JP5284290B2 - ウイルス様粒子の精製 - Google Patents
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関連出願に対する相互参照
本出願は、２００７年３月１４日に出願された米国仮出願第６０／９０６，８２１号の優先権の利益を請求するものである。
本出願は、２００７年３月１４日に出願された米国仮出願第６０／９０６，８２１号の優先権の利益を請求するものである。
本出願は、生物学的供給源からウイルス様粒子（VLP）を抽出および精製するための方法に関する。より詳細には、本出願は、大規模で商用グレードのＶＬＰを生成するための方法に関する。本方法は、精製ＶＬＰをもたらす複数の精製段階を利用する。
政府支援の報告
本発明は、契約番号ＤＡＭＤ１７−０１−Ｃ−０４００およびＷ８１ＸＷＨ−０５−Ｃ−０１３５の、米陸軍医学研究司令部からの政府支援を伴って得られたものである。政府は、本発明に対する一定の権利を有し得る。
本発明は、契約番号ＤＡＭＤ１７−０１−Ｃ−０４００およびＷ８１ＸＷＨ−０５−Ｃ−０１３５の、米陸軍医学研究司令部からの政府支援を伴って得られたものである。政府は、本発明に対する一定の権利を有し得る。
ヒトカリシウイルスであるノロウイルスおよびサポウイルスは、急性の非細菌性胃腸炎の主な原因である。ノロウイルスとは対照的に、サポウイルスは、乳児および幼児に主に感染することが知られているが、サポウイルスは、成人集団においても同様に見られるようになってきている（Johansson et al., 2005, A nosocomial sapovirus-associated outbreak of gastroenteritis in adults. Scand J Infect Dis. 37（3）:200-4）。ノロウイルスは、非細菌性胃腸炎の流行的発生の単一の最も重要な原因として浮上している、培養不可能なヒトカルシウイルスである（Hardy, 1999, Clin Lab Med. 19（3）:675-90）。ノロウイルスの臨床的重要性は、高感度の分子診断アッセイが開発される前にはあまり評価されていなかった。プロトタイプの遺伝子群Ｉのノーウォークウイルス（NV）のゲノムのクローニングおよび組換えバキュロウイルス発現系からのウイルス様粒子（VLP）の生成により、広範なノロウイルス感染を明らかにするアッセイが開発された（Jiang et al. Norwalk Virus Genome Cloning and Characterization. Science 1990; 250: 1580-1583、Jiang et al. 1992, J. Virol. 66 （11）:6527-32）。
ノロウイルスおよびサポウイルスは、断片化されていないＲＮＡゲノムを含む、一本鎖の、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは３つのオープンリーディングフレームをコードし、オープンリーディングフレームのうち後者の２つは主要カプシドタンパク質および主要ではない構造タンパク質の生成をそれぞれ特定するものである（Glass et al., The Epidemiology of Enteric Caliciviruses from Human: A Reassessment Using New Diagnostics. J Infect Dis 2000; 181（Sup 2）:S254-S261）。真核性の発現系において高いレベルで発現すると、ＮＶならびに特定の他のノロウイルスおよびサポウイルスのカプシドタンパク質は、天然のノロウイルスビリオンを構造的に模倣するＶＬＰに自己集合する。透過型電子顕微鏡により観察すると、ＶＬＰは、ヒト排泄物試料から単離された感染性ビリオンと形態学的に区別不可能である。
ＶＬＰの利用可能性およびＶＬＰの大量生成能のため、ノロウイルスおよびサポウイルスはインビトロでは培養できないが、ノロウイルスカプシドの抗原的および構造的なトポグラフィーの決定においては顕著な進歩がなされてきた。ＶＬＰはウイルスカプシドタンパク質の真の立体構造を保ち、一方で感染性遺伝物質を欠いている。その結果、ＶＬＰはウイルスによる細胞受容体との機能的相互作用を模倣し、それにより、強い宿主免疫応答を誘発するが、繁殖能力または感染を生じさせる能力は欠いている。ＮＩＨと協力して、ベイラー医科大学は、学術的な、研究者主導の第Ｉ相臨床試験において、ヒトボランティアにおけるノロウイルスＶＬＰに対する体液性、粘膜性、および細胞性の免疫応答を研究した。経口投与されたＶＬＰは安全であり、健康な成人において免疫原性であった（Ball et al. 1999、Tacket et al. 2003）。他の学術施設では、動物モデルにおける前臨床実験により、細菌外毒素アジュバントと共にＶＬＰを経鼻投与するとＶＬＰに対する免疫応答が増強することが明らかにされている（Guerrero et al. 2001, Recombinant Norwalk Virus-like Particles Administered Intranasally to Mice Induce Systemic and Mucosal（Fecal and Vaginal）Immune Responses. J Virol 2001; 75: 9713、Nicollier-Jamot et al. 2004, Recombinant Virus-like Particles of a Norovirus（Genogroup II Strain）Administered Intranasally and Orally with Mucosal Adjuvants LT and LT（R192G）in BALB/c Mice Induce Specific Humoral and Cellular Th1/Th2-like Immune Responses. Vaccine 2004; 22:1079-1086、Periwal et al. 2003, Enhances Systemic and Mucosal Immune Responses to Recombinant Norwalk Virus-like Particle Vaccine. Vaccine 2003; 21: 376-385）。
ノロウイルスＶＬＰを精製するための小規模な方法は文献に記載されている。例えば、超遠心分離によるノーウォークウイルスＶＬＰの精製が記載されており（Jiang et al. 1990; 1992）、当技術分野におけるノロウイルス研究者によって一般に利用されている。しかし、超遠心分離によって精製されたＶＬＰがヒトの臨床試験において利用されている一方で、この方法は、商用規模の量のカリシウイルスＶＬＰの生成には適していない。したがって、様々な生物学的供給源からＶＬＰを精製することが可能な、拡張性があり効率的な精製系を提供することが依然として必要とされている。
出願人らは、カリシウイルスＶＬＰを効率的に精製するための適切なクロマトグラフィー法を開発することにより、カリシウイルスＶＬＰのための拡張性のある精製系に対するニーズを解決した。本発明の方法は、精製ＶＬＰの商用的な生成のための拡張に適している。したがって、本発明は、クロマトグラフィープロセスを用いてカリシウイルスのウイルス様粒子（VLP）を精製する方法に関する。クロマトグラフィープロセスは、２つ以上のクロマトグラフィー材料および２つ以上の移動相条件を用い得る。クロマトグラフィー材料および移動相条件は、クロマトグラフィープロセスを直交的にする、異なる物理的または化学的特性であり得る。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料および移動相条件は、ＶＬＰが保持されるように選択される。他の実施形態において、クロマトグラフィー材料および移動相条件は、ＶＬＰが通過するように選択される。さらに他の実施形態において、クロマトグラフィー材料および移動相条件は、ＶＬＰ調製物内の混入物質が保持されるように選択される。さらに他の実施形態において、クロマトグラフィー材料および移動相条件は、ＶＬＰ調製物における混入物質が通過するように選択される。
中でも、いくつかの実施形態において、本発明のクロマトグラフィープロセスは、２つ以上のクロマトグラフィー段階を用いる多段階クロマトグラフィープロセスである。本発明の多段階クロマトグラフィープロセスの順序は、所定の規格に見合うＶＬＰを生成するように設計することができる。例えば、本発明の精製方法を用いて、約７０％、８０％、９０％、９５％超、または９９％超の純度にＶＬＰを精製することができる。
一実施形態において、多段階クロマトグラフィープロセスの順序は、得られるＶＬＰ組成を制御するように設計される。別の実施形態において、多段階クロマトグラフィープロセスの順序は、混入物質レベルを、管理機関により医薬品グレードの薬物材料であると承認されると考えられるレベルまで低下させるように設計される。例えば、宿主細胞ＤＮＡ含有量の混入物質レベルは１％未満まで低下させることができる。宿主細胞タンパク質含有量の混入物質レベルは５％未満まで低下させることができる。多段階クロマトグラフィープロセスの順序は、ＶＬＰがＧＭＰの規定と一致し、ヒトにおける医薬品試験に適したものとなるように設計される。
また、本発明はＶＬＰを含む溶液をクロマトグラフィー材料と接触させる方法も包含する。この点において、ＶＬＰを含む細胞溶解物をクロマトグラフィー材料と接触させることができ、ここで、細胞溶解物は、クロマトグラフィー材料との接触の前に濾過されるかまたは沈殿によって精製される。溶液または細胞溶解物は、ショ糖勾配を用いずに遠心分離することができる。一実施形態において、ＶＬＰを含む清澄化した溶液をクロマトグラフィー材料と接触させる。あるいは、１つのクロマトグラフィー段階から得たＶＬＰ含有溶液を、別のクロマトグラフィー材料と接触させる。
ＶＬＰ含有溶液は、組換え法を用いて生成することができる。例えば、ＶＬＰおよびＶＬＰタンパク質は、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞において生成することができる。
一実施形態において、本発明は、溶液内のクロマトグラフィー樹脂、カラム内のクロマトグラフィー樹脂、または膜内もしくは表面上に組み込まれたクロマトグラフィー官能基を含む、クロマトグラフィー材料を提供する。クロマトグラフィー材料は、タンパク質または核酸の精製のために設計することができる。クロマトグラフィー材料はさらに、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、混合モード、逆相、サイズ排除、および吸着の材料を含み得る。吸着材料は樹脂または膜であり得る。
一実施形態において、クロマトグラフィー材料はリン酸カルシウムベースの材料を含む。リン酸カルシウムベースの材料はヒドロキシアパタイトであり得る。
別の実施形態において、クロマトグラフィー材料はイオン交換体を含む。イオン交換体は陽イオン交換体であり、ここで、陽イオン交換体は、硫酸塩、リン酸塩、およびカルボン酸塩で誘導体化されたクロマトグラフィー材料を含む。別の実施形態において、イオン交換体は陰イオン交換体であり、ここで、イオン交換体は、正に帯電したクロマトグラフィー材料を含む。正に帯電したクロマトグラフィー材料は、第四級アミン（Q）またはジエチルアミノエタン（DEAE）であり得る。
さらに別の実施形態において、クロマトグラフィー材料は、疎水性相互作用材料を含む。疎水性相互作用材料は、メチル、エチル、ｔ−ブチル、およびフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の官能基を含み得る。一実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、メチルＨＩＣ樹脂である。
さらに別の実施形態において、クロマトグラフィー材料は、逆相材料を含む。逆相材料は、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ８、またはＣ１８の官能基を含む。別の実施形態において、クロマトグラフィー材料は、アフィニティークロマトグラフィー材料を含む。アフィニティークロマトグラフィー材料は、抗体、乾燥樹脂、および金属を含む。乾燥樹脂は、シバクロムブルーまたはポリミキシンであり得る。
一実施形態において、クロマトグラフィー材料はサイズ排除材料を含み、ここで、サイズ排除材料は樹脂または膜である。樹脂または膜は、同一のまたは異なるサイズの孔を含む。
また、本発明はＶＬＰが保持され、混入物質がクロマトグラフィー材料を通過するようにＶＬＰ含有溶液を調節する、ＶＬＰの精製方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＶＬＰ含有溶液のｐＨを緩衝液で調節して、より酸性の値（例えば７未満のｐＨ）にすることができる。他の実施形態において、ＶＬＰ含有溶液のｐＨを、より塩基性の値（例えば７を超えるｐＨ）に調節することができる。緩衝液は、リン酸塩、カルボン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、またはビストリスを含み得る。緩衝液の濃度は、約１０から１０００ｍＭの範囲であり得る。
一実施形態において、ＶＬＰ含有溶液のイオン強度が調節される。イオン強度は、硫酸アンモニウムなどの、ホフマイスター系列の陰イオンおよび陽イオンによって調節することができる。硫酸アンモニウムの濃度は、約１００ミリモル濃度より大きいか、または約１、２、もしくは２．４モル濃度であり得る。
別の実施形態において、イオン強度はリン酸塩の添加によって調節される。いくつかの実施形態において、リン酸塩はリン酸ナトリウムである。リン酸ナトリウムの濃度は約１０から５００ｍＭの範囲であり得る。一実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭである。
本発明の一実施形態において、ＶＬＰが保持されるように、クロマトグラフィー材料のｐＨを、ＶＬＰを加える前に、緩衝液での平衡によって調節する。ｐＨは酸性値（例えば７未満）、塩基性値（例えば７超）、または中性値（例えば７に等しい）に調節することができる。平衡緩衝液は、リン酸塩、カルボン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、またはビストリスを含み得る。
別の実施形態において、ＶＬＰが保持されるように、クロマトグラフィー材料のイオン強度を調節する。調節は、塩の添加により行うことができる。塩は、硫酸アンモニウムなどの、ホフマイスター系列の陽イオンおよび陰イオンを含み得る。硫酸アンモニウムの濃度は、約１、２、または２．４モル濃度より大きいものであり得る。
別の実施形態において、クロマトグラフィー材料のイオン強度は、リン酸塩の添加によって調節される。いくつかの実施形態において、リン酸塩はリン酸ナトリウムであり得る。リン酸ナトリウムの濃度は、約１０から５００ｍＭの範囲であり得る。一実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭである。
さらに別の実施形態において、ＶＬＰが保持されるように、ＶＬＰ含有溶液の有機溶媒の濃度を調節する。
さらに、本発明は混入物質が保持され、ＶＬＰがクロマトグラフィー樹脂を通過するようにＶＬＰ含有溶液およびクロマトグラフィー材料を選択することによるＶＬＰの精製方法を提供する。その際、ＶＬＰ含有溶液のｐＨは、緩衝液で調節することができ、例えばｐＨを７未満または７以上に調節することができる。緩衝液は、リン酸塩、カルボン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、またはビストリスを含み得る。一実施形態において、緩衝液の濃度は約１０から１０００ｍＭの範囲である。
一実施形態において、混入物質が保持され、ＶＬＰがクロマトグラフィー材料を通過するように、ＶＬＰ含有溶液のイオン強度を調節する。これは、塩の添加により行うことができ、ここで、塩は、リン酸ナトリウムなどの、ホフマイスター系列の陽イオンおよび陰イオンを含み得る。リン酸ナトリウムの濃度は約１０から５００ｍＭの範囲であり得る。一実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭである。
別の実施形態において、混入物質が保持され、ＶＬＰがクロマトグラフィー樹脂を通過するように、クロマトグラフィー材料のｐＨを、ＶＬＰを加える前に、緩衝液を用いた平衡によって調節する。ｐＨは、リン酸塩、カルボン酸塩、または硫酸塩を含み得る緩衝液で、７未満または７以上に調節することができる。
別の実施形態において、混入物質が保持され、ＶＬＰがクロマトグラフィー樹脂を通過するように、クロマトグラフィー材料のイオン強度を、ＶＬＰを加える前に、緩衝液を用いた平衡によって調節する。イオン強度は塩の添加により調節される。塩は、リン酸ナトリウムなどの、ホフマイスター系列の陽イオンおよび陰イオンを含む。一実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は約１０ｍＭ超である。
さらに別の実施形態において、ＶＬＰの結合および溶離を、移動相内に存在する有機溶媒の量によって制御する。ＶＬＰ含有溶液の有機溶媒の濃度もまた、混入物質が保持されるように調節することができる。有機溶媒は、メタノール、エタノール、もしくはプロパノールなどのアルコール、またはアセトニトリルなどの他の水混和性の有機溶媒であり得る。
さらに、本発明はノロウイルスおよびサポウイルスのＶＬＰなどの、カリシウイルスのウイルス様粒子（VLP）からＶＬＰを精製する方法を提供する。ノロウイルスは、遺伝子群Ｉ、遺伝子群ＩＩ、遺伝子群ＩＩＩ、および遺伝子群ＩＶのノロウイルスを含む。サポウイルスは、５つの遺伝子群（Ｉ〜Ｖ）を含み、そのうち、遺伝子群Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、およびＶのみがヒトに感染することが知られている（Farkas et al. 2004, Genetic diversity among sapoviruses. Arch Virol. 2004; 149:1309-23）。
さらに、本発明は多段階クロマトグラフィープロセスによって調製される医薬品を提供する。医薬品は、ノロウイルスワクチンなどのワクチンであり得る。
さらに、本発明は本明細書に記載の多段階クロマトグラフィープロセスにより調製される分析試薬を提供する。分析試薬は、診断アッセイまたは診断キットにおいて用いることができる所望の精製レベルに精製され得る。
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、以下に示す本発明の充分な検討の後に明確になるであろう。
概説
本特許を通して引用される全ての刊行物および特許出願は、それぞれの刊行物または特許／特許出願が、参照によりその全体が組み込まれるように具体的かつ個々に指定される場合と同程度に、参照により組み込まれる。
本特許を通して引用される全ての刊行物および特許出願は、それぞれの刊行物または特許／特許出願が、参照によりその全体が組み込まれるように具体的かつ個々に指定される場合と同程度に、参照により組み込まれる。
本発明の修飾および変更は、当業者に自明のものであろう。本明細書に記載する特定の実施形態は、例として提供されるに過ぎず、本発明はそれにより制限されると解釈されるものではない。
本発明は、ノロウイルスＶＬＰおよびサポウイルスＶＬＰを含む、カリシウイルスのウイルス様粒子（VLP）を精製するための方法に関する。「ノロウイルス（Norovirus）」、「ノロウイルス（NOR）」、「ノロウイルス（norovirus）」、および本明細書における文法上の同等物は、カリシウイルス科のノロウイルス属のメンバーを意味する。いくつかの実施形態において、ノロウイルスは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物種に感染性を有し得る、関連する、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡの、エンベロープを有さないウイルスの群を含み得る。いくつかの実施形態において、ノロウイルスは、ヒトにおける急性胃腸炎の原因となり得る。また、ノロウイルスは、電子顕微鏡法によって観察した場合に決まった表面構造または不規則な境界を有する、小型球形ウイルス（SRSV）であるとされる。ノロウイルスには、１５個の遺伝子クラスターを含む、核酸配列およびアミノ酸配列により規定される少なくとも４つの遺伝子群（ＧＩ〜ＧＩＶ）が含まれる。主要な遺伝子群はＧＩおよびＧＩＩである。ＧＩＩＩおよびＧＩＶは、提示されてはいるが、一般的に認められている。代表的なＧＩＩＩはウシのイエナ株である。ＧＩＶは、現時点では、アルファトロンである１つのウイルスを含む。ノロウイルスのさらなる記載については、Ｖｉｎｊｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．４１：１４２３−１４３３（２００３）を参照されたい。また、本明細書における「ノロウイルス」は、組換えノロウイルスのウイルス様粒子（ｒＮＯＲ ＶＬＰ）を意味する。いくつかの実施形態において、例えばＳｆ９細胞におけるバキュロウイルスベクターからの、少なくとも、細胞内のＯＲＦ２によりコードされているノロウイルスカプシドタンパク質の、組換え発現により、ＶＬＰへのカプシドタンパク質の自然発生的な自己集合が生じ得る。いくつかの実施形態において、例えばＳｆ９細胞におけるバキュロウイルスベクターからの、少なくとも、細胞内のＯＲＦ２およびＯＲＦ３によりコードされているノロウイルスタンパク質の、組換え発現により、ＶＬＰへのカプシドタンパク質の自然発生的な自己集合が生じ得る。ＶＬＰは構造的にノロウイルスに類似しているが、ウイルスＲＮＡゲノムを欠いており、したがって感染性を有さない。したがって、「ノロウイルス」は、不完全な粒子および不完全に干渉する粒子を含む、感染性または非感染性の粒子であり得るビリオンを含む。
ノロウイルスの非制限的な例には、ノーウォークウイルス（NV、GenBank M87661、NP056821）、サウザンプトンウイルス（SHV、GenBank L07418）、デザートシールドウイルス（DSV、U04469）、ヘッセ（Hesse）ウイルス（HSV）、チバウイルス（CHV、GenBank AB042808）、ハワイウイルス（HV、GenBank U0761 1）、スノーマウンテンウイルス（SMV、GenBank U70059）、トロントウイルス（TV、Leite et al., Arch. Virol. 141:865-875）、ブリストールウイルス（BV）、イエナウイルス（JV、AJ01099）、メリーランドウイルス（MV、AY032605）、セト（Seto）ウイルス（SV、GenBank AB031013）、キャンバーウェル（CV、AF145896）、ローズデール（Lordsdale）ウイルス（LV、GenBank X86557）、グリムズビーウイルス（GrV、AJ004864）、メキシコウイルス（MXV、GenBank U22498）、ボクサー（Boxer）（AF538679）、Ｃ５９（AF435807）、ＶＡ１１５（AY038598）、ＢＵＤＳ（AY660568）、ヒューストンウイルス（HoV、AY502023）、ＭＯＨ（AF397156）、パリスアイランド（PiV、AY652979）、ＶＡ３８７（AY038600）、ＶＡ２０７（AY038599）、およびオペレーションイラキフリーダム（Operation Iraqi Freedom）（OIF、AY675554）が含まれる。サポウイルスの非制限的な例には、サッポロウイルス（SV）、ヒューストン／８６［Ｕ９５６４３］（Hu/SLV/Hou/1986/US）、ヒューストン／９０［Ｕ９５６４４］（Hu/SLV/Hou27/1990/US）、ロンドン２９８４５［Ｕ９５６４５］（Hu/SLV/Lon29845/1992/UK）、マンチェスターウイルス［Ｘ８６５６０］（Hu/SLV/Man/1993/UK）、パークヴィルウイルス［Ｕ７３１２４］（Hu/SLV/Park/1994/US）、サッポロウイルス［Ｕ６５４２７］（Hu/SLV/SV/1982/JP）が含まれる。さらなるカリシウイルスのウイルス株が同定され続けており、本発明の方法における利用が検討されている（ICTVdB - The Universal Virus Database, version4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/）。核酸およびそれぞれの対応するアミノ酸配列は、参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態において、記号を同定目的のために用いることができ、体系化されている：ウイルスが単離された宿主種／属の略記／種の略記／株名／生じた年／発生国。（Green et al., Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol.1 841-874（Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001））。ノーウォークウイルスＶＬＰおよびヒューストンウイルスＶＬＰの精製の代表的な例を本明細書において論じる。
「ＶＬＰ調製物」は、ＶＬＰおよび精製しようとする他の物質を含む、あらゆる溶液を意味するものである。ＶＬＰ調製物は、バッチ、潅流、もしくはｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ法のいずれか１つを含むインビトロでの宿主細胞における培養、または適切な動物宿主におけるインビボでの培養を含む、複数の方法により生成することができる。前者の場合、ウイルス感染した細胞を増殖培地から採取、分離することができ、ＶＬＰタンパク質は、発芽プロセスを介して培地に放出されるか、または細胞の溶解および細胞残屑からの分離により遊離する。後者の場合、ウイルスを有する組織または器官を除去することができ、ＶＬＰタンパク質は同様に、その組織または器官を含む細胞の溶解により遊離し、細胞／組織残屑から分離される。
本明細書において用いる場合、「１つもしくは複数のウイルス様粒子またはＶＬＰ」は、カリシウイルスの配列をコードするカプシドタンパク質から生成され、感染性カリシウイルス粒子の抗原特性に類似した１つまたは複数の抗原特性を含む、１つもしくは複数のウイルス様粒子、１つもしくは複数のその断片、または１つもしくは複数のその部分を言う。ＶＬＰはあらゆる構造タンパク質であり得、ここで、構造タンパク質は、１つまたは複数の核酸配列によりコードされている。ＶＬＰは個別の構造タンパク質、すなわち、タンパク質の単量体もしくは二量体、または組換え構造タンパク質の精製の際に自然に形成されるタンパク質複合体、すなわち、自己集合ＶＬＰもしくはインタクトなＶＬＰもしくは凝集ＶＬＰを含み得る。また、ＶＬＰは、カプシド単量体、ＶＬＰもしくはカプシド単量体のタンパク質もしくはペプチド断片、またはその凝集物もしくは混合物の形態であり得る。それらは、構造タンパク質断片またはその突然変異形態、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の付加、置換、または欠失により修飾されている構造タンパク質を用いて生成し得る。ＶＬＰは形態学的および抗原的に真のビリオンに類似している。ＶＬＰは、例えば哺乳動物宿主細胞、酵母宿主細胞、細菌宿主細胞、および昆虫宿主細胞などの適切な宿主細胞においてインビボで生成することができる。
本発明は、生成された組換えＶＬＰを大規模で精製する方法を提供するものである。本方法は、溶液、すなわち宿主細胞系から得た細胞溶解物または培養上清を調製し、次に、溶解物または培養上清を様々な組合のクロマトグラフィー材料またはクロマトグラフィー媒質に通すことを含む。宿主細胞系は、ペトリ皿、ローラーボトル、バイオリアクターにおいて培養することができるか、または大規模な細胞培養に適した別の技術を用いて培養することができる。
当業者には、精製しようとするＶＬＰに適するように本発明のプロセスの特定のフィーチャを適合させることによって、本発明のプロセスを用いて他のウイルス様粒子を精製することができるということが理解されよう。適切なＶＬＰとは、精製プロセスにおける複数のクロマトグラフィー段階、ヒドロキシアパタイト、疎水性相互作用、イオン交換、およびサイズ排除のクロマトグラフィー材料などのクロマトグラフィー材料を用いて容易に精製されるＶＬＰである。
「細菌細胞」は、本明細書において、培養で増殖させることができる原核細胞を含むと定義される。細菌細胞は、異種タンパク質の組換え発現のための宿主細胞として作用し得る。細菌細胞は、ベクターを用いて形質転換、トランスフェクト、または感染させて、ベクター内に挿入されたタンパク質配列を発現させることができる。適切な細菌細胞の例には、限定するものではないが、大腸菌、バチルス・メガテリウム、枯草菌、およびバチルス・ブレビス、ならびに、カウロバクター、スタフィロコッカス、およびストレプトミセスの様々な種が含まれる。
「酵母細胞」は、本明細書において、発芽または直接的な分裂（核分裂）を介した増殖および繁殖が可能な、または単純で不規則なフィラメント（菌糸体）としての増殖による、小さな単細胞性の生物からなる群を含むと定義される。酵母細胞は、異種ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトして、異種ベクター内に挿入された核酸配列を発現させることができる。酵母細胞の例には、異種タンパク質のトランスフェクションおよび発現に一般に用いられるサッカロマイセス・セレビシエが含まれる。
「哺乳動物細胞培養物」は、本明細書において、細胞培養培地においてエクスビボで生存可能な哺乳動物供給源に由来する細胞の群を含むと定義される。哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞供給源に直接由来する初代細胞であり得る。より典型的には、哺乳動物細胞培養物における哺乳動物細胞は不死化され、すなわち、不定数の継代または分裂を経た成長および分裂を可能にされる。
「昆虫細胞」は、本明細書において、昆虫宿主から得たエクスビボで生存可能な昆虫供給源に由来する細胞の群を含むと定義される。昆虫細胞は、異種ベクターを用いて形質転換、トランスフェクト、または感染させて、異種ベクター内に挿入されたタンパク質配列を発現させることができる。昆虫細胞の例には、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞、ヒトスジシマカ細胞、キイロショウジョウバエ細胞、Ｓｆ９昆虫細胞、およびヨトウガ細胞が含まれる。
「溶解」は、化学的もしくは物理的手段により、またはウイルスの生活環の一部として、ウイルス感染細胞を開き、それによりＶＬＰの回収を可能にするプロセスを言う。
「多孔質クロマトグラフィー材料」は、主に分子のサイズ、疎水性、および電荷に基づく分子の分離において一般に用いられる、事実上あらゆるタイプの材料を意味する。本明細書において例示するように、「多孔質クロマトグラフィー材料」には、デキストラン（例えばSephadex（商標）樹脂）、または、様々な表面誘導体化を有する（例えば、親水性、イオン性、疎水性など）、アガロース、ポリスチレンジビニルベンゼン、ポリメタクリレート、シリカ、脂肪族アクリル重合体（例えばAmberlite（商標）樹脂）を含む様々な材料からなり得る他の多孔質材料が含まれる。
本明細書において用いる場合、「沈殿」という用語は、分子（VLPまたは混入物質）の選択的沈殿のいずれかをもたらす、塩の添加もしくは除去、有機溶媒の添加、タンパク質含有溶液の濃縮、またはｐＨの調節を介した、溶液条件の調節を言う。不溶性の物質または沈殿した物質を、次に、遠心分離または濾過などの複数の技術を用いて可溶性物質から分離する。
「ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー」は、マトリックスおよびリガンドの両方を形成する、不溶性のヒドロキシル化リン酸カルシウムＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２を用いるタンパク質の精製方法を言う。官能基は、正に帯電したカルシウムイオン（Ｃ部位）と負に帯電したリン酸基（Ｐ部位）の群との組からなる。ヒドロキシアパタイトとタンパク質との間の相互作用は複雑であり、複数の様式がある。しかし、相互作用の１つの方法において、タンパク質上の正に帯電したアミノ基は、負に帯電したＰ部位と関連し、タンパク質のカルボキシル基は、配位錯体形成によってＣ部位に相互作用する。Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ８９１：９３−９８（２０００）を参照されたい。結晶性ヒドロキシアパタイトは、クロマトグラフィーに用いられた最初のタイプのヒドロキシアパタイトであったが、それは構造上の困難性から制限されたものであった。セラミックヒドロキシアパタイト（cHA）クロマトグラフィーが、流速の制限などの、結晶性ヒドロキシアパタイトに関連する困難性のいくつかを克服するために開発された。セラミックヒドロキシアパタイトは、高い耐久性、良好なタンパク質結合能力を有し、結晶性ヒドロキシアパタイトよりも速い流速および高い圧力で用いることができる。Ｖｏｌａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：６５０−６５５（１９９３）を参照されたい。
「サイズ排除クロマトグラフィー」は、多孔質クロマトグラフィー材料を用いて分子を分離するための方法を意味する。サイズ排除クロマトグラフィーは、１つの段階において用いられる１つもしくは複数の異なるタイプの多孔質クロマトグラフィー材料、または複数の別の段階において用いられる１つもしくは複数の異なるタイプの多孔質クロマトグラフィー材料からなり得る。本明細書において用いる場合、２つ以上の多孔質クロマトグラフィー材料を用いる「サイズ排除クロマトグラフィー」の例は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）ＸＡＤ７ＨＰおよびＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−５０である。
「アフィニティー材料」は、基質またはリガンドに結合する固体状態の材料であり、基質またはリガンドは、目的のタンパク質すなわちアフィニティータグに付着しているタンパク質に選択的に結合する。結合すると、目的のタンパク質はカラムまたは他の精製装置内に保持され、したがって、ＶＬＰ調製物内に存在するあらゆる不純物から分離され得る。アフィニティーマトリックスの洗浄の後、目的のタンパク質はカラムまたは他の装置から、実質的に精製された形態で溶出され得る。アフィニティーマトリックスの例には、クロマトグラフィー媒質、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、フィルター、膜、および、選択したアフィニティータグに結合するリガンドまたは基質に結合する他の固体状態の材料が含まれる。
本明細書において用いる場合、タンパク質を「精製する」とは、タンパク質試料内に存在し得る、異質なまたは好ましくない成分、とりわけタンパク質またはＤＮＡなどの生物学的高分子の量を、所与のレベルの純度まで減少させることを意味する。例えば、本発明の方法は、約７０％、８０％、９０％、９５％超、または９９％超の純度にＶＬＰを精製するために用いることができる。異質なタンパク質の存在は、限定はしないが、ゲル電気泳動および染色またはウェスタンブロット分析、ＨＰＬＣおよび／またはＥＬＩＳＡアッセイを含む、あらゆる適切な方法によってアッセイすることができる。ＤＮＡの存在は、ゲル電気泳動および染色、ＤＮＡ結合タンパク質および／またはポリメラーゼ連鎖反応を用いるアッセイを含む、あらゆる適切な方法によってアッセイすることができる。
本明細書において用いる場合、「クロマトグラフィー材料」、「クロマトグラフィー媒質」、「クロマトグラフィーマトリックス」、および「クロマトグラフィー樹脂」という用語、ならびにそれらの文法上の同等物は、明細書全体を通してほぼ同じ意味で用いられる。
精製手順の説明
本発明は、生物学的供給源物質からのウイルス様粒子（VLP）の精製に関する。より詳細には、本発明は、組換えＶＬＰの完全性に不利益であり得る不純物および混入物質を除去するための手段としてのクロマトグラフィー法の利用、またはクロマトグラフィー法のその後の利用に関する。
本発明は、生物学的供給源物質からのウイルス様粒子（VLP）の精製に関する。より詳細には、本発明は、組換えＶＬＰの完全性に不利益であり得る不純物および混入物質を除去するための手段としてのクロマトグラフィー法の利用、またはクロマトグラフィー法のその後の利用に関する。
開示された発明は、生物学的供給源からＶＬＰを精製するために１つまたは複数のクロマトグラフィー段階を用いることを意図している。様々な順序および組合で用いられる、異なるクロマトグラフィー材料が、本発明により意図されている。１つまたは複数のクロマトグラフィー段階において、２つ以上のクロマトグラフィー材料および２つ以上の移動相条件を用いることができる。クロマトグラフィー材料および移動相条件は異なる物理的または化学的特性であり得、したがって直交的である。
クロマトグラフィー材料には、限定はしないが、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、混合モード、逆相、サイズ排除、および吸着の材料が含まれる。また、本発明は、アガロース、セルロース、シリカ、およびポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）（PSDVB）を含む多くの支持媒質も意図している。加えて、従来のクロマトグラフィー、すなわちＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィーもしくは高圧液体クロマトグラフィー）または潅流クロマトグラフィーを含む、複数のクロマトグラフィー法を用いることができる。当業者であれば、カラムのサイズ（すなわち直径および長さ）が、添加する物質の容量、精製するＶＬＰの濃度、および所望の分解度または純度などのいくつかの因子により決まることも理解されよう。
細胞溶解物の調製
本発明の実施においては、当業者の技術の範囲内である、分子生物学、タンパク質分析、および微生物学の技術を用いる。このような技術は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５に全て説明されている。
本発明の実施においては、当業者の技術の範囲内である、分子生物学、タンパク質分析、および微生物学の技術を用いる。このような技術は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５に全て説明されている。
ＶＬＰは、細胞系、組織などを含む複数の生物学的供給源から調製された細胞溶解物から精製することができる。ＶＬＰは、ウイルス感染した細胞から作製される細胞溶解調製物から精製されることが多く、この場合、細胞は細胞培養法を用いて増殖したものである。ＶＬＰ含有細胞の溶解物は、組換え法を用いて生成することができる。例えば、ＶＬＰおよびＶＬＰタンパク質は、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞において生成することができる。例えば、ノロウイルスＶＬＰは、バキュロウイルスに感染したＳＦ９細胞などから単離することができる。細胞は、収量を最適化するために、高い感染多重度で感染し得る。
ＶＬＰを含む細胞溶解物を調製するために、感染細胞からのＶＬＰタンパク質の放出に適したあらゆる方法を用いることができる。ＶＬＰタンパク質はまた、発芽プロセスを介して増殖培地内に放出され得る。ＶＬＰは培地および細胞残屑からの分離を介して回収され得るか、または当技術分野において既知の技術を用いて感染細胞から放出され得る。ウイルス感染細胞を溶解する方法には、低張溶液、高張溶液、超音波処理、圧力、または洗浄剤の使用が含まれる。一実施形態において、この技術は洗浄剤の使用である。別の実施形態において、試料中のＤＮＡおよびＲＮＡの量に応じて、技術は、洗浄剤と組み合わせたヌクレアーゼの使用でもある。
細胞を可溶化するために、非イオン性またはイオン性の洗浄剤を含む多くの洗浄剤が利用可能である。細胞溶解物を処理するために、１つまたは複数の酵素、好ましくはＲＮＡｓｅおよび／もしくはＤＮＡｓｅからなる、または当業者に既知であるエンドヌクレアーゼの混合物からなる酵素剤を用いることができる。細胞またはウイルスの凝集を生じさせることにより本発明のクロマトグラフィー精製スキームに干渉し得る細胞物質に核酸が接着することができ、その結果、もし存在する場合にはわずかなＶＬＰが回収されることは、当業者に周知である。
清澄化
清澄化段階の前に、洗浄剤で、または場合によっては洗浄剤およびヌクレアーゼで処理した後の細胞溶解調製物を処理して、大きな粒子物を除去することができる。これは、低速遠心分離または濾過を含む複数の手順によって行うことができる。用いるフィルターまたは膜のタイプ（すなわち、組成および孔サイズ）は、特定のＶＬＰの精製にあたり当業者に知られているものである。
清澄化段階の前に、洗浄剤で、または場合によっては洗浄剤およびヌクレアーゼで処理した後の細胞溶解調製物を処理して、大きな粒子物を除去することができる。これは、低速遠心分離または濾過を含む複数の手順によって行うことができる。用いるフィルターまたは膜のタイプ（すなわち、組成および孔サイズ）は、特定のＶＬＰの精製にあたり当業者に知られているものである。
本発明の一実施形態は、沈殿による清澄化を伴う。所望のＶＬＰタンパク質は、限定はしないがＰＥＧ、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、グリシンを含む、タンパク質沈殿剤、または温度の使用などの、当業者に周知の沈殿技術の使用によって、細胞溶解物または培養上清から回収することができる。沈殿は、好ましくは、混入タンパク質の共沈殿を減少させるように慎重に選択した化学物質濃度で行う。次に、沈殿したタンパク質を、濾過または遠心分離により、可溶性物質から分離する。本発明の一実施形態において、ＶＬＰは、脱イオン水の添加を介して溶液のイオン強度を低下させることにより沈殿する。別の実施形態において、ＶＬＰは、硫酸アンモニウムの添加によって沈殿する。次に、沈殿したＶＬＰを、低速遠心分離を用いて回収し、緩衝液内に再懸濁する。
本発明の別の実施形態は、多孔質クロマトグラフィー材料を用いた清澄化を伴い得る。特定の細胞溶解物からのＶＬＰの精製において、また、存在する細胞凝集物の量に応じて、サイズ排除クロマトグラフィーを実施するために単一の多孔質クロマトグラフィー材料を用いることが望ましい可能性がある。これらの場合、事前の清澄化（すなわち濾過）段階を行い、その後、好ましくはデキストランで作製された、また、より好ましくは特定のＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）樹脂で作製された単一の多孔質クロマトグラフィー材料を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを行うことで十分であり得る。通常は、当技術分野で周知の手段によって得られた細胞溶解物または細胞培養上清を清澄化する。
一実施形態において、本発明は、溶液内のクロマトグラフィー樹脂、カラム内のクロマトグラフィー樹脂、または膜内もしくは表面上に組み込まれたクロマトグラフィー官能基を含む、クロマトグラフィー材料を提供する。「膜」は、主に分子のサイズに基づく分子の分離において一般に用いられる、事実上あらゆるタイプの材料を意味する。本明細書において例示するように、「膜」には、フィルター、または分子の分離に用いることができる他の多孔質材料が含まれる。
クロマトグラフィー材料は、タンパク質または核酸の精製のために設計し得る。クロマトグラフィー材料には、さらに、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、混合モード、逆相、サイズ排除、および吸着の材料が含まれ得る。本発明のクロマトグラフィー材料の例を、以下に、より詳細に記載する。このクロマトグラフィー材料は例示の目的のためだけに提供されることが理解されるべきであり、本発明は決してこれらのクロマトグラフィー材料またはクロマトグラフィー段階に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、一般にはタンパク質または核酸の精製、特定的にはＶＬＰの精製に用いることができる、あらゆる全てのクロマトグラフィー材料またはクロマトグラフィー段階を包含すると解釈されるべきである。
以下に論じるクロマトグラフィー法は、個別の段階として、または連続的に、または相前後して実施することができる。「相前後して」とは、１つのクロマトグラフィーから得た溶出液を、溶出液を回収する段階を経ることなく次のクロマトグラフィーに直接利用することを意味する。あるいは、溶出液の画分をプールし、回収して、その後、次のクロマトグラフィーに利用することも可能である。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー材料
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料は、リン酸カルシウムベースの材料を含む。リン酸カルシウムベースの材料はヒドロキシアパタイトであり得る。様々なヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー材料またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂が市販されており、あらゆる利用可能な形態の材料を本発明の実施に用いることができる。本発明の一実施形態において、ヒドロキシアパタイトは結晶形態である。本発明に用いるヒドロキシアパタイトは、凝集して粒子を形成し、安定な多孔質のセラミック塊に高温で焼結されたものであり得る。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料は、リン酸カルシウムベースの材料を含む。リン酸カルシウムベースの材料はヒドロキシアパタイトであり得る。様々なヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー材料またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂が市販されており、あらゆる利用可能な形態の材料を本発明の実施に用いることができる。本発明の一実施形態において、ヒドロキシアパタイトは結晶形態である。本発明に用いるヒドロキシアパタイトは、凝集して粒子を形成し、安定な多孔質のセラミック塊に高温で焼結されたものであり得る。
ヒドロキシアパタイトの粒子サイズは広く変化し得るが、典型的な粒子サイズは１μｍから１０００μｍの直径の範囲であり、１０μｍから１００μｍであり得る。本発明の一実施形態において、粒子サイズは２０μｍである。本発明の別の実施形態において、粒子サイズは４０μｍである。本発明のさらに別の実施形態において、粒子サイズは８０μｍである。
本発明は、容器に入っていない、カラム内に充填された、または連続的な環状クロマトグラフにおける、ヒドロキシアパタイト樹脂と共に用いることができる。本発明の一実施形態において、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂はカラム内に充填されている。カラム直径の選択は、当業者が決定し得る。本発明の一実施形態において、少なくとも０．５ｃｍのカラム直径および約２０ｃｍの床高を、小規模な精製に用いることができる。本発明のさらなる実施形態において、約３５ｃｍから約６０ｃｍのカラム直径を用いることができる。本発明のさらに別の実施形態において、６０ｃｍから８５ｃｍのカラム直径を用いることができる。
ＶＬＰを含むヒドロキシアパタイトカラムから得た溶出液をプールし、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂などの別のクロマトグラフィー樹脂に利用することができる。
疎水性相互作用クロマトグラフィー材料
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料は疎水性相互作用材料を含む。疎水性相互作用材料は、メチル、エチル、ｔ−ブチル、およびフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の官能基を含み得る。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料は疎水性相互作用材料を含む。疎水性相互作用材料は、メチル、エチル、ｔ−ブチル、およびフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の官能基を含み得る。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（「HIC」）は、塩濃度が高い条件下でのタンパク質の分離に有益な技術である（概して、HPLC of Biological Macromolecules. Methods and Applications, Gooding, K. M. et al., Eds., Marcel Dekker, Inc.（1990）を参照されたい）。タンパク質に関して、ＨＩＣ分離は、タンパク質の疎水性アミノ酸残基と、クロマトグラフィー支持体に固定された固定化疎水性部分との相互作用に基づくものである。固定化疎水性部分は、広範なアルキル基およびアリール基から選択され得る。ＰＥＧは、ＨＩＣクロマトグラフィーにおいて一般に用いられる固定化部分である。その部分の疎水性は、アルキルの長さが長くなるにつれ増大する。タンパク質は、塩の濃度が高い（１〜３ＭのＮＨ４（ＳＯ４）２）カラムに吸着し、イオン強度を低下させることより溶出される。ＨＩＣを実施する方法は、参照により全て本明細書に組み込まれる、Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｇ．Ｗ．ら（Meth. Molec. Cell. Biol. 4:184-188（1993））、Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｊ．ら（J. Chromatog. 212:199-209（1981））、Ｏｃｈｏａ，Ｊ．Ｉ．（Biochimie 60:1-15（1978））、Roggenbuck, D.ら（J. Immunol. Meth. 167:207-218（1994））、Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ，Ｓ．ら（Pol. J. Food Nutr. Sci. 3/44:5-44（1994）、Ｒｉｐｐｅｌ，Ｇ．ら（J. Chromatog. 668:301-312（1994））、Ｓｚｅｐｅｓｙ，Ｌ．ら（J. Chromatog. 668:337-344（1994））、Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ，Ｊ．Ｇ．ら（Biotechnol. Bioeng. 44:626-635（1994））、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｅ．ら（Annl. NY Acad. Sci. 721:348-364（1994））により記載されている。
広範な疎水性にわたる、様々な市販されているＨＩＣカラムの化学的性質により、クロマトグラフィー分離を可能にする適切なリガンドを見出すことが可能である。例えば、ＨＩＣカラムは、利用可能なアルキルリガンドおよび芳香族リガンドの全範囲を網羅しているＳｙｎｃｈｒｏｍおよびＢｉｏ−Ｒａｄ（Hercules Calif.）から購入することができる。一実施形態において、本発明において用いるＨＩＣカラムはメチルＨＩＣである。
サイズ排除クロマトグラフィー材料
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料はサイズ排除材料を含み、ここで、サイズ排除材料は樹脂または膜である。本明細書において意図するように、サイズ排除クロマトグラフィーは、主に分子のサイズに基づく分子の分離を伴う。サイズ排除に用いるマトリックスは、好ましくは、架橋した多糖の複合物、例えば、球状ビーズの形態をした、架橋したアガロースおよび／またはデキストランであり得る、不活性なゲル媒質である。架橋の程度により、膨潤ゲルビーズ内に存在する孔のサイズが決まる。一定のサイズより大きい分子はゲルビーズの中に入らず、したがって、最も速くクロマトグラフィー床を移動する。自らのサイズおよび形状に従って様々な程度でゲルビーズ内に入る、洗浄剤、タンパク質、ＤＮＡなどの、より小さい分子は、床の移動が遅い。したがって、分子は通常、分子のサイズが減少するほど溶出される。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料はサイズ排除材料を含み、ここで、サイズ排除材料は樹脂または膜である。本明細書において意図するように、サイズ排除クロマトグラフィーは、主に分子のサイズに基づく分子の分離を伴う。サイズ排除に用いるマトリックスは、好ましくは、架橋した多糖の複合物、例えば、球状ビーズの形態をした、架橋したアガロースおよび／またはデキストランであり得る、不活性なゲル媒質である。架橋の程度により、膨潤ゲルビーズ内に存在する孔のサイズが決まる。一定のサイズより大きい分子はゲルビーズの中に入らず、したがって、最も速くクロマトグラフィー床を移動する。自らのサイズおよび形状に従って様々な程度でゲルビーズ内に入る、洗浄剤、タンパク質、ＤＮＡなどの、より小さい分子は、床の移動が遅い。したがって、分子は通常、分子のサイズが減少するほど溶出される。
ウイルスのサイズ排除クロマトグラフィーに適した多孔質クロマトグラフィー樹脂は、デキストランおよび架橋したデキストランで作製することができる。最も一般に用いられるものは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な「ＳＥＰＨＡＤＥＸ」という商品名の樹脂である。用いるＳＥＰＨＡＤＥＸまたは他のサイズ排除クロマトグラフィー樹脂のタイプは、精製しようとするＶＬＰのタイプ、およびＶＬＰを含む細胞培養溶解物の性質に応じて変化する。異なる材料で構成されている他のサイズ排除支持体もまた適切であり、例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５Ｆ（Tosoh Bioscience, Montgomery Pa.から入手されるポリメタクリレート）およびＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−３０ Ｆｉｎｅ（BioRad Laboratories, Hercules, Calif.）である。
サイズ排除クロマトグラフィーのために、部分的に精製したＶＬＰの濃縮プールを、適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）内で平衡させた適切な分取サイズ排除クロマトグラフィーカラムを含むカラム（Sephadex G200またはSuperpose 6樹脂を含むカラムなど）に添加する。
さらに、本発明はイオン交換体を含むクロマトグラフィー材料を提供する。イオン交換体は陽イオン交換体であり得、ここで、陽イオン交換体は、硫酸塩、リン酸塩、およびカルボン酸塩で誘導体化されたクロマトグラフィー材料を含む。イオン交換体はまた、陰イオン交換体であり得、ここで、陰イオン交換体は、正に帯電したクロマトグラフィー材料を含む。正に帯電したクロマトグラフィー材料は、第四級アミン（Q）またはジエチルアミノエタン（DEAE）であり得る。
陰イオン交換クロマトグラフィー材料
陰イオン交換クロマトグラフィーは、不活性なポリマー骨格に共有結合で架橋した、正に帯電した有機部分を用いる。ポリマー骨格は、樹脂の支持体として用いられる。代表的な有機部分は、第１級、第２級、第３級、および第四級のアミノ基、例えば、トリメチルアミノエチル（TMAE）、ジエチルアミノエチル（DEAE）、ジメチルアミノエチル（DMAE）、および、約５から約９のｐＨ範囲内の正の形式電荷を既に有しているかまたは有するであろう、ポリエチレンイミン（PEI）などの他の基から選択される。
陰イオン交換クロマトグラフィーは、不活性なポリマー骨格に共有結合で架橋した、正に帯電した有機部分を用いる。ポリマー骨格は、樹脂の支持体として用いられる。代表的な有機部分は、第１級、第２級、第３級、および第四級のアミノ基、例えば、トリメチルアミノエチル（TMAE）、ジエチルアミノエチル（DEAE）、ジメチルアミノエチル（DMAE）、および、約５から約９のｐＨ範囲内の正の形式電荷を既に有しているかまたは有するであろう、ポリエチレンイミン（PEI）などの他の基から選択される。
一実施形態において、ＤＭＡＥ、ＴＭＡＥ、ＤＥＡＥ、または第四級アンモニウム基からなる、陰イオン交換樹脂が用いられる。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（Novagen）という商品名で売られている複数の陰イオン交換樹脂は、ＴＭＡＥ、ＤＥＡＥ、ＤＭＡＥを正に帯電した部分として用いており、また、メタクリレートコポリマーのバックグラウンドを用いている。第四級アンモニウム樹脂およびＱ ＳＯＵＲＣＥ−３０（Amersham Biosciences）という商品名で売られているタイプの第四級アンモニウム樹脂を用いる樹脂も用いることができる。Ｑ ＳＯＵＲＣＥ−３０は、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンで作製された支持体を有する。
いくつかの可能な陰イオン交換媒質を、ＰＯＲＯＳ ５０ ＰＩ（商標）、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、あらゆるＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、第３級もしくは第四級アミン、またはＰＥＩベースの樹脂などの、Ｎが帯電しているアミノ樹脂またはイミノ樹脂を含む、このようなカラムにおいて用い得ることが知られている。当業者には、別のカラムで精製する前または後に陰イオン交換カラムで組換えＶＬＰを精製し得ることが理解されよう。
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、放射流もしくは軸流の流動床カラムを用いる重力カラムクロマトグラフィー装置もしくは高圧液体クロマトグラフィー装置において、またはスラリー法、すなわちバッチ法において用いることができる。後者の方法において、樹脂は、デカンテーションもしくは遠心分離もしくは濾過、または方法の組合によって、試料から分離される。
イオン交換クロマトグラフィーの原理は、帯電した分子がイオン交換体に可逆的に吸着し、それにより、分子が、イオン環境の変化によって結合または溶出され得るというものである。イオン交換体での分離は、通常２つの段階で行われる。まず、安定で強力な結合をもたらす条件を用いて、分離しようとする物質を交換体に結合させ、次に、精製しようとする物質の特性に応じて、異なるｐHまたはイオン強度の緩衝液で物質を溶出する。
より具体的には、また、本発明に適用されるように、イオン交換クロマトグラフィーの基本的な原理は、交換体へのＶＬＰの親和性が、タンパク質の電気的特性と、溶媒内の他の帯電した物質の相対的親和性との両方に依存するというものである。したがって、結合したタンパク質は、ｐHの変化、したがってタンパク質の電荷の変化によって、または競合物質を添加することによって溶出され得るが、競合物質の塩は一例である。異なる物質は異なる電気的特性を有しているため、放出のための条件は、それぞれの結合した分子種で変化する。通常、良好な分離を得るために、選択される方法は、連続的なイオン強度勾配での溶出または段階的な溶出である。陰イオン交換体では、ｐＨが低下しイオン強度が上昇するか、または、イオン強度のみが上昇する。陽イオン交換体では、ｐＨおよびイオン強度の両方が上昇し得る。溶出手順の実際の選択は、通常、試行錯誤、および精製しようとするＶＬＰの安定性の検討から決定される。
当業者には、ＶＬＰの結合および溶出に用いる陰イオン交換体のタイプ、および緩衝液、および塩もまた、精製しようとするＶＬＰのタイプに応じて変化することが理解されよう。
陽イオン交換クロマトグラフィー材料
陽イオン交換クロマトグラフィーでは、負の官能基群を不溶性支持媒質に結合させる。したがって、陽イオン交換クロマトグラフィー媒質は、インキュベーション期間が、正に帯電した群が負に帯電した陽イオン交換体媒質に結合し、それと平衡することを可能にするために十分な時間である場合に、正の対イオンを結合する。中性の分子および陰イオンは、陽イオン交換媒質に結合しない。正味の正の電荷を有する種が静電気的に結合した後、陽イオン媒質を洗浄して、結合していない分子を媒質から除去する。次に、結合したイオンを、陽イオンの濃度を上昇させて媒質を洗浄するか、または媒質のｐＨを変化させることにより、溶出する。開示された発明は、当技術分野で周知の多くの支持媒質に結合した、あらゆるスルホ、ホスホルカルボキシ（phosphor carboxy）、またはカルボキシメチルベースの陽イオン交換樹脂などの、様々な陽イオン交換樹脂を用いることを意図するものである。
陽イオン交換クロマトグラフィーでは、負の官能基群を不溶性支持媒質に結合させる。したがって、陽イオン交換クロマトグラフィー媒質は、インキュベーション期間が、正に帯電した群が負に帯電した陽イオン交換体媒質に結合し、それと平衡することを可能にするために十分な時間である場合に、正の対イオンを結合する。中性の分子および陰イオンは、陽イオン交換媒質に結合しない。正味の正の電荷を有する種が静電気的に結合した後、陽イオン媒質を洗浄して、結合していない分子を媒質から除去する。次に、結合したイオンを、陽イオンの濃度を上昇させて媒質を洗浄するか、または媒質のｐＨを変化させることにより、溶出する。開示された発明は、当技術分野で周知の多くの支持媒質に結合した、あらゆるスルホ、ホスホルカルボキシ（phosphor carboxy）、またはカルボキシメチルベースの陽イオン交換樹脂などの、様々な陽イオン交換樹脂を用いることを意図するものである。
本発明の一実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、以下に論じる結合モードまたは流入モードにおいて用いることができる。
アフィニティークロマトグラフィー材料
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料はアフィニティークロマトグラフィー材料を含む。アフィニティークロマトグラフィー材料は、抗体、染料樹脂、および金属を含み得る。乾燥樹脂は、シバクロムブルーまたはポリミキシンであり得る。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー材料はアフィニティークロマトグラフィー材料を含む。アフィニティークロマトグラフィー材料は、抗体、染料樹脂、および金属を含み得る。乾燥樹脂は、シバクロムブルーまたはポリミキシンであり得る。
アフィニティークロマトグラフィーは、標的化合物のリガンド特異的な精製を提供する技術である。そのため、この技術は高分子の構造的および機能的な特徴的特性を利用するものであり、これは、特定の条件下でこれらの特異的な特徴に基づいて分子を結合することによるものである。
様々な異なるアフィニティーカラムマトリックスが、開示される発明で用いられることが意図される。例えば、ＶＬＰに対する抗体を、アフィニティーカラム媒質を作製するために用いることができ、この媒質をＶＬＰの精製に用いることができる。加えて、アフィニティークロマトグラフィー材料は、乾燥樹脂および金属を含み得る。乾燥樹脂はシバクロムブルーまたはポリミキシンであり得る。
開示される発明の一実施形態は、吸着群としてヘパリンを用いることを意図するものである。ヘパリンを含むアフィニティークロマトグラフィー媒質は、様々な販売元から市販されている。例えば、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Framingham, Mass.）は、ヘパリンベースの媒質（POROS 20HE（商標））を市販している。ＰＯＲＯＳ ２０ＨＥ（商標）はアフィニティークロマトグラフィー媒質として用いられ、ＶＬＰ含有溶液をアフィニティー媒質に加え、その後、適切な塩濃度で溶出する。
上記で論じたクロマトグラフィー材料は、個別の段階として、または連続的に、または相前後して実施することができる。本発明の多段階クロマトグラフィープロセスの順序は、所定の規格に見合うＶＬＰを生成するように設計することができる。例えば、本発明の精製方法は、約７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％超の純度にＶＬＰを精製するために用いることができる。
一実施形態において、多段階クロマトグラフィープロセスの順序は、得られるＶＬＰ組成を制御するように設計される。別の実施形態において、多段階クロマトグラフィープロセスの順序は、混入物質レベルを、管理機関により医薬品グレードの薬物材料であると承認されると考えられるレベルまで低下させるように設計される。例えば、宿主細胞のＤＮＡ含有量の混入物質レベルは１％未満まで低下させることができる。宿主細胞のタンパク質含有量の混入物質レベルは５％未満まで低下させることができる。多段階クロマトグラフィープロセスの順序は、ＶＬＰがＧＭＰの規定と一致し、ヒトにおける医薬品試験に適したものとなるように設計される。
さらに、本発明はＶＬＰを含む溶液をクロマトグラフィー材料と接触させる方法を提供する。この点において、ＶＬＰを含む培地または細胞溶解物をクロマトグラフィー材料と接触させることができ、ここで、培地または細胞溶解物は、クロマトグラフィー材料との接触の前に濾過されるかまたは沈殿によって精製される。溶液または細胞溶解物は、ショ糖勾配を用いずに遠心分離することができる。一実施形態において、ＶＬＰを含む清澄化した溶液をクロマトグラフィー材料と接触させる。あるいは、１つのクロマトグラフィー段階から得たＶＬＰ含有溶液を、別のクロマトグラフィー材料と接触させる。
開示される発明の特定の実施形態は、溶解プロセスの際に放出される細胞培地からＶＬＰ粒子を精製するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質と共にヒドロキシアパタイト媒質を用いることを意図したものである。一実施形態において、細胞溶解物を、ヒドロキシアパタイトカラム（Bio-Rad,、CHT）に添加する。このようなカラムは、様々なサイズで市販されている。ヒドロキシアパタイトカラムで精製した後、ＶＬＰ含有物質を疎水性相互作用（HIC）カラムに通す。次にカラムを洗浄し溶出する。ＶＬＰの精製試料は、例えば、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって、純度について分析することができる。
本発明の一実施形態において、薬理学的利用のためにＶＬＰ粒子を精製するために、ヒドロキシアパタイト媒質を、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質と共に用い、さらに、陰イオン交換クロマトグラフィー媒質と共に用いる。本発明者らによって、この組合が、商用的に拡張性のあるレベルでノロウイルスの遺伝子型Ｉのノーウォークウイルスを精製するためにとりわけ適していることが見出された。加えて、本発明者らにより、陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、その後メチルＨＩＣを行うことが、ヒューストンウイルスの精製にとりわけ適していることが見出された。
それぞれの段階においてクロマトグラフィー材料をＶＬＰ調製物と接触させる前に、ｐＨ、イオン強度、および温度などのパラメーターを調節する必要があり得、場合によっては、異なる種類の材料を添加する必要があり得る。これらのパラメーターの調節は、当業者に既知のものであり、ＶＬＰ含有溶液またはクロマトグラフィー媒質において行うことができる。例えば、ＶＬＰ含有溶液のｐＨは緩衝液で調節することができる。ｐＨは、酸性値（例えば７未満のｐＨ）または塩基性値（例えば７を超えるｐＨ）に調節することができる。いくつかの実施形態において、溶液またはクロマトグラフィー材料のｐＨを中性値（例えば７に等しいｐＨ）に調節することが望ましい可能性がある。ｐＨ値を調節するために用いる緩衝液は、リン酸塩、カルボン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、またはビストリスを含み得、緩衝液の濃度は約１０から１０００ｍＭの範囲であり得る。
別の実施形態において、本発明の方法は、ＶＬＰ含有溶液のイオン強度の調節を伴う。イオン強度は、ホフマイスター系列の陽イオンおよび陰イオンを含む塩を添加することによって調節することができる。塩は、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、およびリン酸カリウムなどのリン酸塩であり得る。いくつかの実施形態において、リン酸塩はリン酸ナトリウムである。塩の濃度は約１０から５００ｍＭの範囲であり得る。一実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭである。
あるいは、クロマトグラフィー材料を溶液（例えば、ｐＨ、イオン強度などを調節するための、または洗浄剤を導入するための緩衝液）で洗浄することによってクロマトグラフィー材料に任意の段階を行い、ＶＬＰ調製物の精製に、必要な特徴を付与することができる。例えば、クロマトグラフィー材料のｐＨは、緩衝液での平衡により、ＶＬＰを加える前に調節することができる。ｐＨは、リン酸塩、カルボン酸塩、または硫酸塩を含む緩衝液で、７未満または７以上に調節することができる。
別の実施形態において、クロマトグラフィー材料のイオン強度は、塩の添加によって調節することができる。塩は、硫酸アンモニウムなどの、ホフマイスター系列の陽イオンおよび陰イオンを含む。硫酸アンモニウムの濃度は、約１、２、または２．４モル濃度超であり得る。
別の実施形態において、クロマトグラフィー材料のイオン強度は、リン酸塩の添加によって調節することができる。いくつかの実施形態において、リン酸塩はリン酸ナトリウムである。リン酸ナトリウムの濃度は約１０から５００ｍＭの範囲であり得る。一実施形態において、リン酸ナトリウムの濃度は約１００ｍＭである。さらに別の実施形態において、ＶＬＰ含有溶液の有機溶媒の濃度は、逆相プロセスの間に調節することができる。
ＶＬＰ含有溶液またはクロマトグラフィー材料のパラメーターの調節により、ＶＬＰおよび混入物質の保持または通過が生じ得る。一実施形態において、ＶＬＰ含有溶液またはクロマトグラフィー材料は、ＶＬＰが保持され、混入物質がクロマトグラフィー材料を通過するように選択し得る。別の実施形態において、ＶＬＰ含有溶液またはクロマトグラフィー材料は、混入物質が保持され、ＶＬＰがクロマトグラフィー材料を通過するように選択し得る。このようなフィーチャは、「流入モード」または「結合モード」またはそれらの混合のクロマトグラフィー段階を実施するために用いることができる。「流入モード」という用語は、調製物内に含まれる少なくとも１つのＶＬＰがクロマトグラフィー樹脂またはクロマトグラフィー支持体に流入し、一方で、少なくとも１つの潜在的な混入物質または不純物がクロマトグラフィー樹脂またはクロマトグラフィー支持体に結合するようになっている、ＶＬＰ調製物分離技術を言う。流入モードは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにおいて用いることができる。
「結合モード」は、調製物内に含まれる少なくとも１つのＶＬＰがクロマトグラフィー樹脂またはクロマトグラフィー支持体に結合し、一方で、少なくとも１つの混入物質または不純物が流入する、ＶＬＰ調製物分離技術を言う。結合モードは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにおいて用いることができる。
特定の実施形態において、本発明は、結合モード、流入モード、またはそれらの組合でヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、ＶＬＰ調製物から混入物質を除去するための方法を提供する。このような実施態様は、ＶＬＰ調製物の大規模な精製への適用を有する。
結合モードのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて、本方法は、ＶＬＰを結合するために、中性のｐＨおよび低いイオン強度でリン酸塩で帯電したヒドロキシアパタイト支持体を用いる。次に、リン酸緩衝液でカラムを洗浄して、緩く結合した不純物を除去する。次に、１００から２００ｍＭのリン酸塩を含む高いイオン強度のリン酸緩衝液を用いて、ＶＬＰを選択的に溶出する。最後に、場合により、水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウムの溶液を用いて樹脂を再生させる。
流入モードのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて、ＶＬＰ調製物を適切なｐＨでローディングバッファーに緩衝液交換する。次に、ＶＬＰ調製物がヒドロキシアパタイトカラムに流入し、不純物がカラムに結合するようにする。カラムは、場合によりその後洗浄して清浄し、さらなるＶＬＰがカラムに流入し精製されるようにする。最後に、カラムを場合により剥離し、次に、水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウムの溶液などの緩衝液を用いて再生させることができる。
結合モード／流入モードを組み合わせたヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて、ヒドロキシアパタイト媒質を平衡させ、溶液で洗浄し、それにより、ＶＬＰ調製物の精製に、必要な特徴を付与する。
平衡およびクロマトグラフィーの前に、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒質を、例えば塩溶液および／または緩衝溶液などの選択された溶液内で前平衡させることができる。前平衡は、クロマトグラフィー媒質を再生および／または保存するために用いる溶液を移動させる機能を有する。当業者には、前平衡溶液の組成が保存溶液およびその後のクロマトグラフィーに用いる溶液の組成に依存することが理解されよう。したがって、適切な前平衡溶液は、クロマトグラフィーの実施に用いられる同一の緩衝液または塩を、場合によってはクロマトグラフィーの実施よりも高い濃度で含み得る。
試料をカラムに加える前に、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒質を、ＶＬＰのクロマトグラフに用いる緩衝液または塩内で平衡し得る。クロマトグラフィー（および精製するタンパク質の添加）は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、フッ化物、酢酸塩、リン酸塩、および／もしくはクエン酸塩、ならびに／またはトリス緩衝液を含む、様々な緩衝液または塩内において行うことができる。このような緩衝液または塩は、約２から約１０の範囲のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態において、平衡は、トリスまたはリン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液において生じ得る。場合により、リン酸ナトリウム緩衝液は約０．５ミリモル濃度から約５０ミリモル濃度の濃度であり、より好ましくは、約１５ミリモル濃度から３５ミリモル濃度の濃度である。好ましくは、平衡は少なくとも約５．５のｐＨで生じる。平衡は、約６．０から約８．６のｐＨ、好ましくは約６．５から７．５のｐＨで生じ得る。最も好ましくは、溶液は、約２５ミリモル濃度の濃度および約６．８のｐＨのリン酸ナトリウム緩衝液を含む。
結合モード、流入モード、またはその組合における、ヒドロキシアパタイト樹脂へのＶＬＰ調製物の接触は、充填床カラム、固相マトリックスを含む流動／膨張床カラム、および／または、固相マトリックスが一定時間にわたって溶液と混合される単一バッチ作業において実施することができる。
ヒドロキシアパタイト樹脂をＶＬＰ調製物と接触させた後、場合により洗浄手順が行われる。しかし、いくつかのケースにおいて、洗浄手順を省略して、プロセスの段階および洗浄溶液を節約することができる。用いる洗浄緩衝液は、ヒドロキシアパタイト樹脂の性質、用いるヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのモードに応じるものであり、したがって、当業者が決定することができる。流入モードおよび結合モード／流入モードの組合において、カラムの最適な洗浄の後に得られる精製ＶＬＰの流入を、他の精製ＶＬＰ画分と共にプールすることができる。
結合モードにおいて、ＶＬＰは最適な洗浄手順の後にカラムから溶出され得る。カラムからのＶＬＰの溶出のために、本発明は高いイオン強度のリン酸緩衝液を用いる。例えば、溶出緩衝液は１から３００ｍＭのリン酸ナトリウムを含み得、別の実施形態においては、溶出緩衝液は５０から２５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含み得、別の実施形態においては、溶出緩衝液は１００から２００ｍＭのリン酸ナトリウムを含み得、別の実施形態においては、１５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含み得る。溶出緩衝液のｐＨは６．４から７．６の範囲であり得る。一実施形態において、ｐＨは６．５から７．３であり得、別の実施形態においては、ｐＨは７．２であり得、別の実施形態においてはｐＨは６．８であり得る。溶出緩衝液は、カラムからのＶＬＰの溶出のために、連続的または段階的な勾配で変化させることができる。緩衝液の構成要素は、当業者の知識に従って調節することができる。
結合モード、流入モードの両方、およびその組合において、固相マトリックスは場合により、ＶＬＰの溶出または流入の後に、清掃、すなわち、剥離および再生され得る。この手順は典型的には、固相の表面上での不純物の蓄積を最小化するため、および／またはマトリックスを滅菌して微生物による生成物の汚染を避けるために定期的に行われる。
特定の実施形態において、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー段階をまず行い、疎水性相互作用クロマトグラフィー段階を２番目に行い、陰イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー段階を３番目に行う。
ＶＬＰは通常、ヒドロキシアパタイト段階から、結合画分、流入画分、またはその組合に回収される。実施例１に記載するように、次に、このような画分の塩濃度およびｐＨを、疎水性相互作用カラムでの精製のため、またはあらゆる他の適切なアフィニティーカラムでの精製のために調節し得る。この方法に従って、プールしたＶＬＰに硫酸アンモニウムを８％ｗ／ｖの最終濃度まで添加し、全ての硫酸アンモニウムが溶解するまで試料を攪拌する。２５０ｍＬのＨＩＣ樹脂を含むカラムを、５ＣＶの１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２．４Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．８）、およびＶＬＰ懸濁液を添加して平衡する。安定なベースラインが見られるまでカラムを約３ＣＶの緩衝液Ｃで洗浄し、次に、１０ＣＶの７０％の１００ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）で洗浄する。ＶＬＰは、１５０ｍＭのリン酸塩でカラムから溶出することができる。
クロマトグラフィー媒質の順序は、ＶＬＰ粒子の最終的な精製には重要ではないと考えられることに注意されたい。また、試料をさらに精製するために、サイズ排除クロマトグラフィーを場合により用いることができる。このような組合を用いて得られる収量は、個別のカラム精製段階を用いて得られる収量に基づいて予測することができる。
ＨＩＣカラムから溶出されたＶＬＰは、所望により追加のサイズ排除精製段階に付すことができる。本発明の一実施形態において、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとＨＩＣクロマトグラフィーとの組合により精製された溶出物を、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。
本発明のあらゆるまたは全てのクロマトグラフィー段階は、あらゆる機械的手段によって実施することができる。クロマトグラフィーはカラム内で実施し得る。カラムは、圧力のある状態またはない状態で、頂部から底部または底部から頂部へ流すことができる。カラムにおける流体の流れの方向は、クロマトグラフィープロセスの間に逆転し得る。クロマトグラフィーはまた、重力、遠心分離、または濾過を含むあらゆる適切な手段によって、試料の添加、洗浄、および溶出に用いる液体から固体支持体が離れている、バッチプロセスを用いて実施することができる。クロマトグラフィーはまた、試料を、試料内のいくつかの分子を他のものよりも強く吸着または保持するフィルターと接触させることによって、実施することができる。
最後に、陰イオン交換カラムから得た溶出液を、ダイアフィルターまたは接線方向のフローフィルターを通して濾過し、濾液を濃縮することができる。
追加の任意の段階
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ＶＬＰの分離のために共に用いることが可能であることが発見されているが、上述したように、本発明の精製方法は、他のタンパク質精製技術と組み合わせて用いることができる。本発明の一実施形態において、ヒドロキシアパタイト段階の前の１つまたは複数の段階が、混入物質または不純物の添加負荷を減少させるために望ましい場合がある。本発明の別の実施形態において、疎水性相互作用段階の後の１つまたは複数の精製段階が、さらなる混入物質または不純物を除去するために望ましい場合がある。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ＶＬＰの分離のために共に用いることが可能であることが発見されているが、上述したように、本発明の精製方法は、他のタンパク質精製技術と組み合わせて用いることができる。本発明の一実施形態において、ヒドロキシアパタイト段階の前の１つまたは複数の段階が、混入物質または不純物の添加負荷を減少させるために望ましい場合がある。本発明の別の実施形態において、疎水性相互作用段階の後の１つまたは複数の精製段階が、さらなる混入物質または不純物を除去するために望ましい場合がある。
記載されるヒドロキシアパタイト精製手順は、場合により、限定はしないが、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外濾過、ウイルス除去濾過、および／またはイオン交換クロマトグラフィーを含む、他の精製段階と組み合わせることができる。
さらなる精製方法は、濾過、沈殿、蒸発、蒸留、乾燥、ガス吸収、溶媒抽出、加圧抽出、吸着、結晶化、および遠心分離を含み得る。他の精製方法は、バッチクロマトグラフィーまたはカラムクロマトグラフィーを用いる、本発明に従ったさらなるクロマトグラフィーを含み得る。加えて、さらなる精製は、前記のあらゆるものの組合、例えば異なる方法のクロマトグラフィーの組合、クロマトグラフィーと濾過との組合、クロマトグラフィーと沈殿との組合、または膜処理と乾燥との組合を含み得る。
ＶＬＰの溶出は、光学密度、透過型電子顕微鏡法、または光散乱を含む、当技術分野で既知の技術によってモニターすることができる。さらに、精製前後のＶＬＰの生物学的特性は、良く確立されたアッセイを用いて決定することができる。より具体的には、ＶＬＰの純度および同一性は、還元性および非還元性のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、キャピラリー電気泳動、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、または円二色性を含む、様々な分析法を用いて測定することができる。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態の実証に含まれる。当業者は、本開示に照らして、特定の実施形態において多くの変更がなされ得ることを理解し、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様の結果を得るであろう。
ノロウイルス遺伝子群Ｉウイルスの精製
方法の概要
精製プロセスは３つのクロマトグラフィー段階からなる。段階は、高度に精製されたＶＬＰを生成する、拡張性のあるプロセスをもたらす、直交的メカニズムを用いる。精製の最初の段階は、Ｂｉｏ−Ｒａｄヒドロキシアパタイト（CHT）樹脂を用いる捕捉段階である。ＣＨＴ段階ではノーウォークのＶＬＰを濃縮し、媒質の構成要素を除去し、生成物をリン酸緩衝液に交換する。図１に示すように、硫酸アンモニウムの添加の後、メチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）により精製の大部分が得られる。３番目のクロマトグラフィー段階は、流入モードで実施されるＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーである。用いた条件の下では、ＮｏｗａｌｋのＶＬＰはカラムに結合せず、残った混入物質（エンドトキシン、核酸、およびタンパク質）が保持される。精製プロセスにおける最後の段階は、注入のためにリン酸緩衝液を水で置き換える限外濾過である。バルク薬物材料（NorwalkのVLP）を０．５から１．５ｍｇ／ｍＬの懸濁液として２〜８℃で保存する。
方法の概要
精製プロセスは３つのクロマトグラフィー段階からなる。段階は、高度に精製されたＶＬＰを生成する、拡張性のあるプロセスをもたらす、直交的メカニズムを用いる。精製の最初の段階は、Ｂｉｏ−Ｒａｄヒドロキシアパタイト（CHT）樹脂を用いる捕捉段階である。ＣＨＴ段階ではノーウォークのＶＬＰを濃縮し、媒質の構成要素を除去し、生成物をリン酸緩衝液に交換する。図１に示すように、硫酸アンモニウムの添加の後、メチル疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）により精製の大部分が得られる。３番目のクロマトグラフィー段階は、流入モードで実施されるＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーである。用いた条件の下では、ＮｏｗａｌｋのＶＬＰはカラムに結合せず、残った混入物質（エンドトキシン、核酸、およびタンパク質）が保持される。精製プロセスにおける最後の段階は、注入のためにリン酸緩衝液を水で置き換える限外濾過である。バルク薬物材料（NorwalkのVLP）を０．５から１．５ｍｇ／ｍＬの懸濁液として２〜８℃で保存する。
クロマトグラフィー精製したＶＬＰに対する複数の試験によって、クロマトグラフィー精製したＶＬＰと超遠心分離精製したＶＬＰとの間で何らかの差異があるかどうかを決定することができる。これらの方法は、透過型電子顕微鏡法、ならびに、円二色性スペクトル、動的光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーによる、融点を含む物理的／化学的特徴付けを含む。クロマトグラフィー精製の手順を以下に概説する。精製プロセスは、あらゆる規模に標準化することができる。列挙する線形的な流速は、カラム直径に応じたものである。
ＶＬＰの精製
１５Ｌの発酵により１０Ｌの調整媒質が生じる。以下に記載する精製プロセスは、５Ｌを扱うために設計されたものである。１０Ｌ全体を精製するためには、５Ｌのそれぞれを用いる２回の作業を２週間の期間にわたって実施する。
１５Ｌの発酵により１０Ｌの調整媒質が生じる。以下に記載する精製プロセスは、５Ｌを扱うために設計されたものである。１０Ｌ全体を精製するためには、５Ｌのそれぞれを用いる２回の作業を２週間の期間にわたって実施する。
ＨＡカラムクロマトグラフィー：５リットルの培養上清を、５００ｍＬのヒドロキシアパタイト（Bio-Rad、CHT）樹脂を充填したカラムに添加し、１０カラム容量の５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ａ）を８０ｍＬ／分の流速で通して平衡する。培養上清をカラムに添加し、２カラム容量（CV）の緩衝液Ａで洗浄する。１５０ｍＭのリン酸塩（緩衝液Ｂ）を用いてノーウォークのＶＬＰをＣＨＴカラムから溶出する。ノーウォークのＶＬＰは、緩衝液Ｂにおける単一のピークオフとして溶出する。画分（それぞれ１ＣＶ）をクロマトグラフィーの実施の間に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。ＶＬＰを含む画分を精製における次の段階のためにプールする。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー画分のクマシー染色を伴ったＳＤＳ−ＰＡＧＥを図２に示す。ノーウォークのＶＬＰの大部分が、１００％の緩衝液Ｂで４つの溶出カラム容量画分において溶出している。これらのプールされた画分を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）精製段階２に用いた。
ＨＩＣカラムクロマトグラフィー：ＣＨＴクロマトグラフィー段階から得た、プールしたＶＬＰ画分に、固体の硫酸アンモニウムを８％ｗ／ｖの最終濃度まで添加し、試料を、全ての硫酸アンモニウムが溶解するまで攪拌する。硫酸アンモニウムを添加すると、ＢｉｏＲａｄメチルＨＩＣ樹脂へのタンパク質の吸着が容易になる。２５０ｍＬのＨＩＣ樹脂を含むカラムを、５ＣＶの１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２．４Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ６．８）（緩衝液Ｃ）、およびＶＬＰ懸濁液を添加して平衡する。安定なベースラインが見られるまでカラムを約３ＣＶの緩衝液Ｃで洗浄し、次に、１０ＣＶの７０％の１００ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．８）（緩衝液Ｄ）で洗浄する。ＨＩＣカラムから得たＶＬＰは、３ＣＶから４ＣＶの１００％緩衝液Ｂ内に溶出する。溶出の間に２５０ｍＬ（１ＣＶ）の画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。ＶＬＰを含む画分をプールし、ＤＥＡＥクロマトグラフィー段階において用いる。ＨＩＣカラム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色を図３に示す。
ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー：メチルＨＩＣカラムから部分的に精製されたＶＬＰを含む、プールした画分を、２７０ｍＬのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂を充填したカラムに直接添加する。リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を４０ｍＬ／分の流速で送り込み、空いている空間にＶＬＰが溶出するようにする（流入）。混入タンパク質は樹脂と相互作用し、クロマトグラフィーの後半に溶出する。画分（それぞれ１／４ＣＶ）を、サンプルの添加の際に、ＵＶ検出器のシグナルがベースラインを超えたらすぐに回収する。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＶＬＰを含む画分をダイアフィルトレーションによる緩衝液交換のためにプールする。ＤＥＡＥカラム画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色を図４に示す。
ダイアフィルトレーション：最後の精製段階において、ＤＥＡＥカラムから溶出したノーウォークのＶＬＰをダイアフィルトレートし、濃縮する。この手順は、浄化した攪拌細胞ダイアフィルトレーション装置内にＶＬＰを置くことを伴う。液体の容量を５０％減らし、注入する水を増やして元の容量まで戻す。このプロセスを全部で１０回反復した。未透過物は、ダイアフィルトレートしたノーウォークのＶＬＰを含む。次に、この物質を、最後の無菌濾過プロセスに付す。アリコートをＱＣ試験および放出のために採取する。ダイアフィルトレーション画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色を図５に示す。
ＶＬＰ含有量：精製にわたって、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ＶＬＰを含む画分の同定に用いる。精製の間、同一のゲル上を移動するＶＬＰ参照物質と同様の分子量でバンドが移動することが確認された場合は、画分はＶＬＰを含むと仮定される。ＶＬＰのバンドがＶＬＰ標準の強度と等しいかまたはそれより大きい強度を有している画分のみをプールする。
タンパク質濃度：プロセスの過程のタンパク質の濃度（限外濾過段階）を、タンパク質とのビシンコニン酸の反応に基づく発色アッセイによって決定する。試験試薬はＰｉｅｒｃｅから入手する。
上述した方法によりクロマトグラフィー精製されたノーウォークウイルスＶＬＰの特徴を表１に示す。クロマトグラフィー精製したノーウォークウイルスＶＬＰをまた、透過型電子顕微鏡法（TEM）およびＣＤスペクトルを用いて、超遠心分離法によって精製したＶＬＰと比較した。結果を図６〜１３に示す。
ノロウイルス遺伝子群ＩＩウイルスの精製
方法の概要
ヒューストンの精製プロセスもまた、高度に精製されたＶＬＰを生成する、拡張性のあるプロセスをもたらす、直行のメカニズムを用いる。ＨＡ、ＨＩＣ、および陰イオン交換を用いるノーウォークの精製プロセスとは対照的に、本発明者らは、２つのカラムプロセスが遺伝子群ＩＩ．４ヒューストンウイルスＶＬＰに良好に作用することを見出す。
方法の概要
ヒューストンの精製プロセスもまた、高度に精製されたＶＬＰを生成する、拡張性のあるプロセスをもたらす、直行のメカニズムを用いる。ＨＡ、ＨＩＣ、および陰イオン交換を用いるノーウォークの精製プロセスとは対照的に、本発明者らは、２つのカラムプロセスが遺伝子群ＩＩ．４ヒューストンウイルスＶＬＰに良好に作用することを見出す。
ヒューストンＶＬＰを精製するために、ＶＬＰを含む調整媒質を濾過または遠心分離によって清澄化し、２０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡した陽イオン交換ＳＰ ＦＦ樹脂に添加する。２０％の溶出緩衝液（２０ｍＭのクエン酸リン酸、１Ｍの塩化ナトリウム）での洗浄の後、ＶＬＰを段階的な勾配および１００％溶出緩衝液を用いて溶出する。
ヒューストンＶＬＰを含む陽イオン交換カラムから得た画分をプールし、１５％（w/v）硫酸アンモニウムを添加してイオン強度を調節する。次に、このプールした物質を、メチルＨＩＣ樹脂、および２．４Ｍの硫酸アンモニウムを含むｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）（緩衝液Ａ）を含むカラムに添加する。添加の後、３段階の勾配溶出を用いて、ＨＩＣ樹脂からＶＬＰを溶出する。最初の段階において、４０％の溶出緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム）を用いて汚染物資を溶出する。次に、ＶＬＰが溶出する７０％溶出緩衝液まで勾配を段階的に上げ、最終的に勾配を１００％溶出緩衝液に調節して、完全な溶出を確実にし、あらゆる残りの混入物質を溶出させる。次に、７０％溶出緩衝液におけるメチルＨＩＣクロマトグラフィーから得たＶＬＰを含む溶出ピークを、２０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液および１５０ｍＭの塩化ナトリウム内に、ｐＨ６．０まで透析する。
小規模な生成のランに基づき、このプロセスにより、２００および５００ｍＬのスピナーフラスコから５から１５ｍｇの精製ＶＬＰが得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９０％超のＶＬＰ純度が得られる。
表２は、遺伝子群ＩＩのノロウイルス、ヒューストンウイルスについてのこの精製プロセスをまとめたものである。図１４および１５は、陽イオン交換段階で得られた結果を示し、一方、図１６および１７は、メチルＨＩＣクロマトグラフィー段階で得られた結果を示す。図１８および１９は、精製ヒューストンウイルスタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ−ＳＥＣを示す。
表２に概説したプロセスに加え、本発明者らは、脱イオン水の添加を介して調節媒質のイオン強度を低下させることにより、ヒューストンＶＬＰを選択的に沈殿させることができた。沈殿プロセスにより容積が迅速に減少するため、このことにより顕著な利点が得られる。沈殿すれば、ＶＬＰは遠心分離または濾過を用いて分離することができる。次に、沈殿したＶＬＰを適切な緩衝液内に再懸濁し、上記のクロマトグラフィー法を用いてさらに精製する。本発明者らは、これらのクロマトグラフィー技術の少なくとも２つ、そしておそらく３つ全てを用いる、拡張性のある精製方法の開発を構想する。この精製の開発の目的は、超遠心分離を介して通常生成されるＶＬＰと質が等しく、かつ、ヒューストンＶＬＰの商用的製造のために大規模で生成することができる機能的なＶＬＰを提供するための精製スキームを得ることである。
上記に示した予備データは、クロマトグラフィー法がヒューストンウイルスＶＬＰの精製に有用であることを示す。ＶＬＰは、いくつかの樹脂に結合し、また適切な緩衝液で溶出され得ることが示された。開発における次なる段階は、より純度の高い生成物を生成するためにこれらのクロマトグラフィーを用いる組合および順序を決定することである。また、ＶＬＰの最大収量を得るためにこれらのクロマトグラフィー技術に必要な修飾を決定するために、追加の実験を行う。最終決定された方法は次に、ヒューストンウイルスＶＬＰの大規模な生成および精製において用いられる。
硫酸アンモニウム沈殿によるＧ．ＩＩのＶＬＰの精製
部分的に精製されたヒューストンＶＬＰ調製物を、１ｍＬのアリコートに分けた。硫酸アンモニウムをそれぞれのアリコートに添加して、１０％から３５％（w/v）の最終濃度とした。試料を回転器内に置き、４℃で一晩、回転させて混合した。沈殿の兆候について、試料を視覚的に検査した。２０μＬのアリコートを取り出し、「Ａｍｍ懸濁液」とラベル表示した。硫酸アンモニウム緩衝液を１４０００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。得られた上清を取り出し、「Ａｍｍ Ｓｕｐｔ」とラベル表示した。沈殿したペレットをクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）内に溶解し、回転器内に置き、４℃で２時間、回転させて混合した。試料を１４０００×ｇで１０分間、遠心分離した。得られた上清を取り出し、「クエン酸 ｓｕｐｔ」とラベル表示した。図２０は、精製プロセスにわたって異なる時点で採取した試料の、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。「クエン酸 ｓｕｐｔ」レーンの２つのバンドは、精製ヒューストンＶＬＰを反映している。
部分的に精製されたヒューストンＶＬＰ調製物を、１ｍＬのアリコートに分けた。硫酸アンモニウムをそれぞれのアリコートに添加して、１０％から３５％（w/v）の最終濃度とした。試料を回転器内に置き、４℃で一晩、回転させて混合した。沈殿の兆候について、試料を視覚的に検査した。２０μＬのアリコートを取り出し、「Ａｍｍ懸濁液」とラベル表示した。硫酸アンモニウム緩衝液を１４０００×ｇで１０分間、室温で遠心分離した。得られた上清を取り出し、「Ａｍｍ Ｓｕｐｔ」とラベル表示した。沈殿したペレットをクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）内に溶解し、回転器内に置き、４℃で２時間、回転させて混合した。試料を１４０００×ｇで１０分間、遠心分離した。得られた上清を取り出し、「クエン酸 ｓｕｐｔ」とラベル表示した。図２０は、精製プロセスにわたって異なる時点で採取した試料の、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。「クエン酸 ｓｕｐｔ」レーンの２つのバンドは、精製ヒューストンＶＬＰを反映している。
図２１に示すように、硫酸アンモニウム沈殿段階は、ＶＬＰの純度を顕著に向上させた。ＶＬＰタンパク質に対する宿主細胞タンパク質（HCP）のパーセンテージは、硫酸アンモニウム沈殿の結果では約半分減少した。
沈殿とその後に行う第四級アミン（Q）クロマトグラフィーによるノロウイルス遺伝子群ＩＩのＶＬＰの精製
ヒューストンＶＬＰの精製プロセス
ＳＦ９細胞の１リットルの懸濁培養物を、１．７×１０７個細胞／ｍＬの密度まで増殖させ、ヒューストンＶＰ１配列をコードする組換えバキュロウイルスストックで０．５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩ（感染多重度）で感染させた。感染は、２０％未満の生存率となることを可能にするものであった（図２２、レーン２）。ヒューストンＶＬＰを以下の方法で採取し、精製し、遠心分離した。ＶＬＰを沈殿させるために、培養物のｐＨを、ＨＣｌを用いて５．５まで下げた（レーン３）。次に、ｐＨ５．５の培養物を１０００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。上清（レーン４）をデカンテーションし、廃棄した。次に、残りのペレットを、２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ内に、ｐＨ８で再懸濁した（レーン５）。次に、再懸濁したペレットを、１０００×ｇで５分間、遠心分離した。上清をデカンテーションし、「ヒューストンＶＬＰ抽出物」とラベル表示した（レーン６）。沈殿プロセスにより、レーン２の開始物質で見られる複数のバンドと比較して、レーン６の単一のバンドにより示されるように、純度が顕著に向上した（図２２）。
ヒューストンＶＬＰの精製プロセス
ＳＦ９細胞の１リットルの懸濁培養物を、１．７×１０７個細胞／ｍＬの密度まで増殖させ、ヒューストンＶＰ１配列をコードする組換えバキュロウイルスストックで０．５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩ（感染多重度）で感染させた。感染は、２０％未満の生存率となることを可能にするものであった（図２２、レーン２）。ヒューストンＶＬＰを以下の方法で採取し、精製し、遠心分離した。ＶＬＰを沈殿させるために、培養物のｐＨを、ＨＣｌを用いて５．５まで下げた（レーン３）。次に、ｐＨ５．５の培養物を１０００×ｇで５分間、室温で遠心分離した。上清（レーン４）をデカンテーションし、廃棄した。次に、残りのペレットを、２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ内に、ｐＨ８で再懸濁した（レーン５）。次に、再懸濁したペレットを、１０００×ｇで５分間、遠心分離した。上清をデカンテーションし、「ヒューストンＶＬＰ抽出物」とラベル表示した（レーン６）。沈殿プロセスにより、レーン２の開始物質で見られる複数のバンドと比較して、レーン６の単一のバンドにより示されるように、純度が顕著に向上した（図２２）。
採取の後、ヒューストンＶＬＰの抽出物を水で１：２に希釈し、Ｑ１００膜上に添加した。移動相緩衝液は２０ｍＭのトリス（ｐＨ６．５）であり、溶出緩衝液は２０ｍＭのトリス、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）であった。添加の後、カラムを２０％溶出緩衝液で洗浄し（図２２、レーン７）、その後、５０％溶出緩衝液で洗浄した（レーン８）。図２２に示す銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ヒューストンＶＬＰがこのキャプチャークロマトグラフィー段階によって濃縮されていることを示す（レーン８とレーン２とを比較されたい）。
ローレンスＶＬＰの精製プロセス
ヒューストンＶＬＰについて上記に概説したＶＬＰの採取プロセスを、ＧＩＩ．４ローレンスウイルスから得たＶＰ１配列をコードする組換えバキュロウイルスストックに感染したＳＦ９培養物に適用し、ローレンスＶＬＰ抽出物を得た（図２３、レーン１１）。再懸濁したペレットを水で１：２に希釈し、Ｑ１００膜上に添加した。移動相緩衝液は２０ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）であり、溶出緩衝液は２０ｍＭのトリス、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．８）であった。図２３のレーン２から１０は、Ｑ１００膜からの段階的な勾配溶出にわたって回収された画分を示す。ＶＬＰは４０％溶出緩衝液画分内に溶出した（レーン５〜８）。ヒューストンで見られたように、ローレンスＶＬＰは、ｐＨ調節およびキャプチャークロマトグラフィーを用いて精製および濃縮し得る。
ヒューストンＶＬＰについて上記に概説したＶＬＰの採取プロセスを、ＧＩＩ．４ローレンスウイルスから得たＶＰ１配列をコードする組換えバキュロウイルスストックに感染したＳＦ９培養物に適用し、ローレンスＶＬＰ抽出物を得た（図２３、レーン１１）。再懸濁したペレットを水で１：２に希釈し、Ｑ１００膜上に添加した。移動相緩衝液は２０ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）であり、溶出緩衝液は２０ｍＭのトリス、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．８）であった。図２３のレーン２から１０は、Ｑ１００膜からの段階的な勾配溶出にわたって回収された画分を示す。ＶＬＰは４０％溶出緩衝液画分内に溶出した（レーン５〜８）。ヒューストンで見られたように、ローレンスＶＬＰは、ｐＨ調節およびキャプチャークロマトグラフィーを用いて精製および濃縮し得る。
ノロウイルスＧＩおよびＧＩＩのＶＬＰ構造におけるｐＨ依存性の電荷
ＶＬＰ精製手順をさらに最適化するために、ノロウイルスＧＩおよびＧＩＩ株から得られたＶＬＰの安定性を、約ｐＨ２から約ｐＨ１０のｐＨ範囲に暴露した。
ＶＬＰ精製手順をさらに最適化するために、ノロウイルスＧＩおよびＧＩＩ株から得られたＶＬＰの安定性を、約ｐＨ２から約ｐＨ１０のｐＨ範囲に暴露した。
インタクトなＶＬＰは約１０ＭＤａの質量である。特定のｐＨ条件に暴露し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）によって分析したインタクトなＶＬＰは、球形タンパク質のサイズ標準に関して、約２２０ｋＤａの質量を有する安定な中間断片への変化を示す。完全な変性を生じさせる条件により、約６０ｋＤａの単量体への中間断片のさらなる分解が生じる。ノロウイルスＶＬＰがインタクトのままであり続けるｐＨ範囲をさらに調査するために、ノロウイルスＧＩのＶＬＰまたはノロウイルスＧＩＩのＶＬＰを含む溶液のｐＨを、約２から約１０まで上げながら調節し、その後、ＳＥ−ＨＰＬＣで分析した。さらに、ＳＥ−ＨＰＬＣカラム緩衝液を分析のために同一のｐＨに調節した。
ｐＨ２（図２４Ａ）からｐＨ８（図２４Ｂ）の範囲のｐＨ条件に暴露したノロウイルスＧＩのＶＬＰは、約１７分に、インタクトな単分散ＶＬＰを意味する単一の吸光ピークを示す。ｐＨ８．５に暴露されたＶＬＰ（図２４Ｃ）は、約３３分に、より安定度の低い中間ＶＬＰ断片を意味する吸光ピークを示す。これらの結果は、ノロウイルスＧＩのＶＬＰがｐＨ２から８ではインタクトなままであり、ｐＨ８から８．５では安定な中間断片に分解することを示す。
ｐＨ２（図２５Ａ）からｐＨ９．５（図２５Ｂ）の範囲のｐＨ条件に暴露したノロウイルスＧＩＩのＶＬＰは、約１７分に単一の吸光ピークを示し、一方、ｐＨ１０（図２５Ｃ）に暴露したＶＬＰは、約３４分に単一の吸光ピークを示す。したがって、これらの結果は、ノロウイルスＧＩＩのＶＬＰがｐＨ２から９．５の範囲にわたってインタクトなままであり、ｐＨ９．５から１０では安定な中間断片に分解することを示す。
これらの実験の所見により、当業者は、ＶＬＰを含む溶液のｐＨを調節することにより、インタクトなＶＬＰまたはその断片が生じる条件を選択することが可能となる。このような条件により、精製プロセスが容易となり得る。
ポリエチレングリコール（PEG）を用いたＶＬＰタンパク質の沈殿
塩の添加によるＶＬＰの沈殿で見られた方法（実施例３）と同様の方法で、ＶＬＰの選択的な沈殿および可溶化をもたらすためにポリエチレングリコールなどの他の添加剤を用いることによって、同様の結果が生じ得る。
塩の添加によるＶＬＰの沈殿で見られた方法（実施例３）と同様の方法で、ＶＬＰの選択的な沈殿および可溶化をもたらすためにポリエチレングリコールなどの他の添加剤を用いることによって、同様の結果が生じ得る。
ポリエチレングリコール（PEG）の質量および濃度の最適な濃縮を決定するために、２００から２００００の範囲の分子量を有するＰＥＧを、ＶＬＰを含む溶液に、５％ずつの増大で０から５０％ＰＥＧの最終ＰＥＧ濃度となる量で添加する。各５％ＰＥＧの添加の後、ＶＬＰ含有溶液を１００００ｇで遠心分離し、上清の試料を得る。上清の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、および／またはＨＰＬＣ分析に付し、ＶＬＰの純度および総濃度を評価する。
ＶＬＰは最初、上清において見られる。ＰＥＧ濃度が増大すると、ＶＬＰおよび混入タンパク質は様々な程度に沈殿する。ペレットを観察する場合、上清をデカンテーションすることでペレットを回収する。ペレットを緩衝液内に再懸濁し、ＶＬＰの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。再懸濁したペレット内の総ＶＬＰ含有量をＥＬＩＳＡまたはＨＰＬＣにより評価する。ＰＥＧの質量および濃度に対する上清およびペレットの相対的純度の表またはグラフを準備する。最適なＰＥＧ質量およびＰＥＧ濃度の組合を、許容可能な収容または生成物の回収を伴った最高純度が得られる条件に基づいて選択する。
Claims (17)
- 多段階クロマトグラフィープロセスを用いてカリシウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製する方法であって、
（ａ）前記ＶＬＰを含む細胞溶解物または培養上清をイオン交換クロマトグラフィー材料と接触させる工程であって、前記ＶＬＰは前記イオン交換クロマトグラフィー材料に結合する、工程と、
（ｂ）前記イオン交換クロマトグラフィーから溶出された前記ＶＬＰを、疎水性相互作用材料と接触させる工程であって、前記ＶＬＰは前記疎水性相互作用材料に結合する、工程と、
（ｃ）前記疎水性相互作用材料から前記ＶＬＰを溶出させる工程であって、前記ＶＬＰは約７０％超に精製される、工程と、
を含む方法。 - 前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料がメチルＨＩＣ樹脂である、請求項１に記載の方法。
- ＶＬＰが保持され、混入物質が前記疎水性相互作用材料を通過するように、工程（ｂ）におけるＶＬＰを含む溶液のイオン強度が調節される、請求項１に記載の方法。
- 前記イオン強度が硫酸アンモニウムの添加によって調節される、請求項３に記載の方法。
- 工程（ｃ）からの前記溶出液を、１以上のさらなる精製工程に供する、請求項１に記載の方法。
- 前記１以上のさらなる精製工程が、濾過、沈殿、蒸発、蒸留、乾燥、ガス吸収、溶媒抽出、加圧抽出、吸着、結晶化、遠心分離、クロマトグラフィー、及びこれらの組合せからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
- 前記組合せが、クロマトグラフィーと濾過の組合せである、請求項６に記載の方法。
- 前記ＶＬＰは約９０％超に精製される、請求項１に記載の方法。
- 前記カリシウイルスのＶＬＰはノロウイルスのＶＬＰである、請求項１に記載の方法。
- 前記ノロウイルスのＶＬＰはノロウイルス遺伝子群ＩのＶＬＰである、請求項９に記載の方法。
- 前記細胞溶解物または前記培養上清は、組換え法を用いて生成される、請求項１に記載の方法。
- 前記ＶＬＰは、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞において生成される、請求項１１に記載の方法。
- 宿主細胞ＤＮＡ含有量の混入物質レベルが１％未満である、請求項１に記載の方法。
- 宿主細胞タンパク質含有量の混入物質レベルが５％未満である、請求項１に記載の方法。
- 請求項１の方法によって調製された前記ＶＬＰを含むワクチン。
- 前記イオン交換クロマトグラフィー材料は、陽イオン交換体を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィー材料は、陰イオン交換体を含む、請求項１に記載の方法。
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