PT821695E

PT821695E - Purificação de anticorpos por cromatografia de interacção hidrofóbica a ph baixo

Info

Publication number: PT821695E
Application number: PT96912575T
Authority: PT
Inventors: Ernst H Rinderknecht; Gerardo A Zapata
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 2007-03-30
Also published as: WO1996033208A1; US5641870A; US20050271654A1; MX9707909A; CA2214633C; NZ306718A; NZ334211A; EP1752465A3; EP0821695A1; US8012754B2; US7038017B2; HK1099310A1; AU721736B2; ATE346858T1; ES2365929T3; US6214984B1; US6066719A; ZA962885B; CA2214633A1; JP2006257098A

Description

ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Purificação de anticorpos por cromatografia de interacção hidrofóbica a pH baixo"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo do Invento 0 presente invento refere-se, em geral, à purificação de anticorpos. Em particular, o invento refere-se a um método de recuperação de um fragmento de anticorpo a partir de variantes, impurezas e contaminantes a ele associados.

Descrição da Arte Relacionada A cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC) é uma ferramenta útil para a separação de moléculas com base na sua hidrofobicidade. Em geral, as moléculas de amostra num tampão de elevado teor salino são carregadas numa coluna de HIC. 0 sal no tampão interage com as moléculas de água para reduzir a solvatação das moléculas em solução, expondo assim as regiões hidrofóbicas das moléculas de amostra que são consequentemente adsorvidas pela coluna de HIC. Quanto mais hidrofóbica é a molécula, menos sal é necessário para promover a ligação. Normalmente, utiliza-se um gradiente de sal decrescente para eluir amostras da coluna. À medida que a força iónica diminui, aumenta a exposição das regiões hidrófilas das moléculas e as moléculas eluem da coluna de forma a aumentar a hidrofobicidade. A eluição da amostra pode também ser alcançada pela adição de modificadores ou detergentes orgânicos suaves ao tampão de eluição. A HIC é revista em Protein Purification, 2a Ed., Springer-Verlag, New York, pg. 176-179 (1988). A HIC tem sido utilizada por vários investigadores para purificação de anticorpos. Danielsson et al., Journal of Immunoloqical Methods 115: 79-88 (1988) verificaram que a HIC era particularmente útil para purificação de anticorpos monoclonais a partir de ascites de ratinho quando o ponto isoeléctrico dos anticorpos era inferior a 7,2. A HIC foi realizada com uma coluna de Alkyl Superose HR™. 0 sistema 2 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ tampão foi fosfato Ο,ΙΜ, com adição de sulfato de amónio. Normalmente, o tampão de partida continha sulfato de amónio 2M. Bridonneau et al., Journal of Chromatography 616: 197-204 (1993) interessaram-se em determinar se era ou não possível utilizar colunas HIC diferentes para purificação selectiva de subclasses de imunoglobulina G (IgG) humana. Os anticorpos foram adsorvidos em colunas de Phenyl-Sepharose™, Butyl-Sepharose™ ou Octyl-Sepharose™ em sulfato de amónio 1M (pH 7,0) e eluíram com um gradiente de sal decrescente. O meio de Octyl-Sepharose™ deu uma fracção fracamente adsorvida um pouco enriquecida em lgG2a. Ver também Berkowitz et al., Journal of Chromatography 389: 317-321 (1987); Gagnon et al., (90th Annual Meeting, American Society for Microbiology, Anaheim, 13-17 Maio, 1990) Resumo No. 0-4; Johansson et al., Biol, Recombinant Microorq. Anim. Cells, (Oholo 34 Meeting), 409-414 (1991); Pavlu et al., Journal of Chromatography 359: 449-460 (1986) e Abe et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 27: 215-227 (1993) no que se refere à HIC de anticorpos. A HIC tem também sido utilizada para purificar fragmentos de anticorpo. Inouye et al., Protein Engineering, pag. 6, 8 e 1018-1019 (1993); Inouye et al., Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects 5: 609-616 (1993); Inouye et al., Journal Of Biochemical and Biophysical Methods 26: 27-39 (1993) e Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) prepararam fragmentos F(ab')2 a partir de digeridos de pepsina de anticorpos monoclonais IgM de ratinho utilizando uma coluna HIC TSKgel Ether-5PW™. Os fragmentos de anticorpo foram salgados com sulfato de amónio a 60% e os precipitados foram dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) contendo sulfato de amónio 1M. Esta solução foi carregada numa coluna HIC que tinha sido equilibrada com PBS contendo também sulfato de amónio 1M. Os fragmentos F(ab')2 que foram adsorvidos na coluna foram eluidos por redução da concentração de sulfato de amónio no tampão de eluição até 0M. Inouye et al. verificaram que a fracção contendo o F(ab')2 era homogénea quer por SDS-PAGE quer por hplc de filtração em gel. O método foi considerado adequado para purificação a larga escala de fragmentos F(ab')2· Similarmente, Rea et al., Journal of Cell, Biochem.

Supl. 0, Resumo No. Xl-206 (17 Parte A), pg. 50 (1993) 3 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ avaliaram a HIC para purificação de um fragmento F(ab')2 produzido por digestão péptica de um anticorpo monoclonal

IgG2a de murino. A purificação da proteína A para remoção do anticorpo intacto residual precedeu o passo de HIC. O desempenho de purificação das três colunas de HIC diferentes foi testado em vários sais e pH diferentes. POROS PE™ (Éter fenílico) mostrou ser a melhor coluna e o sulfato de sódio tamponado com fosfato a pH 8 deu a melhor resolução do fragmento F(ab')2-

Em WO 95/22389 descreve-se a aplicação da cromatografia de combinação de cromatografia de interacção hidrofóbica à purificação de moléculas de anticorpo.

SUMÁRIO DO INVENTO

Em contraste com as técnicas de HIC acima descritas, que são geralmente realizadas a pH aproximadamente neutro na presença de elevadas concentrações de sal (utilizando um gradiente de sal para eluir o anticorpo), o presente invento refere-se à cromatografia de interacção hidrofóbica a pH baixo (LPHIC) para purificação de anticorpos. A LPHIC é, de preferência, realizada a baixas concentrações de sal, i.e., sal a cerca de 0-0,25M, de preferência sal a cerca de 0-0,1M e mais preferivelmente sal a 0-30mM. Esta baixa concentração de sal aplica-se também ao tampão de carga. De preferência, não se utiliza nenhum gradiente de sal para eluir o anticorpo. O invento refere-se a um processo de purificação de um anticorpo a partir de um contaminante que compreende o carregamento de uma mistura contendo o anticorpo e o contaminante numa coluna de cromatografia de interacção hidrofóbica e eluição do anticorpo a partir da coluna com um tampão tendo um pH de cerca de 2,5-4,5. De preferência, o tampão está a um pH de cerca de 2,8-3,5 e, mais preferivelmente, a um pH de cerca de 3,1. Normalmente, a mistura carregada na coluna está aproximadamente ao mesmo pH que o tampão de eluição.

Em particular, o invento proporciona um processo de purificação de um anticorpo compreendendo o carregamento de uma mistura contendo o anticorpo e anticorpo incorrectamente 4 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ dobrado e/ou ligado por dissulfureto, numa coluna de cromatografia de interacção hidrofóbica e eluição do anticorpo a partir da coluna com um tampão tendo um pH de cerca de 2,5-4,5, em que o pH do tampão causa a retenção na coluna do anticorpo incorrectamente dobrado e/ou ligado por dissulfureto. 0 método é particularmente útil na purificação de fragmentos de anticorpo, especialmente fragmentos de anticorpo correctamente dobrados e ligados por dissulfureto (por exemplo, fragmentos Fab) a partir de fragmentos de anticorpo contaminantes que não estão correctamente dobrados e/ou ligados por dissulfureto. 0 invento reside, pelo menos em parte, na identificação de um problema associado à formação de imunoglobulinas recombinantes. Observou-se que tal produção resulta na formação de anticorpos F(ab')2 funcionais assim como numa variedade de fragmentos leves e pesados incorrectamente associados. A impureza mais difícil de remover foi aqui caracterizada como um fragmento de anticorpo correctamente dobrado cujas cadeias leve e pesada são incapazes de associar através de ligação dissulfureto. Esta impureza de anticorpo pode ser detectada por geles de SDS-PAGE e HPLC de Fase Inversa como cadeias pesadas e leves. A LPHIC aqui descrita proporciona um meio para remoção substancial deste contaminante a partir de composições parcialmente purificadas derivadas de células hospedeiras que produzem o fragmento de anticorpo recombinante, embora não esteja limitada à purificação de produtos recombinantes. 0 invento refere-se também à formulação de anticorpo preparada pelo processo e utilizações desta formulação de anticorpo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig.l apresenta um cromatograma de fluxo dinâmico típico da cromatografia de interacção hidrofóbica a pH baixo (ver Exemplo 1) . A coluna foi operada no modo de fluxo dinâmico ("flow-through"). 0 fragmento de anticorpo ligado por dissulfureto, correctamente dobrado elui no fluxo. As espécies de fragmentos de anticorpo de cadeia leve, cadeia pesada, agregados leve-pesada e não ligados por dissulfureto 5 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ permanecem fixadas à coluna. O pico 1 é o fluxo que elui após lavagem com água, o pico 2 é a lavagem com ureia das espécies ligadas. A FIG.2 representa uma análise de HPLC de Fase Inversa de conjuntos ABX™ e Phenyl-Sepharose™ Fast Flow (FF) de fragmento de anticorpo anti-CDl8 MHM23. Cromatograma 1; conjunto ABX™ contendo contaminantes de cadeia leve e pesada presentes antes da purificação por LPHIC. Cromatograma 2; purificação por LPHIC. Cromatograma 3; análise de Fase Inversa do tampão de regeneração da coluna contendo as impurezas de cadeia leve e pesada e os fragmentos de anticorpo retidos pela coluna Phenyl-Sepharose™ Fast Flow.

As Fig. 3A-3D representam espectros no UV próximo e UV longínquo de dois fragmentos de anticorpo, rhuMAb H520ZG1 e rhuMAb H520ZG2, obtidos por dicroismo circular. A Fig.3A representa espectros no UV próximo de rhuMAb H520ZG2 e a

Fig.3B representa espectros no UV longínquo de rhuMAb H520ZG2. Este anticorpo é um mutante de rhuMAb H520ZG1 no qual os resíduos cisteína 215 e 228, envolvidos na ligação dissulfureto entre as cadeias pesada e leve, foram mutados para resíduos serina. Os espectros de dicroismo circular nas regiões de UV longínquo e próximo mostraram um ponto de transição próximo do pH 3,2 (linha grossa). Um ponto de transição representa uma alteração de fragmento de anticorpo dobrado para o seu estado não dobrado. A Fig.3C é um espectro no UV próximo de rhuMAb H520ZG e a Fig.3D é um espectro no UV longínquo de rhuMAb H520ZG1. Este fragmento de anticorpo mostrou um ponto de transição diferente a pH 2,5 (linha grossa). A Fig.4 é um gráfico de barras que representa as consequências no rendimento do produto da variação do pH na HIC. Os conjuntos de fragmentos de anticorpo purificados por ABX™ contendo a impureza de anticorpo não ligada (i.e. não tendo ligação dissulfureto entre a cadeia pesada e leve) foram posteriormente purificados numa coluna de Phenyl-Sepharose™ Fast Flow. A purificação foi realizada a valores de pH entre 3,0 e 6,5 de forma a determinar o melhor pH para obter o máximo rendimento e pureza. A análise dos conjuntos que eluíram no fluxo foi realizada utilizando HPLC de Fase 6 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Inversa. A partir do gráfico de barras pode-se observar que o pH 3,1 representa o melhor valor para maximizar quer a pureza quer o rendimento da purificação do fragmento de anticorpo rhuMAb H520ZG1.

As Fig. 5A e 5B representam o desenho de L-F(ab')2 e a cassete de expressão descrita no Exemplo 2, deste documento. A Fig.5A é uma representação esquemática das variantes de L-F(ab')2 (vl, v2 e v3) nas quais os domínios variáveis (V) do Ab anti-pl85HER2, huMAb4D5-8, e do Ab anti-CD18, huMAb H520ZG1, são indicados por caixas vazias e a cheio, respectivamente. A Fig. 5B é uma representação esquemática do operão dicistrónico para expressão de variantes de L-F(ab')2 anti-pl85HER2 derivadas do plasmídeo pAK19. A expressão está sob o controlo de transcrição do promotor de fosfatase alcalina de E. coli {phoA) que é indutível por privação de fosfato. Cada cadeia de anticorpo (Ab) é precedida pela sequência de sinal da enterotoxina II estável ao calor (stll) de E. coli para dirigir a secreção para o espaço periplasmático de E. coli. Os domínios VL e VH (ambas as cópias) humanizados estão precisamente fundidos no seu lado 3' a domínios constantes Ki CL e IgGi CH1 humanos, respectivamente. A cadeia H compreende segmentos duplicados em série nos quais o domínio 5' CH1 é ligado em enquadramento a um segmento que codifica vH. 0 domínio 3' CH1 é seguido pelo terminador (ter) de transcrição do bacteriófago lambda tO.

As Fig. 6A-6C representam as análises por cromatografia de exclusão por tamanhos FPLC de anti-pl85HER2. A Fig.6A mostra L-F(ab')2 vl; a Fig.6B mostra F(ab')2 ligado a tioéter e a Fig.6C mostra a titulação de Fab com domínio extracelular (ECD) de pl85HER2. A Fig. 7 apresenta a inibição da proliferação de células BT474 por fragmentos L-F(ab')2, F(ab')2 e Fab anti-pl85HER2. Os dados mostrados são apresentados como uma percentagem de resultados com culturas não tratadas (média de medições duplicadas e representativos de três experiências separadas). Os fragmentos monovalentes e bivalentes calculados por titulação com ECD pl85 e filtração em gel, sao representados por símbolos a vazio e a cheio, respectivamente. 7 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ A Fig. 8 representa a farmacocinética dos fragmentos anti-pl85HER2, L-F(ab')2 vl, Fab e F(ab')2 ligado a tioéter, em ratinhos normais. As amostras de soro foram recuperadas a partir de grupos de 45 ratinhos fêmea CD-I após uma única injecção na veia da cauda (10 mg/kg). As concentrações séricas médias (Ct + DP) calculadas por elisa de ligação ao antigénio (Ag) são apresentadas juntamente com os ajustes pelo método dos minimos quadrados não linear (-):

Ct = 155e~1,73t + 190e”°'°42t, L-F(ab')2 vl;

Ct = 239e~°' 704t + 38,4e“0,264t, F(ab')2;

Ct = 440e~4,99t + 2,69e~°' 442t, Fab;

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Definições: O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais intactos (incluindo anticorpos agonistas e antagonistas), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de, pelo menos, dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpo desde que exibam a actividade biológica desejada. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, em geral, a região de ligação ao antigénio ou a região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (ver o Exemplo 2 abaixo); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A expressão "anticorpo monoclonal", como aqui utilizada, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e., os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos com excepção de possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que 8 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ incluem tipicamente anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Adicionalmente à sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos porque são sintetizados pela cultura de hibridomas, não contaminada por outras imunoglobulinas. 0 adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e que não é construído requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos pelo método do hibridoma pela primeira vez descrito por Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975) ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (ver, por exemplo, Patente U.S. N°. 4816567 [Cabilly et al.]). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991).

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto que o resto da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855 [1984]).

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) que contêm a sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região determinante de 9 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como de ratinho, rato ou coelho, tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos de esqueleto de Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo receptor nem na CDR importada ou sequências de esqueleto. Estas modificações são produzidas para aperfeiçoar mais e optimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado vai compreender substancialmente todo ou, pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado vai também compreender, optimamente, pelo menos, uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes ver: Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). 0 anticorpo humanizado inclui um anticorpo Primatized™ em que a região do anticorpo de ligação ao antigénio é derivada de um anticorpo produzido por imunização de macacos Macaque com o antigénio de interesse. 0 termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo pequenos com dois locais de ligação ao antigénio, fragmentos que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL) . Utilizando um ligante que é demasiadamente curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios da mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigénio. Os diacorpos são mais completamente descritos em, por exemplo, EP 404097; WO 93/11161; e Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993).

Como aqui utilizado, "tampão" refere-se a uma solução tamponada que resiste a alterações do pH pela acção dos seus componentes ácido-base conjugados. O tampão para o aspecto de 10 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ cromatografia de interacção hidrofóbica do presente invento tem um pH num intervalo de cerca de 2,5-4,5, de preferência, cerca de 2,8-3,5. Exemplos de tampões que vão controlar o pH neste intervalo incluem tampões de fosfato, acetato, citrato ou amónio, ou mais de um. Os tampões preferidos são os tampões de citrato e amónio, mais preferivelmente tampões de sulfato de amónio ou citrato de amónio. O "tampão de carga" é aquele que é utilizado para carregar a mistura do anticorpo e contaminante na coluna de Hic e o "tampão de eluição" é aquele que é utilizado para eluir o anticorpo da coluna.

Frequentemente, o tampão de carga e o tampão de eluição são o mesmo.

Por "correctamente ligado por dissulfureto" quer-se dizer que todos os resíduos cisteína no anticorpo estão covalentemente associados por ligações dissulfureto e estas associações dissulfureto correspondem a associações dissulfureto da imunoglobulina nativa. O dicroísmo circular como descrito no Exemplo 1 pode ser utilizado para determinar se um anticorpo está ou não correctamente ligado por dissulfureto seguindo a integridade estrutural da molécula após desnaturação com ácido. Um anticorpo está "incorrectamente ligado por dissulfureto" quando um ou mais resíduo(s) cisteína não está(ão) covalentemente associado(s) por ligação(ões) dissulfureto ou está(ão) covalentemente associado(s) com resíduos cisteína aos quais não está(ão) normalmente associado(s) na imunoglobulina nativa.

Formas de Realização do Invento 0 presente processo envolve a purificação de um anticorpo a partir das suas variantes relacionadas, normalmente depois do anticorpo ter sido já purificado da maioria das outras impurezas. Este passo de purificação pode ser o final antes da formulação terapêutica ou pode ser seguido por outro(s) passo(s) de purificação. Embora o anticorpo na mistura de variantes possa ser produzido a partir de uma qualquer fonte (por exemplo, clivagem péptica de anticorpos intactos), é, de preferência, produzido recombinantemente. Seguem-se as técnicas para a produção de anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos. 11 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ I. Preparação de Anticorpos (i) Anticorpos policlonais

Os anticorpos policlonais são geralmente criados em animais por múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e de um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante com uma proteina que seja imunogénica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa Fissurela, albumina sérica, tiroglobulina de bovino ou inibidor de tripsina de rebento de soja utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoílsulfosuccinimida (conjugação através de residuos cisteina), N-hidroxissuccinimida (através de residuos lisina), glutaraldeido, anidrido succinico, SOCI2 ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquilo diferentes.

Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos ou derivados por combinação de 1 mg ou 1 μg do péptido ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injecção intradérmica da solução em múltiplos locais. Um mês mais tarde, os animais recebem um reforço com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é analisado quanto ao titulo em anticorpos. Os animais recebem reforços até o titulo atingir um patamar. De preferência, 0 animal recebe o reforço com 0 conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado com uma proteina diferente e/ou através de um reagente de ligação cruzada diferente. Os conjugados podem também ser produzidos em cultura de células recombinantes como fusões de proteínas. Os agentes agregantes tais como alúmen são também adequadamente utilizados para intensificar a resposta imunitária. (ii) Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos com excepção de possíveis mutações de ocorrência 12 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ natural que possam estar presentes em quantidades menores. Assim, o adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975) ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (Cabilly et al., supra).

No método do hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado como acima descrito para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se vão ligar especificamente à proteína utilizada para a imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pag. 59-103 [Academic Press, 1986].

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e deixadas crescer num meio de cultura adequado que contém, de preferência, uma ou mais substância(s) que inibe(m) o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma progenitoras, não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma progenitoras não possuírem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas vai incluir tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficazmente, sustentam a produção de nível elevado e estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpos seleccionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Entre estas, as linhas de células de mieloma preferidas são as linhas de mieloma de murino, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis a partir do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, e as células SP-2 disponíveis a partir da American Type 13 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA. As linhas de células de mieloma humano e heteromieloma de ratinho-humano foram também descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pg. 51-63 [Mareei Dekker, Inc., New York, 1987]). O meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem é analisado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada, de preferência, por imunoprecipitação ou por um teste de ligação in vitro, tal como radio-imunoensaio (RIA) ou teste imunoassorvente com enzimas ligadas (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, pela análise de Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980).

Depois de se identificarem as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e deixados crescer por métodos padrão (Goding, supra). Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser deixadas crescer in vivo na forma de tumores asciticos num animal.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido ascitico ou soro, por procedimentos de purificação de imunoglobulinas convencionais, tais como, por exemplo, proteina A-Sephamse™, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais é rapidamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotidicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino). As células de hibridoma servem como uma fonte 14 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ preferida de um tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são depois transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma, que de outro modo não produzem a proteina imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisão relativos à expressão recombinante em bactérias de ADN que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992).

Numa outra concretização, os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos produzidas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990), que utilizam o antigénio adequado tal como CDlla, CD18, IgE ou HER-2 para seleccionar um anticorpo ou fragmento de anticorpo adequado. Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e humano, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. As publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (gama de nM) por ligação aleatória de cadeias (Mark et al., Bio/Technology 10: 779-783 [1992]), assim como a infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21: 2265-2266 [1993]). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas do hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos "monoclonais". O ADN pode também ser modificado, por exemplo, por substituição da sequência de codificação por domínios constantes de cadeia pesada e leve humana em vez das sequências de murino homólogas (Cabilly et al., supra;

Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 81: 6851 [1984]) ou por ligação covalente à sequência de codificação de imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação de um polipéptido que não imunoglobulina. 15 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Tais polipéptidos que não imunoglobulina são tipicamente substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo, ou são substituídos pelos domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio, de um anticorpo, para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um local de combinação com o antigénio que tem especificidade para um antigénio e um outro local de combinação com o antigénio que tem especificidade para um antigénio diferente.

Os anticorpos quiméricos ou híbridos podem também ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química da síntese de proteínas, incluindo os que envolvem agentes de ligação cruzada. Por exemplo, as imunotoxinas podem ser construídas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou por formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este fim incluem o iminotiolato e o metil-4-mercaptobutirimidato.

Para aplicações em diagnóstico, as variantes aqui derivadas de anticorpos são tipicamente marcadas com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125l; um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; marcas isotópicas radioactivas, tais como, por exemplo, I, P, C ou H; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano.

Pode ser utilizado um qualquer método conhecido na arte para conjugar separadamente a variante de polipéptido à porção detectável, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); e Nygren, J. Histochem. And Cytochem. 30: 407 (1982). (iii) Anticorpos humanizados e humanos

Os métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na arte. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduo(s) de aminoácidos introduzido(s), 16 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ provenientes de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", e são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-525 [1986]; Riechmann et al., Nature 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 [1988]), por substituição das sequências correspondentes de um anticorpo humano por CDR ou sequências de CDR de roedores. Por conseguinte, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Cabilly et al., supra), nos quais substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. A escolha dos domínios variáveis humanos, leves e pesados, a utilizar na preparação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o denominado método do "melhor ajuste" {“best-fit”), a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é analisada contra a biblioteca completa de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana que é mais próxima da dos roedores é então aceite como o esqueleto humano (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 [1993]; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 [1987]). Um outro método utiliza um esqueleto particular derivado da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves e pesadas. O mesmo esqueleto pode ser utilizado para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285 [1992]; Presta et al., J. Immunol. 151: 2623 [1993]) . É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de elevada afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das 17 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ sequências progenitoras e de vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências progenitoras e humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão normalmente disponíveis e são conhecidos dos peritos na arte. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas seleccionadas. A inspecção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para ligar o seu antigénio. Deste modo, os resíduos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir de sequências de consenso e de importação de forma a alcançar a característica do anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o(s) antigénio(s) alvo. Em geral, os resíduos da CDR estão directa e mais substancialmente envolvidos na influência à ligação ao antigénio.

Alternativamente, é agora possível produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene de região de ligação da cadeia pesada (JH) de anticorpo em ratinhos mutantes quiméricos e de linha germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do arranjo génico da imunoglobulina da linha germinativa humana para tais ratinhos mutantes de linha germinativa vai resultar na produção de anticorpos humanos após provocação com o antigénio. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2551-255 (1993);

Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et ai., Year in Immuno. 7: 33 (1993). Os anticorpos humanos podem também ser produzidos em bibliotecas de exibição em fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 [1991]). (iv) Fragmentos de anticorpo

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos 18 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ eram derivados da digestão proteolitica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 [1992] e Brennan et al.r

Science 229: 81 [1985]). No entanto, estes fragmentos podem agora ser directamente produzidos por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas de anticorpos em fagos acima discutidas. Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser directamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 [1992]). Alternativamente, os fragmentos F(ab')2 podem ser directamente isolados a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para os peritos. (v) Anticorpos biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos (BsAb) são anticorpos que têm especificidades de ligação para, pelo menos, dois antigénios diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser derivados de anticorpos de comprimento total ou de fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

Os métodos para a preparação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein e Cuello, Nature 305: 537-539 [1983]). Devido à ordenação aleatória das cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta, que é normalmente realizada por passos de cromatografia de afinidade, é bastante incómoda, sendo baixos os rendimentos de produto. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829, publicado em 13 de Maio de 1993, e em Traunecker et ai., EMBOJ. 10: 3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente e mais preferida, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de 19 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos nas sequências de dominio constante de imunoglobulina. A fusão é, de preferência, com um dominio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo, pelo menos, parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o local necessário para ligação da cadeia leve, presente, pelo menos, numa das fusões. Os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade na regulação das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptidicos nas concretizações em que proporções desiguais das três cadeias polipeptidicas utilizadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. No entanto, é possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptidicas num vector de expressão, quando a expressão de, pelo menos, duas cadeias polipeptidicas em iguais proporções resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não têm significado particular.

Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num ramo e um par cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro ramo. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina não desejadas, porque a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina apenas numa metade da molécula biespecífica proporciona uma forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita em WO 94/04690 publicado em 3 de Março de 1994. Para mais detalhes relativos à produção de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymoloqy 121: 210 (1986).

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos ligados de modo cruzado ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos foram propostos, por exemplo, 20 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ para direccionar células do sistema imunitário para células não desejadas (Patente US N°. 4676980) e para tratamento da infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser preparados utilizando um qualquer método de ligação cruzada adequado. Os agentes de ligação cruzada adequados são bem conhecidos na arte e estão descritos na Patente US N°. 4676980, juntamente com um certo número de técnicas de ligação cruzada.

As técnicas para produção de anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo foram também descritas na literatura. Por exemplo, os anticorpos biespecificos podem ser preparados utilizando ligação quimica. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) descrevem um procedimento no qual os anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para produzir fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' produzidos são então convertidos nos derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então convertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o BsAb. Os BsAb produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas. O progresso recente tem facilitado a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J, Exp, Med, 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de BsAb F(ab')2 completamente humanizada. Cada fragmento Fab' foi separadamente segregado a partir de E. coli e submetido a acoplamento quimico dirigido in vitro para formar o BsAb. O BsAb assim formado era capaz de se ligar a células que sobre-expressam o receptor HER2 e a células T humanas normais, assim como desencadear a actividade litica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor da mama humano. Ver também Rodriguez et al., Int. J. Cancers, (Supl.) 7: 45-50 (1992) .

Foram também descritas várias técnicas para a preparação e isolamento de fragmentos de BsAb directamente a partir de 21 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ culturas de células recombinantes. Por exemplo, os heterodímeros F(ab')2 biespecíficos têm sido produzidos utilizando "fechos de correr" ("zipper") de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Os péptidos "fecho de correr" de leucinas das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de charneira para formar monómeros e depois re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. A tecnologia do "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 90: 6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para preparação de fragmentos de BsAb. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligante gue é demasiadamente curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Por conseguinte, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de um outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antigénio. Foi também descrita uma outra estratégia para preparar fragmentos de BsAb, por utilização de dímeros de Fv de cadeia simples (sFv) . Ver Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994). Estes investigadores desenharam um anticorpo que compreendia os domínios VH e VL de um primeiro anticorpo ligados por um ligante de 25 resíduos de aminoácido aos domínios VH e VL de um segundo anticorpo. A molécula redobrada ligou a fluoresceína e o receptor de células T e redireccionou a lise de células de tumores humanos que tinham fluoresceína covalentemente ligada na sua superfície. 2. Purificação de Anticorpos

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou ser directamente segregado para o meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como um primeiro passo, os detritos em partículas, quer de células hospedeiras quer de fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descrevem um procedimento para o isolamento de anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Em resumo, a pasta de células é descongelada na 22 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante cerca de 30 min. Os detritos de células podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugar utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Pode ser incluído em qualquer dos passos anteriores, para inibir a proteólise, um inibidor de protease tal como PMSF, e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição de anticorpos preparada a partir das células é submetida, de preferência, a, pelo menos, um passo de purificação antes da LPHIC. Exemplos de passos de purificação adequados incluem cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como ligando de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 [1986]). A matriz à qual o ligando de afinidade está ligado é com muita frequência agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. As matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem velocidades de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que os que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (j.t. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Estão também disponíveis outras técnicas para purificação de proteínas tais como fraccionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina-Sepharose™, cromatografia numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amónio, dependendo do 23 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ anticorpo a recuperar.

Após qualquer(quaisquer) passo(s) de purificação preliminar(es), a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminante(s) é submetida a LPHIC. Frequentemente, a composição de anticorpo a purificar está presente num tampão do passo de purificação prévio. No entanto, pode ser necessário adicionar um tampão à composição de anticorpos antes do passo de LPHIC. Estão disponíveis muitos tampões que podem ser seleccionados por experimentação de rotina. 0 pH da mistura que compreende o anticorpo a purificar e, pelo menos, um contaminante num tampão de carga é ajustado a pH de cerca de 2,5-4,5 utilizando um ácido ou uma base, dependendo do pH de partida. 0 tampão de carga tem, de preferência, uma baixa concentração de sal (i.e. sal inferior a cerca de 0,25M). A mistura é carregada na coluna de HIC. As colunas de HIC compreendem normalmente uma matriz de base (por exemplo, agarose reticulada ou material de copolimero sintético) à qual estão acoplados ligandos hidrofóbicos (por exemplo, grupos alquilo ou arilo). A coluna de HIC preferida compreende uma resina de agarose substituída com grupos fenilo (por exemplo, uma coluna de Phenyl-Sepharose™) . Estão comercialmente disponíveis muitas colunas de HIC. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, coluna Phenyl-Sepharose™ 6 Fast Flow com baixa ou elevada substituição (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); coluna Phenyl-Sepharose™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); coluna Octyl-Sepharose™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); colunas Fractogel™ emd Propyl ou Fractogel™ EMD Phenyl (E. Merck, Alemanha); Suportes Macro-Prep™ Methyl ou Macro-Prep™ t-Butyl (Bio-Rad, Califórnia); coluna WP HI-Propyl (C3)™ (J.T. Baker, New Jersey) e colunas de éter, fenilo ou butilo Toyopearl™ (TosoHaas, PA) . O anticorpo é eluído da coluna utilizando um tampão de eluição que é normalmente o mesmo que o tampão de carga. O tampão de eluição pode ser seleccionado utilizando experimentação de rotina. O pH do tampão de eluição está entre cerca de 2,5-4,5 e tem uma baixa concentração de sal (i.e. sal 24 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ inferior a cerca de 0,25M). Verificou-se que não é necessário utilizar um gradiente de sal para eluir o anticorpo de interesse; o produto desejado é recuperado na fracção que elui no fluxo, que não se liga significativamente à coluna. 0 passo de LPHIC proporciona uma forma para remover um anticorpo correctamente dobrado e ligado por dissulfureto, de contaminantes indesejados (por exemplo, fragmentos leves e pesados incorrectamente associados). Em particular, o método proporciona um meio para remover substancialmente uma impureza aqui caracterizada como um fragmento de anticorpo correctamente dobrado cujas cadeias leve e pesada são incapazes de se associar através de ligação dissulfureto. Verificou-se que a composição de anticorpos preparada utilizando a LPHIC aqui descrita é, pelo menos, 95% pura.

Foram alcançadas purezas superiores a 98% utilizando o método descrito no Exemplo 1. A composição de anticorpos preparada por LPHIC pode ser adicionalmente purificada como desejado utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte. As formulações de diagnóstico ou terapêuticas da proteína purificada podem ser preparadas fornecendo a composição de anticorpos num veículo fisiologicamente aceitável, de que são fornecidos abaixo exemplos.

Para remover os contaminantes (por exemplo, anticorpo não dobrado e fragmentos leves e pesados incorrectamente associados) da coluna de HIC de modo a que esta possa ser reutilizada, pode-se fazer fluir através da coluna uma composição que inclui ureia (por exemplo, ureia 6,0M, tampão MES a 1%, pH 6,0, sulfato de amónio 4mM). 3. Utilizações para o Anticorpo Purificado

Estão contempladas muitas utilizações para os anticorpos que foram purificados utilizando o método descrito, incluindo utilizações em diagnóstico e terapêuticas. Várias utilizações em diagnóstico e terapêuticas para os anticorpos foram revistas em, por exemplo, Goldenberg et ai., Semin. Câncer Biol. 1(3): 217-225 (1990), Beck et al. Semin. Câncer Biol. 1(3): 181-188 (1990), Niman, Immunol. Ser. 53: 189-204 (1990) 25 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ e Endo, Nippon Igaku Hoshasen Gakkai Zasshi (Japan) 50(8): 901-909 (1990) .

Os anticorpos aqui descritos podem ser utilizados em imunoensaios, tais como imunoensaios com enzimas. Os BsAb são particularmente úteis para este tipo de teste: um ramo do BsAb pode ser desenhado para se ligar a um epitopo especifico na enzima de forma a que a ligação não cause inibição enzimática, o outro ramo do anticorpo pode ser desenhado para se ligar a uma matriz de imobilização assegurando uma elevada densidade enzimática no local desejado. Exemplos de tais BsAb de diagnóstico incluem, por exemplo, aqueles que têm especificidade para IgG, assim como a ferritina, e aqueles que têm especificidades de ligação para peroxidase de rábano (HRP), assim como uma hormona.

Os anticorpos podem ser desenhados para utilização em imunoensaios de dois locais. Por exemplo, são produzidos dois anticorpos que se ligam a dois epitopos separados na proteína analito; um anticorpo liga o complexo a uma matriz insolúvel, o outro liga uma enzima indicadora.

Os anticorpos podem também ser utilizados para imunodiagnóstico in vitro ou in vivo de várias doenças tais como cancro. Para facilitar esta utilização em diagnóstico, um anticorpo que liga um antigénio associado a um tumor pode ser conjugado com um marcador detectável (por exemplo, um quelante que liga um radionuclido). Por exemplo, um anticorpo tendo especificidade para o antigénio associado a um tumor CEA pode ser utilizado para obter imagens de carcinomas colorrectais e da tiróide. O anticorpo anti-pl85HER2 aqui descrito pode ser utilizado para detectar cancros caracterizados por amplificação do proto-oncogene HER2. Outras utilizações de diagnóstico, não terapêuticas, para o anticorpo serão evidentes para o perito.

Para aplicações em diagnóstico, o anticorpo é tipicamente marcado, directa ou indirectamente, com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I; um composto fluorescente ou 26 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou HRP.

Pode ser utilizado um qualquer método conhecido na arte para conjugar separadamente o anticorpo à porção detectável, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); e Nygren, J. Histochem. And Cytochem. 30: 407 (1982).

Os anticorpos podem ser utilizados num qualquer método de teste conhecido, tal como testes de ligação competitiva, testes em sanduíche, directos ou indirectos, e testes de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pag. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Os testes de ligação competitiva assentam na capacidade de um padrão marcado para competir com o analito amostra de teste para ligação a uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de analito na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligada ao anticorpo. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligada, o anticorpo é geralmente insolubilizado antes ou após a competição, de forma a que o padrão e o analito que estão ligados ao anticorpo possam ser adequadamente separados do padrão e do analito que permanecem não ligados.

Os BsAb são particularmente úteis para testes em sanduíche que envolvem a utilização de duas moléculas, cada uma capaz de ligação a uma porção imunogénica, ou epítopo, diferentes, da amostra a ser detectada. Num teste em sanduíche, o analito da amostra de teste é ligado por um primeiro ramo do anticorpo que está imobilizado num suporte sólido e em seguida um segundo ramo do anticorpo liga-se ao analito, formando assim um complexo tripartido insolúvel. Ver, por exemplo, Pat. US N°. 4376110. O segundo ramo do anticorpo pode ele mesmo ser marcado com uma porção detectável (testes em sanduíche directos) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que está marcado com uma porção detectável (teste em sanduíche indirecto). Por exemplo, um 27 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ tipo de teste em sanduíche é um teste ELISA, caso em que a porção detectável é uma enzima.

Os anticorpos são também úteis para a purificação por afinidade de um antigénio de interesse a partir de culturas de células recombinantes ou fontes naturais.

Estão também contempladas utilizações terapêuticas para os anticorpos purificados utilizando o método aqui descrito. Por exemplo, o anticorpo pode ser utilizado para citotoxicidade redirigida (por exemplo, para matar células tumorais), como um adjuvante de vacina, para entrega de agentes trombolíticos a coágulos, para entrega de imunotoxinas a células tumorais, para conversão de profármacos activados por enzima num local alvo (por exemplo, um tumor), para tratamento de doenças infecciosas ou direccionar complexos imunes para receptores de superfície celular. As formulações terapêuticas do anticorpo são preparadas para armazenamento por mistura do anticorpo com o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A., Ed., [1980]), na forma de bolo liofilizado ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; aldóis tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais, tais como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos tais como Tween, Pluronics ou polietilenoglicol (PEG). O anticorpo pode também ser retido em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli[metilmetacilato], respectivamente) em sistemas de entrega 28 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Reminqton's Pharmaceutical Sciences, supra. 0 anticorpo a utilizar para administração in vivo deve ser estéril. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas de esterilização por filtração, antes ou após a liofilização e a reconstituição. 0 anticorpo é normalmente armazenado na forma liofilizada ou em solução.

As composições terapêuticas de anticorpo são geralmente colocadas num recipiente com um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco para solução intravenosa com uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica. A via de administração do anticorpo está de acordo com os métodos conhecidos, por exemplo, injecção ou perfusão por vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial ou intralesional, ou por sistemas de libertação sustentada como indicado abaixo. 0 anticorpo é administrado continuamente por perfusão ou por injecção em bolus.

Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo a proteína, matrizes que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis [por exemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) como descrito por Langer et al., J, Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) e Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982) ou poli(álcool vinílico)], polilactidos (Patente U.S. N°. 3773919, EP 58481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 [1983]), copolímeros de etileno-acetato de vinilo não degradáveis (Langer et al., supra), de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tais como o Lupron Depot™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133988). 29 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Embora os polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico possibilitem a libertação de moléculas durante cerca de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um período de tempo longo, podem desnaturar ou agregar-se em resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda de actividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Podem ser idealizadas estratégias racionais para estabilização de anticorpos dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se se verificar que o mecanismo de agregação é a formação de ligação S-S intermolecular através de interpermuta de tio-dissulfureto, pode-se alcançar a estabilização por modificação dos resíduos sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização apropriada de aditivos e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específicas.

As composições de anticorpo de libertação sustentada incluem também anticorpo lipossomicamente retido. Os lipossomas que contêm o anticorpo são preparados por métodos conhecidos per se: DE 3218121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; pedido de patente Japonesa 83-118008; Patentes U.S. Nos. 4485045 e 4544545; e EP 102324.

Normalmente, os lipossomas são do tipo unilamelar pequeno (cerca de 200-800 Angstroms) em que o teor em lípidos é superior a cerca de 30% mol. de colesterol, sendo a proporção seleccionada ajustada para terapêutica óptima com anticorpo.

Uma quantidade eficaz de anticorpo a utilizar vai depender, por exemplo, dos objectivos da terapêutica, da via de administração e da condição do doente. Por conseguinte, será necessário o terapeuta titular a dosagem e modificar a via de administração quando necessário para obter o efeito terapêutico óptimo. Uma dose diária típica pode variar de cerca de 1 μρ/kg até 10 mg/kg ou mais, dependendo dos factores acima mencionados. O médico vai administrar, tipicamente, o anticorpo até ser alcançada uma dosagem que atinja o efeito desejado. O progresso desta terapêutica é facilmente monitorizado por testes convencionais. 30 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Os exemplos seguintes são dados com a finalidade de ilustração e não como limitação. EXEMPLO 1 CROMATOGRAFIA DE INTERACÇÃO HIDROFÓBICA A pH BAIXO (LPHIC)

Foi desenvolvido um método para desdobrar preferencialmente anticorpo não ligado por dissulfureto por desnaturação ácida. Durante a desnaturação ácida, a repulsa de cargas intermoleculares contribui para o desdobramento, dependendo a extensão do desdobramento das condições de acidificação assim como da estrutura da proteína. A pH baixo, o anticorpo desdobrado e os fragmentos leves e pesados incorrectamente associados podem ser separados por LPHIC (modo de fluxo dinâmico - "flow through"). As espécies de anticorpo indesejadas ligam-se à coluna enquanto que os fragmentos de anticorpo desejados eluem no fluxo. As impurezas podem ser removidas da coluna com ureia 6,0M, tampão MES a 1% (pH 6,0), sulfato de amónio 4mM).

Os anticorpos seguintes foram submetidos a LPHIC: (a) Fab' e F(ab')2 anti-CDl8 humanizado (b) Fab' e F(ab')2 anti-CDl8 quimérico (c) F(ab')2 anti-CDl8 humanizado linear; e (d) F(ab')2 anti-pl85HER2 humanizado linear.

MATERIAIS E MÉTODOS

Material Celular. As estirpes de E. coli transformadas foram utilizadas para produzir Fab' anti-CDl8 humanizado H52, versão OZ (rhuMAb H520ZG1) como descrito em Eigenbrot et ai., Proteins: Structure, Function and Genetics 18: 49-62 (1994).

Uma versão quimérica do MAb anti-CDl8, MHM23 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13: 202-208 [1983], foi preparada tendo a sequência de cadeia leve SEQ ID NO:l e a sequência de cadeia pesada SEQ id NO.2. As sequências que codificam o Fab foram subclonadas num vector baseado no pAKl9 que foi previamente descrito por Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992). Os fragmentos F(ab')2 huMAbH52 anti-CDl8 e huAb4D5-8 anti-pl85HER2 humanizados, lineares, foram produzidos como descrito no Exemplo 2 abaixo. 31 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Análise por Cromatografia de Fase inversa. A cromatografia de Fase Inversa foi realizada numa coluna de Fase Inversa PLRP-S™ de 4,6x50mm, 8mm de tamanho de partícula (Polymer Laboratories, Shropshire, RU) mantida a 50°C. As proteínas foram eluídas utilizando um gradiente linear crescente de Tampão B a 31% para Tampão B a 41%. 0 Tampão A continha ácido trifluoroacético a 0,1% em água desionizada e o Tampão B continha ácido trifluoroacético a 0,1% em acetonitrilo de grau de HPLC. O caudal foi mantido a 2 ml/min e o comprimento de onda de detecção foi de 214 nm.

Extracção dos fragmentos de anticorpo Fab' a partir de E. coli e protecção do sulfidrilo livre com 4,4-DTP. Os fragmentos de anticorpo foram extractados a partir de pelotas de células de E. coli congeladas obtidas a partir de fermentações de 10 litros. Assim que as células estavam completamente rebentadas, adicionou-se 4,4-ditiodipiridina (4,4-DTP) para proteger a cisteína livre no fragmento de anticorpo Fab' manipulado para conter um tiol livre na região de charneira (huMAb H520ZG anti-CD18 e MAb MHM23 anti-CD18) . As versões de F(ab')2 lineares sem cisteínas livres manipuladas na região de charneira (versões lineares de huMAbH52 e huMAb4D5-8 anti-CDl8) foram extractadas sem 4,4-DTP como descrito no Exemplo 2 abaixo.

Extracção. As pelotas de células congeladas foram ressuspensas à temperatura ambiente em tampão MES 20mM, pH 6,0, contendo EDTA 5mM e 4,4'-DTP 20mM previamente dissolvido em etanol (3 litros de tampão/kg de pelota de células) . As células suspensas foram rebentadas por duas passagens através de um homogeneizador Mantin Gaulin a 5500 até 6500 PSI. O homogeneizado foi ajustado a 0,25% (v/v) com polietileno-imina (PEI) e diluído com um volume igual de água purificada a 2-8°C. O homogeneizado diluído foi então centrifugado. O fragmento de anticorpo foi observado no sobrenadante.

Purificação dos fragmentos de anticorpo Fab'-TP protegidos. A cromatografia ABX™ foi utilizada para a purificação inicial dos fragmentos de anticorpo a partir de proteínas de E. coli. Para purificar adicionalmente os fragmentos de anticorpo a partir de espécies de anticorpos que 32 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ não possuem uma ligação dissulfureto entre as cadeias leve e pesada, introduziu-se um passo de cromatografia de interacção hidrofóbica a pH baixo.

Cromatografia ABX™. 0 sobrenadante contendo o fragmento de anticorpo foi diluído com água purificada até uma condutividade de 2 milisiemens ou menos. 0 sobrenadante diluido foi bombeado sequencialmente através de filtros de 0,5 e 0,22 micrones e carregado numa coluna ABX™ (J.T. Baker Phillipsburg, NJ) equilibrada em MES 50mM/EDTA 5mM, pH 6,0 (Tampão A). O efluente foi monitorizado a 280 nm. Após carregamento, a coluna foi lavada com 2 volumes de coluna de Tampão A. Os anticorpos foram eluidos com um volume de 20 colunas de gradiente de sulfato de amónio de 0 a 50mM em Tampão A. As fracções foram analisadas por HPLC e adequadamente agrupadas.

Cromatografia de Interacção Hidrofóbica a pH Baixo (LPHIC). Os conjuntos de Fab' purificados por ABX™ (anti-CDl8 humanizado e quimérico) foram ajustados a NaP04 20mM e o pH dos conjuntos foi ajustado a 3,1 utilizando HC1 6N imediatamente antes do carregamento numa coluna de Phenyl-Sepharose™ Fast Flow (Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ) . Os conjuntos de ABX™ de F(ab')2 quimicamente acoplados (anti-CD18 humanizado e quimérico) e de F(ab')2 lineares (anti-CDl8 e anti-pl85HER2) foram preparados da mesma forma com excepção de serem levados a 20mM em sulfato de amónio. Um cromatograma de fluxo dinâmico típico da LPHIC é apresentado na Fig. 1. O pH do anticorpo purificado por LPHIC foi imediatamente ajustado a pH 5, com NaOH a 10%.

Análise do pH. Desenhou-se uma experiência para determinar o pH na qual se pode alcançar a purificação máxima assim como o rendimento máximo. Os conjuntos de ABX™ foram levados 25mM em NaP04 e o pH foi ajustado utilizando HC1 6N. Depois de se obter o pH desejado, as amostras foram eluídas através de uma coluna de Phenyl Sepharose™ Fast Flow e os conjuntos foram analisados utilizando HPLC de Fase Inversa para determinar a pureza e o rendimento. 33 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Dicroísmo Circular. Os espectros foram registados num instrumento AVIV modelo 60DS a 25°C. Utilizaram-se células de percurso óptico de 1 mm para as medições no UV longínquo e as células de comprimento de percurso de 10 mm para medições no UV próximo. Trocou-se o tampão das amostras de anticorpo purificado rhuMAb H520ZG1 e rhuMAb H520ZG2 para tampão de KPO4 lOmM por cromatografia de penetração em gel em Sephadex G25™ (Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ) . As amostras foram tituladas com ácido fosfórico até ao pH desejado antes da medição dos espectros de CD.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Espectroscopia de CD de rhuMAb H520Z61 e rhuMAb H520ZG2. O conjunto purificado por ABX™ parece conter pequenas quantidades de fragmentos de anticorpo cujas cadeias leves e pesadas estão correctamente dobradas mas são incapazes de se associar covalentemente através de ligação dissulfureto. Esta impureza pode ser detectada em géis de SDS e por HPLC de Fase Inversa analítica (Fig. 2). Os fragmentos de anticorpo não covalentemente associados podem ser separados do produto desejado por desnaturação ácida preferencial seguida por LPHIC. Para determinar as diferenças de desnaturação ácida entre as espécies associadas a dissulfureto e não associadas a dissulfureto utilizaram-se dois fragmentos de anticorpo purificados; rhuMAb H520ZG2 e rhuMAb H520ZG1. O rhuMAb H520ZG2 é um mutante de rhuMAb H520GZ1 no qual os resíduos cisteína 215 e 228 nas cadeias leve e pesada, respectivamente, foram alterados para resíduos serina. Este mutante deve mimetizar o comportamento de desnaturação ácida de anticorpos não ligados por dissulfureto. Os espectros no UV próximo e UV longínquo de rhuMAb H520ZG2 e rhuMAb H520ZG1 a diferentes valores de pH apresentam pontos de transição de desnaturação diferentes (Fig. 3A-3D). Um ponto de transição representa uma alteração de um fragmento de anticorpo correctamente dobrado, para o seu estado não dobrado. Os fragmentos não associados por dissulfureto podem ser desnaturados a pH próximo de 3,2, enquanto que os fragmentos associados por dissulfureto requerem valores de pH inferiores a 2,5 para desnaturação.

Análise do pH de LPHIC. A partir da análise de desnaturação ácida pode-se concluir que a pH próximo de 3,0 os 34 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ fragmentos não associados por dissulfureto podem ser desnaturados e depois preferencialmente ligados a uma coluna de Phenyl-Sepharose™ Fast Flow. De forma a avaliar o efeito da variação dos pH baixos no passo de LPHIC, os conjuntos de anticorpos purificados por ABX™ foram purificados por LPHIC a diferentes valores de pH. A análise dos conjuntos purificados foi realizada utilizando HPLC de Fase Inversa. Produziu-se um gráfico de barras em que as percentagens de pureza, rendimento e cadeias leves foram determinadas a partir das purificações por LPHIC (Fig. 4) . A partir do gráfico de barras determinou-se que o pH de 3,1 era o melhor valor para equilibrar a pureza e o rendimento para a purificação do anticorpo rhuMAb H520ZG1. As purificações em grande escala de conjuntos de ABX™ foram realizadas a pH 3,1.

SUMÁRIO A LPHIC tornou possível a purificação de fragmentos de anticorpo Fab', L-F(ab')2 e F(ab')2 quimicamente ligado, a partir de espécies de anticorpos indesejadas com mais de 98% de pureza. 0 fluxo das amostras através de uma coluna de Phenyl-Sepharose™ Fast Flow a pH baixo removeu anticorpos que não possuíam ligações dissulfureto entre as cadeias pesadas e leves assim como espécies de cadeias leves e pesadas incorrectamente associadas. Os estudos de Dicroísmo Circular dos anticorpos F(ab')2 anti-CDl8 ligados por dissulfureto e não ligados por dissulfureto (rhuMAb H520ZG1 e rhuMAb H520ZG2) demonstraram que o anticorpo não ligado por dissulfureto (rhuMAb H520ZG2) desnaturou em moléculas de cadeias leves e pesadas a pH 3,2. 0 anticorpo ligado por dissulfureto (rhuMAb H520ZG1) desnaturou a pH 2,5. As experiências de cromatografia a diferentes valores de pH demonstraram que o pH de 3,1 representa o melhor valor para equilibrar a pureza e o rendimento para purificação de rhuMAb H520ZG1 anti-CDl8. EXEMPLO 2

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS LINEARES

Este exemplo descreve a produção de fragmentos (L-F(ab')2 lineares bivalentes (compreendendo repetições em série de um fragmento de cadeia pesada, Vh-Ch-Vh-Ch1 co-segregado com uma cadeia leve) que foram submetidos a LPHIC (ver Exemplo 1 35 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ acima).

MATERIAIS Ε MÉTODOS

Construção de variantes L-F(ab')2. O plasmídeo de expressão, pAKl9, para secreção do fragmento Fab' huMAb4D5-8 foi previamente descrito (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 [1992]). Os plasmideos pLAl, pLA2 e pLA3 foram desenhados para segregar as variantes de L-F(ab')2 vl, v2 e v3, respectivamente (Fig. 5A). O plasmideo pLAl foi construído a partir de pAKl9 por modificação da cadeia pesada que codifica os segmentos Fd huMAb4D5-8 em série: Vh-Ch1-Vh-Ch1 . L-F(ab')2 v2 e v3 foram construídos a partir de pLAl por substituição com exactidão de cópias 5' ou 3' de VH em pLAl, respectivamente, pelas do Ab anti-CDl8 humanizado, huMAb H520Z (Eigenbrot et al., supra). Desenhou-se um plasmideo para segregar L-F(ab')2 anti-CDl8. Foi construído um plasmideo a partir de Ab anti-CDl8, huMAb H520Z (Eigenbrot et al., supra) por modificação da cadeia pesada para codificar segmentos Fd em série Vh-Ch1-Vh-Ch1 .

Expressão e purificação em E. coli de variantes de L-F(ab')2. A produção de fragmentos Fab huMAb4D5-8 e F(ab')2 ligados a tioéter, a partir de E. coli, foi previamente descrita por Kelley et al., Biochemistry 31: 5434-5441 (1992) e Rodriguez et al., J. Immunol. 151: 6954-6961 (1993). As variantes L-F(ab')2 foram segregadas a partir da estirpe de E. coli 33B6 (Rodriguez et al., Câncer Res. 55: 63-70 [1995]) que contém os plasmideos de expressão correspondentes deixados crescer durante 40h a 30°C num fermentador de 10 litros arejado como previamente descrito (Cárter et al., supra). Os títulos de expressão foram calculados por ELISA de ligação ao antigénio (Ag) (Cárter et al., supra). As variantes L-F(ab')2 foram purificadas a partir de 400 g de pastas de fermentação correspondentes descongeladas na presença de 2 litros de MES 20mM, EDTA 5mM, pH 6,0 (tampão ME). As células ressuspensas foram rebentadas por três passagens através de um microfluidificador (Microfluidics Corporation, Newton, MA) e ajustadas com polietileno-imina a 0,25% (v/v). Os detritos sólidos foram removidos por centrifugação (7300 g, 30 min, 4°C) . O sobrenadante foi diluído com um volume igual de água destilada e depois carregado numa coluna Bakerbond ABX™ de 36 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ 20 ml (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) pré-equilibrada com tampão ME. O L-F(ab')2 foi eluído utilizando um gradiente linear de 0-50mM (NH4SO4 em tampão ME). 0 L-F(ab')2 agrupado foi ajustado com Na2HP04 25mM, pH 3,0, e passado sobre uma coluna de Phenyl-Sepharose™ Fast Flow (high sub) de 20 ml (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada com Na2HP04 25mM, (NH4)2S04 20mM, pH 3,0. As fracções do fluxo contendo L-F(ab')2 foram agrupadas e ajustadas a pH 6,0.

Trocou-se o tampão de todos os fragmentos de anticorpo para PBS por cromatografia de exclusão por tamanhos S100-HR™ (Pharmacia) (2,5cmxl00cm). A endotoxina residual foi removida por passagem repetida através de filtros PyroBind-ST™ (Sepracor, Marlborough, MA) . O nivel de endotoxina de cada preparação foi calculado pelo teste de lisado de amebócitos de limulo (Associates of Cape Cod Inc., Woods Hole, MA). Os fragmentos de anticorpo (Ab) purificados foram passados através de um filtro de 0,2 mm, congelados rapidamente em azoto liquido e armazenados a -70°C até serem necessários.

Análise do fragmento de Ab que se liga a ECD pl85HER2. A afinidade e a cinética de ligação dos fragmentos de Ab huMAb4D5-8 relativamente a ECD pl85HER2 (Fendly et al., J. Biol. Resp. Mod. 9: 449-455 [1990]) foram determinadas por

ressonância plasmónica de superfície utilizando o sistema BIAcore (Pharmacia) como previamente descrito por Kelley e 0'Connell em Biochemistry 32: 6828-6835 (1993). A estequiometria da ligação dos fragmentos de Ab ao Ag foi determinada em solução. Em resumo, foram adicionadas várias quantidades de ECD pl85HER2 (Fendly et al., supra) em PBS a uma quantidade fixa de fragmento Ab (15-20 mg) e a mistura depois analisada por FPLC de exclusão por tamanhos que utiliza uma coluna Superose 12™ (Pharmacia) equilibrada com NaH2HP04 0, 1M, pH 6,7.

Teste de proliferação de células. O efeito dos fragmentos de Ab huMAb4D5-8 (0-30 mg/ml) após proliferação da linha de células de adenocarcinoma mamário humano, BT474, foi investigado como previamente descrito (Hudziak et al., Molec. Cell. Biol. 9: 1165-1172 [1989]). 37 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Farmacocinéticas dos fragmentos de Ab em ratinhos normais. Grupos de ratinhos CD-I fêmea (20-32 g, n=45) de Hanlen Sprague Dawley (Indianapolis, IN) receberam um dos fragmentos de Ab huMAb4D5-8 (3-4 mg/ml em PBS) por injecção rápida na veia da cauda (10 mg/kg). Sacrificaram-se três ratinhos por ponto temporal em tempos programados no intervalo de 1 min a 24 h após a injecção e as amostras dos seus soros foram recolhidas e armazenadas congeladas. As concentrações séricas de cada fragmento de Ab foram determinadas por ELISA de ligação a Ag como previamente descrito utilizando fragmentos correspondentes como padrões (Rodriguez et ai., supra). Apenas o F(ab')2 ligado a tioéter era detectável (0,7 mg/ml) 24 h após a injecção.

Os dados de cada grupo de tratamento foram analisados por ajuste de uma função biexponencial, C(t) = Ae“at + Be~bt, aos valores médios das concentrações séricas em cada tempo. Os componentes exponenciais foram calculados por um método dos mínimos quadrados não linear utilizando o procedimento de Gauss-Newton-Marquardt-Levenberg (Press et ai., Em Numerical Recipies in C, Cambridge University Press, Cambridge, UK, [1988] ) e uma ponderação de y“2, em que y é a concentração sérica medida. O volume de distribuição inicial (Vi), o volume de distribuição no estado estacionário (Vss), o tempo de depuração (CL), mais as semividas iniciais e terminais (t^,) foram então calculados a partir dos parâmetros calculados como descrito (Wagner, J. Pharmacokin. Biopharm. 4:443-467 [1976]):

Co = A + B

Vj = Dose/Co

Vss = (A/a2 + B/b2) / (AUC) 2 CL = Dose/AUC tfc inicial = ln2/a tií terminal = ln2/b em que Co é a concentração inicial extrapolada e AUC é a área sob a curva ajustada de concentração plasmática versus tempo. O tempo de permanência (T), que é o intervalo de tempo esperado gasto pelo fármaco em todas as suas passagens através de um compartimento (neste caso, o soro) foi calculado (Mordenti e Rescigno, Pharm. Res. 9: 17-25 [1992]) como se segue: T = AUC/Cq. 38 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

RESULTADOS Ε DISCUSSÃO

Desenho de L-F(ab')2. As variantes de L-F(ab')2 foram desenhadas para compreender uma cadeia pesada (H) de fragmentos Fd em série, Vh-Ch1-Vh-Ch1, associados a duas cópias da cadeia leve (L) correspondente (Fig. 5A) . Na junção Fd-Fd, o terminal C de CH1 (... THT) é ligado directamente ao terminal N de VH (EVQ ...) sem quaisquer sequências de proteínas de ligação estranhas, isto foi uma tentativa de minimizar os riscos potenciais de imunogenicidade e susceptibilidade a proteases séricas nos doentes. Um inconveniente potencial desta estratégia de omitir ligantes é a de que a acessibilidade do local de ligação ao antigénio (Ag) C-terminal possa ser comprometida. A variante de L-F(ab')2 huMAb4D5-8, vl, foi desenhada para ter dois locais de ligação funcionais para o Ag, ECD pl85HER2 (Fig. 5A) . Ao contrário, L-F(ab')2 huMAb4D5-8 v2 e v3 foram desenhadas para ter um único local de ligação a Ag. isto foi realizado por substituição das cópias 5' ou 3' de VH em L-F(ab')2 vl pelas do Ab anti-CDl8, huMAbH520Z (Eigenbrot et al.f supra) . Um Fab compreendendo a cadeia L de huMAb4D5-8 e a cadeia H do fragmento Fd de huMAbH520Z foi expresso e purificado e mostrou não se ligar a ECD pl85HER2 como esperado.

Produção e caracterização in vitro dos fragmentos de anticorpo (Ab). As variantes de L-F(ab')2 foram expressas em E. coli por co-secreção da cadeia L com os fragmentos Fd de cadeia H em série de um operão dicistrónico (Fig. 5B).

Alcançaram-se títulos de >100 mg/1 de L-F(ab')2 huMAb4D5-8 funcional (de ligação a Ag) após cultura de E. coli contendo os plasmídeos de expressão correspondentes para elevada densidade de células no fermentador. Os L-F(ab')2 foram recuperados directamente a partir de E. coli por rompimento total das pastas de fermentação correspondentes seguida por ABX™, interacção hidrofóbica a pH baixo e cromatografia de exclusão por tamanhos. A concentração de endotoxinas foi calculada como <0,32 unidades de endotoxina por mg de proteína purificada.

As variantes de L-F(ab')2 huMAb4D5-8 purificadas juntamente com F(ab')2 e Fab foram analisadas por SDS-PAGE. 39 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Sob condições de não redução, as três variantes de L-F(ab')2 huMAb4D5-8 (Mr-96kDa) e o fragmento Fab (Mr ~48 kDa) apresentam uma banda principal com a mobilidade electroforética esperada. O fragmento F(ab')2 ligado a tioéter (Mr ~96 kDa) apresenta mobilidade anormalmente retardada quando comparado com o padrão de 97 kDa.

Sob condições de redução todos os fragmentos de Ab huMAb4D5-8 deram origem a uma banda de peso molecular aparente de -23 kDa esperada para a cadeia L livre. Adicionalmente, L-F(ab')2 θ F(ab')2 deram origem a uma banda de ~48 kDa como esperado pela presença de dimeros de cadeia H em série e ligados a tioéter, respectivamente. As cadeias H e L reduzidas para o fragmento Fab não são resolvidas sob as condições electroforéticas utilizadas.

Análise da ligação dos fragmentos Ab a ECD ρΐδδ™®2. A estequiometria da interacção Ab-Ag foi investigada por titulação dos fragmentos Ab huMAb4D5-8 com ECD pl85HER2 seguida por análise cromatográfica de exclusão por tamanhos (Fig. 6A-6C) . L-F(ab')2 vl e F(ab')2 huMAb4D5-8 apresentam perfis de titulação muito similares com ECD pl85HER2 e ligam dois equivalentes de antigénio (Fig. 6A e 6B) . Como esperado, o fragmento Fab liga um equivalente de Ag (Fig. 6C) . L-F(ab')2 v2 e v3 ligam apenas um único equivalente de Ag. A afinidade e a cinética de ligação dos fragmentos de Ab huMAb4D5-8 a Ag foram investigadas por ressonância plasmónica de superfície utilizando ECD pl85HER2 imobilizado. Ver Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Análise da ligação dos fragmentos de Ab anti-pl85HER2 a ECD pl85HER2 a Fragmento de Ab kligadob S^M'1 jV . b ^desligado ^ Kd nM Fab 3,4 x 10b 5,2 X 1(T4 1,5 L-F(ab')2 vl 6,4 x 10b 2,9 x 1(T4 0, 46 L-F(ab')2 vl 2,3 x 105 2,8 x 10“4 1,2 L-F(ab')2 vl 5,7 x 10b 3, 1 x l(Tb 5,5 F(ab')2 1,9 x 106 3,2 x 1(T4 0, 17 a Dados obtidos por ressonância plasmónica de superfície. b DP de estimativas s ± 3% 40 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ A variante de L-F(ab')2, vl, bivalente, liga Ag com afinidade 3 vezes inferior à de F(ab')2. Isto reflecte principalmente uma pequena diminuição na velocidade de associação entre F(ab')2 e L-F(ab')2, respectivamente. As variantes de L-F(ab')2, v2 e v3, monovalentes, apresentam uma ligação aproximadamente 3 e 12 vezes mais fraca do que a variante de L-F(ab')2, vl, bivalente. Assim, os dois locais de ligação no L-F(ab')2 são competentes para ligação de ECD pl85HER2, embora a eficiência da ligação a Ag seja aparentemente ligeiramente comprometida para o local C-terminal. Como esperado, a afinidade de ligação de ΕΡ (ab')2 v2 é muito similar à do fragmento Fab correspondente.

Actividade antiproliferativa dos fragmentos Ab. A actividade antiproliferativa dos fragmentos Ab huMAb4D5-8 foi investigada utilizando a linha de células de tumor da mama que sobre-expressam pl85HER2, BT474 (ver Fig. 7) . A proliferação de BT474 na presença de quantidades saturantes de L-F(ab')2 vl e F(ab')2 ligado a tioéter são aproximadamente 40% e 55% do controlo não tratado, respectivamente. Assim, L-F(ab')2 vl é mais potente no bloqueio da proliferação de células BT474 do que o fragmento F(ab')2 ligado a tioéter. As actividade antiproliferativas das variantes de L-F(ab')2, v2 e v3 monovalentes, aproximam-se da da variante L-F(ab')2 vl bivalente, e são muito superiores à do fragmento Fab.

Caracterização farmacocinética dos fragmentos Ab em ratinhos normais. O curso de tempo de Fab, F(ab')2 e variantes L-F(ab')2 huMAb4D5-8 no soro de ratinhos normais foi determinado a partir do sacrifício em série de múltiplos animais (Fig. 8) e utilizado para cálculo dos parâmetros farmacocinéticos. Ver Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Parâmetros farmacocinéticos para os fragmentos de Ab anti-pl85HERii em ratinhos normais3 Fragmento de Ab Vi ml kg-1 Vss ml kg-1 1 tn d * 1 tVi horas T horas inicial terminal*5 L-F(ab')2vl 29, 0 38,0 19,3 0, 40 1,6 1,50 F(ab')2 36,1 44,0 20,6 0, 99 2,6 1,75 Fab 22,6 35,4 106 0, 144 1,6 0,21 a Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados a partir dos dados da Figura 3. b A semivida terminal contribui com 83%, 30% e 6,5% da AUC total para L-F(ab')2 vl, F(ab')2 e Fab, respectivamente. 41 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ Ο L-F(ab')2 e ο F(ab')2 ligado a tioéter são muito similares em termos dos seus parâmetros farmacocinéticos, enquanto que o fragmento Fab é depurado mais rapidamente. Os tempos de permanência no soro para fragmentos L-F(ab')2 vi e os F(ab')2 ligados a tioéter, são 7 e 8 vezes superiores ao do fragmento Fab, respectivamente.

LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Genentech, Inc.

(ii) TÍTULO DO INVENTO: PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Genentech, Inc. (B) RUA: 460 Point San Bruno Blvd (C) CIDADE: South San Francisco (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 94080 (v) FORMA DE LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete de 1,44 Mb, de 3,5 polegadas

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WinPatin (Genentech) (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 20-Abril-1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO DO ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Wendy M. Lee (B) NÚMERO DE REGISTO: 00000

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/DOCUMENTO: P0941PCT (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 415/225-1994 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 214 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear 42 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Asp Vai Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 15 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Asn 20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asn Gly Thr Vai Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Vai Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Asn Leu Asp Gin Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin 80 85 90

Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105

Ile Arg Arg Ala Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai 140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu 155 160 165

Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu 185 190 195

Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210

Arg Gly Glu Cys 214 43 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 232 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Glu Tyr Thr Met His Trp Met Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 35 40 45

Glu Trp Ile Gly Gly Phe Asn Pro Lys Asn Gly Gly Ser Ser His 50 55 60

Asn Gin Arg Phe Met Asp Lys Ala Thr Leu Ala Vai Asp Lys Ser 65 70 75

Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90

Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Arg Gly Leu Asn Tyr Gly 95 100 105

Phe Asp Vai Arg Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Ala Gly Thr Thr Vai 110 115 120

Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 125 130 135 44 ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 140 145 150

Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp 155 160 165

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai 170 175 180

Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai 185 190 195

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn 200 205 210

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys 215 220 225

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 230 232

Lisboa,

Claims

ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Processo de purificação de um anticorpo compreendendo o carregamento de uma mistura contendo o anticorpo e anticorpo incorrectamente dobrado e/ou ligado por dissulfureto, numa coluna de cromatografia de interacção hidrófoba, e a eluição do anticorpo a partir da coluna com um tampão tendo um pH de cerca de 2,5-4,5, em gue o pH do tampão causa a retenção na coluna do anticorpo incorrectamente dobrado e/ou ligado por dissulfureto.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a mistura carregada na coluna está a um pH de cerca de 2,5-4,5.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a mistura carregada na coluna tem uma concentração de sal de cerca de 0-0,25M.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a mistura carregada na coluna tem uma concentração de sal de cerca de 0-0,1M.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o tampão tem uma concentração de sal de cerca de 0-0,25M.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que o tampão tem uma concentração de sal de cerca de 0-0,1M.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o anticorpo é quimérico.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o anticorpo é humanizado.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o anticorpo compreende um fragmento de anticorpo que é um fragmento de anticorpo correctamente ligado por dissulfureto que é um fragmento F(ab')2r um fragmento Fab ou um fragmento F(ab')2 linear. ΕΡ Ο 821 695 /ΡΤ 2/2
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que o fragmento de anticorpo liga HER-2 ou CD18.
11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, em que o fragmento de anticorpo compreende um fragmento F(ab')2·
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o tampão tem um pH de cerca de 2,8-3,5.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que o tampão tem um pH de cerca de 3,1.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a coluna de cromatografia de interacção hidrofóbica é uma coluna de fenil-agarose.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que o anticorpo purificado está correctamente ligado por dissulfureto.
16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o anticorpo é purificado a partir de um anticorpo incorrectamente ligado por dissulfureto.
17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o anticorpo incorrectamente ligado por dissulfureto é um fragmento de anticorpo.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, que compreende adicionalmente a mistura do anticorpo recuperado a partir da coluna com um veiculo, excipiente ou estabilizante fisiologicamente aceitáveis.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, que compreende adicionalmente a preparação de uma preparação liofilizada do anticorpo. Lisboa,