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CN118344476B - 人c反应蛋白单克隆抗体、抗体对和检测试剂或试剂盒及其应用 - Google Patents

人c反应蛋白单克隆抗体、抗体对和检测试剂或试剂盒及其应用 Download PDF

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CN118344476B CN202410611443.8A CN202410611443A CN118344476B CN 118344476 B CN118344476 B CN 118344476B CN 202410611443 A CN202410611443 A CN 202410611443A CN 118344476 B CN118344476 B CN 118344476B
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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及人C反应蛋白单克隆抗体、抗体对和检测试剂或试剂盒及其应用。单克隆抗体为第一抗体或第二抗体，所述第一抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5‑7所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示；所述第二抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15‑17所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18‑20所示。本发明抗体和抗体对对人CRP蛋白的特异性强、亲和力高，用于检测人CRP蛋白具有灵敏、准确、特异、稳定和抗干扰性强等优点。

Description

人C反应蛋白单克隆抗体、抗体对和检测试剂或试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及人C反应蛋白单克隆抗体、抗体对和检测试剂或试剂盒及其应用。
背景技术
C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)是一种急性时相反应蛋白，在组织受损、发炎或感染时，经细胞因子如IL-6、IL-2、TNF等诱导，主要在肝脏中合成后存在于人的血液中，其它组织局部如神经细胞、单核细胞、淋巴细胞及动脉粥样硬化斑块内可少量产生CRP，其在血中半衰期稳定，约为19h，血液中CRP浓度主要依赖于肝脏的生成量。人CRP基因位于人1号染色体，在1q21和1q23之间，包含2263个核苷酸，并有一个内含子。CRP蛋白以5个相同亚单位形成环状的五聚体，每个单体呈球体形(由206个氨基酸组成)，以非共价形式构成对称的环状五球体，是五聚蛋白(Pentraxin)蛋白质家族的成员，相对分子量为115-140KD，沉降系数6.5-7.5，等电点为5.5，不易溶于水。
CRP具有多种生物学功能，参与多种自身生理及病理过程。CRP与磷脂胆碱残基具有高度亲和力，并且可以和多种自身配体(如浆细胞脂蛋白、损伤细胞的细胞膜、小核糖体蛋白颗粒和调理素细胞等)或外来配体(如多聚糖、磷脂以及细菌、真菌、寄生虫等微生物的组分)相结合。CRP与这些配体结合后，能激活补体活化经典途径的初级阶段，限制补体激活晚期炎症反应的发展及强度。CRP还能增加淋巴细胞活性，加强吞噬细胞的吞噬能力，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤、坏死、凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。CRP广泛参与体内的各种炎症及免疫反应。在健康人血清中CRP含量极少，浓度为0.07-8.0mg/L，在感染发生后浓度显著上升，6-8h开始升高，24-48h达峰值，可升高至正常值的1000-2000倍，升高幅度与感染程度成正比；且炎症治愈后浓度迅速下降，一周内可恢复正常水平。CRP的变化不受病人的个体差异、机体状态和治疗药物的影响，是非特异性的炎性反应标记物，其水平可高低以反映机体潜在的炎症活跃程度及严重程度。目前，其含量变化在多个领域发挥着重要的作用：1)诊断与鉴别诊断细菌或病毒感染。研究表明CRP为10-50mg/L，为轻度炎症；>50mg/L，可确定有细菌性感染；>100mg/L，表示严重的疾病过程并常表示细菌感染的存在。2)辅助诊断新生儿期感染性疾病。新生儿CRP是胎儿期自身产生的，分娩使CRP应激性升高，生后3d内测CRP无特异性。大多数细菌感染的新生儿CRP在一定时期内均有升高。CRP是诊断新生儿败血症的一种手段。CRP的升高亦可出现于非细菌感染的情况下，如胎粪吸入、呼吸窘迫综合征等。3)监控病情变化及术后感染。当手术后伴有细菌感染，高值CRP会持续存在，正常术后2-3d其浓度为250-350mg/L；术后5-7d降低至30mg/L以下。4)观察抗生素应用疗效。CRP可作为细菌感染停用抗生素的安全可靠的指标，指导抗生素应用、评估其疗效、指导疗程等。此外，CRP与一些感染性疾病、心血管疾病、自身免疫病、恶性肿瘤和抑郁症等疾病的发生发展存在很大的相关性。
鉴于CRP的重要生物学功能，检测该指标变得尤为重要。目前，免疫学方法如酶联免疫吸附法、免疫比浊法、免疫沉淀法、免疫荧光法检测CRP由于操作简便、结果易于判定，已成为主流方向。不同方法都需要针对于CRP的特异性单克隆抗体。传统临床诊断使用的都是鼠源单克隆抗体，其亲和力和特异性普遍较低，可在感染或组织损伤时检测出大于8mg/L的CRP，但是不能检测出低浓度(<8mg/L)的CRP水平变化。因此，开发新型有效且特异性结合CRP的高亲和性抗体具有重要意义和临床价值。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了抗人CRP蛋白的特异性强、亲和力高的兔源单克隆抗体和抗体对，利用前述抗体和抗体对构建的检测体系用于检测人CRP蛋白，具有灵敏、准确、特异、稳定和抗干扰性强等优点，适用于定性和定量检测极微量水平的人CRP蛋白，由此，本发明还提供了前述抗体和抗体对在制备人CRP蛋白检测试剂或试剂盒中的应用，并提供了含有前述抗体和抗体对的检测试剂或试剂盒。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种人C反应蛋白单克隆抗体，为第一抗体或第二抗体，其中：所述第一抗体轻链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5-7所示，重链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；所述第二抗体轻链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15-17所示，重链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQID NO.18-20所示。
进一步地，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步地，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
进一步地，所述第一抗体或所述第二抗体为全长抗体或抗体片段；所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
本发明第二方面提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体或第二抗体。
本发明第三方面提供了一种人C反应蛋白抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。
本发明第四方面提供了如上所述的人C反应蛋白单克隆抗体或抗体对在制备人C反应蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明第五方面提供了一种人C反应蛋白检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
进一步地，所述检测试剂或试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为捕获抗体，所述第二抗体为检测抗体，且所述第二抗体修饰有可检测标记。
更进一步地，所述可检测标记为生物素。
与现有技术相比，本发明的优点及积极效果为：
本发明提供的含有上述CDR序列的抗体异性识别人CRP蛋白，具有结合活性好和亲和力高等优势，且第一抗体和第二抗体特异性识别人CRP蛋白的不同抗原决定簇，能够形成双抗夹心酶联免疫吸附检测体系，有利于实现微量水平人CRP蛋白的灵敏性、准确性、特异性和稳定性检测，在临床诊断和科研领域上均具有重要意义和广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。
图1为本发明实施例1构建兔源单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为携带轻链恒定区和重链恒定区的pRB322载体图谱；
图2为本发明实施例2单克隆抗体A与人CRP蛋白结合的亲和力曲线图；
图3为本发明实施例2单克隆抗体B与人CRP蛋白结合的亲和力曲线图；
图4为本发明实施例3基于单克隆抗体A和单克隆抗体B建立的双抗夹心酶联免疫吸附体系检测人CRP蛋白的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B以及(iii)A和B。术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，应该理解这样的使用在适当情况下可以互换。
术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”和“单抗”等类似词语具有相同含义，可互换使用，如非特殊说明，均指特异性结合人C反应蛋白的抗体。术语“人C反应蛋白”、“Human C-reaction protein”、“Human CRP”等类似词语具有相同含义，可以互换使用。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区来源于兔源免疫球蛋白序列。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。抗体片段可以是全长抗体的一个或多个部分或片段，保留该抗体与目标抗原特异性结合的能力。在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
术语“抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)”是抗体分子中可以与抗原结合的区域，其由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和一个恒定区片段)组成，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc'片段。F(ab')2片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备单链抗体(scFv)一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构，在临床诊断和治疗上应用广泛。
术语“可变片段(Fv)”位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整抗体。
术语“单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)“是指重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成的最小抗体片段，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
在一些实施例中，本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。在另一些实施例中，抗体可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如，人源化抗体、嵌合抗体等类型，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自人FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如人兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到人类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。
术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能自然发生的少量突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，对抗原上的相同或基本相同的表位显示出单一的结合特异性和亲和力。修饰词“单克隆”表明抗体是从一个基本同质的抗体群体中获得的，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。该抗体可以通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种人C反应蛋白单克隆抗体，为第一抗体或第二抗体，单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，分别命名为CDR1、CDR2和CDR3；其中：所述第一抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述第二抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。
本发明提供的含有上述CDR序列的抗体特异性识别人CRP蛋白，具有结合活性好和亲和力高等优势，第一抗体与人CRP蛋白的亲和常数KD为1.49×10-9M，第二抗体与人CRP蛋白的亲和常数KD为2.88×10-10M，并证明这两个抗体可以识别CRP蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫吸附(ELISA)检测体系；以第一抗体作为捕获抗体、第二抗体作为检测抗体的构建双抗夹心ELISA体系，对不同浓度的CRP进行定量检测，线性范围(31.2-2000pg/mL)广，检测限低至25.97pg/mL，具有良好的检测特异性和极高的检测灵敏度；本发明为能够在血清、细胞培养液等样品中稳定检测极微量水平人CRP蛋白提供了解决途径，在临床诊断和科研领域上均具有重要意义和广泛的应用前景。
可选地，本发明单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区还包括4个框架区(FR)，每条链中，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。具体地，所述第一抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述第二抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
可选地，本发明兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成轻链，CH和VH构成重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。具体地，所述第一抗体的轻链(FL链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链(FH链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述第二抗体的轻链(FL链)的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示，重链(FH链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。其中，第一抗体和第二抗体的轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG1型。
需要说明的是，本发明单克隆抗体可以为全长抗体(具有典型的Y型分子结构)或抗体片段，该抗体片段是指基本上保持与兔单克隆抗体的全长形式具有相同的生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗体片段包括如上所述的CDR区，更优选地具有如上所述的可变区，由此保留有完整的CRP抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。
所述抗体片段包括但不限于：(i)Fab片段，由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区构成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fv片段，由抗体的一个重链可变区和一个轻链可变区构成；(iv)(Fv)2片段，由两个共价连接在一起的Fv片段构成；(v)scFv片段，由单一多肽链构成的Fv片段，一个重链可变区和一个轻链可变区通过接头连接形成；(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接成。这些抗体片段可通过本领域的常规技术获得。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
核酸分子可以是DNA形式(如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。
核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。将所得核酸分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，并在特定条件下培养转染后的宿主细胞，即可表达获得本发明的抗体。
构建重组载体的原始载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件以允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体。此为公知技术，在此不再详细介绍。
编码本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以分别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，编码本发明兔单克隆抗体的重链与轻链的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
本发明中重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2处理；也可通过显微注射、电穿孔或脂质体包装等。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电穿孔法、脂质体包装等。宿主细胞可以是原核或真核细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌，酵母，果蝇S2或Sf9细胞，哺乳动物CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转染或转化如上所述重组载体的宿主细胞后，在适合条件下培养，即可表达出抗体，再进行分离，得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明另一实施例提供了一种人C反应蛋白抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。
本发明提供的第一抗体和第二抗体结合于人CRP表面的不同抗原决定簇，用于开发双抗夹心酶联免疫吸附检测体系具有特异性高、检测灵敏度高等优点，而且既可以测定低CRP含量，又可以测定浓度高CRP含量，适用范围广。
本发明再一实施例提供了如上所述的人C反应蛋白单克隆抗体或抗体对在制备人C反应蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。
所述人C反应蛋白单克隆抗体或抗体对在制备人C反应蛋白检测试剂或试剂盒中的应用优势与如上所述的人CRP单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
基于上述相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种人C反应蛋白检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
需要强调的是，第一抗体和第二抗体可以分别单独使用，也可以共同使用，或者配对使用。在检测时，如分开使用或共同使用时，将第一抗体和/或第二抗体作为一抗或捕获抗体，将待检样本与第一抗体和/或第二抗体接触，之后检测该抗体。在一些实施方案中，可以将第一抗体和/或第二抗体偶联可检测标记，通过分析可检测标记产生的可识别信号的变化来实现定性或定量检测CRP。在另一些实施方案中，不标记抗人CRP的第一抗体和/或第二抗体(作为一抗或捕获抗体)，而将可检测标记偶联可结合一抗的二抗(作为检测抗体)或其他分子，例如，如果抗人CRP抗体是兔源IgG抗体，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联可检测标记的二抗产生可识别信号的变化。如配对使用时，则将第一抗体和第二抗体其中之一作为一抗或捕获抗体，另一者作为二抗或检测抗体。
上述所述的检测方法采用通常的免疫学方法，包括但不限于：酶免疫分析法(EIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)、免疫组织化学法(IHC)、免疫荧光法(IF)、免疫印迹法(WB)、流式细胞术(FC)等。检测对象包括重组表达的CRP蛋白、细胞分泌的CRP蛋白或人血清中的CRP蛋白。检测样品包括但不限于血清、血浆、尿液、细胞培养液等中的CRP蛋白。
优选地，所述检测试剂或试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体作为捕获抗体(或一抗)，所述第二抗体作为检测抗体(或二抗)，且所述第二抗体修饰有可检测标记。
具体地，用于产生可识别信号变化的可检测标记包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白(如异藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、PerCP和R-藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
在较佳的实施方式中，可检测标记为生物素。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人CRP兔单克隆抗体的制备
本发明用来制备Human CRP兔单克隆抗体的免疫原来自商品化的重组Human CRP蛋白(来自Abclonal，货号RP01019)，其蛋白序列参见NCBI登录号：NP_000558.2)。抗体制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，简要地，从免疫抗原的兔脾脏细胞中先分选B淋巴细胞并进行培养，之后提取B淋巴细胞中的RNA，反转录成cDNA，经PCR扩增获得天然配对的编码兔单克隆抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因，最后将前述基因分别装载至表达载体上，并将载体共转化或转染宿主细胞，培养宿主细胞，分离、纯化获得结合人CRP的高特异性和高亲和力兔源抗体A和B。
抗体A和抗体B的氨基酸(AA)分别见表1-2。以下为描述方便，轻链CDR1-3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链CDR1-3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。
表1本实施例兔单克隆抗体A的序列信息
表2本实施例兔单克隆抗体B的序列信息
兔单克隆抗体A和抗体B的制备方法具体包括以下步骤：
1、动物免疫：以重组Human CRP蛋白为免疫原，免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次；三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人CRP的滴度，取血清滴度高的兔子，用200μg免疫原在皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物并取脾脏。
2、分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿,加入30-40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
3、分离脾脏中B淋巴细胞和进行B淋巴细胞分选：采用常规方法分离脾脏中B淋巴细胞，相关方法参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日期：2019-07-16)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日期：2020-08-11)”。
4、编码兔单克隆抗体基因的克隆：将培养的B淋巴细胞上清用CRP抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆，得到抗原特异性B淋巴细胞。阳性克隆细胞收集裂解后按Quick-RNATM MicroPrep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，反转录成cDNA，其中，反转录体系包括：Oligo(dT)12-18primer(Life)1μL、dNTPs(10mM)1μL、RNA 11μL；在PCR仪中进行65℃、5min后，向以上产物中加入5×FS Buffer(来自ABconal)4μL、DTT(100mM)1μL、RNase OUT(40U/μL)1μL、ABScriptⅡRT(200U/μL，来自ABconal)1μL，混匀后在42℃、1h，85℃、5min下进行反应，得到cDNA。以前述cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来并进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。PCR反应体系包括：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL2×Gloria HiFi(来自ABclonal，货号RK20717)和6.5μL H2O；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。其中，扩增VL和VH基因的引物序列(5'-3')如下所示，F和R分别表示正向引物和反向引物：
VL-F：tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC(见SEQ ID NO.21)；
VL-R：cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG(见SEQ ID NO.22)；
VH-F：tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG(见SEQ ID NO.23)；
VH-R：gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG(见SEQ ID NO.24)。
5、兔单克隆抗体的生产和纯化：为了扩大化生产人CRP蛋白的兔单克隆抗体，将装载有携带轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因的哺乳动物表达载体pBR322分别用XbaI和NheI限制性内切酶常规线性化处理，将上述PCR扩增的包含信号肽的VL和VH基因纯化后，采取同源重组的方式构建到前述表达载体中，得到轻链基因和重链基因表达载体，经测序验证表达载体构建成功。所用载体表达图谱见图1，pRB322 origin和f1 origin为复制启动子，Ampcillin为抗性基因，CMVpromoter为转录启动子，SV40 PAterminator为加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。CL、CH基因通过查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。
本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”和专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”的轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”或“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
将测序验证正确的含有轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的识别人CRP的兔单克隆抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从培养上清液中纯化出目的抗体。使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度＞95％，抗体A浓度为1.92mg/mL，抗体B浓度2mg/mL。将纯化抗体分装后于-20℃低温保存备用。
实施例2兔单克隆抗体A和B的亲和力测试
获得多株Human CRP兔单克隆抗体后，对抗体进行亲和力测试和抗原表位鉴定，获得本发明抗体A和B。具体如下：使用Probe Life公司Gator生物分子相互作用分析仪对单克隆抗体A和B与人CRP蛋白亲和力进行精确测定，抗体A和B的浓度均为3μg/mL。分别将抗体固定在proteinA探针上，然后针对抗体A和抗体B分别用100nM、200nM两个浓度的重组HumanCRP蛋白去结合，获得亲和力曲线。
抗体A和B结合人CRP的亲和力曲线分别见图2-3，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示结合时间，深灰色曲线为实时结合数值曲线，浅灰色曲线为拟合平均值曲线。通过曲线拟合计算得到的亲和力常数见表3，解离系数Koff用于表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数Kon用于表征抗体与其靶标结合速度的常数，亲和常数KD为Koff/Kon的比，表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数。
表3兔单克隆抗体的亲和力相关参数测定结果
抗体 Kon(1/Ms) KonError Koff(1/s) KoffError KD(M)
A 1.77×104 3.91×101 2.63×10-5 1.30×10-6 1.49×10-9
B 2.87×105 5.20×102 8.25×10-5 8.00×10-7 2.88×10-10
由上述结果可知，抗体A和B与人CRP蛋白的亲和常数KD分别为1.49×10-9M和2.88×10-10M，两株抗体的亲和力高。
实施例3基于抗体A和B建立双抗夹心酶联免疫吸附法及其灵敏度测试
将抗体A作为捕获抗体、抗体B作为检测抗体建立双抗夹心法酶联免疫吸附(ELISA)法，步骤如下：1)包被捕获抗体A：将抗体A用1×PBS稀释成0.5μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h；2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；3)封闭：将E013封闭液(1×PBS中含2％BSA、5％蔗糖、0.05％吐温和0.1％proclin 300，pH7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h，取出备用；4)加抗原蛋白：将人CRP蛋白用E013封闭液进行梯度稀释，稀释浓度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25和0pg/mL，然后将不同浓度以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；6)加检测抗体B：将用生物素标记的抗体B(B-biotin)稀释成0.0556μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；其中，B-biotin处理方法包括：将抗体B配成1mg/mL的溶液，用DMSO将NHS-LC-biotin配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL 1mg/mL的抗体B溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30min后，加入50μg 500mM的Tris溶液(pH9.0)中止反应；最后加入大量pH7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡；7)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；8)加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00001-0)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；9)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；10)加TMB显色液：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；11)读数：孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪进行读数。以人CRP蛋白浓度为横坐标，吸光值的校正值Y1(Y1＝OD450nm-OD630nm)为纵坐标作图，得到标准曲线，见图4。以吸光值平均值大于三倍空白对照吸光值平均值的最低人CRP浓度为双抗夹心ELISA法的灵敏度，结果见表4。
表4基于兔单克隆抗体A和B建立双抗夹心酶联免疫吸附法的灵敏度测试数据
上述结果显示，基于抗体A和B建立双抗夹心ELISA检测CRP蛋白灵敏度(sensitivity)达到25.97pg/mL，线性范围31.2-2000pg/mL，R2＝0.9928，可满足痕量蛋白的高灵敏性检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人C反应蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为第一抗体或第二抗体，其中：
所述第一抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQID NO.6和SEQ ID NO.7所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
所述第二抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQID NO.16和SEQ ID NO.17所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的人C反应蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
3.根据权利要求2所述的人C反应蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。
4.根据权利要求1所述的人C反应蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体或所述第二抗体为全长抗体或抗体片段；
所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项所述的第一抗体或第二抗体。
6.一种人C反应蛋白抗体对，其特征在于，由如权利要求1-4任一项所述的第一抗体和第二抗体组成。
7.如权利要求1-4任一项所述的人C反应蛋白单克隆抗体或如权利要求6所述的人C反应蛋白抗体对在制备人C反应蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。
8.一种人C反应蛋白检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的人C反应蛋白单克隆抗体或如权利要求6所述的人C反应蛋白抗体对。
9.根据权利要求8所述的人C反应蛋白检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为捕获抗体，所述第二抗体为检测抗体，且所述第二抗体修饰有可检测标记。
10.根据权利要求9所述的人C反应蛋白检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述可检测标记为生物素。
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