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CN117362431B - 抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN117362431B CN202311080455.4A CN202311080455A CN117362431B CN 117362431 B CN117362431 B CN 117362431B CN 202311080455 A CN202311080455 A CN 202311080455A CN 117362431 B CN117362431 B CN 117362431B
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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体及其应用。所述兔单克隆抗体包括2H4和/或3F5，兔单克隆抗体2H4的轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示；兔单克隆抗体3F5的轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13‑15所示，重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18‑20所示。本发明的兔单克隆抗体2H4和/或3F5对小鼠IL‑10的亲和力高且特异性好，用于免疫检测时具有高准确性、良好的可靠性和优良的抗干扰能力以及优异的检测灵敏度等优点。

Description

抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体及其应用。
背景技术
白细胞介素10(interlenkin 10，IL-10)，简称白介素10，也称为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)，是一种多效性细胞因子，其主要由抗原呈递细胞分泌，如活化的T细胞(主要包括Th2细胞)、单核细胞、B细胞和巨噬细胞。小鼠和人IL-10基因都定位于第1号染色体，其基因组包括5个外显子和4个内含子。人和小鼠IL-10在DNA和氨基酸水平上分别有81％和73％的同源性，人IL-10可作用于鼠源性细胞，而小鼠IL-10对人的细胞则无交叉反应。IL-10具有双向免疫调节作用，可以在多种类型细胞中发挥免疫抑制或免疫刺激的作用，一方面，IL-10可以通过降低树突状细胞、巨噬细胞表面主要组织相容性抗原Ⅱ(MHC2)类分子的表达，削弱抗原呈递细胞(APC)的功能，还能下调T淋巴细胞活性，抑制炎性细胞的激活、迁移和粘附，在肿瘤环境中对免疫应答具有负向调节作用；另一方面，IL-10对T、B淋巴细胞具有刺激作用，并且在肿瘤环境中IL-10也能发挥刺激作用。IL-10的双向调节作用不仅影响免疫系统，而且可以通过调节生长因子、细胞因子影响许多病理生理过程，包括血管生成、肿瘤形成和感染，还能通过诱导调节性T细胞在外周耐受中建立作用。
IL-10表达异常如过度表达和缺乏都具有病理生理学意义，肿瘤生长、全身性红斑狼疮(SLE)、淋巴瘤、皮肤癌属于IL-10表达过多的疾病，而克罗恩病、银屑病、炎症性肠病、类风湿性关节炎、哮喘、器官移植反应属于IL-10表达缺乏的疾病；因此，检测IL-10水平对相关疾病进展的诊断和评估以及预后判断具有重要的指导意义。
开发特异性好的抗IL-10抗体是实现精确、灵敏检测IL-10的基础。目前，已有专利公开了用于IL-10蛋白的免疫检测抗体的开发，采用的免疫原主要是人源、禽源或鱼源的IL-10重组蛋白，并无针对鼠源IL-10蛋白开发的单克隆抗体。然而，相当多的IL-10研究相关的动物疾病模型是用小鼠物种造模的，因此开发一种性能优良的抗小鼠白细胞介素10的单克隆抗体对深入研究该蛋白的生物学功能和对IL-10抗原在相关疾病中的表达水平检测具有非常重要的意义和临床使用价值。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体，包括兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)；其中：所述兔单克隆抗体2H4的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；所述兔单克隆抗体3F5的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18-20所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体2H4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述兔单克隆抗体3F5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述兔单克隆抗体2H4和所述兔单克隆抗体3F5的轻链恒定区均为κ链，重链恒定区均为IgG1型。
进一步地，所述兔单克隆抗体2H4的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述兔单克隆抗体3F5的轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5。
进一步地，所述兔单克隆抗体2H4的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述兔单克隆抗体3F5的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
本发明第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包含用于编码如上所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5的核酸分子。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的重组载体或者所述宿主细胞的基因组中整合有编码如上所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5的核酸分子。
本发明第五方面提供了一种免疫检测小鼠白细胞介素10的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5。
进一步地，免疫检测方法包括酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞术中的一种或多种。
进一步地，免疫检测方法为双抗夹心酶联免疫吸附法，所述双抗体夹心酶联免疫吸附法中，捕获抗体为所述兔单克隆抗体2H4，检测抗体为经可检测标记物标记的所述兔单克隆抗体3F5。
进一步地，免疫检测样本为表达IL-10蛋白的组织样本、表达IL-10蛋白的细胞系样本、分泌IL-10蛋白的血清样本和重组表达的IL-10蛋白中的一种或多种。
本发明的优点及积极效果为：
1、本发明提供的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5对小鼠白细胞介素10的亲和力高且特异性好，在用于免疫检测小鼠IL-10蛋白具有高准确性、良好的可靠性和优良的抗干扰能力，为免疫检测小鼠IL-10蛋白的分布、表达水平或生物学功能提供了有效的抗体原材料。
2、本发明提供的兔单克隆抗体2H4和3F5识别和特异性结合小鼠IL-10蛋白表面不同的抗原表位且互不干扰，可作为双抗夹心酶联免疫吸附法的配对抗体，以兔单克隆抗体2H4为捕获抗体，兔单克隆抗体3F5为检测抗体，检测小鼠IL-10蛋白的检测限为1.965pg/mL，建立的双抗夹心酶联免疫吸附法具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等诸多优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为预先携带轻链恒定区和重链恒定区的pRB322载体图谱；
图2为本发明实施例1兔单克隆抗体2H4与小鼠IL-10蛋白结合的亲和力曲线图；
图3为本发明实施例1兔单克隆抗体3F5与小鼠IL-10蛋白结合的亲和力曲线图；
图4为本发明实施例1兔单克隆抗体2H4和3F5的抗原决定簇识别曲线图；
图5为本发明实施例2基于兔单克隆抗体2H4和3F5建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的标准曲线图；
图6为本发明实施例3基于兔单克隆抗体2H4和3F5建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的特异性测定结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
在本发明的上下文中，术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”等类似词语具有相同含义，可互换使用，均指特异性结合小鼠白细胞介素10(IL-10)蛋白的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。其中，“抗体片段”是指全长抗体的一个或多个部分或片段，在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。“兔单克隆抗体”表明抗体由兔产生。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体，包括兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)；其中：所述兔单克隆抗体2H4的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述兔单克隆抗体3F5的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。
本发明以小鼠白细胞介素10(IL-10)蛋白为免疫原，利用单个B细胞筛选和培养技术，成功开发了抗小鼠IL-10的兔单克隆抗体2H4和兔单克隆抗体3F5。抗体的生物学功能在于抗体的互补决定区(CDR)与抗原决定簇之间的空间构象互补，抗体对潜在抗原的亲和力和特异性大部分由CDR序列的长度和氨基酸组成决定，本发明具备上述CDR序列的兔单克隆抗体2H4和3F5可以特异性识别重组表达的小鼠IL-10蛋白以及小鼠血清分泌或组织、细胞表面表达的天然IL-10蛋白，以重组表达的小鼠IL-10蛋白作为检测对象，兔单克隆抗体2H4和3F5的亲和常数(KD)分别为1.38×10-10(M)和1.24×10-10(M)，具有高的亲和力，进一步通过交叉实验发现，二者均仅特异性识别和结合小鼠IL-10蛋白，对与小鼠IL-10蛋白相近的其他白介素系列蛋白及人源IL-10蛋白没有交叉反应，具有高度的专一性，证实该抗体在免疫检测小鼠IL-10蛋白具有高准确性、良好的可靠性和优良的抗干扰能力，为免疫学检测小鼠IL-10蛋白的分布、表达水平或生物学功能提供了有效的抗体原材料。此外，兔单克隆抗体2H4和3F5可以识别小鼠IL-10蛋白表面不同的抗原表位，基于此，可以开发针对小鼠IL-10蛋白的双抗夹心酶联免疫吸附方法，以兔单克隆抗体2H4为捕获抗体，兔单克隆抗体3F5为检测抗体，采用双抗夹心酶联免疫方法检测小鼠IL-10时的检测限为1.964752pg/mL，可见能够在血清、细胞、组织样本中稳定检测极微量水平的小鼠IL-10，具有特异性好、检测灵敏度高和稳定性强等诸多优点，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。所述兔单克隆抗体2H4的轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述兔单克隆抗体3F5的轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
可选地，本发明的兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成完整轻链，CH和VH构成完整重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。
示例性地，所述兔单克隆抗体2H4和所述兔单克隆抗体3F5的轻链恒定区均为κ链，重链恒定区均为IgG1型。
对应地，所述兔单克隆抗体2H4的轻链(L链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链(H链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述兔单克隆抗体3F5的轻链(L链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链(H链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5。
核酸分子可以是DNA形式(例如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(例如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或是非编码链。核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。
示例性地，所述兔单克隆抗体2H4的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。所述兔单克隆抗体3F5的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。本领域技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，不同于前述示例的核酸分子同样可以编码得到兔单克隆抗体2H4和3F5，因此，上述示例的核酸分子不应作为对本发明保护范围的限定。
核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。此外，为了便于纯化，还可将重链和轻链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
本发明另一实施例提供了一种重组载体，所述重组载体包含用于编码如上所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5的核酸分子。
所述重组载体可通过本领域常规方法将本发明提供的核酸分子连接于各种载体上构建而成。载体只要其能够容载所述核酸分子即可。常用的载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。
载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中形成携带本发明核酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
编码本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以分别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，编码如本发明兔单克隆抗体的重链与轻链的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。后述的表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2法处理，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔和脂质体包装等。
本发明再一实施例提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的重组载体或者所述宿主细胞的基因组中整合有编码如上所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5的核酸分子。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转化如上所述的表达载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出单克隆抗体，然后再进行分离以得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，上述所述的重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明实施例还提供了如上所述的抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体、如上所述的宿主细胞在制备免疫检测小鼠白细胞介素10的试剂盒中的应用。
所述在制备免疫检测小鼠白细胞介素10的试剂盒中的应用优势与如上所述的抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
本发明的兔单克隆抗体2H4和3F5可以分别单独使用，也可以配对使用，还可以分别与可检测标记物(用于产生检测信号)结合或偶联。用于产生检测信号的可检测标记物包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶(如辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
在免疫检测时，如分开使用2H4或3F5，则将本发明的抗体2H4或3F5作为抗原结合抗体(捕获抗体)，其特异性识别和结合待检样本中的IL-10蛋白，之后通过与其连接的可检测标记物产生可识别的信号变化，或者通过偶联有可检测标记物的检测抗体如IgG特异性结合本发明的抗体以产生可识别的信号变化，从而实现定性或定量检测小鼠IL-10蛋白。
在较佳的实施方式中，免疫检测方法包括但不限于：酶免疫分析法(Enzymeimmunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹法(Western blot，WB)、流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)等。
可选地，免疫检测样本包括但不限于：表达IL-10蛋白的组织样本、表达IL-10蛋白的细胞系样本、分泌IL-10蛋白的血清样本和重组表达的IL-10蛋白，其中，血清、细胞或组织中IL-10蛋白可以以天然状态存在。
基于本发明的兔单克隆抗体2H4和3F5识别不同的抗原表位，上述所述的免疫检测方法优选为酶联免疫吸附法，尤其是双抗夹心酶联免疫吸附法，所述双抗体夹心酶联免疫吸附法中，捕获抗体为兔单克隆抗体2H4，检测抗体为经可检测标记物(如生物素)标记的兔单克隆抗体3F5。经兔单克隆抗体2H4和3F5配对检测小鼠IL-10具有很高的灵敏性和特异性，检测限低至1.965pg/mL。
基于相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种免疫检测小鼠白细胞介素10的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5。
所述免疫检测小鼠白细胞介素10的试剂盒的优势与如上所述的抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗小鼠IL-10蛋白的兔单克隆抗体制备
本实施例用来制备小鼠白细胞介素10(IL-10)兔单克隆抗体的免疫原来自哺乳表达系统在HEK293细胞中表达得到的具有生物活性的重组小鼠IL-10成熟蛋白(购自ABclonal，货号RP01465)，IL-10蛋白序列参见NCBI登录号NP_034678.1，成熟蛋白表达区域为前述序列的Ser19-Ser178(19-178aa)，C端带6×His tag，成熟蛋白为单体形式，理论分子量大小为17.6KDa，因有糖基化修饰，在后续实际检测时大小为20-24kDa。抗体制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，具体包括以下步骤：
1、动物免疫
以重组小鼠IL-10成熟蛋白(购自ABclonal，货号RP01465)为免疫原，免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，血清按1：243000倍数稀释后用ELISA方法测定其针对小鼠IL-10的滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
2、分离脾脏中B淋巴细胞
在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
3、B淋巴细胞分选与培养
参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。
4、编码兔单克隆抗体基因的克隆
培养后的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA鉴定出能够结合小鼠IL-10蛋白的阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后按Quick-RNATM MicroPrep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来，由金开瑞生物科技有限公司测序确定序列。前述PCR反应体系如下：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×GloriaHiFi(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20717)和6.5μL H2O；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
上述所述的正向引物和反向引物的核酸序列(5'-3')如下所示：
VL-F(见SEQ ID NO.25)：tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC；
VL-R(见SEQ ID NO.26)：cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG；
VH-F(见SEQ ID NO.27)：tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG；
VH-R(见SEQ ID NO.28)：gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG。
5、兔单克隆抗体的生产和纯化
为了获得多株识别小鼠IL-10蛋白的兔单克隆抗体，将上述挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因(上游具有信号肽)分别装载在表达载体pBR322上，所使用的表达载体pBR322预先携带轻链和重链恒定区，其表达图谱见图1，其中，pBR322Ori和f1Ori是E.coli中的复制起始位点，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为转录启动子，SV40 PAterminator是加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。具体方法步骤如下：将含兔单克隆抗体CH和CL的哺乳动物细胞表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，将上述扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将上游具有信号肽编码基因的VL基因和VH基因构建到表达载体中，经测序验证表达载体构建成功之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染后培养72-96h，培养获得含有识别小鼠IL-10的兔单克隆抗体的上清液。使用protein A亲和凝胶树脂从培养上清液中纯化出识别小鼠IL-10的兔单克隆抗体，使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。亲和层析采用本领域的常规操作，在此不再赘述。
需要说明的是，本实施例VL基因和VH基因上游的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，具体可参见专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”或“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”，轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”或“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
6、单克隆抗体筛选及鉴定
获得多株小鼠IL-10兔单克隆抗体后，首先对兔单克隆抗体进行初步鉴定和筛选，包括抗体亲和力的鉴定及抗原识别表位的鉴定，具体方法如下：
1)抗体亲和力测定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体的亲和力进行初步测定。使用的抗原材料为重组小鼠IL-10蛋白，工作浓度为3μg/mL，兔单克隆抗体的工作浓度为2μg/mL；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择解离常数KD≤1×10-9(M)的抗体。
2)抗原识别表位的鉴定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对解离常数KD≤1×10-9的兔单克隆抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇；其中，抗原为重组小鼠IL-10蛋白，工作浓度为3μg/mL，第一和第二抗体的工作浓度均为3μg/mL。通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位的两个抗体，分别命名为兔单克隆抗体2H4和3F5。
图2-3分别示出了兔单克隆抗体2H4和3F5与小鼠IL-10蛋白结合的亲和力曲线，其中，横坐标表示结合时间，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后、结合物的厚度变化，兔单克隆抗体2H4工作浓度为5.94μg/mL，兔单克隆抗体3F5工作浓度为8.61μg/mL；深灰色曲线为实时结合数值曲线，浅灰色曲线为拟合平均值曲线。通过曲线拟合和计算，获得抗体的亲和力相关参数(见表1)，解离系数Koff用于表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数Kon用于表征抗体与其靶标结合速度的常数，解离常数KD为Koff/Kon的比，表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数。由图2-3和表1可知，兔单克隆抗体2H4和3F5与重组小鼠IL-10的亲和常数KD分别为1.38×10-10(M)和1.24×10-10(M)，均低于纳米级，表明与IL-10蛋白的亲和力高。
表1兔单克隆抗体2H4和3F5的亲和力相关参数测定结果
兔单克隆抗体 Koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M)
2H4 8.33×10-5 6.04×105 1.38×10-10
3F5 6.59×10-5 5.33×105 1.24×10-10
图4示出了兔单克隆抗体2H4和3F5的抗原决定簇识别结果，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后、结合物的厚度变化，横坐标表示结合时间，图中，2H4表示兔单克隆抗体2H4，3F5表示兔单克隆抗体3F5。从图中可以看出，在兔单克隆抗体2H4和重组小鼠IL-10蛋白结合后，兔单克隆抗体3F5仍旧能够结合IL-10蛋白，证明兔单克隆抗体2H4和3F5结合在IL-10蛋白表面不同的部位，识别不同的抗原表位且相互不干扰，基于此，二者可用于双抗夹心法酶联免疫检测的配对抗体。
本实施例得到的兔单克隆抗体2H4和3F5的氨基酸和核苷酸序列分别见表2-3，兔单克隆抗体2H4和3F5的轻链可变区VL以及重链可变区VH序列一致性分别为75.45％以及66.38％。以下为描述方便，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，AA表示氨基端序列，DNA表示核苷酸序列。
表2本实施例单克隆抗体2H4涉及的序列信息汇总
表3本实施例单克隆抗体3F5涉及的序列信息汇总
实施例2基于兔单克隆抗体2H4和3F5建立双抗夹心酶联免疫吸附方法
双抗夹心法酶联免疫吸附方法包括以下步骤：
2.1、捕获抗体包被：将兔单克隆抗体2H4用1×PBS稀释成2μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/孔加入到96孔酶标板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。
2.2、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样350μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.3、封闭：将封闭液(1×PBS中含2％ BSA、5％蔗糖、0.05％ Tween 20和0.1％proclin300，pH 7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，于37℃烘0.5-2h，取出备用。
2.4、加蛋白：将小鼠IL-10蛋白(购自R&D，货号417-ML)用pH 7.2的含2％牛血清白蛋白、0.05％ Tween-20和0.1％proclin 300的磷酸盐缓冲液进行稀释，稀释后的浓度为：500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.6pg/mL、7.8pg/mL，然后以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。
2.5、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.6、加检测抗体：将用生物素标记的兔单克隆抗体3F5稀释成0.05μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。其中，生物素标记兔单克隆抗体3F5的制备方法包括：将兔单克隆抗体3F5配成1mg/mL的溶液，用二甲基亚砜(DMSO)将N-琥珀酰亚胺基6-生物素氨己酸(NHS-LC-biotin，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液，取200μL 1mg/mL兔单克隆抗体3F5溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin，混匀后在室温放置3min后，加入50μL 500mM的Tris-HCl溶液(pH 9.0)终止反应；最后加入4mL 1×PBS溶液(pH7.4)，用排阻极限为30KDa的离心柱离心，以除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡，得兔单克隆抗体3F5-biotin。
2.7、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.8、加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00001-0)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。
2.9、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。
2.10、加TMB显色液：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。
2.11、孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪在450nm下进行读数。
依据检测结果绘制的标准曲线见图5。结果显示，以兔单克隆抗体2H4为捕获抗体，兔单克隆抗体3F5为检测抗体，建立的双抗夹心酶连免疫方法检测小鼠IL-10蛋白具有灵明度高，可靠性好的优势，经标准曲线计算，检测灵敏度可低至1.965pg/mL。
实施例3兔单克隆抗体2H4和3F5的特异性检测
基于实施例2建立的双抗夹心酶联免疫吸附方法，分别用与小鼠IL-10蛋白相近的六种蛋白对兔单克隆抗体2H4和3F5的特异性进行检测，每种标准品蛋白的浓度均为10ng/mL。六种蛋白分别为小鼠干扰素γ(IFN-γ，厂家R&D，货号485-MI-100/CF)、小鼠干扰素β(IFN-β，厂家R&D，货号8234-MB-010)、小鼠白细胞介素20(IL-20，厂家R&D，货号1204-ML-025/CF)、小鼠白细胞介素22(IL-22，厂家R&D，货号582-ML-010/CF)、小鼠白细胞介素24(IL-24，厂家R&D，货号7807-ML-010/CF)、人白细胞介素10(IL-10，厂家ABclonal，货号RP00093)，前述蛋白均为市售所得，特异性检测结果见图6。
当兔单克隆抗体与抗原结合之后，将产生光信号，而仅有小鼠IL-10蛋白能够引起吸光度值的变化，这说明基于兔单克隆抗体2H4和3F5的双抗夹心法酶联免疫检测方法只与小鼠IL-10蛋白结合，不与其他六种蛋白产生任何交叉反应，说明本发明制备得到的兔单克隆抗体2H4和3F5对小鼠IL-10具有高度的特异性，适用于高特异性和高灵敏性检测小鼠白细胞介素10。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体，其特征在于，包括兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区；其中：
所述兔单克隆抗体2H4的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.3-5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；
所述兔单克隆抗体3F5的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.13-15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18-20所示。
2.根据权利要求1所述的抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体2H4的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述兔单克隆抗体3F5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
3.根据权利要求1所述的抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述兔单克隆抗体2H4和所述兔单克隆抗体3F5的所述轻链恒定区均为κ链，所述重链恒定区均为IgG1型。
4.根据权利要求1所述的抗小鼠白细胞介素10的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体2H4的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述兔单克隆抗体3F5的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
5.一种核酸分子，其特征在于，编码如权利要求1-4任一项所述的兔单克隆抗体2H4或兔单克隆抗体3F5。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述兔单克隆抗体2H4的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述兔单克隆抗体3F5的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
7.一种重组载体，其特征在于，包含编码如权利要求1-4任一项所述的兔单克隆抗体2H4或兔单克隆抗体3F5的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求7所述的重组载体或者所述宿主细胞的基因组中整合有编码如权利要求5所述的核酸分子。
9.一种免疫检测小鼠白细胞介素10的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4任一项所述的兔单克隆抗体2H4和/或兔单克隆抗体3F5；
免疫检测方法为酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞术中的一种或多种；
免疫检测样本为表达IL-10蛋白的组织样本、表达IL-10蛋白的细胞系样本、分泌IL-10蛋白的血清样本和重组表达的IL-10蛋白中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的免疫检测小鼠白细胞介素10的试剂盒，其特征在于，免疫检测方法为双抗夹心酶联免疫吸附法，所述双抗体夹心酶联免疫吸附法中，捕获抗体为所述兔单克隆抗体2H4，检测抗体为经可检测标记物标记的所述兔单克隆抗体3F5。
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