(Fv)₂：由两个共价连接在一起的Fv片段构成。

(v)scFv：单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)是由单一多肽链构成的Fv片段，由一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)通过柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。

(vi)sc(Fv)₂片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接构成。

在一些实施例中，本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。在另一些实施例中，抗体可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如，人源化抗体、嵌合抗体等类型，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自人FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如人兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到人类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区的FR序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。

术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能自然发生的少量突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，对抗原上的相同或基本相同的表位显示出单一的结合特异性和亲和力。修饰词“单克隆”表明抗体是从一个基本同质的抗体群体中获得的，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。该抗体可以通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法。

术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。

为使本发明的上述目的和优点更为明显易懂，下面对本发明具体实施方式做详细说明。

本发明实施例提供了一种针对人S100A7蛋白的抗体，所述抗体为第一抗体或第二抗体，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，分别命名为CDR1、CDR2和CDR3；其中：所述第一抗体轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示；所述第二抗体的轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20所示。

本发明以人S100A7蛋白为免疫原(来自ABclonal，货号RP01795)，通过B细胞标记及分选技术，直接从免疫后兔子脾脏中富集并分离能够识别人S100A7蛋白的B淋巴细胞，大大提高了抗原特异性B细胞筛选的效率。并且分离的B淋巴细胞以单个细胞的形式进行培养，直接得到的就是单克隆抗体，省去了杂交瘤技术中多次亚克隆的繁琐步骤。之后通过重组技术表达得到大量的单克隆抗体株，具有生产流程简单、产品批次稳定性好的优势。

在抗原识别方面，本发明提供的2株单克隆抗体能够识别及结合人S100A7蛋白，具有特异性强、亲和力高等优势，其中，第一抗体和第二抗体的亲和常数K_D分别为0.518nM、3.03nM，适用于免疫诊断试剂对高灵敏度和高特异性的抗体原料的需求。而且本发明的2株抗体结合于人S100A7蛋白的不同抗原表位，利用该抗体开发的双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)检测体系，具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、准确性和可信度好等优点。以第一抗体为捕获抗体、经生物素标记的第二抗体为检测抗体，对人S100A7蛋白进行定量检测，检测限低至162.44pg/mL，所建立的方法可用于低浓度人S100A7蛋白的高效检测，在人血清、尿液、细胞、组织等生物样本中S100A7蛋白的检测领域具有良好的应用前景。

可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。所述第一抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述第二抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

可选地，本发明兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成轻链，CH和VH构成重链。抗体的恒定区通常查询通过IMGT在线数据库获得。

具体地，所述第一抗体轻链(FL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链(FH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述第二抗体轻链(FL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链(FH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。所述第一抗体和所述第二抗体轻链恒定区均为κ链，重链恒定区均为IgG型。

需要说明的是，本发明单克隆抗体可以为全长抗体(具有典型的Y型分子结构)或其抗原结合区域；该抗原结合区域是指基本上保持与抗体全长形式具有相同生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗原结合区域包括如上所述的CDR区，更优选地具有如上所述的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。可选地，所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)₂、Fab’、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv和sc(Fv)₂中的至少一种。这些抗原结合区域可通过本领域常规技术获得。

本发明又一实施例提供了一种核酸分子、包含前述核酸分子的重组载体或包含前述核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。

核酸分子可以是DNA形式(如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。

核酸分子的序列依据抗体AA序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

示例性地，所述第一抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.22所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.24所示或是与之互补的序列。所述第二抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.26所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.28所示或是与之互补的序列。

示例性地，所述第一抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.21所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.23所示或是与之互补的序列。所述第二抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.25所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.27所示或是与之互补的序列。

构建重组载体的原始载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒(如pBR322、pUC系列、pET系列、pGEX系列)、病毒载体、噬菌体(如λgt4λB、λ-Charon、λΔz1和M13)、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件以允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。将核酸分子插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体，然后导入宿主细胞，并在特定条件下培养，即可表达获得抗体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。

编码本发明抗体FL与FH的核酸分子可以分别插入到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，抗体FL与FH的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。

重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用CaCl₂法或MgCl₂处理；也可通过显微注射、电穿孔或脂质体包装等。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电穿孔法、脂质体包装或粒子轰击等方式实现基因导入。

宿主细胞可以是原核或真核细胞。可用于本发明的原核宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌(例如DH5α、JM109、BL21、W3110)、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)以及肠杆菌科菌株(例如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌)和假单胞菌属。可用于转化的真核宿主细胞的实例包括但不限于酵母、昆虫细胞和动物细胞，例如果蝇S2或Sf9细胞，哺乳动物CHO、CHO DG44、CHO-S、COS-7、293系列细胞、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK和HEK293细胞系。在获得转染或转化如上所述重组载体的宿主细胞后，在适合条件下培养，即可表达出抗体，再进行分离，得到纯化的抗体。

本发明中重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法或MgCl₂处理。如果需要，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，以及显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

优选地，所述重组载体为表达载体pBR322，所述宿主细胞为人肾上皮(293F)细胞。

本发明另一实施例提供了一种针对人S100A7蛋白的抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。

本发明提供的第一抗体和第二抗体识别和结合于人S100A7的不同表位，可用于配对抗体开发双抗夹心ELISA体系或试剂盒，检测人S100A7时具有高特异性、低检测限、宽线性范围等优点。

本发明再一实施例提供了如上所述的针对人S100A7蛋白的抗体或抗体对在制备检测人S100A7蛋白试剂盒中的应用。

所述针对人S100A7蛋白的抗体或抗体对在制备检测人S100A7蛋白试剂盒中的应用优势与如上所述的针对人S100A7蛋白的抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。

基于上述相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种用于检测人S100A7蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。

需要强调的是，第一抗体和第二抗体可以分别单独使用，也可以共同使用，或者配对使用。在检测时，如分开使用或共同使用时，将第一抗体和/或第二抗体作为一抗或捕获抗体，将待检样本与捕获抗体接触，之后检测该抗体。在一些实施方案中，可以将捕获抗体偶联(共价或非共价)检测标记，通过分析检测标记产生的可识别信号的变化来实现定性或定量检测S100A7蛋白。在另一些实施方案中，不标记抗人S100A7蛋白的一抗，而将检测标记偶联可结合捕获抗体的二抗(作为检测抗体)或其他分子，例如，如果抗人S100A7蛋白抗体是兔源IgG抗体，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联检测标记的二抗产生可识别信号的变化。如配对使用时，则将第一抗体和第二抗体其中之一作为一抗或捕获抗体，另一者作为二抗或检测抗体。

上述所述的检测方法采用通常的免疫学方法，包括但不限于：酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)、免疫组织化学法(IHC)、免疫荧光法(IF)、免疫印迹法(WB)、流式细胞术(FC)等。检测对象包括重组表达的人S100A7蛋白、细胞或组织天然分泌或表达的人S100A7蛋白。检测样品包括但不限于血清、血浆、尿液、细胞或细胞培养液、组织或组织匀浆等。

优选地，所述检测试剂盒为双抗夹心酶连免疫吸附试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体作为捕获抗体(或一抗)，所述第二抗体作为检测抗体(或二抗)，且所述第二抗体偶联有检测标记。

上述用于产生可识别信号变化的检测标记包括但不限于：生物素、荧光染料(如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯)、荧光蛋白(如异藻蓝蛋白、藻红蛋白、PerCP和藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、抗生物素蛋白)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例1识别人S100A7蛋白的兔源单克隆抗体A和B的筛选及其制备

本实施例基于B细胞标记及分选技术，直接从抗原蛋白S100A7免疫后的新西兰大白兔脾脏中富集并分离能够识别人S100A7蛋白的B淋巴细胞，大大提高了抗原特异性B淋巴细胞筛选的效率，之后将B淋巴细胞以单个细胞的形式进行培养，直接得到单克隆抗体，省去了杂交瘤技术中多次亚克隆的繁琐步骤。最后通过基因工程重组表达技术实现兔源单克隆抗体的规模化生产。具体而言，从抗原特异性的B淋巴细胞中经PCR扩增获得天然配对的抗体重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因，并将前述基因分别装载至含有重、轻链恒定区的表达载体上，将载体转染宿主细胞并进行培养，从细胞培养上清液中分离纯化得到的目的抗体A和B。抗体测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，其氨基酸(AA)序列和基因(DNA)序列分别见表1-2。为描述方便，轻链互补决定区1-3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区1-3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。

表1本实施例单克隆抗体A的序列信息

表2本实施例单克隆抗体B的序列信息

兔源单克隆抗体A和B的制备方法具体包括以下步骤：

1、动物免疫：以Human S100A7蛋白(来自于ABclonal，货号RP01795)为免疫原，免疫新西兰大白兔，每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，稀释后用ELISA方法测定其针对Human S100A7的滴度，取血清滴度高的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物并取脾脏。

2、分离脾脏中B淋巴细胞和进行B淋巴细胞分选：采用常规方法分离脾脏中的B淋巴细胞，分选得到抗原特异性B淋巴细胞，相关方法参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日期：2019-07-16)”和“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日期：2020-08-11)”。

3、编码兔单克隆抗体基因的克隆：将培养后的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后按Quick-RNA^TMMicroPrep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来；PCR反应体系：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×Gloria HiFi(来自ABclonal自售自产，货号RK20717)和6.5μL H₂O；PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。扩增VL和VH基因的引物序列(5'-3')如下所示，F和R分别表示正向和反向引物：

VL-F：tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC(见SEQ ID NO.29)；

VL-R：cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG(见SEQ ID NO.30)；

VH-F：tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG(见SEQ ID NO.31)；

VH-R：gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG(见SEQ ID NO.32)。

对扩增产物进行测序，获得抗体的可变区及其编码基因序列；并通过在IMGT在线数据库(www.imgt.org)中搜寻兔源IgG gamma C reign获得重链恒定区(CH)，搜寻兔源IgGKappa C reign获得轻链恒定区(CL)。

4、兔单克隆抗体的生产和纯化：为了获得多株识别重组Human S100A7蛋白的兔单克隆抗体，将CL、CH基因插入哺乳动物表达载体pBR322中，得到的载体图谱见图1，其中，pBR322 origin和f1origin为复制启动子，Ampcillin为抗性基因，CMVpromoter为转录启动子，SV40 PAterminator为加尾信号，Light chain constant为CL的核酸序列(左图)，Heavychain constant为CH的核酸序列(右图)。然后将扩增得到的VL和VH基因通过同源重组的方式与用XbaI和NheI限制性内切酶分别线性化处理的携带CL和CH基因的表达载体pBR322进行连接，得到完整的轻链和重链基因表达载体，经测序验证载体构建成功。

通常为了实现抗体的分泌表达，其VL和VH基因前端需添加信号肽序列，信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”和专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”的VL上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”或“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，VH上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。当然本领域技术人员也可以在获得本发明抗体序列之后更换其它信号肽进行抗体表达，因此，本实施例表1-2的抗体序列中未体现信号肽序列。

上述信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”的编码基因可以为atggacacgagggcccccactcagctgctgggacttctgctgctttggctgcctggcgccacgttc；信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”编码基因可以为atggacacgagggcccccactcagctgctgggtctcctgctgctgtggttgcccggagcaagatgc；信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”编码基因可以为atggagactgggctgcgctggcttctcctggtagcggtgctgaag ggggttcaatgc或atggagactgggctgcgctggcttctcctggtggcagtactcaaaggtgttcagtgt。

将构建成功的含有轻链(FL)基因和重链(FH)基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的识别Human S100A7的兔单克隆抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从培养上清液中纯化出重组的识别Human S100A7蛋白的兔单克隆抗体。使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度＞95％，将纯化抗体分装后于-20℃低温保存备用。

1.5、抗体性能检测：获得多株重组表达的抗体后，对抗体进行亲和力的鉴定及抗原识别表位的鉴定，得到本发明的目的抗体株A和B。

1)抗体亲和力的鉴定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪测定抗原抗体结合曲线，进行抗体亲和力的鉴定。首先将抗原蛋白Human S100A7固化在HFC(Anti-HIgG FC)探针(购于Gator Bio，货号160003)上，固化浓度为3μg/mL；然后将固化抗原后的探针放置于抗体溶液中测试抗体结合抗原的情况，抗体A的浓度为3.3μg/mL，抗体B的浓度为5.23μg/mL，当抗原抗体结合达到饱和状态后，将探针转至解离体系中完成解离过程。抗体A和B的亲和力曲线分别见图2-3，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示结合时间，深灰色曲线为实时结合数值曲线，浅灰色曲线为拟合平均值曲线。通过曲线拟合计算得到的亲和力常数见表3，其中，解离系数K_off表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数K_on表征抗体与其靶标结合速度的常数，亲和常数K_D为K_off/K_on的比，表征抗体与抗原之间的解离平衡常数。

表3单克隆抗体A和B的亲和力相关参数测定结果

单克隆抗体	Koff(1/s)	Kon(1/Ms)	KD(M)
				A	1.14×10-4	2.20×105	5.18×10-10
B	8.19×10-4	2.70×105	3.03×10-9

由表3可知，抗体A和抗体B针对人S100A7的亲和常数K_D分别为0.518nM、3.03nM，显示出兔单克隆抗体A、B分别与重组Human S100A7具有高亲和力。

2)抗原识别表位的鉴定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位。首先将抗原蛋白固化在HumanS100A7蛋白固化在HFC(Anti-HIgG FC)探针上，固化浓度为3μg/mL，然后将固化抗原蛋白后的探针依次放置于抗体A和B的溶液中，使抗体株A和B分别和S100A7蛋白结合至饱和，通过分析不同抗体在抗原上的结合特性，分析抗体株A和B的识别表位，结果见图4，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后、结合物的厚度变化，横坐标表示结合时间。

从图4中可以看出，固化Human S100A7的探针在结合B后能明显结合作为第二抗体的抗体A，此时shift值为0.203，可见两株抗体结合Human S100A7蛋白上的不同表位，因此二者可用于双抗夹心法酶联免疫吸附检测的配对抗体。

实施例2基于抗体A和B建立双抗夹心酶联免疫吸附体系及其分析灵敏度

抗体B生物素标记：将抗体B配成1mg/mL的溶液，用二甲基亚砜(DMSO)将NHS-LC-biotin(N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL 1mg/mL的抗体B溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30min后，加入50μg 500mM Tris-HCl(pH9.0)终止反应；最后加入大量的1×PBS缓冲液(pH7.4)，用排阻极限30KDa的离心柱离心，以除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡，得到生物素标记的抗体B(B-biotin)。

将抗体A作为捕获抗体、抗体B-biotin作为检测抗体，建立双抗体夹心法酶联免疫吸附(ELISA)法，步骤如下：1)包被捕获抗体A：将抗体A用1×PBS稀释成4μg/mL，以100μL/孔加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，4℃孵育16-20h；2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体；3)封闭：将封闭液(1×PBS中含2％BSA、5％蔗糖、0.05％吐温20和0.1％proclin 300，pH 7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h，取出备用；4)加抗原蛋白：将重组Human S100A7蛋白(购自RD，货号9085-SA)用稀释液(1×PBS中含2％BSA、0.05％吐温20和0.1％proclin300，pH 7.2)进行稀释，至浓度为：6000、3000、1500、550、375、187.5、93.75、0pg/mL，然后以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；5)洗板：同步骤2)；6)加检测抗体B：将用生物素标记的抗体B(B-biotin)稀释成0.05μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；7)洗板：同步骤2)；8)加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00001-0)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；9)洗板：同步骤2)；10)加TMB显色液：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液(购自四正柏，货号4ATMB1000)以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；11)读数：孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪读数。

以Human S100A7蛋白浓度为横坐标，吸光值的校正值Y1(Y1＝OD_450nm-OD_630nm)为纵坐标作图，见图5。结果显示，抗体A作为捕获抗体，抗体B作为检测抗体，对人S100A7进行ELISA检测，体现出良好的线性，使检测结果具备良好的准确性。

以16个空白孔(不含标准品蛋白的稀释液)的平均吸光值与2倍的标准偏差之和为灵敏度的吸光值，将其带入标准曲线中所得浓度即为检测体系的灵敏度(见表4)。结果显示本发明双抗夹心ELISA检测体系的检测限低至162.44pg/mL，具有较高的灵敏度。

表4基于抗体A和B建立双抗夹心酶联免疫吸附方法的灵敏度

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种针对人S100A7蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体为第一抗体或第二抗体，其中：

所述第一抗体轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.3-5所示，重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8-10所示；

所述第二抗体轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.13-15所示，重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.18-20所示。

2.根据权利要求1所述的针对人S100A7蛋白的抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根据权利要求2所述的针对人S100A7蛋白的抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示。

4.根据权利要求1所述的针对人S100A7蛋白的抗体，其特征在于，所述第一抗体或所述第二抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；

所述抗原结合区域选自Fab片段、F(ab)₂片段、Fv片段、(Fv)₂片段、scFv片段和sc(Fv)₂片段中的至少一种。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项中所述的第一抗体或第二抗体。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.22所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.24所示或是与之互补的序列；

所述第二抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.26所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.28所示或是与之互补的序列。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述第一抗体轻链的核酸序列如SEQID NO.21所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.23所示或是与之互补的序列；

所述第二抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.25所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.27所示或是与之互补的序列。

8.一种针对人S100A7蛋白的抗体对，其特征在于，由如权利要求1-4任一项中所述的第一抗体和第二抗体组成。

9.一种用于检测人S100A7蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的针对人S100A7蛋白的抗体或如权利要求8所述的针对人S100A7蛋白的抗体对。

10.根据权利要求9所述的用于检测人S100A7蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，且所述第一抗体为捕获抗体，所述第二抗体为检测抗体且所述第二抗体偶联有检测标记。