ES2559421T3

ES2559421T3 - Purificación de partículas similares a virus

Info

Publication number: ES2559421T3
Application number: ES08782762.2T
Authority: ES
Inventors: Thomas S. Vedvick; Bryan Steadman; Charles Richardson; Thomas R. Foubert; Charles R. Petrie
Original assignee: Takeda Vaccines Inc
Current assignee: Takeda Vaccines Inc
Priority date: 2007-03-14
Filing date: 2008-03-14
Publication date: 2016-02-12
Anticipated expiration: 2028-03-14
Also published as: US9359410B2; JP2019068846A; WO2008113011A2; AU2008224877A1; SG10201701988TA; KR20170001720A; EP2134360A4; PL2134360T3; US10172930B2; JP5284290B2; CA2683977C; JP2017086090A; US8481693B2; US20130344107A1; JP2010530734A; KR20150098681A; US20100150961A1; US20190282686A1; CA2683977A1; EP2134360B1

Abstract

Un método para purificar partículas similares a virus (VLP) de Calicivirus usando un proceso cromatográfico de múltiples etapas, en el que el proceso cromatográfico de múltiples etapas utiliza más de un material cromatográfico y en el que una etapa del proceso comprende poner en contacto una solución que contiene VLP con una resina de interacción hidrófoba-metilo (HIC), en el que el proceso cromatográfico de múltiples etapas purifica dichas VLP hasta más de aproximadamente el 70 %.

Description

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cápsida de Calicivirus y que comprenden características antigénicas similares a aquellas de las partículas infecciosas de Calicivirus. Las VLP pueden ser cualquier proteína estructural en las que las proteínas estructurales están codificadas por una o más secuencia de ácido nucleico. Las VLP pueden incluir proteínas estructurales individuales, es decir, monómeros de proteína, o dímeros, o complejos de proteína formados espontáneamente tras

5 la purificación de proteínas estructurales recombinantes, es decir, autoensamblaje de VLP intactas, o VLP agregadas. Las VLP también pueden estar en forma de monómeros de cápsida, fragmentos de proteína o peptídicos de VLP o monómeros de cápsida, o agregados o mezclas de los mismos. Estos pueden producirse usando fragmentos de proteínas estructurales o formas mutadas de los mismos, por ejemplo, proteínas estructurales que se han modificado mediante la adición, sustitución o eliminación de uno o más aminoácidos. Las VLP son morfológicamente y antigénicamente similar a viriones auténticos. Las VLP pueden producirse in vivo, en células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, células de mamífero, levaduras, bacterianas, y de insecto hospedadoras.

La presente invención proporciona métodos para la purificación a gran escala de VLP recombinantes. Los métodos incluyen preparar una solución, un lisado celular o sobrenadante de cultivo a partir de la línea celular hospedadora y

15 después pasando el lisado o sobrenadante de cultivo sobre varias combinaciones de materiales o medio de cromatografía. La línea celular hospedadora puede cultivarse en placas de Petri, botellas rotatorias, un biorreactor, o usando otra técnica adecuada para cultivo celular a gran escala.

Un experto en la materia apreciará que en principio, pueden purificarse otras partículas similares a virus usando el proceso de la presente invención adaptando algunas de sus características según sea adecuado para la VLP que se esté purificando. Las VLP adecuadas son aquellas que se purifican fácilmente usando múltiples etapas cromatográficas en el proceso de purificación, materiales cromatográficos, tales como materiales de cromatografía de hidroxlapatita, interacción hidrófoba, intercambio iónico y exclusión por tamaño.

25 Una "célula bacteriana" se define en el presente documento como incluyente de células procariotas que pueden propagarse en cultivo. La célula bacteriana puede actuar como célula hospedadora para la expresión recombinante de proteínas heterólogas. La célula bacteriana puede transformarse, transfectarse o infectarse con un vector para la expresión de una secuencia de proteína insertada en el vector. Los ejemplos de células bacterianas adecuadas incluyen, pero sin limitación, E. coli, B. megaterium, B. subtilis y B. brevis y varias especies de Caulobacter, Staphylococcus,y Streptomyces.

Una "célula de levadura" se define en el presente documento como incluyente del grupo que consiste en organismos pequeños unicelulares capaces de crecer y reproducirse mediante gemación o división directa (fisión), o mediante crecimiento como filamentos irregulares individuales (micelio). La célula de levadura puede transformarse o

35 transfectarse con un vector heterólogo para la expresión de una secuencia de ácido nucleico insertada en el vector heterólogo. Un ejemplo de una célula de levadura incluye Saccharomyces cerevisiae, usado comúnmente para la transfección y expresión de proteínas heterólogas.

Un "cultivo celular de mamífero" se define en el presente documento como incluyente del grupo de células procedentes de una fuente de mamífero capaz de sobrevivir ex vivo en un medio de cultivo celular. La célula de mamífero puede ser una célula primaria, procedente directamente de una fuente celular de mamífero. Más normalmente, se inmortalizará la célula de mamífero en un cultivo celular de mamífero, es decir, capaz de crecer y dividirse a lo largo de un número indeterminado de pases o divisiones.

45 Una "célula de insecto" se define en el presente documento como incluyente del grupo de células procedente de una fuente de insecto capaz de sobrevivir ex vivo a partir de un hospedador de insecto. La célula de insecto puede transformarse, transfectarse o infectarse con un vector heterólogo para la expresión de una secuencia de proteína insertada en el vector heterólogo. Los ejemplos de células de insecto incluyen células High Five™, células de Aedes albopictus, células de Drosophila melanogaster, células de insecto Sf9 y células de Mamestra brassicae.

La "lisis" se refiere al proceso de apertura de células infectadas por virus por medios químicos, o físicos, o como parte del ciclo viral permitiendo de este modo la recogida de VLP.

Por "material cromatográfico poroso" se entiende virtualmente cualquier tipo de material usado comúnmente en la

55 separación de moléculas basadas principalmente en su tamaño, hidrofobicidad y carga. Tal como se ejemplifica en el presente documento, el "material cromatográfico poroso" incluye dextrano (por ejemplo, resinas Sephadex™), u otros materiales porosos que pueden estar compuestos por diversos materiales incluyendo agarosa, poliestireno, divinilbenceno, polimetacrilato, sílice, polímeros acrílicos alifáticos (por ejemplo, resinas Amberlite™), con diversas derivatizaciones superficiales (por ejemplo, hidrófilas, iónicas, hidrófobas, etc.).

Tal como se usa en el presente documento, el término "precipitación" se refiere al ajuste de las condiciones de disolución mediante la adición o retirada de sal, la adición de disolvente orgánico, la concentración de la solución que contiene proteína o el ajuste del pH, dando como resultado la precipitación selectiva de moléculas (VLP o contaminante). El material insoluble o precipitado se separa entonces del material soluble usando una serie de

65 técnicas, tales como centrifugación o filtración. "Cromatografía de hidroxiapatita" se refiere a un método para purificar proteínas que utiliza fosfato de calcio

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decreciente.

Las resinas cromatográficas porosas adecuadas para la cromatografía de exclusión por tamaño de virus pueden estar hechas de dextrano, y dextranos reticulados. Las usadas de manera más común son aquellas con el nombre

5 comercial "SEPHADEX" disponibles a través de Amersham Biosciences. El tipo de SEPHADEX, u otra resina cromatográfica de exclusión por tamaño usada va en función del tipo de VLP que se quiera purificar, y de la naturaleza del lisado de cultivo celular que contiene la VLP. También son adecuados otros soportes de exclusión por tamaño de diferentes materiales, por ejemplo, Toyopearl 55F (polimetacrilato, de Tosoh Bioscience, Montgomery Pa.) y Bio-Gel P-30 Fine (BioRad Laboratories, Hercules, Calif.).

Para la cromatografía de exclusión por tamaño se carga un grupo concentrado de VLP parcialmente purificadas sobre una columna que contiene una columna de cromatografía de exclusión por tamaño preparativa adecuada (tal como una columna que contiene resinas Sephadex G200 o Superpose 6) que se han equilibrado en un tampón adecuado (por ejemplo, un tampón fosfato).

15 La divulgación proporciona materiales cromatográficos que comprenden un intercambiador de iones. Un intercambiador de iones puede ser un intercambiador catiónico en el que el intercambiador catiónico comprende materiales cromatográficos derivatizados con sulfato, fosfato y carboxilato. El intercambiador iónico también puede ser un intercambiador aniónico, en el que el intercambiador aniónico comprende material cromatográfico cargado positivamente. El material cromatográfico cargado positivamente puede ser amina cuaternaria (Q) o dietilaminoetano (DEAE).

Material cromatográfico de intercambio aniónico

25 La cromatografía de intercambio aniónico usa un resto orgánico cargado positivamente reticulado covalentemente a un armazón polimérico inerte. Este último se usa como soporte para la resina. Los restos orgánicos representativos se extraen entre grupos de amina primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria; tales como trimetilaminoetilo (TMAE), dietilaminoetilo (DEAE), dimetilaminoetilo (DMAE), y otros grupos, tales como la polietilenimina (PEI) que ya tienen,

o tendrán, una carga positiva formal dentro del intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9.

Puede usarse una resina de intercambio aniónico que consiste en DMAE, TMAE, DEAE o grupos de amonio cuaternario. Una serie de resinas de intercambio aniónico vendidas con el nombre comercial Fractogel (Novagen) usan TMAE, DEAE, DMAE como resto cargado positivamente, y un fondo de copolímero de metacrilato. Las resinas que usan resinas de amonio cuaternario y las resinas de amonio cuaternario del tipo vendido con el nombre

35 comercial Q SOURCE-30 (Amersham Biosciences) también pueden usarse. Q SOURCE-30 tiene un soporte hecho de poliestireno reticulado con divinilbenceno.

Se conocen en la técnica varios medios de intercambio aniónico posibles que pueden usarse en dichas columnas, incluyendo resinas de amino o iminio N-cargadas, tales como POROS 50 PI™, Q SEPHAROSE™, cualquier DEAE, TMAE, amina terciaria o cuaternaria, o resina basada en PEI. Un experto en la materia apreciará que las VLP recombinantes pueden purificarse en una columna de intercambio aniónico bien antes o después de la purificación en otras columnas.

Las resinas cromatográficas de intercambio aniónico pueden usarse en aparatos de cromatografía en columna por

45 gravedad o de cromatografía líquida de alta presión usando flujo radial o axial, columnas de lecho fluido, o en una lechada, es decir, método por lotes. En el último método, la resina se separa de la muestra mediante decantación o centrifugación o filtración o una combinación de métodos.

El principio de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas se adsorben a intercambiadores iónicos de manera reversible de tal forma que las moléculas pueden unirse o eluirse cambiando el ambiente iónico. La separación en los intercambiadores iónicos se logra normalmente en dos etapas: en primer lugar, la sustancia que se va a separar se une al intercambiador, usando condiciones que dan unión estable y estrecha; después la sustancia se eluye con tampones de diferentes pH, o fuerza iónica, dependiendo de las propiedades de la sustancia que se esté purificando.

55 Más específicamente, y tal como puede aplicarse a la presente invención, el principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que la afinidad de una VLP para el intercambiador depende tanto de las propiedades eléctricas de la proteína, como de la afinidad relativa de otras sustancias cargadas en el disolvente. De este modo, las proteínas unidas pueden eluirse cargando el pH, alterando de este modo la carga de la proteína, o añadiendo materiales de competición, de los cuales las sales solo son un ejemplo. Debido a que las diferentes sustancias tienen diferentes propiedades eléctricas, las condiciones para la liberación varían con cada especie molecular unida. En general, para tener una buena separación, los métodos de elección son bien elución en gradiente de fuerza iónica continua o elución por etapas. Para un intercambiador aniónico, o bien se disminuye el pH y se aumenta la fuerza iónica o solo se aumenta la fuerza iónica. Para un intercambiador catiónico, pueden aumentarse tanto el pH

65 como la fuerza iónica. La elección real del procedimiento de elución es normalmente un resultado de ensayo y error y de consideraciones de estabilidad de las VLP que se estén purificando.

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Ejemplo 1. Purificación de virus del Genogrupo I de Norovirus

Descripción general del método

5 El proceso de purificación consiste en 3 etapas de cromatografía. Las etapas usan mecanismos ortogonales que dan como resultado procesos escalables que producen VLP altamente purificadas. La primera etapa de la purificación es una etapa de captura que usa resina de hidroxiapatita (CHT) de Bio-Rad. La etapa de CHT concentra las VLP de Norwalk, elimina los componentes del medio, e intercambia el producto a un tampón fosfato. Después de la adición de sulfato de amonio, la cromatografía de interacción hidrófoba de metilo (HIC) proporciona la mayoría de la purificación, tal como se muestra en la figura 1. La tercera etapa cromatográfica es una cromatografía de intercambio iónico de DEAE operada en modo de flujo. En las condiciones usadas, las VLP de Norwalk no se unen a la columna y se retienen los contaminantes residuales (endotoxina, ácido nucleico, y proteínas). La etapa final en el proceso de purificación es una ultrafiltración en donde el tampón fosfato se reemplaza por agua para inyección. La sustancia farmacológica en bruto (VLP de Norwalk) se almacena como una suspensión de 0,5 a 1,5 mg/ml a 2-8 °C.

15 Puede llevarse a cabo una serie de pruebas en las VLP purificadas cromatográficamente para determinar si hay alguna diferencia entre las VLP purificadas cromatográficamente y las VLP purificadas por ultrafiltración. Estos métodos incluyen microscopía electrónica de transmisión y caracterización fisicoquímica, incluyendo puntos de fusión mediante espectros de dicroísmo circular, dispersión de luz dinámica, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía líquida de alto rendimiento. Los procedimientos de purificación por cromatografía se indican generalmente a continuación. El proceso de purificación puede normalizarse para cualquier escala. Los caudales lineales listados son independientes del diámetro de columna.

Purificación de VLP

25 Una fermentación de 15 l produce 10 l de medio condicionado. El proceso de purificación descrito a continuación está diseñado para manipular 5 l. Para purificar los 10 l completos, se llevan a cabo 2 campañas usando 5 l con cada una durante un periodo de dos semanas.

Cromatografía en columna de HA: Se cargan cinco litros de sobrenadante de cultivo en una columna empaquetada con 500 ml de resina de hidroxiapatita (Bio-Rad, CHT), equilibrada pasando 10 volúmenes de columna de tampón de fosfato de sodio 5 mM (tampón A) con un caudal de 80 ml/min. El sobrenadante de cultivo se carga sobre la columna y se lava con dos volúmenes de columna (VC) de tampón A. Se usan 150 mM de fosfato (tampón B) para eluir las VLP de Norwalk de la columna CHT. Las VLP de Norwalk se eluyen como un solo pico en tampón B. Las fracciones

35 (1 VC cada una) se recogen durante el ciclo cromatográfico y se analizan mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contienen las VLP se agrupan para la siguiente etapa en la purificación. Las SDS-PAGE con tinción de Coomasie de las fracciones de cromatografía de hidroxiapatita se muestran en la figura 2. La mayoría de las VLP de Norwalk se eluyen en las 4 fracciones de volumen de columna eluido con el tampón B 100 %. Estas fracciones agrupadas se usaron para la etapa 2 de purificación de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).

Cromatografía en columna HIC: A las fracciones de VLP agrupadas de la etapa de cromatografía CHT, se les añade amonio sólido a una concentración final del 8 % p/v y se agita la muestra hasta que se disuelve todo el sulfato de amonio. La adición de sulfato de amonio facilita la adsorción de la proteína en la resina Methyl HIC de BioRad. Se equilibra

45 una columna que contiene 250 ml de resina HIC con cinco VC de fosfato de sodio 100 mM, sulfato de amonio 2,4 M pH 6,8 (tampón C) y se carga la suspensión de VLP. La columna se lava con aproximadamente tres VC de tampón C hasta que se observa un valor inicial estable y después se lava con 10 VC de fosfato 100 mM al 70 %, pH 6,8 (tampón D). Las VLP de la columna de HIC eluyen en tres a cuatro VC de tampón B al 100 %. Durante la elución se recogen fracciones de 250 ml (1 VC) y se analizan mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contienen VLP se agrupan y usan en la etapa cromatográfica de DEAE. La SDS-PAGE/tinción de Coomasie de fracciones de columna de HIC se muestra en la figura 3.

Cromatografía en columna de DEAE: Las fracciones agrupadas, que contienen las VLP parcialmente purificadas a partir de la columna de HIC metilo, se cargan directamente sobre una columna empaquetada con 270 ml de resina

55 DEAE Sephadex. Se bombea tampón fosfato a pH 6,5 a un caudal de 40 ml/min haciendo que las VLP eluyan en el volumen vacío (flujo a través). Las proteínas contaminantes interactúan con la resina y se eluyen posteriormente en la cromatografía. Las fracciones (1/4 VC cada una) se recogen tras la carga de la muestra y tan pronto como la señal del detector UV se eleva por encima del valor inicial. Las fracciones se analizan mediante SDS-PAGE y las fracciones que contienen VLP se agrupan para el intercambio de tampón mediante diafiltración. La SDSPAGE/tinción de Coomasie de fracciones de columna de DEAE se muestra en la figura 4.

Diafiltración: En la etapa de purificación final de VLP de Norwalk, que eluyen de la columna de DEAE, se diafiltran y concentran. Este procedimiento implica colocar las VLP en un aparato de diafiltración celular agitado higienizado. El volumen de líquido se reduce en un 50 % y se añade agua para inyección de nuevo al volumen original. Este

65 proceso se repitió un total de 10 veces. La parte retenida contiene las VLP de Norwalk diafiltradas. Este material se somete después a un proceso de esterilizado por filtración. Se extraen alícuotas para las pruebas de CC y su

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La tabla 2 resume este proceso de purificación para el Norovirus de genogrupo II, virus Houston. Las figuras 14 y 15 proporcionan los resultados de la etapa de intercambio catiónico, mientras que las figuras 16 y 17 proporcionan los resultados de la etapa de cromatografía de HIC metilo. Las figuras 18 y 19 proporcionan una SDS-PAGE y HPLC-SEC de la proteína de virus Houston purificada.

Tabla 2

Condiciones: MDI = 1

de cultivo: 3 x 106 células/ml se añade NaCl a 150 mM en el día 7 Se recoge el sobrenadante

Protocolo de: 1ª etapa: Resina SP FF de Tampón de equilibrado: citrato fosfato 20 mM, pH 4,0

purificación: intercambio catiónico Tampón de elución: citrato fosfato 20 mM, cloruro de sodio 1 mM, pH 4,0 Gradiente por etapas: 1ª etapa -lavado con tampón de elución al 20 %; 2ª etapa -lavado con tampón de elución al 100 %

2a etapa: Resina HIC metilo -el: Tampón de equilibrado: fosfato de sodio 100 mM, sulfato

material de partida contiene: de amonio 2,4 M, pH 6,8 Tampón de elución: fosfato de

sulfato de amonio al 15 %: sodio 100 mM pH 6,8 Muestra cargada con la adición de sulfato de amonio al 15 % (p/v). Gradiente por etapas: 1ª etapa -lavado con tampón de elución al 40 %; 2ª etapa -lavado con tampón de elución al 70 %; 3ª etapa -lavado con tampón de elución al 100 %.

3a etapa: Diálisis al tampón: Pico de elución obtenido mediante cromatografía HIC metilo con tampón de elución al 70 % dializado en tampón citrato fosfato 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6,0.

Rendimientos finales: 20-30 mg de proteína purificada/l

Además del proceso indicado en la tabla 2, ha sido posible precipitar de manera selectiva VLP de Houston

10 disminuyendo la fuerza iónica del medio condicionado mediante la adición de agua desionizada. Esto ofrece una ventaja significativa porque la rápida reducción de volumen proporcionó procesos de precipitación. Una vez precipitados, las VLP pueden separarse usando centrifugación o filtración. Las VLP precipitadas se resuspenden entonces en un tampón adecuado y se purifican adicionalmente usando los métodos cromatográficos descritos anteriormente. Se prevé el desarrollo de un método de purificación escalable usando al menos dos y posiblemente

15 las tres técnicas cromatográficas. El objetivo de este desarrollo de purificación podría ser obtener un esquema de purificación que podría proporcionar VLP funcionales que son idénticas en cuanto a calidad a las VLP producidas normalmente mediante ultracentrifugación y podrían producirse a gran escala para la fabricación comercial de las VLP de Houston. Los datos preliminares presentados anteriormente demuestran que los métodos cromatográficos podrían ser útiles

20 para la purificación de VLP del virus Houston. Se demostró que las VLP se unen a varis resinas y también podrían eluirse con los tampones adecuados. La etapa siguiente en el desarrollo sería determinar la combinación y orden en el que estas cromatografías se usarían para producir un producto más puro. Asimismo, se llevarán a cabo experimentos adicionales para determinar las modificaciones necesarias para estas técnicas cromatográficas para obtener el máximo rendimiento de las VLP. EL método finalizado se usaría entonces en la producción a gran escala

25 y purificación de VLP del virus Houston.

Ejemplo 3. Purificación de VLP de G.II mediante precipitación de sulfato de amonio

Se dividió una preparación parcialmente purificada de VLP en alícuotas de 1 ml. Se añadió sulfato de amonio a cada

30 alícuota para lograr una concentración final del 10 % al 35 % (p/v). Las muestras se colocaron en un rotador y se mezclaron de arriba a abajo a 4 °C durante toda la noche. Las muestras se inspeccionaron visualmente para signos de precipitación. Se extrajo una alícuota de 20 ml y se marcó como "Suspensión de am.". La suspensión de sulfato de amonio se centrifugó a 14.000 x g durante 10 min, a temperatura ambiente. Se extrajo el sobrenadante resultante y se marcó como "Sob. Am.". El sedimento precipitado se disolvió en un tampón citrato, pH 7,0, se colocó en un

35 rotador y se mezcló de arriba a abajo a 4 °C durante 2 h. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 min. El sobrenadante resultante se extrajo y se marcó como "Sob. Citrato". La figura 20 ilustra un gel de SDS-PAGE con tinción de planta de muestras tomadas en distintos momentos durante el proceso de purificación. Las dos bandas en el carril de "Sob. Citrato" reflejan las VLP de Houston purificadas. La etapa de precipitación de sulfato de amonio mejoró significativamente la pureza de las VLP tal como se muestra

40 en la figura 21. El porcentaje de proteína de célula hospedadora (HCP) a proteína de VLP se redujo en

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Claims

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