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CN118620078B - 抗人cd45ra蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用 - Google Patents

抗人cd45ra蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用 Download PDF

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CN118620078B CN202410915325.6A CN202410915325A CN118620078B CN 118620078 B CN118620078 B CN 118620078B CN 202410915325 A CN202410915325 A CN 202410915325A CN 118620078 B CN118620078 B CN 118620078B
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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人CD45RA蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用。所述抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明提供的具备上述CDR序列的抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD45RA蛋白以及细胞或组织中表达的天然CD45RA蛋白，且与同型蛋白无交叉反应，具有良好的特异性和较高的亲和性，能够有效抗细胞组分干扰，显著提升免疫检测CD45RA蛋白的准确性、灵敏度和可靠性，在流式细胞等免疫检测领域具有广阔的应用前景。

Description

抗人CD45RA蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人CD45RA蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用。
背景技术
CD45，又称C型蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTPRC)，是白细胞表面共同抗原(leukocyte common antigen，LCA)，属于I型跨膜蛋白，在除成熟红细胞和血小板外的所有造血干细胞谱系细胞中均有表达，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等，是T和B细胞抗原受体介导的活化的重要调节因子。CD45的胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物上酪氨酸脱磷酸而激活，是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义。
CD45由一类结构相似、分子量较大的跨膜蛋白组成，通过胞外域中外显子4(A)、5(B)和6(C)的选择性剪接可产生多种CD45亚型，仅表达外显子A的同型称为CD45RA，仅表达外显子B的同型称为CD45RB，仅表达外显子C的同型称为CD45RC，而缺乏三种外显子的同型称为CD45RO。CD45亚型的变化随着T细胞的活化而改变，并影响细胞内信号转导，因此CD45亚型的分布常用用作某些T细胞亚群的分类标志。T淋巴细胞表达不同的CD45亚型与其功能差异有一定的关系，通常CD45RO表达于记忆性T细胞，CD45RA表达于初始T细胞。记忆性辅助T细胞在抗原刺激下产生细胞因子等效应因子，辅助B细胞产生抗体，初始T细胞则在抗原的刺激下发生增殖反应，其表面的CD45RA表达减少，转变为CD45RO以增强免疫反应，所以CD45RA/CD45RO作为CD45的重要亚型也多被视为区分初始T细胞和记忆T细胞的理想标志，其在免疫应答、病毒感染和自身免疫性疾病方面发挥关键作用。
CD45RA+和CD45RO+T细胞在表型、功能等各方面均不同，了解其亚群的变化有助于了解许多疾病的发病机制、临床状态及预后。目前已经发现在系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、过敏性紫癜等、髓系白血病、带状疱疹、支气管哮喘、贫血、结直肠癌、胃癌等疾病中CD45RA的表达发生明显的变化，可以作为临床诊断上重要的判断依据，也可通过检测CD4+CD45RA+的细胞数量来评估高效抗逆转录病毒治疗(HAART)在AIDS病程中的治疗效果。由此可见检测CD45RA的表达水平具有重要的科研价值和临床意义。
在活细胞检测领域，主要是通过流式细胞术(FC)来鉴定细胞亚群，其关键在于开发抗CD45RA抗体。目前市面上关于CD45RA的抗体开发，检测应用主要满足免疫印迹法(WB)、免疫组织化学法(IHC)等，少有满足FC分析应用的抗体。这是因为FC检测过程中目标抗原CD45RA的含量低且干扰因素多，且有多种同型蛋白，抗体的特异性和/或亲和性偏低容易导致非特异性结合，故而市面上少有满足FC分析应用的单克隆抗体。因此开发一种能满足流式细胞分析应用场景的高特异性的CD45RA抗体，具有非常重要的意义。
发明内容
针对现有技术中抗人CD45RA蛋白抗体的特异性、亲和力和/或抗干扰能力差，难以用于活细胞检测尤其是活细胞流式细胞检测等问题，本发明提供了抗人CD45RA蛋白的抗体及其抗体偶联物，并进一步提供了该抗体或抗体偶联物在制备人CD45RA蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用以及相关的免疫检测试剂和/或试剂盒。本发明提供的抗体能够特异性识别并结合人CD45RA蛋白，与靶点亲和力高，对其余CD45蛋白亚型无交叉反应，可应用于免疫学检测领域。为实现前述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗人CD45RA蛋白的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5所示；所述重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区；其中，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成完整轻链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链恒定区和所述重链可变区构成完整重链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述抗体为全长抗体或其抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
本发明第二方面提供了一种抗体偶联物，包含如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
本发明第三方面提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体。
进一步地，所述抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.16所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.18所示或是与之互补的序列。
更进一步地，所述抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.15所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.17所示或是与之互补的序列。
本发明第四方面提供了如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体或抗体偶联物在制备人CD45RA蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明第五方面提供了一种人CD45RA蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒，所述检测试剂和/或试剂盒包括如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体或抗体偶联物。
进一步地，免疫检测方法包括酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞术中的至少一种。
本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的具备上述CDR序列的抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD45RA蛋白以及细胞或组织中表达的天然CD45RA蛋白，且与同型蛋白无交叉反应，具有良好的特异性和较高的亲和性，能够有效抗细胞组分干扰，显著提升免疫检测CD45RA蛋白的准确性、灵敏度和可靠性，在流式细胞等免疫检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1通过酶联免疫吸附法检测兔免疫血清滴度的结果图；
图2为本发明实施例1通过流式细胞法检测兔免疫血清与阳性细胞Jurkat结合的结果图，其中，从左至右，血清稀释度分别为1：500、1：1000和1：2000；
图3为本发明实施例1通过流式细胞法检测兔免疫血清与阴性细胞293T结合的结果图，其中，从左至右，血清稀释度分别为1：500、1：1000和1：2000；
图4为本发明实施例1构建抗人CD45RA蛋白抗体所用的哺乳动物表达载体pRB322图谱，从左至右分别为预先携带抗体轻链恒定区和重链恒定区的载体；
图5为本发明实施例3通过流式细胞法检测抗人CD45RA蛋白抗体与阳性细胞Daudi结合的结果图，其中，荧光标记为ABflo488，左图为阴性细胞293T，右图为阳性细胞Daudi；
图6为本发明实施例3通过流式细胞法检测抗人CD45RA蛋白抗体与阳性细胞Jurkat结合的结果图，其中，荧光标记为ABflo647，左图为阴性细胞293T，右图为阳性细胞Jurkat。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B以及(iii)A和B。
术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“兔源抗体”和“兔单抗”等类似词语具有相同含义，如非特殊说明，均指特异性结合人(Human)CD45RA的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
抗体片段是全长抗体的一个或多个部分或片段，基本上保持与全长形式具有相同的生物学功能或活性，具体而言，抗体片段至少包括与全长抗体相同的CDR区，更优选地具有相同的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2，这些抗体片段可通过本领域的常规技术获得。
(i)Fab：抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和第一恒定区)构成的单价片段，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc'片段。F(ab')2片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备scFv一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构。
(ii)F(ab)2：包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab构成的双价片段。
(iii)Fv：可变片段(Fv)位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整抗体。
(iv)(Fv)2：由两个共价连接在一起的Fv片段构成。
(v)scFv：单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)是由单一多肽链构成的Fv片段，由一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)通过柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接构成。
在一些实施例中，本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。在另一些实施例中，抗体可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如，人源化抗体、嵌合抗体等类型，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自鼠FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如鼠兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到鼠类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他鼠类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。
术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能自然发生的少量突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，对抗原上的相同或基本相同的表位显示出单一的结合特异性和亲和力。修饰词“单克隆”表明抗体是从一个基本同质的抗体群体中获得的，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。该抗体可以通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种抗人CD45RA蛋白的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，分别命名为CDR1、CDR2和CDR3，其中，轻链可变区上互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链可变区上互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列分别如SEQID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明提供的具备上述CDR序列的抗人CD45RA蛋白抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD45RA蛋白以及细胞上表达的天然CD45RA蛋白，通过酶联免疫吸附法检测抗体对重组CD45RA蛋白及其同型蛋白的反应性，抗体仅识别和结合CD45RA蛋白，与同型蛋白无交叉反应；进一步通过流式细胞法进行检测，本发明抗体在表达CD45RA蛋白的阳性细胞上有明显的荧光跃迁且信号强度单一，而在阴性细胞中无信号。前述结果证明该抗体对CD45RA蛋白具有良好的特异性和较高的亲和性，能够有效抗细胞组分干扰，显著提升免疫检测CD45RA蛋白的准确性、灵敏度和可靠性，在流式细胞等免疫检测领域具有广阔的应用前景。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。本发明抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
可选地，本发明抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成完整轻链(FL)，CH和VH构成完整重链(FH)。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。具体地，所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
可选地，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体(具有典型的Y型分子结构)或为所述全长抗体的抗原结合区域；该抗原结合区域是指基本上保持与抗体全长形式具有相同生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗原结合区域包括如上所述的CDR区，更优选地具有如上所述的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。可选地，所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv和sc(Fv)2中的至少一种。这些抗原结合区域可通过本领域的常规技术获得。
本发明又一实施例提供了一种抗体偶联物，包含如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
检测标记用于产生可识别的信号变化，以根据所述信号变化识别待检样本。检测标记包括但不限于：生物素、荧光染料(如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯)、荧光蛋白(如异藻蓝蛋白、藻红蛋白、PerCP和藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、抗生物素蛋白)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
本发明另一实施例提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子用于编码如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体。
核酸分子可以是DNA形式(如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。
核酸分子的序列依据抗体AA序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。将所得核酸分子插入表达载体内，然后导入宿主细胞，并在特定条件下培养，即可表达获得抗体。
示例性地，所述抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.16所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.18所示或是与之互补的序列。
示例性地，所述抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.15所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.17所示或是与之互补的序列。
本领域技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，不同于上述示例的核酸分子同样可以编码得到本发明的抗体，因此，上述示例的核酸分子不应作为对本发明保护范围的限定。
构建重组载体的原始载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒(如pBR322、pUC系列、pET系列、pGEX系列)、病毒载体、噬菌体(如λgt4λB、λ-Charon、λΔz1和M13)、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件以允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
编码本发明抗体FL与FH的核酸分子可以分别插入到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，抗体FL与FH的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2处理；也可通过显微注射、电穿孔或脂质体包装等。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电穿孔法、脂质体包装或粒子轰击等方式实现基因导入。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。可用于本发明的原核宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌(例如DH5α、JM109、BL21、W3110)、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)以及肠杆菌科菌株(例如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌)和假单胞菌属。可用于转化的真核宿主细胞的实例包括但不限于酵母、昆虫细胞和动物细胞，例如果蝇S2或Sf9细胞，哺乳动物CHO、CHO DG44、CHO-S、COS-7、293系列细胞、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK和HEK293细胞系。在获得转染或转化如上所述重组载体的宿主细胞后，在适合条件下培养，即可表达出抗体，再进行分离，得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，所述重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，所述宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明再一实施例提供了如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体或抗体偶联物在制备人CD45RA蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
所述抗人CD45RA蛋白的抗体或抗体偶联物在制备人CD45RA蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
本发明实施例还提供了一种人CD45RA蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒，所述检测试剂和/或试剂盒包括如上所述的抗人CD45RA蛋白的抗体或抗体偶联物。
需要说明的是，本发明的抗体可以单独使用，也可与检测标记结合或偶联形成抗体偶联物。在一些实施方案中，将本发明的抗体作为抗原结合抗体，其特异性识别和结合待检样本中的CD45RA蛋白，之后通过与其连接的检测标记产生可识别的信号变化来实现定性或定量检测CD45RA蛋白，在另一些实施方案中，不标记抗人CD45RA蛋白的抗体(作为一抗或捕获抗体)，而将检测标记偶联可结合一抗的二抗(作为检测抗体)或其他分子，例如，如果抗人CD45RA蛋白抗体是兔源IgG抗体，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联检测标记的二抗特异性结合本发明的抗体之后产生可识别信号的变化，从而实现定性或定量检测。
上述所述的免疫检测方法包括但不限于：酶免疫分析法(Enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹法(Western blot，WB)、免疫沉淀法(Immunoprecipitation，IP)和流式细胞法(Flow Cytometry，FC)。检测对象包括重组表达的CD45RA蛋白以及天然分泌或表达的CD45RA蛋白。检测样品包括但不限于血清、血浆、尿液、细胞培养液和组织匀浆。
在较佳的实施方式中，所述免疫检测方法为流式细胞法，所述检测试剂和/或试剂盒为流式细胞检测检测试剂和/或试剂盒。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗人CD45RA蛋白的兔源单克隆抗体的制备
采用的免疫原为人重组CD45RA蛋白，将Human CD45RA蛋白26aa-482aa序列构建至pYURK-Chis载体，Human CD45RA蛋白序列参见Uniprot编号P08575-8，基因序列参见Uniprot编号Gene ID：5788。将pYURK-Chis载体转入293F细胞，在293F细胞中表达出具有生物活性的重组Human CD45RA成熟蛋白26aa-482aa。CD45RA蛋白表达和纯化方法采用本领域常规操作。
采用上述免疫原免疫新西兰大白兔，获得免疫增强的B淋巴细胞，之后基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得抗人CD45RA蛋白的抗体。抗体测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，抗体的氨基酸(AA)和核酸(DNA)序列见表1，表中LCDR1-3分别表示轻链互补决定区CDR1-3，HCDR1-3分别表示重链互补决定区CDR1-3。
表1本实施例兔单克隆抗体的序列信息
1.1、动物免疫
以重组Human CD45RA蛋白为免疫原，分别免疫4只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，按1：243000稀释后用ELISA方法测定其针对HumanCD45RA的滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物，取脾脏。用FC方法测定血清与阳性样本的特异性和亲和力。
1.2、兔免疫血清滴度联免疫吸附法(ELISA)检测
免疫血清滴度检测采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定，具体操作包括：1)包被Human CD45RA：用1×PBS缓冲液稀释的重组Human CD45RA蛋白(终浓度为1μg/mL)，在384孔板中按25μL/孔加入稀释后的Human CD45RA蛋白，将384孔板配平后，短暂离心(rpm到达1000后停止)平板，4℃过夜；2)封闭：取出4℃中过夜的平板，用洗板机在每孔中加入75μL的洗涤缓冲液(PBS含0.05％(v/v)Tween-20)洗涤5次；之后按50μL/孔加入封闭缓冲液(PBS含1％BSA、0.5％明胶和5％蔗糖)，并在室温下孵育1h，用于封闭不相关的结合位点；3)待测血清梯度稀释及加样：重复2)洗板过程清洗孔板，在96孔板中对待测血清进行梯度稀释，用稀释缓冲液(PBS含1％BSA)对血清以1：1000开始，进行三倍稀释，一共8个梯度，稀释比例可根据实际情况进行调整；4)二抗孵育：重复2)洗板过程清洗孔板，用稀释缓冲液对辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG(购自Jackson，货号111-035-045)进行稀释，稀释比为1：5000，按照25μL/孔加入稀释好的羊抗兔IgG-HRP到平板内，用于结合平板中的目的蛋白，并在室温下避光孵育1h；5)终止反应及显色：重复2)洗板过程清洗孔板，按100μL/孔加入TMB显色，37℃避光10min，按100μL/孔加入0.5M草酸溶液终止反应，测450nm吸收值，以免疫前兔血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
血清滴度检测结果见图1，可见在第三次免疫和第四次加强免疫之后兔体内产生了较强的免疫反应，中和抗体的滴度较高。
1.3、兔免疫血清流式细胞术(FC)检测
免疫血清与待测细胞样本的特异性采用流式细胞分析(FC)法，包括如下步骤：1)消毒：紫外照射消毒超净工作台15-20min，开风机5min，准备无菌工作；2)细胞活力检测：收集并洗涤待检细胞，测定细胞总数，检查细胞活力是否在95％左右且不低于90％，用1×PBS溶液重悬细胞至约3×106-5×106细胞/mL，将细胞分配到96孔V型板里，每孔50μL；3)一抗孵育：按每孔50μL将用1×Stain buffer(含0.5％BSA的PBS溶液，BSA购自Biofrox，货号4240GR500)稀释好的免疫血清分配到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，混合；阴性对照加入等体积Stain buffer，重悬每孔中的细胞，混合；用铝箔纸包好96孔V型板，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀30min；400g离心5min，弃上清，用Stain buffer洗2次；4)二抗孵育：按每孔100μL将用Stain buffer按1：200稀释好的Fluorescein(FITC)AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Rabbit IgG(购自jackson，货号Cat#111-096-046)荧光二抗分配到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，混合；用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀30min；用Stain buffer洗2次；用200μL FACS buffer重悬每孔细胞，避光保存；5)流式分析：按Beckman cytoflex流式分析仪使用与维护操作说明进行分析。同型对照抗体来自ABclonal，货号A24173。
细胞样本包括阳性细胞人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat、人B淋巴母细胞Daudi和阴性细胞人肾上皮细胞293T，阳性细胞高表达CD45RA，阴性细胞不表达CD45RA。稀释后的兔免疫血清与阳性细胞和阴性细胞的FC检测结果见图2-3，从左至右，血清稀释度分别为1：500、1：1000和1：2000，图中横坐标表示荧光亮度，纵坐标表示细胞个数，红色曲线为阴性对照，蓝色曲线为同型对照，黄色曲线为待测血清。从图中可以看出，各血清稀释度的阳性荧光信号跃迁较好，确定动物免疫较好，体内已产生可用于流式检测的抗体，动物可进入分离脾细胞阶段。
1.4、分离脾脏中B淋巴细胞和进行B淋巴细胞分选
采用常规方法分离脾脏中B淋巴细胞，并分选得到抗原特异性的B淋巴细胞，相关方法参见已公开专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日期：2019-07-16)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日期：2020-08-11)”。
1.5、编码兔源单克隆抗体基因的克隆和表达
培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来，挑选若干个克隆进行测序。其中，PCR反应体系如下：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×GloriaHiFi(来自ABclonal，货号RK20717)和6.5μL H2O。PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。正反向引物的序列如下所示：
VL-F：5’-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3’(见SEQ ID NO.11)；
VL-R：5’-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3’(见SEQ ID NO.12)；
VH-F：5’-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3’(见SEQ ID NO.13)；
VH-R：5’-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3’(见SEQ ID NO.14)。
将轻链和重链编码基因装载在表达载体上。所使用的哺乳动物表达载体pBR322预先携带兔轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)序列。pBR322图谱见图4，图中，pBR322origin和f1origin为复制启动子，Ampcillin为抗性基因，CMV promoter为转录启动子，SV40PAterminator为加尾信号，Light chain constant为CL的核酸序列(左图)，Heavy chainconstant为CH的核酸序列(右图)。CL、CH通过查询IMGT数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。
将上述PCR扩增获得的含有信号肽的抗体可变区基因纯化，并将含兔CL和CH的pBR322质粒分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，采用同源重组的方式分别将重链可变区和轻链可变区基因连接到相应的质粒中并测序确定序列，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，得到抗Human CD45RA蛋白的兔单克隆抗体，命名为3B2。
本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”和专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”的VL上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”(编码基因可以为ATGGAC ACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTTCTGTGGCTTCCTGGAGCCACCTT T)，VH上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”(编码基因可以为ATGGAGACTG GGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTTGCAGTGCTGAAAGGAGTCCAGTGC)。
将构建成功的含有轻链(FL)基因和重链(FH)基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的识别人CD45RA蛋白的抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从培养上清液中纯化出目的抗体3B2。实验步骤如下：将培养上清转移至无菌50mL离心管中，1000g、4℃(或常温)离心10min，收集上清液。将预处理后的ProteinAAgarose悬浮液加入到离心后细胞上清液中，振荡孵育3-4h(室温)或4℃过夜。孵育完成后1000g离心10min，将ProteinAAgarose悬浮液转移到吸附柱中，常温离心1min，使固液分离，收集流穿液。加入10倍Protein AAgarose体积的洗涤缓冲液并重新悬浮颗粒，离心机离心，收集洗杂液，再重复洗杂两次。向吸附柱中加入l体积洗脱缓冲液，离心，获得抗体上清，将抗体上清装入透析袋中，透析过夜后，得到纯化后抗体3B2，使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用，所得抗体浓度为2mg/mL，纯度大于95％。
实施例2兔单克隆抗体3B2对抗原识别特异性检测
2.1、间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定交叉反应性
采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定3B2抗体能否特异性识别CD45RA蛋白，具体操作同实施例1，区别在于，以抗体3B2替换免疫血清，抗体以1：1000开始，进行三倍稀释，一共8个梯度。将Human CD45RA蛋白的同型蛋白Human CD45RB(Uniprot编号P08575-9，制备方法同实施例1，表达区段为26-463aa)、Human CD45RO(Uniprot编号P08575-4，制备方法同实施例1，表达区段为27-120aa)作为负筛对照，以免疫前兔血清作为阴性对照，以不识别CD45RA的其他兔抗体(来自Abclonal，货号A23507)作为无关对照，NC表示不加待测的免疫血清/待测抗体、仅添加缓冲液(1×PBS含1％BSA)的空白对照，滴度检测结果见表2。
表2本实施例兔单克隆抗体抗体3B2的滴度检测结果
由表2可知，抗体3B2仅在人CD45RA蛋白中滴度较高，在CD45RB和CD45RO中无检测滴度。说明该抗体特异性识别CD45RA，不识别和结合CD45RB和CD45RO，具有高度的专一性和优良的特异性。
2.2、流式细胞分析测定抗体亲和性
本实施例的细胞样本包括阳性样本Jurkat、Daudi和阴性样本293T，阳性样本是指相应细胞或组织表达CD45RA蛋白，阴性表示相应细胞或组织不表达CD45RA蛋白。测定方法参见实施例1，一抗为本发明的兔单克隆抗体3B2，抗体浓度为0.2μg/mL，荧光二抗为ABflo488(Fluorescein(FITC)AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Rabbit IgG,Fcγfragment specific，购自jackson，货号115-096-071)或ABflo647(Alexa 647AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG,Fcγfragment specific，购自jackson，货号115-605-071)，用以验证抗体对不同荧光的适应性。本发明的抗体3B2识别CD45RA蛋白，荧光二抗识别抗体3B2，通过识别荧光强度(荧光跃迁)和荧光细胞占比，可以判断一抗的特异性和亲和力，结果见图5-6，从左至右分别为阴性细胞样本和阳性细胞样本，图5为阳性细胞Daudi(荧光信号ABflo488)，图6为阳性细胞Jurkat(荧光信号ABflo647)，图中横坐标表示647或488荧光亮度，纵坐标表示细胞个数，红色曲线为阴性对照，蓝色曲线为同型对照，黄色曲线为待测抗体3B2。
结果显示，抗体3B2检测细胞表面天然分泌的CD45RA蛋白时，荧光跃迁良好，说明抗体识别靶点人CD45RA蛋白亲和力高，阳性存在唯一峰且在阴性样本上无背景信号，说明抗体特异性高，具有分析灵敏度高、抗干扰能力强等优点，而且对488、647两种荧光检测信号的适应性较好，说明本发明的抗体可满足多荧光的检测特性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人CD45RA蛋白的抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；所述重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的抗人CD45RA蛋白的抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求2所述的抗人CD45RA蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区；其中，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成完整轻链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链恒定区和所述重链可变区构成完整重链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的抗人CD45RA蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体为全长抗体或其抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
5.一种抗体偶联物，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的抗人CD45RA蛋白的抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项所述的抗人CD45RA蛋白的抗体。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.16所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.18所示或是与之互补的序列。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述抗体轻链的核酸序列如SEQ IDNO.15所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.17所示或是与之互补的序列。
9.如权利要求1-4任一项所述的抗人CD45RA蛋白的抗体或如权利要求5所述的抗体偶联物在制备人CD45RA蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
10.一种人CD45RA蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的抗人CD45RA蛋白的抗体、或如权利要求5所述的抗体偶联物。
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