CN118561998A - 抗羊白介素6抗体、抗体对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学检测技术领域，尤其涉及抗羊白介素6抗体、抗体对及其应用。所述抗体为第一抗体或第二抗体，第一抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示；第二抗体轻链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13‑15所示，重链可变区上CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18‑20所示。本发明提供的抗体及其抗体对对羊IL‑6蛋白具有高度的识别专一性，而且识别和结合活性好，亲和力高，用于免疫检测羊IL‑6具有高准确性、高特异性、高灵敏度和良好的稳定性等优点。

Description

抗羊白介素6抗体、抗体对及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学检测技术领域，特别涉及抗羊白介素6抗体、抗体对及其应用。

背景技术

白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，简称白介素6或IL6，属于白细胞介素家族成员，是一种功能广泛的多效性细胞炎症因子，主要在纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞、上皮细胞、角质细胞以及多种肿瘤细胞中产生。IL-6可调节多种细胞的生长与分化，能够诱导B细胞分化产生免疫球蛋白、促进T细胞的增殖生长、促进骨髓造血干细胞的增殖和增强血细胞的分化及其抗瘤效应等，具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能，并在机体的抗感染免疫反应中方面发挥重要作用。IL-6是固有免疫系统对损伤和感染最初反应所表达的重要细胞因子，可促进肝脏产生急性阶段反应物(如CRP、PCT、C3、SAA等等)，是急性感染早期诊断的灵敏指标，其血清浓度水平增高早于PCT和CRP，可用于早期炎症及早期脓毒症的预警诊断，并有效指导抗生素的合理用药。在发生感染、内外伤、外科手术、应激反应、脑死亡、肿瘤产生以及其它情况的急性炎症反应过程中，IL-6的快速产生有助于宿主防御，且IL-6升高与疾病的严重程度呈正相关。连续监测患者血清或血浆中IL-6的含量，能有效评估系统性炎症反应综合征(SIRS)的严重情况以及脓毒血症、脓毒血症性休克的预后情况。另外，在不同炎症疾病中，IL-6含量具有显著性差异，如细菌感染所导致的IL-6含量增加显著高于非细菌感染。因此，准确检测体内IL-6表达水平可为了解病情、评估病情严重程度和判断预后及疗效观察提供可靠数据。

羊是传统畜牧业中的六畜之一，是社会生产生活中重要的畜牧品种，对保证生活中肉类供给、增加农牧民收入等具有重要作用。实现羊养殖业的高质量发展，至关重要的一点就是对疾病的预防和质控。IL-6表达水平与炎症以及细菌感染等疾病息息相关。在生理状态下，羊血液中IL-6表达水平较低，难以被精确定量，因此，提供一种分析灵敏度高的IL-6检测方法对于预防和监控畜牧养殖羊疾病具有重要的现实意义和推广应用价值。

目前，基于抗原和抗体之间特异性和高灵敏性反应的免疫分析方法具有成本低、选择性强等优势，成为蛋白水平检测的主要研究方向，如胶体金免疫层析、乳胶免疫层析、放射免疫、酶联免疫吸附或化学发光免疫等方法，其关键技术在于开发出特异性识别和结合IL-6的抗体。然而，目前缺乏亲和力和特异性高的IL-6抗体，导致其灵敏度和检测效率受到了极大限制。

发明内容

针对现有技术存在抗体亲和力和/或特异性不高导致的免疫检测灵敏度低等问题，本发明提供了2株兔源抗体及其抗体对，对羊IL-6蛋白具有高度的识别专一性，而且识别和结合活性好，亲和力高，用于免疫检测羊IL-6具有高准确性、高特异性、高灵敏度和良好的稳定性等优点，由此，本发明还提供了前述抗体和抗体对在制备羊白介素6检测试剂或试剂盒中的应用。本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种抗羊白介素6抗体，选自第一抗体或第二抗体，其中：所述第一抗体轻链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-5所示，重链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8-10所示；所述第二抗体轻链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13-15所示，重链可变区上CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQID NO.18-20所示。

进一步地，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

进一步地，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

进一步地，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)₂、Fab’、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv或sc(Fv)₂。

本发明第二方面提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体或第二抗体。

进一步地，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

进一步地，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。

本发明第三方面提供了一种抗羊白介素6抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。

本发明第四方面提供了如上所述的抗羊白介素6抗体或抗体对在制备羊白介素6检测试剂或试剂盒中的应用。

进一步地，所述检测试剂或试剂盒包括第一抗体和第二抗体，且所述第一抗体作为捕获抗体，修饰有检测标记的所述第二抗体作为检测抗体。

与现有技术相比，本发明的优点及积极效果为：

1、本发明提供的2株兔源抗体能够特异性识别羊白介素6，对羊白介素6蛋白具有高度的专一性，而且识别和结合活性好，亲和力高，为免疫检测白介素6蛋白的分布或表达水平提供了性能优异的抗体原材料。

2、本发明提供的2株抗体识别羊白介素6蛋白表面不同的抗原决定簇，能够用于开发双抗夹心法酶联免疫吸附(ELISA)检测体系，为准确、特异、灵敏、高效、稳定检测血清、细胞、组织样本中微量水平的羊IL-6蛋白提供了一种可行性和可靠性的方法，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为携带轻链恒定区和重链恒定区的pBR322载体图谱；

图2为本发明实施例2兔单克隆抗体4C1与羊IL-6结合的亲和力曲线图；

图3为本发明实施例2兔单克隆抗体4E2与羊IL-6结合的亲和力曲线图；

图4为本发明实施例2兔单克隆抗体4C1和4E2与羊IL-6结合的抗原表位识别曲线；

图5为本发明实施例3基于兔单克隆抗体4C1和4E2建立的双抗夹心酶联免疫吸附法检测羊IL-6的标准曲线；

图6为本发明实施例3基于兔单克隆抗体4C1和4E2建立的双抗夹心酶联免疫吸附法的热稳定测定结果图；

图7为本发明实施例3基于兔单克隆抗体4C1和4E2建立的双抗夹心法酶联免疫吸附法的特异性测定结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B以及(iii)A和B。术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，应该理解这样的使用在适当情况下可以互换。

术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“兔源抗体”和“兔单抗”等类似词语具有相同含义，可互换使用，如非特殊说明，均指特异性结合羊(Sheep)白介素6的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。术语“羊白介素6”、“Sheep IL-6”等类似词语具有相同含义，可以互换使用。

抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。

典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(frameworkregion，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

CDR和FR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，由Kabat编号系统来定义。

轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。

全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。

抗体片段是全长抗体的一个或多个部分或片段，基本上保持与全长形式具有相同的生物学功能或活性，具体而言，抗体片段至少包括与全长抗体相同的CDR区，更优选地具有相同的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、F(ab)₂、Fab’、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv、sc(Fv)₂，这些抗体片段可通过本领域的常规技术获得。

(i)Fab：抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和第一恒定区)构成的单价片段，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)₂、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)₂片段和一个pFc'片段。F(ab’)₂片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备scFv一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构。

(ii)F(ab)₂：包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab构成的双价片段。

(iii)Fv：可变片段(Fv)位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整抗体。

(iv)(Fv)₂：由两个共价连接在一起的Fv片段构成。

(v)scFv：单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)是由单一多肽链构成的Fv片段，由一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)通过柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。

(vi)sc(Fv)₂片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接构成。

在一些实施例中，本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的互补决定区(CDR)和骨架区(FR)。在另一些实施例中，抗体可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如，羊源化抗体、嵌合抗体等类型，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“羊源化抗体”是非羊源抗体如兔源抗体的CDR区和来自羊FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非羊源抗体的可变区与羊源抗体的恒定区结合，例如羊兔嵌合抗体；在另一些情况下，非羊源抗体的CDR区与源自羊源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非羊源抗体的CDR区嫁接到羊类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他羊类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或羊源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。

术语“单克隆抗体”或“单抗”等类似词语可互换使用，是指同质抗体群，即除了可能自然发生的少量突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。“单克隆抗体”是高度特异性的，对抗原上的相同或基本相同的表位显示出单一的结合特异性和亲和力。修饰词“单克隆”表明抗体是从一个基本同质的抗体群体中获得的，不应解释为限制抗体的来源或制备方式。该抗体可以通过多种方法制备，包括但不限于杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法。

术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

本发明实施例提供了一种抗羊白介素6抗体，所述抗体选自第一抗体或第二抗体，所述第一抗体和所述第二抗体均包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，分别命名为CDR1、CDR2和CDR3；其中：

所述第一抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

所述第二抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。

抗体对潜在抗原的亲和力和特异性在于抗体的互补决定区(CDR)与抗原决定簇之间的空间构象互补，本发明具备上述CDR序列的2株兔源抗体具有特异性识别羊白介素6蛋白的能力，通过交叉实验发现二者均仅特异性识别和结合羊白介素6蛋白，对其它种属蛋白没有交叉反应，具有高度的专一性，而且对羊白介素6蛋白结合活性好，亲和常数K_D均在0.1nM级别，亲和力高，为免疫检测白介素6蛋白的分布或表达水平提供了性能优异的抗体原材料。此外，本发明提供的两株抗体识别羊白介素6蛋白表面不同的抗原决定簇，能够用于开发双抗夹心法酶联免疫吸附(ELISA)检测体系，该检测体系具有良好的检测特异性、高的检测灵敏度、优异的抗干扰能力以及热稳定性，以第一抗体作为捕获抗体、第二抗体作为检测抗体为例，对白介素6进行定量检测，检测限可低至2.146pg/mL，为准确、特异、灵敏、高效、稳定检测血清、细胞、组织样本中微量水平的羊IL-6蛋白提供了一种可行性和可靠性的方法，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。

可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。所述第一抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述第二抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

可选地，所述第一抗体和所述第二抗体还包括轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)，各抗体CL和VL构成轻链(FL)，CH和VH构成重链(FH)。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。具体地，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

可选地，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体(具有典型的Y型分子结构)或为所述全长抗体的抗原结合区域；该抗原结合区域是指基本上保持与兔单克隆抗体的全长形式具有相同的生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗原结合区域包括如上所述的CDR区，更优选地具有如上所述的可变区，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。可选地，所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)₂、Fab’、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv和sc(Fv)₂中的至少一种。这些抗原结合区域可通过本领域的常规技术获得。

本发明又一实施例提供了一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或宿主细胞，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。

核酸分子可以是DNA形式(如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或非编码链。

核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。将所得核酸分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，并在特定条件下培养转染后的宿主细胞，即可表达获得本发明的抗体。

示例性地，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

示例性地，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。

构建重组载体的原始载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件以允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带所述核酸分子的克隆载体或表达载体。

编码本发明抗体FL与FH的核酸分子可以分别插入到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞。当FL与FH在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，将分离的FL与FH混合并在合适条件下孵育以形成抗体。在另一些实施方式中，编码本发明抗体FL与FH的核酸分子也可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码FL与FH的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码FL与FH的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得FL与FH都可由相同的启动子表达。表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞类型。

本发明中重组载体转染或转化进入宿主细胞采用常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用CaCl₂法或MgCl₂处理；也可通过显微注射、电穿孔或脂质体包装等。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射法、电穿孔法、脂质体包装等。

宿主细胞可以是原核或真核细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌，酵母，果蝇S2或Sf9细胞，哺乳动物CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转染或转化如上所述重组载体的宿主细胞后，在适合条件下培养，即可表达出抗体，再进行分离，即得到纯化的抗体。

在较佳的实施方式中，重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。

本发明另一实施例提供了一种抗羊白介素6抗体对，由如上所述的第一抗体和第二抗体组成。

本发明提供的第一抗体和第二抗体结合于羊IL-6表面的不同表位，用于开发羊IL-6蛋白的双抗夹心酶联免疫吸附检测体系具有特异性高、灵敏度高、可靠性好等优点。

本发明再一实施例提供了如上所述的抗羊白介素6抗体或抗体对在制备羊白介素6检测试剂或试剂盒中的应用。

所述抗羊白介素6抗体或抗体对在制备羊白介素6检测试剂或试剂盒中的应用优势与如上所述的抗羊白介素6抗体或抗体对相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。

基于上述相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种用于检测羊白介素6的检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。

需要强调的是，第一抗体和第二抗体可以分别单独使用，也可以共同使用，或者配对使用。在检测时，如分开使用或共同使用时，将第一抗体和/或第二抗体作为一抗或捕获抗体，将待检样本与第一抗体和/或第二抗体接触，之后检测该抗体。在一些实施方案中，可以将第一抗体和/或第二抗体偶联检测标记，通过分析检测标记产生的可识别信号的变化来实现定性或定量检测IL-6。在另一些实施方案中，不标记抗羊IL-6的第一抗体和/或第二抗体(此时第一抗体和/或第二抗体作为一抗或捕获抗体)，而将检测标记偶联可结合一抗的二抗(此时二抗作为检测抗体)或其他分子，例如，如果抗羊IL-6抗体是兔源IgG抗体，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联检测标记的二抗产生可识别信号的变化。如配对使用时，则将第一抗体和第二抗体其中之一作为一抗或捕获抗体，另一者作为二抗或检测抗体。

上述所述的检测方法采用通常的免疫学方法，包括但不限于：酶免疫分析法(EIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)、免疫组织化学法(IHC)、免疫荧光法(IF)、免疫印迹法(WB)、流式细胞术(FC)等。检测对象包括重组表达的IL-6、天然分泌或表达的IL-6蛋白。检测样品包括但不限于血清、血浆、尿液、细胞培养液等中的IL-6蛋白。

优选地，所述检测试剂或试剂盒包括第一抗体和第二抗体，且所述第一抗体作为捕获抗体(或一抗)，所述第二抗体作为检测抗体(或二抗)，所述第二抗体修饰有检测标记。

上述用于产生可识别信号变化的检测标记包括但不限于：生物素、荧光染料(如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯)荧光蛋白(如异藻蓝蛋白、藻红蛋白、PerCP和藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、抗生物素蛋白)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。

在较佳的实施方式中，检测标记为生物素。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例1羊白介素6兔源单克隆抗体的制备

本实施例采用重组羊白介素6蛋白(购自Abcam，货号ab235819)为免疫原，免疫新西兰大白兔，从脾细胞中分离出单个抗原特异性B淋巴细胞培养，通过特定引物提取抗体对应的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的基因扩增产物，进一步构建到含有重链恒定区、轻链恒定区的表达载体上，并转染宿主细胞，培养宿主细胞以获得含有兔单克隆抗体的上清，经过纯化即得候选兔单克隆抗体。之后通过亲和力测试和抗原表位鉴定等方法进行筛选，得到兔单克隆抗体4C1和4E2。对筛选出的抗体进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，抗体4C1和4E2的氨基酸(AA)和核苷酸(DNA)序列分别见表1-2。以下为描述方便，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。

表1本实施例兔单克隆抗体4C1的序列信息

表2本实施例兔单克隆抗体4E2的序列信息

兔源抗体4C1和抗体4E2的制备方法具体包括以下步骤：

1、动物免疫：以商品化羊白介素6蛋白免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗氏佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次；三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对羊白介素6的滴度，取血清滴度高的兔子，用200μg免疫原在皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物，取脾脏。

2、分离脾脏中B淋巴细胞和进行B淋巴细胞分选：采用常规方法分离脾脏中B淋巴细胞，分选得到抗原特异性B淋巴细胞，相关方法参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日期：2019-07-16)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日期：2020-08-11)”。

3、编码兔单克隆抗体基因的克隆：将培养的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆细胞收集裂解后按Quick-RNA^TMMicroPrep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，反转录成cDNA。以前述cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来并进行测序。PCR反应体系包括：4μLcDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×Gloria HiFi(来自ABclonal，货号RK20717)和6.5μL H₂O；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。扩增VL和VH基因的引物序列(5'-3')如下所示，F和R分别表示正向引物和反向引物：

VL-F：tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac(见SEQ ID NO.29)；

VL-R：cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag(见SEQ ID NO.30)；

VH-F：tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg(见SEQ ID NO.31)；

VH-R：gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg(见SEQ ID NO.32)。

4、兔单克隆抗体的生产和纯化：为了规模化生产抗羊IL-6的抗体，将携带轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)基因的哺乳动物表达载体pBR322分别用XbaI和NheI限制性内切酶进行线性化处理，将上述PCR扩增的包含信号肽的VL和VH基因纯化后，采取同源重组方式构建到表达载体CL、CH基因上游，得到轻链(FL)和重链(FH)基因表达载体，经测序验证载体构建成功。所用载体表达图谱见图1，pBR322 origin和f1 origin为复制启动子，Ampcillin为抗性基因，CMV promoter为转录启动子，SV40 PA terminator为加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。CL、CH基因通过查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。

本实施例的信号肽采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”和专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”的轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”或“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。

将测序验证正确的含有轻链(FL)基因和重链(FH)基因的表达载体一起转染至293F细胞中，转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的识别羊IL-6的兔源单克隆抗体。使用proteinA亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从培养上清液中纯化出目的抗体。使用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，抗体4C1浓度为2.3mg/mL，抗体4E2浓度为2.44mg/mL，纯度均大于95％。将纯化抗体分装后于-20℃低温保存备用。

实施例2兔单克隆抗体4C1和4E2识别IL-6抗原的性能测试

1)使用Probe Life公司Gator生物分子相互作用分析仪对抗体4C1和4E2与羊IL-6蛋白亲和力进行测定，抗体4C1浓度为1μg/mL和抗体4E2的浓度为4μg/mL；分别将抗体固定在protein A探针上，然后针对抗体4C1和抗体4E2分别用70nM、150nM两个浓度的IL-6蛋白结合，获得亲和力曲线，抗体4C1和4E2结合羊IL-6的亲和力曲线见图2-3，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示结合时间，深灰色曲线为实时结合数值曲线，浅灰色曲线为拟合平均值曲线。通过曲线拟合计算得到的亲和力常数见表3，其中，解离系数K_off用于表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数K_on用于表征抗体与其靶标结合速度的常数，亲和常数K_D为K_off/K_on的比，表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数。可以看到，抗体4C1和4E2与羊IL-6蛋白的亲和常数K_D均在0.1nM级别，证实抗体亲和力高、特异性良好。

表3兔单克隆抗体的亲和力相关参数测定结果

抗体	Koff(1/s)	Kon(1/Ms)	KD(M)
				4C1	1.15×10-4	3.64×105	3.17×10-10
4E2	7.96×10-5	6.08×105	1.31×10-10

2)抗原识别表位的鉴定：使用Probe Life公司Gator生物分子相互作用分析仪对抗体4C1和4E2识别羊IL-6蛋白的表位进行鉴定，抗体和抗原浓度均为3μg/mL。通过分析两种抗体之间的配对数据，从中确定其识别抗原表位决定簇是否相同。图4示出了4C1和4E2识别羊IL-6的抗原表位情况，其中，纵坐标表示探针结合抗体和蛋白后的结合物厚度变化，横坐标表示抗体和抗原蛋白结合时间。可以看到，在抗体4C1和羊白介素6结合后，抗体4E2仍旧能够结合上去，体现为曲线进一步上升，表明结合在探针上的抗体浓度及厚度进一步增强，证明兔单克隆抗体4C1和4E2结合在羊白介素6蛋白表面不同的部位，且结合位点相互不干扰。因此，二者可作为双抗夹心法酶联免疫检测的配对抗体。

实施例3基于抗体4C1和4E2建立双抗夹心酶联免疫吸附体系的灵敏度测试

将4C1作为捕获抗体、4E2作为检测抗体建立双抗夹心法酶联免疫吸附(ELISA)体系，步骤如下：1)包被捕获抗体4C1：将抗体4C1用1×PBS稀释成0.5μg/mL，涡旋仪混匀后，以100μL/well加入到96孔微孔板中，盖上盖板膜，置于4℃冰箱孵育16-20h；2)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板一次，加样350μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；3)封闭：将E013封闭液(1×PBS中含2％BSA、5％蔗糖、0.05％吐温和0.1％proclin 300，pH 7.2)以200μL/孔加入到板孔内，盖上盖板膜，37℃封闭2h，封闭完成后弃去封闭液，将酶标板拍干后，置于37℃烘箱烘干0.5-2h，取出备用；4)加抗原IL-6蛋白：将羊IL-6蛋白用E013封闭液进行梯度稀释(稀释浓度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.635和0pg/mL)，然后将不同浓度以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育2h；5)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；6)加检测抗体4E2：将用生物素标记的兔单克隆抗体4E2(4E2-biotin)稀释成0.04μg/mL后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育1h；其中，4E2-biotin处理方法包括：将抗体4E2配成1mg/mL的溶液，用DMSO将NHS-LC-biotin配成浓度为60mg/mL的溶液；取200μL 1mg/mL的抗体4E2溶液，加入10μL 60mg/mL的NHS-LC-biotin溶液；混匀后在室温放置30min后，加入50μg 500mM的Tris溶液(pH9.0)中止反应；最后加入大量pH7.4的1×PBS缓冲液，用排阻极限为30KD的离心柱离心，用于除去多余的生物素分子和进行缓冲液体系的平衡；7)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；8)加SA-HRP：将100×SA-HRP(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自武汉三鹰生物科技有限公司，货号SA00001-0)浓缩液进行100倍稀释后，以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育0.5h；9)洗板：孵育完成后，弃去孔内液体，用1×PBST洗板三次，加样300μL，静置40s后弃去孔内液体，在平板纸上拍干孔内液体；10)加TMB显色液：将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液以100μL/孔依次加入酶标板中，盖上盖板膜，37℃孵育15min；11)读数：孵育完成后，取出酶标板，每孔加入50μL终止液(1mol/L盐酸)，立即用酶标仪进行读数。以羊白介素6蛋白浓度为横坐标，吸光度值的校正值Y1(Y1＝OD_450nm-OD_630nm)为纵坐标作图，使用Logistic曲线四参数拟合，建立的标准曲线见图5，曲线方程为：y＝7.71018/[1+(x/2636.05835)^^-1.03201]+0.07514(R²＝0.99999)。经标准曲线计算，其检测灵敏度为2.146pg/mL(即检测限可低至2.146pg/mL)，结果见表4；证实该抗体对具有灵敏度高、可靠性好的优势。

表4基于抗体4C1和4E2建立双抗夹心酶联免疫吸附体系的灵敏度测试数据

实施例4基于抗体4C1和4E2建立双抗夹心酶联免疫吸附体系的热稳定性测试

将包被好捕获抗体4C1的酶标板、冻干的羊白介素6蛋白、100×浓缩的检测抗体4E2形成的检测体系分别置于-20℃、37℃密封保存7d后取出，按照实施例3建立的双抗夹心ELISA进行测试，不同温度保存下检测得到的标准曲线见图6。结果显示，在37℃存储7d，抗体对稳定性变异系数为3.71％，远小于15％，判定稳定性合格，说明抗体4C1和4E29形成的抗体对的稳定性较佳。

实施例5基于抗体4C1和4E2建立双抗夹心酶联免疫吸附体系的特异性测试

分别采用与羊IL-6相近的人(Human)IL-6(购自RD，货号840115)、小鼠(Mouse)IL-6(购自RD，货号840173)和大鼠(Rat)IL-6(购自RD，货号840236)作为抗原，标准品蛋白的浓度均为1000pg/mL，按照实施例3建立的双抗夹心ELISA进行交叉反应测试，结果见图7。结果显示，抗体4C1和4E2只与羊白介素6结合，不与其他相近蛋白产生任何交叉反应；证实抗体4C1和4E2对羊IL-6蛋白具有高度的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗羊白介素6抗体，其特征在于，选自第一抗体或第二抗体，其中：

所述第一抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

所述第二抗体轻链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQID NO.14和SEQ ID NO.15所示，重链可变区上CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示。

2.根据权利要求1所述的抗羊白介素6抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述第二抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根据权利要求2所述的抗羊白介素6抗体，其特征在于，所述第一抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述第二抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示。

4.根据权利要求1所述的抗羊白介素6抗体，其特征在于，所述第一抗体和/或所述第二抗体为全长抗体或为所述全长抗体的抗原结合区域；

所述抗原结合区域选自Fab、F(ab)₂、Fab’、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv或sc(Fv)₂。

5.一种核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项所述的第一抗体或第二抗体。

6.根据权利要求5所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述第一抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

所述第二抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。

7.根据权利要求6所述的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体或包含所述核酸分子的宿主细胞，其特征在于，所述第一抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；

所述第二抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，重链的核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示。

8.一种抗羊白介素6抗体对，其特征在于，由如权利要求1-4任一项所述的第一抗体和第二抗体组成。

9.如权利要求1-4任一项所述的抗羊白介素6抗体或如权利要求8所述的抗羊白介素6抗体对在制备羊白介素6检测试剂或试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的抗羊白介素6抗体或抗羊白介素6抗体对在制备羊白介素6检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒包括第一抗体和第二抗体，且所述第一抗体作为捕获抗体，修饰有检测标记的所述第二抗体作为检测抗体。