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CN118638236B - 抗人cd127蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用 - Google Patents

抗人cd127蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用 Download PDF

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CN118638236B CN202410915315.2A CN202410915315A CN118638236B CN 118638236 B CN118638236 B CN 118638236B CN 202410915315 A CN202410915315 A CN 202410915315A CN 118638236 B CN118638236 B CN 118638236B
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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人CD127蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用。所述抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明提供的抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD127蛋白以及细胞或组织中天然表达的CD127蛋白，具有良好的特异性和较高的亲和性，能够有效抗细胞组分干扰，有效降低免疫检测CD127蛋白时的非特异性结合等造成的假阳性或假阴性结果，提高检测结果的准确性、灵敏度和可靠性，在流式细胞等免疫检测领域具有广阔的应用前景。

Description

抗人CD127蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人CD127蛋白的抗体、抗体偶联物及其应用。
背景技术
IL-7受体alpha链(IL-7Rα)，又被称为CD127，在维持T淋巴细胞(简称T细胞)内环境稳态中发挥着重要作用。白细胞介素IL-7已被确定为各种成熟T细胞存活的主要稳态细胞因子，其受体是由α链及γ链构成的，γ链受体广泛表达于淋巴细胞，并且是IL-2、IL-4、IL-9、IL-15和IL-21的通用受体，因此淋巴细胞对IL-7的特异性应答主要由CD127的表达进行调控。CD127主要由在淋巴细胞分化、增殖和存活中起重要作用的淋巴谱系细胞表达，包括发育和成熟的T细胞，特别是在初始T细胞(T Cell)和记忆T细胞(Memory T Cell)中，另外在骨髓基质细胞和B细胞祖细胞中有表达，但在成熟的B细胞中不存在。
机体对T细胞表面CD127的表达调控贯穿了T细胞的整个生命周期。IL-7-CD127调控轴与其他生长因子协同扩增T细胞前体，此外，IL-7-CD127调控轴通过增殖和细胞因子分泌促进了T细胞的共刺激，能够调节初始T细胞和记忆性CD4和CD8T细胞稳态及其淋巴细胞诱导增殖。另外，IL-7-CD127调控轴还通过抗凋亡作用促进T细胞的存活与重构，维持T淋巴细胞内环境稳态。CD127除了被发现在淋巴细胞中高表达，近几年还有研究报道其在部分单核细胞中也有高表达，在新冠患者肺部以及类风湿关节炎患者的外周血和关节组织中发现了数量可观的CD127高表达单核细胞，揭示了单核细胞亚群间CD127的表达水平差异指征出不同程度的单核细胞炎症表型。而且首次发现了单核细胞上的IL-7受体介导的CD127-STAT5信号通路具有抑炎调控作用；暗示了CD127介导的单核细胞免疫表型作为未来疾病治疗的相关靶点的可能性。
在病理方面，CD127与类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫性疾病有关。在临床模型中，阻断IL-7或CD127主要通过阻碍单核细胞和内皮细胞浸润以及抑制促炎巨噬细胞和Th1/Th17细胞分化，有效地损害关节炎症、破骨细胞形成和新生血管。除此之外，CD127在HIV感染免疫发病机制中起重要作用。在HIV感染患者血中高表达的CD8+T细胞被证明是CD127-亚型，CD127-CD8+T细胞的扩增与病毒感染程度的加重及T细胞活化水平的增高直接相关，而CD8+T细胞表面CD127表达水平降低，会引起效应T细胞向记忆性T细胞分化的障碍，导致HIV特异性CD8+T细胞不能长期存活。因此，CD127越来越被认为是HIV感染进展的重要检测指标。另外，CD127在包括乳腺癌和肺癌在内的不同实体癌中均有扩增，其高水平与不良预后相关。
随着对CD127研究的入，其作为某些细胞特异性的标记物方面也发挥着重要作用，最常见的是CD127作为调节性T细胞(Treg T Cell)的阴性表面标记物。调节性T细胞稳态主要依赖IL-2而不是IL-7，其表面低表达CD127，因此，CD127可以帮助识别Treg细胞(CD4+CD25+CD127low)与活化的T细胞(CD4+CD25+CD127high)，通过CD4+CD25+CD127low纯化亚群的方法在Treg细胞功能研究中发挥重大作用。除此之外，CD127还作为记忆T细胞(Memory TCell)表面标记物，根据CD127及CD62L的表达将抗原刺激后的CD8+T细胞分为三种亚型：中心性记忆性T细胞(CD62L+CD127+)、效应性记忆性T细胞(CD62L-CD127+)及效应性T细胞(CD62L-CD127-)。由此可见CD127对于T细胞等免疫细胞分型的研究具有重大意义。
基于CD127的表达特征和其标记价值，对CD127的检测显得十分重要。在活细胞检测层面，主要是通过流式细胞术(Flow Cytometry，FC)来鉴定细胞亚群，这对于CD127流式抗体的需求日益增多，对于抗体研发的挑战也日益增大。目前市面上大多数CD127流式抗体均采用鼠抗人单克隆抗体，其亲和力和特异性较低，在流式检测时存在着灵敏度不高、背景干扰大等挑战。因此，开发特异性强、抗干扰能力好的针对人CD127蛋白的单克隆抗体已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中抗人CD127蛋白抗体的特异性和抗干扰能力差、难以用于免疫学检测尤其是流式细胞检测等问题，本发明提供了抗人CD127蛋白的抗体和抗体偶联物，并进一步提供了该抗体或抗体偶联物在制备人CD127蛋白免疫检测试剂盒中的应用以及相关的免疫检测试剂盒。为实现前述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗人CD127蛋白的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5所示；所述重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述抗体为全长抗体或其抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
本发明第二方面提供了一种抗体偶联物，包含如上所述的抗人CD127蛋白的抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
本发明第三方面提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的抗人CD127蛋白的抗体。
进一步地，所述抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.12所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.14所示或是与之互补的序列。
更进一步地，所述抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.11所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.13所示或是与之互补的序列。
本发明第四方面提供了如上所述的抗人CD127蛋白的抗体或抗体偶联物在制备人CD127蛋白免疫检测试剂盒中的应用。
本发明第五方面提供了一种人CD127蛋白免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的抗人CD127蛋白的抗体或抗体偶联物。
进一步地，所述免疫检测试剂盒为流式细胞检测试剂盒。
进一步地，所述CD127蛋白为全长蛋白或是CD127蛋白21-236aa片段。
本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的具备上述CDR序列的抗人CD127蛋白的抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD127蛋白以及细胞或组织中天然表达的CD127蛋白，具有良好的特异性和较高的亲和性，能够有效抗细胞组分干扰，有效降低免疫检测CD127蛋白时的非特异性结合等造成的假阳性或假阴性结果，提高检测结果的准确性、灵敏度和可靠性，在流式细胞等免疫检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1采用酶联免疫吸附法检测免疫血清滴度的结果图；
图2为本发明实施例1采用流式细胞术检测免疫血清与293T细胞结合情况的直方图，其中，从左至右，血清稀释度依次为1：500和1：2000；
图3为本发明实施例1采用流式细胞术检测免疫血清与293T细胞结合情况的平均荧光强度统计结果图；
图4为本发明实施例1构建抗人CD127蛋白的抗体所用的哺乳动物表达载体pRB322图谱，从左至右分别为预先携带抗体轻链恒定区和重链恒定区的载体；
图5为本发明实施例2采用流式细胞术检测抗人CD127蛋白的抗体与293T细胞结合情况的直方图；
图6为本发明实施例2采用流式细胞术检测抗人CD127蛋白的抗体与PBMC细胞结合情况的直方图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B以及(iii)A和B。
术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“兔源抗体”和“兔单抗”等类似词语具有相同含义，如非特殊说明，均指特异性结合人(Human)白细胞介素IL-7受体α链的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。术语“白细胞介素IL-7受体α链”、“CD127”、“IL-7Rα”和“CD127/IL-7Rα”具有相同含义，可互换使用。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
抗体片段是全长抗体的一个或多个部分或片段，基本上保持与全长形式具有相同的生物学功能或活性，具体而言，抗体片段至少包括与全长抗体相同的CDR区，更优选地具有相同的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2，这些抗体片段可通过本领域的常规技术获得。
(i)Fab：抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和第一恒定区)构成的单价片段，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc'片段。F(ab')2片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备scFv一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构。
(ii)F(ab)2：包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab构成的双价片段。
(iii)Fv：可变片段(Fv)位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整抗体。
(iv)(Fv)2：由两个共价连接在一起的Fv片段构成。
(v)scFv：单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)是由单一多肽链构成的Fv片段，由一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)通过柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接构成。
在一些实施例中，本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。在另一些实施例中，抗体可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如，人源化抗体、嵌合抗体等类型，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自鼠FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如鼠兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到鼠类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他鼠类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。
术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能自然发生的少量突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，对抗原上的相同或基本相同的表位显示出单一的结合特异性和亲和力。修饰词“单克隆”表明抗体是从一个基本同质的抗体群体中获得的，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。该抗体可以通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种抗人CD127蛋白的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，分别命名为CDR1、CDR2和CDR3，其中，轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示；重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明提供的具备上述CDR序列的抗人CD127蛋白的兔单克隆抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD127蛋白以及细胞或组织中天然表达的CD127蛋白，通过流式细胞法进行免疫检测，在表达CD127蛋白阳性细胞上有明显的荧光跃迁且信号强度单一，而在不表达CD127蛋白的阴性细胞中无荧光信号跃迁，证明该抗体对CD127蛋白具有良好的特异性和较高的亲和性，能够有效抗细胞组分干扰，有效降低免疫检测CD127蛋白时的非特异性结合等造成的假阳性或假阴性结果，提高检测结果的准确性、灵敏度和可靠性，在流式细胞等免疫检测领域具有广阔的应用前景。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。本发明抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
可选地，本发明抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成完整轻链(FL)，CH和VH构成完整重链(FH)。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。具体地，所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
可选地，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体(具有典型的Y型分子结构)或为所述全长抗体的抗原结合区域；该抗原结合区域是指基本上保持与抗体全长形式具有相同生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗原结合区域包括如上所述的CDR区，更优选地具有如上所述的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。可选地，所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv和sc(Fv)2中的至少一种。这些抗原结合区域可通过本领域的常规技术获得。
本发明又一实施例提供了一种抗体偶联物，包含如上所述的抗人CD127蛋白的抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
检测标记用于产生可识别的信号变化，以根据所述信号变化识别待检样本。检测标记包括但不限于：生物素、荧光染料(如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯)、荧光蛋白(如异藻蓝蛋白、藻红蛋白、PerCP和藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、抗生物素蛋白)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
本发明另一实施例提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子用于编码如上所述的抗人CD127蛋白的抗体。
核酸分子可以是DNA形式(如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。
核酸分子的序列依据抗体AA序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。将所得核酸分子插入表达载体内，然后导入宿主细胞，并在特定条件下培养，即可表达获得抗体。
示例性地，所述抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.12所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.14所示或是与之互补的序列。
示例性地，所述抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.11所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.13所示或是与之互补的序列。
本领域技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，不同于上述示例的核酸分子同样可以编码得到本发明的抗体，因此，上述示例的核酸分子不应作为对本发明保护范围的限定。
构建重组载体的原始载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒(如pBR322、pUC系列、pET系列、pGEX系列)、病毒载体、噬菌体(如λgt4λB、λ-Charon、λΔz1和M13)、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件以允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
编码本发明抗体FL与FH的核酸分子可以分别插入到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，抗体FL与FH的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2处理；也可通过显微注射、电穿孔或脂质体包装等。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电穿孔法、脂质体包装或粒子轰击等方式实现基因导入。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。可用于本发明的原核宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌(例如DH5α、JM109、BL21、W3110)、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)以及肠杆菌科菌株(例如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌)和假单胞菌属。可用于转化的真核宿主细胞的实例包括但不限于酵母、昆虫细胞和动物细胞，例如果蝇S2或Sf9细胞，哺乳动物CHO、CHO DG44、CHO-S、COS-7、293系列细胞、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK和HEK293细胞系。在获得转染或转化如上所述重组载体的宿主细胞后，在适合条件下培养，即可表达出抗体，再进行分离，得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，所述重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，所述宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明再一实施例提供了如上所述的抗人CD127蛋白的抗体或抗体偶联物在制备人CD127蛋白免疫检测试剂盒中的应用。
所述抗人CD127蛋白的抗体或抗体偶联物在制备人CD127蛋白免疫检测试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人CD127蛋白的抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
基于相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种人CD127蛋白免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的抗人CD127蛋白的抗体或抗体偶联物。
需要说明的是，本发明的抗体可以单独使用，也可与检测标记结合或偶联形成抗体偶联物。在一些实施方案中，将本发明的抗体作为抗原结合抗体，其特异性识别和结合待检样本中的CD127蛋白，之后通过与其连接的检测标记产生可识别的信号变化来实现定性或定量检测CD127蛋白，在另一些实施方案中，不标记抗人CD127蛋白的抗体(作为一抗或捕获抗体)，而将检测标记偶联可结合一抗的二抗(作为检测抗体)或其他分子，例如，如果抗人CD127蛋白抗体是兔源IgG抗体，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联检测标记的二抗特异性结合本发明的抗体之后产生可识别信号的变化，从而实现定性或定量检测。
上述所述的免疫检测方法包括但不限于：酶免疫分析法(Enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹法(Western blot，WB)、免疫沉淀法(Immunoprecipitation，IP)和流式细胞法(Flow Cytometry，FC)。检测对象包括重组表达的CD127蛋白以及天然分泌或表达的CD127蛋白，CD127蛋白可以为全长形式或是其21-236aa片段。检测样品包括但不限于血清、血浆、尿液、细胞培养液和组织匀浆。
在较佳的实施方式中，所述免疫检测方法为流式细胞法，所述试剂盒为流式细胞检测试剂盒。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗人CD127蛋白的兔源单克隆抗体的制备
为了获得识别人CD127/IL-7Rα蛋白的兔单克隆抗体，采用的免疫原为商品化人重组CD127/IL-7Rα蛋白(来自ABclonal，货号RP02407)，免疫新西兰大白兔，获得免疫增强的兔源B淋巴细胞，之后基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，分选出单个抗原特异性B淋巴细胞，再通过PCR扩增，将抗原特异性B淋巴细胞的抗体编码基因克隆出来，得到编码重链、轻链氨基酸的核酸序列，将编码重链、轻链氨基酸的核酸连接至表达载体中后，进行重组表达，筛选得到目标抗体株2D11。抗体测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，抗体的氨基酸(AA)和核酸(DNA)序列见表1，表中LCDR1-3分别表示轻链互补决定区CDR1-3，HCDR1-3分别表示重链互补决定区CDR1-3。
表1本实施例兔单克隆抗体2D11的序列信息
1.1、动物免疫
将商品化人重组CD127/IL-7Rα蛋白(来自ABclonal，货号RP02407)按200μg每只，免疫新西兰大白兔，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次，三次免疫后，取免疫血清按1：24300稀释后用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定血清滴度，取OD450大于0.2的兔子，同时对终免血清进行流式细胞术检测，取血清效价高且满足流式检测的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物并取脾脏。
1.2、血清滴度ELISA检测
血清滴度检测的酶联免疫吸附(ELISA)法包括如下步骤：1)包被：用1×PBS缓冲液稀释的人CD127/IL-7Rα蛋白(终浓度为1μg/mL)，在384孔板中按25μL/孔加入包被液，将384孔板配平后，短暂离心(rpm到达1000后停止)平板，4℃过夜；2)封闭：取出4℃中过夜的平板，用洗板机在每孔中加入75μL的洗涤缓冲液洗涤5次；使用排枪加入封闭缓冲液50μL/孔到平板内，并在室温下孵育1h，用于封闭不相关的结合位点；3)待测血清梯度稀释及加样：重复2)洗板过程清洗孔板，在96孔板中对待测血清进行梯度稀释，用稀释缓冲液对血清以1：1000开始，进行三倍稀释，一共8个梯度，稀释比例可根据实际情况进行调整；4)二抗孵育：重复2)洗板过程清洗孔板，用稀释缓冲液对辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG((购自Jackson，货号111-035-045))进行稀释，稀释比为1：5000，按照25μL/孔加入稀释好的羊抗兔IgG-HRP到平板内，用于结合平板中的目的蛋白，并在室温下避光孵育1h；5)终止反应及显色：重复2)洗板过程清洗孔板，按照100μL/孔加入TMB显色，37℃避光10min，加100μL/孔稀释盐酸溶液终止反应，测450nm吸收值，以免疫前兔血清作为阴性对照，以测定值与对照值的比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
上述各溶液配方如下：1)洗涤缓冲液：将1.8L 1×PBS(购自biosharp，货号BL601A)和2mL Tween-20(购自国药，货号30189328)充分混匀，补充ddH2O至总体积2L；2)封闭缓冲液：将90mL 1×PBS、5g Skim milk、1g BSA(购自Biofrox，货号4240GR500)和0.05mLTween-20充分混匀，补充ddH2O至总体积100mL，现配现用；3)稀释缓冲液：将90mL 1×PBS、1g BSA和0.05mL Tween-20充分混匀，补充ddH2O至总体积100mL；4)TMB显色液：将71.628g十二水合磷酸氢二钠和29.41g二水合柠檬酸三钠加入800mL ddH2O充分混匀，用一水合柠檬酸调pH至5.0，补充ddH2O至总体积1L；5)终止液：将79mL纯水和21mL盐酸充分混匀，室温存放使用。
血清滴度检测结果见图1，可见在第四次加强免疫时兔体内产生了较强的免疫反应，抗体滴度高，且第四次免疫的血清效价最优，可用于分离抗体。
1.3、血清流式细胞术检测
血清与细胞样本的流式细胞(FC)分析包括如下步骤：1)紫外照射消毒超净工作台15-20min，开风机5min，准备无菌工作；2)收集并洗涤细胞，然后测定细胞总数和活力，具体操作如下：倒掉细胞培养基，用10mL 1×PBS(购自biosharp，货号BL601A)(pH7.4)清洗细胞，再用3mL 0.05％Trypsin-EDTA(购自Gibco，货号25300062)溶液室温下消化3min，在显微镜下观察有大量细胞脱落，用15mL培养基终止反应，最后用移液枪反复吹打冲洗贴壁细胞收集于50mL离心管中，400g、5min离心细胞，将细胞收集后测定细胞总数，并检查细胞活力是否不低于90％；3)用含0.5％BSA(购自Biofrox，货号4240GR500)的PBS溶液(0.5％BSA/PBS)重悬细胞至约3×106-5×106细胞/mL，按每孔50μL将细胞分配到96孔V型板里；4)将用0.5％BSA/PBS稀释好的免疫血清(作为一抗)50μL分配到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，常温孵育20min，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀，保证染色均匀充分，待检血清和阴性血清分别按1：500和1：2000稀释；5)400g离心5min，弃上清，用200μL 0.5％BSA/PBS洗涤2次，400g离心5min，弃上清；6)将使用0.5％BSA/PBS按1：200稀释好的荧光二抗(购自Jackson，111-136-144)按每孔100μL的体积分配到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，常温避光孵育20min，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀，保证染色均匀充分；7)用200μL 0.5％BSA/PBS洗2次，最后用200μL 0.5％BSA/PBS重悬每孔细胞，避光保存；8)流式分析：按Beckmancytoflex流式分析仪使用与维护SOP-105-AND-CA-008操作进行分析。同型对照采用RabbitIsotype Control抗体(来自ABclonal，货号A22070)，阳性对照抗体购自Biolegend，货号351315，空白对照加入100μL 0.5％BSA/PBS。
细胞样本包括不表达CD127的人肾上皮(293T)细胞(阴性样本)以及过表达CD127的293T细胞(阳性样本)。阳性细胞样本制备方法包括：使用Human CD127蛋白序列Glu21-Gly236aa片段对应的基因序列构建至pCDNATM3.1载体(购自Thermo，V38520)，形成重组质粒；将正在培养的293T(购自Thermo)传代后以细胞密度为5×105/mL铺板，接种至直径为10cm的TC处理的细胞培养皿(购自JET，货号TCD010100)中进行培养，体系为10mL。培养24h后将293T培养基换为等体系的opti-MEM(购自gibco，货号31985088)，取构建好的目的质粒10μg，与转染试剂PeiMAX(购自polysciences，货号24765-1)按照比例为1μg：3μL的比例混合反应10min。将混合液滴入细胞培养皿中并混匀。经培养48h后，通过0.05％的胰酶(购自gibco，25300062)消化吹打使皿中细胞掉落并收集至离心管中，即可得到所需过表达CD127细胞样本。其中，CD127蛋白序列参见NCBI登录号：NP_000871.1或Uniprot ID：P16871，基因序列参见NM_000880.4，其中CD127蛋白21-236aa对应NM_000880.4的542-1075bp碱基。
血清流式细胞检测直方图数据见图2，其中，横坐标表示相对荧光强度，纵坐标表示相对细胞个数，红色曲线为空白对照，蓝色曲线为同型对照，黄色曲线为待检免疫血清，绿色曲线为阳性对照；MFI平均荧光强度统计结果见图3。结果显示，竞品阳抗(绿色)在阳性样本上有信号跃迁差异，说明过表达CD127细胞样本制备成功。待检血清在过表达CD127细胞阳性样本上有高于阴性样本的信号，且待检血清阳性信号明显强于阴性血清，说明该血清中有针对CD127/IL-7Rα的特异性抗体存在，故择优选择N28519-4血清对应的N28519新西兰大白兔进行最终免疫。
1.4、分离脾脏中B淋巴细胞和进行B淋巴细胞分选
采用常规方法分离脾脏中B淋巴细胞，并分选得到抗原特异性的B淋巴细胞，相关方法参见已公开专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日期：2019-07-16)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日期：2020-08-11)”。
1.5、编码兔源单克隆抗体基因的克隆
将培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。
以前述cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来并进行测序。PCR反应体系包括：4μLcDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×Gloria HiFi(来自ABclonal，货号RK20717)和6.5μL H2O；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。扩增VL和VH基因的引物序列(5'-3')如下所示，F和R分别表示正向引物和反向引物。
VL-F：tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC(见SEQ ID NO.15)；
VL-R：cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG(见SEQ ID NO.16)；
VH-F：tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG(见SEQ ID NO.17)；
VH-R：gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG(见SEQ ID NO.18)。
1.6、兔单克隆抗体的表达和规模化生产
为了获得多株识别人CD127蛋白的抗体，将携带轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因的哺乳动物表达载体pBR322分别用XbaI和NheI限制性内切酶常规线性化处理，将上述扩增的包含信号肽的VL和VH基因分别装载在携带CL和CH基因的表达载体pBR322上，得到轻链基因和重链基因表达载体，经测序验证表达载体构建成功。所用载体表达图谱见图4，图中，pBR322origin和f1origin为复制启动子，Ampcillin为抗性基因，CMVpromoter为转录启动子，SV40PAterminator为加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。CL、CH基因通过查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgGKappa C reign获得CL。
本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”和专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”的轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
将构建成功的含有轻链(FL)基因和重链(FH)基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的识别人CD127蛋白的兔源单克隆抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从培养上清液中纯化出目的抗体2D11。使用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，抗体纯度大于95％。将纯化抗体分装后于-20℃低温保存备用。
实施例2兔单克隆抗体2D11对抗原识别表位鉴定
2.1、过表达CD127蛋白的293T阳性细胞验证
获得人CD127/IL-7Rα兔单克隆抗体后，通过流式细胞术对抗体亲和能力及抗原识别表位鉴定，具体见实施例1中步骤“1.3、血清流式细胞术检测”，区别仅在于将免疫血清替换为抗体2D11，抗体2D11工作浓度为2μg/mL，荧光二抗购自Jackson(货号111-136-144)，同型对照加入100μL稀释后的Rabbit Isotype Control(来自ABclonal，货号A22070)，空白对照加入100μL 0.5％BSA/PBS，阳性对照加入100μL稀释后的阳性抗体(购自Biolegend，货号351315)。
兔单克隆抗体2D11通过流式细胞法检测293T阳性细胞的直方图数据如图5所示，其中，横坐标表示相对荧光强度，纵坐标表示相对细胞个数，红色曲线为空白对照，蓝色曲线为同型对照，黄色曲线为待检抗体2D11。结果显示，待检抗体2D11(黄色曲线)在过表达CD127蛋白的293T阳性细胞样本上有明显的高表达群(此处阳性峰双峰主要因过表达样本转染效率所致)，在阴性样本上无背景信号，空白对照(红色曲线)和同型对照(蓝色曲线)无明显信号跃迁，说明2D11抗体株可以满足流式检测检测需求。
2.2、高表达CD127蛋白的原代PBMC细胞验证
上述检测使用的阳性样本为293T细胞，本实施例使用人(Human)外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)(购自澳能生物，货号PB003F-C-10M)对该抗体进行原代验证，PBMC包括淋巴细胞和单核细胞。CD127作为调节性T细胞(Treg TCell)等相关免疫表型的分子标记(marker)，在临床等实际应用场景中，较多适用于血液、组织、PBMC等样本上，故增加PBMC原代样本进行验证，并同时与竞品抗体进行对比，展示该抗体在实际应用端的性能。抗体流式细胞检测方法同上。
兔单克隆抗体2D11通过流式细胞法检测PBMC细胞的直方图数据如图6所示，其中，横坐标表示相对荧光强度，纵坐标表示相对细胞个数，红色曲线为空白对照，蓝色曲线为同型对照，黄色曲线为待检抗体2D11，结果显示本发明的抗体在PBMC上有明显的高表达群(黄色曲线)，能够清晰地区分CD127-和CD127+细胞群，阳性信号强于竞品抗体(绿色曲线)且信号单一，空白(红色曲线)及同型对照(蓝色曲线)均无信号跃迁，证明抗体2D11可以识别天然状态的CD127蛋白，具有特异性高、抗干扰能力强等优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人CD127蛋白的抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；所述重链可变区上互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的抗人CD127蛋白的抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求2所述的抗人CD127蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的抗人CD127蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体为全长抗体或其抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
5.一种抗体偶联物，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的抗人CD127蛋白的抗体，以及与所述抗体连接的检测标记。
6.一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项所述的抗人CD127蛋白的抗体。
7.根据权利要求6所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述抗体轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.12所示或是与之互补的序列，重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.14所示或是与之互补的序列。
8.根据权利要求7所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述抗体轻链的核酸序列如SEQ ID NO.11所示或是与之互补的序列，重链的核酸序列如SEQ ID NO.13所示或是与之互补的序列。
9.一种人CD127蛋白免疫检测试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述的抗人CD127蛋白的抗体、或如权利要求5所述的抗体偶联物。
10.根据权利要求9所述的人CD127蛋白免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为流式细胞检测试剂盒。
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