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CN118994389A - 抗小鼠TNF-α蛋白的抗体和抗体对及其应用 - Google Patents

抗小鼠TNF-α蛋白的抗体和抗体对及其应用 Download PDF

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CN118994389A
CN118994389A CN202411193777.4A CN202411193777A CN118994389A CN 118994389 A CN118994389 A CN 118994389A CN 202411193777 A CN202411193777 A CN 202411193777A CN 118994389 A CN118994389 A CN 118994389A
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antibody
seq
amino acid
variable region
light chain
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田科
吴海
程瑶
吴飞鸽
蒋晓园
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Wuhan Abclonal Inc
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Abstract

本发明属于免疫学检测技术领域，尤其涉及抗小鼠TNF‑α蛋白的抗体和抗体对及其应用。所述抗体为第一抗体或第二抗体，第一抗体轻链上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示；第二抗体轻链上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13‑15所示，重链上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18‑20所示。本发明提供的两株抗体具有高亲和力和高特异性，用于开发小鼠TNF‑α蛋白免疫检测体系具有灵敏度高、特异性高、稳定性好、结果可靠、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作等优点。

Description

抗小鼠TNF-α蛋白的抗体和抗体对及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域，特别涉及抗小鼠TNF-α蛋白的抗体和抗体对及其应用。
背景技术
肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)是一种连接炎症和免疫系统的多效细胞因子，属于TNF超家族的配体，主要由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、CD4+T细胞、NK细胞分泌，在炎症、细胞凋亡和免疫系统发育中起着核心作用，也可以协同调节其它细胞因子的产生、细胞存活和死亡来协调组织的稳态。TNF-α属于促炎细胞因子，在正常免疫反应中，TNF-α激活免疫系统进行免疫调节，发挥抗感染和抗损伤的作用。然而，过度产生或异常释放的TNF-α将触发细胞因子风暴，并在类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎等多种自身免疫疾病和炎症性疾病扮演重要角色，因此，TNF-α是一个代表全身性炎症程度的标志物。大量研究发现，TNF-α在类风湿性关节炎等自身免疫疾病患者的血清、滑膜和滑液等组织中显著升高，甚至可以促使机体释放IL-1、IL-6、IL-8、TGF等其它炎症因子，加重对组织的损伤。TNF-α也可以由肿瘤相关微环境中的恶性细胞和免疫细胞产生，其作为内源性肿瘤启动子，通过产生炎症生态环境来促进恶性疾病的进展。此外，临床发现TNF-α可作为复发性流产筛查的重要指标，复发性流产患者及子痫前期患者外周血中TNF-α水平较正常妊娠妇女明显升高，TNF-α在高浓度时可以通过多种途径导致流产，血浆高水平的TNF-α被认为可以增加反复妊娠失败女性的流产风险。因此，检测TNF-α对许多病理状态的诊断有重要的意义。
近十年来免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。用于检测TNF-α的方法主要包括酶联免疫吸附(ELISA)法，其核心是特异性抗TNF-α的抗体，通过抗原抗体的免疫反应建立的定性、定量分析方法。然而，目前现有技术中制备的抗TNF-α抗体，存在抗体特异性不高、与抗原亲和力差等问题，导致TNF-α蛋白检测灵敏度与可靠性不佳。
发明内容
针对现有技术存在抗体特异性不高和/或与抗原亲和力差等问题，本发明提供了两株高亲和力和高特异性的抗小鼠TNF-α的兔源抗体及其组成的抗体对，用于开发小鼠TNF-α蛋白免疫检测体系具有灵敏度高、特异性高、稳定性好、结果可靠、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作等优点。本发明进一步提供了前述抗体和抗体对在制备小鼠TNF-α检测试剂盒中的应用，并提供了含有前述抗体和抗体对的检测试剂盒。本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗小鼠TNF-α蛋白的抗体，选自第一抗体或第二抗体，其中：所述第一抗体轻链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示，重链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；所述第二抗体轻链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18-20所示。
进一步地，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
进一步地，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
进一步地，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv或sc(Fv)2。
本发明第二方面提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体或第二抗体。
进一步地，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
更进一步地，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
本发明第三方面提供了一种抗小鼠TNF-α蛋白的抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。
本发明第四方面提供了如上所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体或抗体对在制备小鼠TNF-α蛋白检测试剂盒中的应用。
本发明第五方面提供了一种检测小鼠TNF-α蛋白的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体或抗体对。
进一步地，所述检测试剂盒为双抗夹心酶连免疫吸附试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体作为捕获抗体，所述第二抗体作为检测抗体，且所述第二抗体修饰有检测标记。
与现有技术相比，本发明的优点及积极效果为：
1、本发明提供的两株单克隆抗体能够与小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白高亲和力地结合，亲和常数KD低至0.1nM水平，而且该抗体只与同源性极高的大鼠TNF-α蛋白发生弱交叉反应，与其他细胞因子无反应，对小鼠TNF-α具有高度的灵敏度和高特异性，为定性或定量检测小鼠TNF-α蛋白提供了性能优良的抗体材料。
2、本发明提供的两株抗体识别小鼠TNF-α蛋白表面不同的抗原表位，能够形成双抗夹心酶联免疫吸附检测体系，用于定量检测生物样品中TNF-α含量时，具有灵敏度高、特异性高、稳定性好、结果可靠、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作等优点，检测灵敏度可低至1.004pg/mL，适用于低浓度TNF-α的高特异性和高灵敏性检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为携带轻链恒定区和重链恒定区的pBR322载体图谱；
图2为本发明实施例2兔单克隆抗体7C7与小鼠TNF-α结合的亲和力曲线图；
图3为本发明实施例2兔单克隆抗体5E12与小鼠TNF-α结合的亲和力曲线图；
图4为本发明实施例2兔单克隆抗体7C7和5E12识别TNF-α抗原表位曲线图；
图5为本发明实施例3基于兔单克隆抗体7C7和5E12建立的双抗夹心酶联免疫吸附体系检测小鼠TNF-α的标准曲线；
图6为本发明实施例4基于兔单克隆抗体7C7和5E12建立的双抗夹心酶联免疫吸附体系的特异性测定结果图；
图7为本发明实施例5基于兔单克隆抗体7C7和5E12建立的双抗夹心酶联免疫吸附体系的热稳定性测定结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B以及(iii)A和B。术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，应该理解这样的使用在适当情况下可以互换。
术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“兔源抗体”和“兔单抗”等类似词语具有相同含义，如非特殊说明，均指特异性结合小鼠(Mouse)TNF-α蛋白的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。术语“小鼠TNF-α蛋白”、“Mouse TNF-α”、“小鼠TNF-α”、“Mouse TNF-alpha”等类似词语具有相同含义。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(frameworkregion，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
抗体片段是全长抗体的一个或多个部分或片段，基本上保持与全长形式具有相同的生物学功能或活性，具体而言，抗体片段至少包括与全长抗体相同的CDR区，更优选地具有相同的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2，这些抗体片段可通过本领域的常规技术获得。
(i)Fab：抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和第一恒定区)构成的单价片段，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab')2片段和一个pFc'片段。F(ab')2片段进一步被还原，形成两个Fab'片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备scFv一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构。
(ii)F(ab)2：包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab构成的双价片段。
(iii)Fv：可变片段(Fv)位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整抗体。
(iv)(Fv)2：由两个共价连接在一起的Fv片段构成。
(v)scFv：单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)是由单一多肽链构成的Fv片段，由一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)通过柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接构成。
在一些实施例中，本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。在另一些实施例中，抗体可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如，鼠源化抗体、嵌合抗体等类型，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“鼠源化抗体”是非鼠源抗体如兔源抗体的CDR区和来自鼠FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非鼠源抗体的可变区与鼠源抗体的恒定区结合，例如鼠兔嵌合抗体；在另一些情况下，非鼠源抗体的CDR区与源自鼠源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非鼠源抗体的CDR区嫁接到鼠类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他鼠类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或鼠源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。
术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能自然发生的少量突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，对抗原上的相同或基本相同的表位显示出单一的结合特异性和亲和力。修饰词“单克隆”表明抗体是从一个基本同质的抗体群体中获得的，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。该抗体可以通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种抗小鼠TNF-α蛋白的抗体，所述抗体选自第一抗体或第二抗体，所述第一抗体和所述第二抗体均包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，分别命名为CDR1、CDR2和CDR3；其中：所述第一抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸(AA)序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述第二抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。
本发明提供的单克隆抗体能够与小鼠(Mouse)肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白高亲和力地结合，其中，第一抗体和第二抗体与小鼠TNF-α的亲和常数KD分别为0.441nM、0.738nM，而且，在抗体特异性鉴定中，本发明抗体只与同源性极高的大鼠TNF-α蛋白发生弱交叉反应，而不与人TNF-α以及小鼠其他细胞因子反应，对小鼠TNF-α具有高度的灵敏度和高特异性，为定性或定量检测小鼠TNF-α蛋白提供了性能优良的抗体材料。而且，本发明的两株抗体识别和结合小鼠TNF-α蛋白的不同抗原表位，可作为配对抗体构建双抗夹心酶联免疫吸附检测体系，以第一抗体作为捕获抗体、第二抗体作为检测抗体为例，用于定量检测生物样品中TNF-α含量时具有灵敏度高、特异性高、稳定性好、结果可靠、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作等优点，并有效提高了TNF-α最低检测限，检测灵敏度可低至1.004pg/mL，适用于生物样本低浓度TNF-α的高特异性和高灵敏性检测。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。所述第一抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述第二抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
可选地，所述第一抗体和所述第二抗体还包括轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)，各抗体CL和VL构成轻链(FL)，CH和VH构成重链(FH)。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。
具体地，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
可选地，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体(具有典型的Y型分子结构)或为所述全长抗体的抗原结合区域；该抗原结合区域是指基本上保持与抗体全长形式具有相同生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗原结合区域包括如上所述的CDR区，更优选地具有如上所述的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。可选地，所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv和sc(Fv)2中的至少一种。这些抗原结合区域可通过本领域的常规技术获得。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
核酸分子可以是DNA形式(如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。
核酸分子的序列依据抗体AA序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。将所得核酸分子插入表达载体内，然后导入宿主细胞，并在特定条件下培养，即可表达获得抗体。
具体地，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
具体地，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
构建重组载体的原始载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒(例如pBR322、pUC系列、pET系列、pGEX系列)、病毒载体、噬菌体(例如λgt4λB、λ-Charon、λΔz1和M13)、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件以允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体。
编码本发明抗体FL与FH的核酸分子可以分别插入到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，抗体FL与FH的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2处理；也可通过显微注射、电穿孔或脂质体包装等。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电穿孔法、脂质体包装或粒子轰击等方式实现基因导入。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。可用于本发明的原核宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌(例如DH5α、JM109、BL21、W3110)、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)以及肠杆菌科菌株(例如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌)和假单胞菌属。可用于转化的真核宿主细胞的实例包括但不限于酵母、昆虫细胞和动物细胞，例如果蝇S2或Sf9细胞，哺乳动物CHO、CHO DG44、CHO-S、COS-7、293系列细胞、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK和HEK293细胞系。在获得转染或转化如上所述重组载体的宿主细胞后，在适合条件下培养，即可表达出抗体，再进行分离，得到纯化的抗体。
优选地，所述重组载体为表达载体pBR322，所述宿主细胞为人肾上皮(293F)细胞。
本发明另一实施例提供了一种抗小鼠TNF-α蛋白的抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。
本发明提供的第一抗体和第二抗体识别和结合于小鼠TNF-α蛋白的不同表位，用于开发小鼠TNF-α蛋白的双抗夹心酶联免疫吸附检测体系具有高特异性、高灵敏度、低检测限和结果可靠等优点。
本发明再一实施例提供了如上所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体或抗体对在制备小鼠TNF-α蛋白检测试剂盒中的应用。
所述抗小鼠TNF-α蛋白的抗体或抗体对在制备小鼠TNF-α蛋白检测试剂盒中的应用优势与如上所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体或抗体对相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
基于上述相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种检测小鼠TNF-α蛋白的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
需要强调的是，第一抗体和第二抗体可以分别单独使用，也可以共同使用，或者配对使用。在检测时，如分开使用或共同使用时，将第一抗体和/或第二抗体作为一抗或捕获抗体，将待检样本与第一抗体和/或第二抗体接触，之后检测该抗体。在一些实施方案中，可以将第一抗体和/或第二抗体偶联检测标记，通过分析检测标记产生的可识别信号的变化来实现定性或定量检测TNF-α。在另一些实施方案中，不标记抗小鼠TNF-α的第一抗体和/或第二抗体(作为一抗或捕获抗体)，而将检测标记偶联可结合一抗的二抗(作为检测抗体)或其他分子，例如，如果抗小鼠TNF-α抗体是兔源IgG抗体，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联检测标记的二抗产生可识别信号的变化。如配对使用时，则将第一抗体和第二抗体其中之一作为一抗或捕获抗体，另一者作为二抗或检测抗体。
上述所述的检测方法采用通常的免疫学方法，包括但不限于：酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)、免疫组织化学法(IHC)、免疫荧光法(IF)、免疫印迹法(WB)、流式细胞术(FC)等。检测对象包括重组表达的TNF-α、天然分泌或表达的TNF-α。检测样品包括但不限于血清、血浆、尿液、细胞培养液、组织匀浆等中的TNF-α。
优选地，所述检测试剂盒为双抗夹心酶连免疫吸附试剂盒，包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体作为捕获抗体(或一抗)，所述第二抗体作为检测抗体(或二抗)，且所述第二抗体修饰有检测标记。
上述用于产生可识别信号变化的检测标记包括但不限于：生物素、荧光染料(如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯)、荧光蛋白(如异藻蓝蛋白、藻红蛋白、PerCP和藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、抗生物素蛋白)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗TNF-α兔源单克隆抗体的制备
本实施例提供了抗小鼠(Mouse)TNF-α的兔源单克隆抗体的制备方法，用来制备Mouse TNF-α兔单克隆抗体的免疫原来自哺乳表达系统具有生物活性的高质量重组MouseTNF-α成熟蛋白(购自义翘生物，货号：50349-MNAE)；制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，具体包括以下步骤：
1.1、动物免疫：以重组Mouse TNF-α蛋白为免疫原，免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，按1：243000稀释后用ELISA方法测定其针对Mouse TNF-α的滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物并取脾脏。
1.2、分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中，取干净的研磨棒对组织进行碾压研磨，使膜内细胞慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
1.3、B淋巴细胞分选和培养：参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日期：2019-07-16)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日期：2020-08-11)”，获得抗原特异性B淋巴细胞。
1.4、编码兔单克隆抗体基因的克隆：将培养的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后，采用Quick-RNATMMicro Prep试剂盒(购自ZYMO公司，货号：R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序。扩增VL和VH基因的引物序列(5’-3’)如下，F和R分别表示正向引物和反向引物：
VL-F：tgaattcgagctcggtacccATGGACACGAGGGCCCCCAC(见SEQ ID NO.29)；
VL-R：cacacacacgatggtgactgTTCCAGTTGCCACCTGATCAG(见SEQ ID NO.30)；
VH-F：tgaattcgagctcggtacccATGGAGACTGGGCTGCGCTG(见SEQ ID NO.31)；
VH-R：gtagcctttgaccaggcagcCCAGGGTCACCGTGGAGCTG(见SEQ ID NO.32)。
PCR反应体系包括：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL2×Gloria HiFi(来自ABclonal，货号RK20717)和6.5μL H2O；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
1.5、单克隆抗体制备和纯化：为了规模化生产抗Mouse TNF-α的抗体，将携带轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因的哺乳动物表达载体pBR322分别用XbaI和NheI限制性内切酶常规线性化处理，将上述PCR扩增的包含信号肽的VL和VH基因纯化后，采取同源重组的方式构建到前述表达载体中，得到轻链基因和重链基因表达载体，经测序验证表达载体构建成功。所用载体表达图谱见图1，pBR322 origin和f1 origin为复制启动子，Ampcillin为抗性基因，CMVpromoter为转录启动子，SV40 PA terminator为加尾信号，Light chainconstant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。CL、CH基因通过查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma Creign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。
本实施例信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”和专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”的VL上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”或“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，VH上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
将构建成功的含有轻链(FL)基因和重链(FH)基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的识别Mouse TNF-α的兔源单克隆抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从培养上清液中纯化出纯度大于95％的目的抗体。将纯化抗体分装后于-20℃低温保存备用。
1.6、单克隆抗体筛选及鉴定：获得多株重组表达的Mouse TNF-α抗体后，对抗体进行亲和力的鉴定及抗原识别表位的鉴定，具体方法如下：
1.6.1、单克隆抗体的筛选：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体的亲和力进行初步测定。其中，筛选原为重组Mouse TNF-α蛋白(购自义翘生物，货号：50349-MNAE)，使用浓度为3μg/mL，兔单克隆抗体的浓度为2μg/mL；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择亲和常数≤1×10-9的抗体。
1.6.2、抗原识别表位的鉴定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇；其中，筛选原为重组Mouse TNF-α蛋白(购自义翘生物，货号：50349-MNAE)，使用浓度为3μg/mL，第一兔单克隆抗体的浓度为3μg/mL，第二兔单克隆抗体的浓度为3μg/mL；通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位决定簇的两个抗体，分别命名为抗体7C7和5E12。
对兔单克隆抗体7C7和5E12的亲和力进行测定，其亲和力曲线分别见图2-3，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示结合时间，深灰色曲线为实时结合数值曲线，浅灰色曲线为拟合平均值曲线。通过曲线拟合、计算得到亲和力常数见表1，解离系数Koff表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数Kon表征抗体与其靶标结合速度的常数，亲和常数KD为Koff/Kon的比，表征抗体与抗原之间的平衡解离常数。由图2-3和表1可知，抗体7C7和5E12与Mouse TNF-α蛋白的亲和常数KD分别为0.441nM、0.738nM，显示出抗体与小鼠TNF-α蛋白具有较高的亲和力。
表1兔单克隆抗体的亲和力相关参数测定结果
抗体株 Koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M)
7C7 8.91×10-4 2.02×106 4.41×10-10
5E12 7.62×10-4 1.03×106 7.38×10-10
兔单克隆抗体7C7和5E12的抗原决定簇测定结果见图4，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后、结合物的厚度变化，横坐标表示结合时间，图中7C7表示兔单克隆抗体7C7，5E12表示兔单克隆抗体5E12。可以看出，抗体7C7和5E12分别TNF-α蛋白不同的表位且识别和结合位点互不干扰，因此二者可用于双抗夹心法酶联免疫吸附(ELISA)检测体系的配对抗体。
对筛选得到的抗体进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，抗体7C7和5E12的氨基酸(AA)和核苷酸(DNA)序列分别见表2-3，表中LCDR1-3分别表示轻链互补决定区CDR1-3，HCDR1-3分别表示重链互补决定区CDR1-3。抗体7C7和5E12的轻链可变区(VL)以及重链可变区(VH)序列的一致性分别为75.45％以及66.38％。
表2本实施例兔单克隆抗体7C7的序列信息
表3本实施例兔单克隆抗体5E12的序列信息
实施例2基于抗体7C7和5E12建立双抗夹心酶联免疫吸附体系及其灵敏度测试
抗体5E12生物素标记：将抗体5E12配成1mg/mL的溶液，用二甲基亚砜(DMSO)将NHS-LC-biotin(N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸，购自Thermo公司)配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL1mg/mL的抗体5E12溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30min后，加入50μg 500mM Tris-HCl溶液(pH9.0)终止反应；最后加入4mL 1×PBS缓冲液(pH7.4)，用排阻极限30KDa的离心柱离心，以除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡，得到生物素标记的抗体5E12(5E12-biotin)。
将抗体7C7作为捕获抗体、生物素标记的抗体5E12-biotin作为检测抗体，建立双抗体夹心法酶联免疫吸附(ELISA)法，步骤如下：
2.1、包被捕获抗体7C7：将抗体7C7用1×PBS稀释成2μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h；
2.2、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；
2.3、封闭：将封闭液(1×PBS中含2％BSA、5％蔗糖、0.05％Tween 20和0.1％proclin 300，pH7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h，取出备用；
2.4、加抗原蛋白TNF-α：将TNF-α蛋白用稀释液(1×PBS中含2％BSA、0.05％Tween20、0.1％proclin 300，pH 7.2)进行梯度稀释，稀释浓度：150pg/mL、75pg/mL、37.5pg/mL、18.75pg/mL、9.37pg/mL、4.68pg/mL和2.34pg/mL，然后将不同浓度以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；以不含蛋白的稀释液作为空白孔对照；
2.5、洗板：同步骤2.2；
2.6、加检测抗体5E12：将5E12-biotin稀释成0.08μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；
2.7、洗板：同步骤2.2；
2.8、加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00001-0)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；
2.9、洗板：同步骤2.2；
2.10、加TMB显色液：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；
2.11、读数：孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪在450nm进行读数。
以小鼠TNF-α蛋白浓度为横坐标，吸光值OD450nm为纵坐标作图，拟合得到标准曲线(见图5)，以吸光值平均值大于三倍空白对照吸光值平均值的TNF-α蛋白浓度为双抗夹心法酶联免疫检测体系的灵敏度。结果所示，抗体7C7和5E12建立的双抗夹心ELISA检测体系的标准曲线线性良好，检测灵敏度可低至1.004pg/mL，能够实现生物样本中极微量水平TNF-α蛋白的高灵敏度和高可靠性检测。
实施例3基于抗体7C7和5E12建立双抗体夹心酶联免疫吸附体系的特异性测试
用十三种与Mouse TNF-α相近的蛋白进行交叉反应测定双抗夹心ELISA检测体系的抗原识别特异性，交叉反应测试蛋白分别为：小鼠IL-1α(购自ABclonal，货号RM00437)、小鼠IL-1β(购自ABclonal)、小鼠IL-2(购自RD，货号840139)、小鼠IL-4(购自RD，货号840142)、小鼠IL-5(购自RD，货号840479)、小鼠IL-6(购自ABclonal，货号RP01321)、小鼠IL-10(购自RD，货号417-ML-005/CF)、小鼠IL-12/IL-23p40(购自ABclonal，货号RM00093)、小鼠IFN-β(购自RD，货号844567)、小鼠IFN-γ(购自RD，货号485-MI-100/CF)、小鼠EGF(购自ABclonal，货号RM01481)、人(Human)TNF-α(购自RD，货号840121)、大鼠(Rat)TNF-α(购自ABclonal，货号RM00141)。按照前述实施例2中的双抗夹心ELISA检测体系进行检测，结果见图6。
结果显示，抗体7C7和5E12除了与Mouse和Rat TNF-α(TNF-alpha)有反应，与其余蛋白无交叉反应，与Rat TNF-α有交叉反应是因为大鼠和小鼠TNF-α抗原同源性高达95％，蛋白结构极为相近，总体上本发明提供的抗体对Mouse TNF-α蛋白具有高度的特异性。
实施例5基于抗体7C7和5E12建立双抗体夹心酶联免疫吸附体系的热稳定性测试
将包被好捕获抗体的酶标板、冻干的Mouse TNF-α蛋白、100×浓缩的生物素化检测抗体分别置于-20℃、4℃、37℃密封保存7d后取出，按照前述实施例2的双抗夹心ELISA检测体系进行检测。比较不同温度处理的抗体样品所建立的标准曲线，分析双抗体夹心ELISA体系的热稳定性，结果见图7。
从图7中可以看出，兔单克隆抗体7C7和5E12在-20℃、4℃和37℃的OD450nm值差别不大，不同保存温度对检测灵敏度和线性范围的影响较小，说明本发明制备的Mouse TNF-α抗体具有高度的热稳定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗小鼠TNF-α蛋白的抗体，其特征在于，为第一抗体或第二抗体，其中：
所述第一抗体轻链可变区上的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链可变区上的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
所述第二抗体轻链可变区上的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，重链可变区上的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
3.根据权利要求2所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示。
4.根据权利要求1所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体，其特征在于，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；
所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv或sc(Fv)2。
5.一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项中所述的第一抗体或第二抗体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
7.根据权利要求6所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示。
8.一种抗小鼠TNF-α蛋白的抗体对，其特征在于，由如权利要求1-4任一项中所述的第一抗体和第二抗体组成。
9.如权利要求1-4任一项所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体或如权利要求8所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体对在制备小鼠TNF-α蛋白检测试剂盒中的应用。
10.一种检测小鼠TNF-α蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体或如权利要求8所述的抗小鼠TNF-α蛋白的抗体对。
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