CN117487018B

CN117487018B - 抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN117487018B
Application number: CN202311259307.9A
Authority: CN
Inventors: 姚雪迪; 景攀; 张云; 吴海; 李志友; 魏艳飞; 左健兰
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2023-09-27
Filing date: 2023-09-27
Publication date: 2024-05-17
Anticipated expiration: 2043-09-27
Also published as: CN117487018A

Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体及其应用。所述兔单克隆抗体为第一抗体或第二抗体，第一抗体轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示；第二抗体轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13‑15所示，重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18‑20所示。本发明兔单克隆抗体识别和结合人HE4蛋白的特异性好、亲和力高，以第一抗体和第二抗体配对建立的双抗夹心酶联免疫吸附检测体系，具有灵敏度高、准确性高、可靠性好和抗干扰能力优良等优点。

Description

抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

人附睾分泌蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)是一种分子量为22-26kDa的分泌型糖蛋白，属于乳清酸性蛋白家族(WAP)成员，因其结构含有Whey酸性蛋白四个二硫键核心区域(WFDC)，故又称为乳清酸性蛋白四二硫化物核心区2(WAP-four-disulfidecore domain 2，WFDC2)，与细胞外蛋白酶抑制剂有高度同源性。HE4最初在男性附睾远端上皮组织中发现，与精子成熟密切相关，后来发现在呼吸道上皮细胞、唾液腺粘液细胞、乳腺导管上皮等上皮细胞中也有表达，在许多家族成员中起蛋白酶抑制剂的作用。作为一种小的分泌蛋白，HE4在正常组织中表达较低，在纤维化和人类癌症中高表达，已先后发现其在卵巢癌、肺癌等恶性肿瘤中高表达且在肿瘤早期就能检测到。HE4在卵巢组织中的阳性表达率与卵巢癌的组织类型相关，在浆液性卵巢癌和子宫内膜样卵巢癌中升高最为明显，大量研究已证明HE4通过激活AKT信号通路，诱导MMP-2表达，促进卵巢癌转移和EMT的正向调节。HE4在卵巢癌血清学诊断上具有较高的灵敏度和特异性，能较好地对乳腺癌进行早期筛查，被认为是继CA125后最有前景的卵巢癌标记物，其对早期卵巢癌的敏感性和特异性均优于CA125，可用于卵巢癌等的早期诊断、鉴别、治疗监测及预后评估。

基于HE4在临床诊断和监测方面所表现出的突出特性，研发出针对HE4的特异性结合抗体显得尤为重要，特异性好、亲和力高的HE4抗体是实现高灵敏度检测HE4的基础。目前，市售用于检测HE4的单克隆抗体多来自于小鼠腹水，其与人HE4的亲和力和特异性普遍较低，无法很好地应用于检测人HE4蛋白，检测结果的准确性不高且检测灵敏度较差，难以适用于血清或细胞组织中低含量的人HE4蛋白水平检测。因此开发新型的适用于免疫学检测的抗人附睾分泌蛋白4的单克隆抗体和检测试剂盒，对于相关疾病中HE4水平检测具有非常重要的临床价值，尤其是对于卵巢癌的发生发展、预后判断及疗效监测方面具有重要的参考意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体，包括第一抗体和/或第二抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区；其中：所述第一抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；所述第二抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.18-20所示。

进一步地，所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

进一步地，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；其中：所述第一抗体的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述第二抗体的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。

进一步地，所述第一抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述第二抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

进一步地，所述第一抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；所述第二抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

本发明第三方面提供了一种重组载体，包含用于编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体的核酸分子。

本发明第四方面提供了一种免疫检测人附睾分泌蛋白4的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。

进一步地，所述试剂盒包括如上所述的第一抗体和第二抗体，其中，所述第一抗体作为捕获抗体，所述第二抗体作为检测抗体或标记抗体。

进一步地，免疫检测方法包括酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞术中的一种或多种。

进一步地，免疫检测样本包括重组人HE4蛋白和细胞分泌的人HE4蛋白中的至少一种。

本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的兔单克隆抗体识别和结合人HE4蛋白的特异性好、亲和力高，且第一抗体和第二抗体分别识别和结合人HE4蛋白不同的抗原表位，以二者配对建立双抗夹心酶联免疫吸附检测体系，具有灵敏度高、准确性高、可靠性好和抗干扰能力优良的等优点，在与HE4表达水平相关疾病的临床诊断、预后判断及疗效监测方面有良好的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为预先携带轻链恒定区和重链恒定区的pRB322载体图谱；

图2为本发明实施例1兔单克隆抗体2G4与人HE4蛋白结合的亲和力曲线图；

图3为本发明实施例1兔单克隆抗体2F6与人HE4蛋白结合的亲和力曲线图；

图4为本发明实施例1兔单克隆抗体2G4和2F6的抗原决定簇识别曲线图；

图5为本发明实施例2基于兔单克隆抗体2G4和2F6建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的标准曲线；

图6为本发明实施例3基于兔单克隆抗体2G4和2F6建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法的热稳定性检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，应该理解这样的使用在适当情况下可以互换。

术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”等类似词语具有相同含义，可互换使用，均指特异性结合人附睾分泌蛋白4(HE4)蛋白的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。

抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。其中，“抗体片段”是指全长抗体的一个或多个部分或片段，在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)₂、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv、sc(Fv)₂。

典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。

轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。

术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。

术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

本发明实施例提供了一种抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体，包括第一抗体和/或第二抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)；其中：所述第一抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述第二抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。

本发明以人附睾分泌蛋白4(HE4)蛋白为免疫原，利用单个B淋巴细胞分选和培养技术，开发了抗人HE4蛋白的第一抗体和第二抗体。本发明提供的第一抗体和第二抗体可以特异性识别人HE4蛋白(包括重组表达的重组人HE4蛋白和细胞分泌的天然HE4蛋白)，与人HE4蛋白结合的亲和力高，而且经抗原表位结合分析，二者分别识别和结合人HE4蛋白不同的抗原表位，以第一抗体作为捕获抗体、第二抗体作为检测抗体或标记抗体建立的双抗夹心酶联免疫吸附检测体系(双抗夹心ELISA)去检测人HE4蛋白，其检测灵敏度高，检测限低至4.1pg/mL，可用于检测样本中极低含量的人HE4蛋白，具有准确性高、可靠性好和抗干扰能力优良的等诸多优点，在与HE4水平表达相关的疾病的临床诊断、预后判断及疗效监测方面有良好的应用价值。

可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。所述第一抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述第二抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

可选地，本发明的兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成完整轻链，CH和VH构成完整重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。

可选地，所述第一抗体的轻链(L链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链(H链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述第二抗体的轻链(L链)的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示，重链(H链)的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明又一实施例提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。

核酸分子可以是DNA形式(例如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(例如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或是非编码链。核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。

示例性地，所述第一抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。所述第二抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

示例性地，所述第一抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。所述第二抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

本领域技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，不同于上述示例的核酸分子同样可以编码得到第一抗体和第二抗体，因此，上述示例的核酸分子不应作为对本发明保护范围的限定。

核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明另一实施例提供了一种重组载体，所述重组载体包含用于编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体的核酸分子，如包含如SEQ ID NO.21-28所示的核酸分子。

所述重组载体可通过本领域常规方法将本发明提供的核酸分子连接于各种载体上构建而成。载体只要能够容载所述核酸分子即可，较佳地包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，载体与质粒在本发明中可互换使用。

载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中形成携带本发明核酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。

编码本发明兔单克隆抗体的重链与轻链的核酸分子可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些实施方式中，编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子也可以分别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。

重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法或MgCl₂法处理，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔和脂质体包装等。

宿主细胞根据重组载体类型选择，具体可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7、293系列细胞等。

在具体的实施方式中，当重组载体为pBR322时，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。在获得转化含有抗体重链基因、轻链基因的pBR322重组载体的宿主细胞293F后，在适合条件下培养293F细胞，获得包含抗人HE4蛋白兔单克隆抗体的上清液，然后再进行亲和纯化即可得到纯化的抗体。

本发明实施例还提供了如上所述的抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子或如上所述的重组载体在制备免疫检测人附睾分泌蛋白4的试剂盒中的应用。

所述抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体、核酸分子或重组载体在制备免疫检测人附睾分泌蛋白4的试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。

需要说明的是，第一抗体和第二抗体可以分别单独使用，也可以配对使用，还可以分别与可检测标记物(为检测目的)结合或偶联。用于检测目的的可检测标记物包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶(如辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。

在免疫检测时，如分开使用第一抗体和第二抗体，则将第一抗体或第二抗体作为抗原结合抗体(捕获抗体)，其特异性识别和结合待检样本中的HE4蛋白，之后通过与其连接的可检测标记物产生可识别的信号变化，或者通过偶联有可检测标记物的检测抗体如IgG特异性结合本发明的抗体以产生可识别的信号变化，从而实现定性或定量检测人HE4蛋白。

在较佳的实施方式中，免疫检测方法包括但不限于：酶免疫分析法(Enzymeimmunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹法(Western blot，WB)、流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)等。

可选地，免疫检测样本包括但不限于：重组人HE4、细胞分泌的人HE4。

基于本发明的第一抗体和第二抗体识别不同的抗原表位，上述所述的免疫检测方法优选为双抗夹心酶联免疫吸附法，所述双抗体夹心酶联免疫吸附法中，捕获抗体为第一抗体，检测抗体为经可检测标记物(如生物素)标记的第二抗体。二者配对检测人HE4具有很高的灵敏性和特异性，检测限低至4.1pg/mL。

基于相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种免疫检测人附睾分泌蛋白4的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。

所述免疫检测人附睾分泌蛋白4的试剂盒的优势与如上所述的抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。

可选地，所述试剂盒包括如上所述的第一抗体和第二抗体，所述试剂盒用于双抗夹心酶联免疫吸附法检测人HE4，其中，所述第一抗体作为捕获抗体，所述第二抗体作为检测抗体或标记抗体。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例1抗人附睾分泌蛋白4蛋白的兔单克隆抗体制备

本实施例用来制备人附睾分泌蛋白4(HE4)兔单克隆抗体的免疫原为重组HumanHE4蛋白(来自ABclonal自售自产蛋白，产品名：Recombinant Human WAP5/WFDC2/HE4Protein，货号：RP00132)。抗体制备方法为基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，具体包括以下步骤：

1、动物免疫

以重组Human HE4蛋白(货号RP00132)为免疫原，免疫4只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，血清按1：243000倍数稀释后用ELISA方法测定其针对Human HE4蛋白的滴度，取OD_450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

2、分离脾脏中B淋巴细胞

在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基清洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。

3、B淋巴细胞分选与培养

参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。

4、编码兔单克隆抗体基因的克隆

培养后的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA鉴定出能够结合Human HE4蛋白的阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后按Quick-RNA^TM Micro Prep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来，经测序确定序列。前述PCR反应体系如下：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×GloriaHiFi(来自ABclonal自售自产，货号RK20717)和6.5μL H₂O；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。

扩增VL和VH引物对(5'-3')核苷序列如下所示，F和R分别表示正向和反向引物：

VL-F(见SEQ ID NO.29)：5’-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3’；

VL-R(见SEQ ID NO.30)：5’-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3’；

VH-F(见SEQ ID NO.31)：5’-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3’；

VH-R(见SEQ ID NO.32)：5’-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3’。

5、兔单克隆抗体的生产和纯化

将兔单克隆抗体的VL基因、VH基因(上游具有信号肽)分别装载在预先携带轻链恒定区和重链恒定区的表达载体pBR322上，所使用的预先携带轻链和重链恒定区的表达载体pBR322的表达图谱见图1，其中，pBR322Ori和f1Ori是E.coli中的复制起始位点，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为转录启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区(CL)的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区(CH)的核酸序列(右图)。具体而言，将含抗体CL和CH的哺乳动物细胞表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶(注：轻链对应载体用XbaI酶切处理，重链对应载体用NheI酶切处理)常规线性化处理，将上述扩增后的VL基因、VH基因进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将上游具有信号肽编码基因的VL基因和VH基因构建到表达载体中，经测序验证表达载体是否构建成功。

将构建成功的携带抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染后培养72-96h，培养获得含有识别人HE4的兔单克隆抗体的上清液。使用Protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出识别人HE4蛋白的兔单克隆抗体，下述兔单克隆抗体2G4和2F6的浓度分别为4.11mg/mL和4.22mg/mL，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。Protein A亲和层析采用本领域的常规操作，在此不再赘述。

需要说明的是，本实施例VL基因和VH基因上游的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，具体可参见专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”或“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”，轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”或“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。

6、单克隆抗体筛选及鉴定

对上述获得的多株抗人HE4兔单克隆抗体进行初步鉴定和筛选，具体方法如下：

1)抗体亲和力测定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对所获得的兔单克隆抗体的亲和力进行初步测定，抗原为重组Human HE4蛋白，工作浓度为150nM和75nM，兔单克隆抗体的工作浓度为2μg/mL；通过比较各个抗体的亲和力，从中选择亲和常数≤1×10^-9的抗体。

2)抗原识别表位的鉴定：使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对亲和常数≤1×10^-9的兔单克隆抗体进行配对反应来测试其识别的抗原表位决定簇，抗原为重组Human HE4蛋白，工作浓度为5μg/mL，第一和第二抗体的工作浓度均为分别为2μg/mL和5μg/mL。通过分析两种抗体之间的配对数据，从中选择识别不同抗原表位的两个抗体，分别命名为兔单克隆抗体2G4和兔单克隆抗体2F6。

进一步对兔单克隆抗体2G4和兔单克隆抗体2F6的亲和力进行测定，抗体浓度为2μg/mL，抗原浓度为10μg/mL，2G4和2F6的检测结果分别见图2-3，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示结合时间，深灰色曲线为实时结合数值曲线，浅灰色曲线为拟合平均值曲线，其结果表明抗体在短时间内结合抗原达到饱和状态，较长时间内无明显解离，整体亲和情况较好。通过曲线拟合和计算得到的亲和力常数见表1，解离系数K_off用于表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数K_on用于表征抗体与其靶标结合速度的常数，亲和常数K_D为K_off/K_on的比，表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数。由表1可知，兔单克隆抗体2G4和2F6与重组Human HE4的亲和常数K_D分别为5.37×10^-10(M)和9.44×10^-11(M)，与HE4蛋白的亲和力高。

表1兔单克隆抗体2G4和2F6的亲和力相关参数测定结果

兔单克隆抗体	K_off(1/s)	K_on(1/Ms)	K_D(M)
				2G4	1.43×10^-4	2.65×10⁵	5.37×10^-10
2F6	2.38×10^-5	2.52×10⁵	9.44×10^-11

图4示出了兔单克隆抗体2G4和2F6的抗原决定簇识别结果，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示筛选原和蛋白结合的时间变化。从图4中可以看出，兔单克隆抗体2G4和2F6分别识别的是不同的抗原表位且识别位点互不干扰，因此二者可用于双抗夹心法酶联免疫检测的配对抗体。

对筛选出的抗体2G4和2F6分别进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，得到的2G4和2F6的氨基酸和核苷酸序列分别见表2-3，兔单克隆抗体2G4和2F6的轻链可变区VL以及重链可变区VH序列一致性分别为64.3％以及80.2％。以下为描述方便，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，AA表示氨基酸序列，DNA表示核苷酸序列。

表2本实施例单克隆抗体2G4涉及的序列信息汇总

表3本实施例单克隆抗体2F6涉及的序列信息汇总

实施例2基于兔单克隆抗体2G4和2F6建立双抗夹心酶联免疫吸附方法

本实施例提供基于抗人HE4兔单克隆抗体2G4和2F6建立的双抗夹心酶联免疫检测方法，具体包括以下步骤：

2.1、包被捕获抗体2G4：将兔单克隆抗体2G4用1×PBS稀释成4μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/孔加入到96孔酶标板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h。

2.2、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

2.3、封闭：将封闭液(1×PBS中含2％BSA、5％蔗糖、0.05％Tween 20和0.1％proclin 300，pH 7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，于37℃烘0.5-2h，取出备用。

2.4、加蛋白：将重组Human HE4蛋白稀释，稀释后的浓度为：8000pg/mL、4000pg/mL、2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、0pg/mL，然后以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h。

2.5、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

2.6、加检测抗体2F6：将用生物素标记的兔单克隆抗体2F6(2F6-biotin)稀释成0.028μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h。其中，2F6-biotin的制备方法包括：生物素Biotin标记处理方法：将兔单克隆抗体2F6配成1mg/mL的溶液，用DMSO将NHS-LC-biotin配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL 1mg/mL的抗兔单克隆抗体2F6溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30min后，加入50μg500mM pH 9.0的Tris溶液中止反应；最后加入大量pH 7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡。

2.7、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

2.8、加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00001-0)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h。

2.9、洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体。

2.10、加TMB显色液：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min。

2.11、孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪在450nm下进行读数。

依据检测结果绘制的标准曲线图5，标准曲线方程式为：y＝0.0003x+0.1717，R²＝0.9949。以兔单克隆抗体2G4为捕获抗体，2F6为检测抗体，建立的双抗夹心酶联免疫方法检测人HE4蛋白的检测限可低至4.1pg/mL，具有灵敏度高、可靠性好的优势。

实施例3兔单克隆抗体2G4和2F6的热稳定检测

将包被好捕获抗体的酶标板、冻干的重组Human HE4蛋白、100×浓缩的检测抗体形成的检测体系分别置于-20℃、4℃、37℃密封保存，7天后取出，按照实施例2建立的双抗夹心酶联免疫吸附方法进行测试。

检测结果见图6，其中浅灰色曲线代表-20℃下抗体对稳定性的检测结果，深灰色曲线代表37℃下抗体对稳定性检测结果。结果显示，在37℃破坏7d，抗体对稳定性变异系数均小于15％，稳定性达标，说明兔单克隆抗体2G4和2F6形成的抗体对的稳定性较佳。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为第一抗体或第二抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区；其中：

所述第一抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；

所述第二抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18-20所示。

2.根据权利要求1所述的抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示；

所述第二抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根据权利要求1所述的抗人附睾分泌蛋白4的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；其中：

所述第一抗体的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述第二抗体的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3任一项所述的第一抗体或第二抗体。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述第一抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

所述第二抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述第一抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；

所述第二抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，重链的核苷酸序列如SEQIDNO.28所示。

7.一种重组载体，其特征在于，包含用于编码如权利要求1-3任一项所述的第一抗体和/或第二抗体的核酸分子。

8.一种免疫检测人附睾分泌蛋白4的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的第一抗体和/或第二抗体。

9.根据权利要求8所述的免疫检测人附睾分泌蛋白4的试剂盒，其特征在于，包括所述第一抗体和所述第二抗体，其中，所述第一抗体作为捕获抗体，所述第二抗体作为检测抗体或标记抗体。

10.根据权利要求8所述的免疫检测人附睾分泌蛋白4的试剂盒，其特征在于，免疫检测方法为酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫印迹法和流式细胞术中的一种或多种；

免疫检测样本包括重组人HE4蛋白和细胞分泌的人HE4蛋白中的至少一种。