ES2545067T3 - Purificación de proteínas basada en la no afinidad - Google Patents

Abstract

Un método para purificar una proteína diana a partir de una mezcla que contiene una proteína de una célula hospedadora, que comprende someter dicha mezcla a: (a) una primera etapa de purificación de no afinidad, y (b) una segunda etapa de purificación de no afinidad, seguido de (c) filtración de flujo tangencial de alto rendimiento (FTTAR), y (d) aislar dicha proteína hasta una pureza que contiene menos de 100 partes por millón (ppm) de dicha proteína de la célula hospedadora, en el que dicha primera etapa de purificación de no afinidad es la cromatografía de intercambio catiónico y dicha segunda etapa de purificación de no afinidad es cromatografía de intercambio aniónico y en donde el método incluye una etapa de purificación de no afinidad.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

E03756162

11-08-2015

proteína de interés, de forma alternativa menos de 90 ppm, menos de 80 ppm, menos de 70 ppm, menos de 60 ppm, menos de 50 ppm, menos de 40 ppm, menos de 30 ppm, menos de 20 ppm, menos de 10 ppm, menos de 5 ppm, o menos de 3 ppm.

5 Los términos "proteína A" y "ProA" se utilizan indistintamente en el presente documento y abarca la Proteína A recuperada de una fuente nativa de la misma, la Proteína A producida por vías sintéticas (por ejemplo, mediante síntesis de péptidos o mediante técnicas recombinantes), y variantes de la misma que retienen la capacidad para unirse a proteínas que tienen una región CH2/CH3, tal como una región Fc. La proteína A se puede adquirir comercialmente de Repligen, Pharmacia y Fermatech. La proteína A es generalmente inmovilizada sobre un material de soporte de fase sólida. El término "ProA" también se refiere a una resina de cromatografía de afinidad o columna que contiene matriz sólida de soporte cromatográfica a la que está unida covalentemente la Proteína A.

El término "cromatografía" se refiere al proceso mediante el cual un soluto de interés en una mezcla se separa de otros solutos en una mezcla como resultado de diferencias en las velocidades a las que los solutos individuales de la

15 mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase móvil, o en procesos de unión y elución.

La expresión "cromatografía de afinidad" y "cromatografía de afinidad de proteínas" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una técnica de separación de proteínas en la que una proteína de interés o anticuerpo de interés se une de forma reversible y específicamente a un ligando bioespecífico. Preferentemente, el ligando bioespecífico está unido covalentemente a un material cromatográfico en fase sólida y es accesible a la proteína de interés en solución cuando la solución entra en contacto con el material en fase sólida cromatográfico. La proteína de interés (por ejemplo, anticuerpo, enzima, proteína receptora) retiene su afinidad de unión específica por el ligando bioespecífico (antígeno, sustrato, cofactor u hormona, por ejemplo) durante las etapas

25 cromatográficas, mientras que otros solutos y/o proteínas en la mezcla no se unen de forma apreciable o específica al ligando. La unión de la proteína de interés al ligando inmovilizado permite que las proteínas contaminantes o las impurezas proteicas atraviesen el medio cromatográfico, mientras que la proteína de interés permanece unida específicamente al ligando inmovilizado sobre el material en fase sólida. Después, la proteína de interés unida específicamente se retira en forma activa del ligando inmovilizado con un pH bajo, pH alto, concentración elevada de sal, ligando competidor, y similares, y atraviesa la columna cromatográfica con el tampón de elución, libre de las proteínas contaminantes o de las impurezas de proteínas que antes podían pasar a través de la columna. Se puede usar cualquier componente como un ligando para la purificación de su respectiva proteína de unión específica, por ejemplo anticuerpos.

35 Los términos "cromatografía de no afinidad" y "purificación de no afinidad" se refieren a un proceso de purificación en el que no se utiliza cromatografía de afinidad. La cromatografía de no afinidad incluye técnicas cromatográficas que se basan en interacciones no específicas entre una molécula de interés (tal como una proteína, por ejemplo, un anticuerpo) y una matriz en fase sólida.

La expresión "unión específica", como se usa en el presente documento, tal como para describir las interacciones entre una molécula de interés y un ligando unido a una matriz en fase sólida, generalmente se refiere a la unión reversible de una proteína de interés a un ligando a través de los efectos combinados de la complementariedad espacial de las estructuras de proteínas y el ligando en un sitio de unión junto con las fuerzas electrostáticas, puentes de hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas y/o fuerzas de van der Waals en el sitio de unión. Cuanto mayor es la

45 complementariedad espacial y la más fuerte de las otras fuerzas en el sitio de unión, mayor será la especificidad de unión de una proteína por su respectivo ligando. Ejemplos no limitantes de unión específica incluyen la unión antígeno-anticuerpo, la unión enzima-sustrato, la unión enzima-cofactor, la quelación de iones metálicos, la unión del ADN en proteína-ADN, las interacciones de regulación proteína-proteína y similares no limitantes. Idealmente, en la cromatografía de afinidad, la unión específica se produce con una afinidad de aproximadamente 10 "4 a 10 "8 M en solución libre.

La expresión "unión no específica", como se usa en el presente documento, tal como para describir las interacciones entre una molécula de interés y un ligando u otro compuesto unido a una matriz en fase sólida, se refiere a la unión de una proteína de interés al ligando o compuesto en una matriz de fase sólida mediante fuerzas electrostáticas,

55 puentes de hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas y/o fuerzas de van der Waals en un sitio de interacción, pero que carecen de complementariedad estructural que aumenta los efectos de las fuerzas no estructurales. Ejemplos de interacciones no específicas incluyen, pero no se limitan a, fuerzas electrostáticas, hidrofóbicas y de van der Waals, así como puentes de hidrógeno.

Una "sal" es un compuesto formado por la interacción de un ácido y una base. Una sal útil para la invención incluye, entre otras, acetato (por ejemplo, acetato sódico), citrato (por ejemplo citrato sódico), cloruro (por ejemplo, cloruro sódico), sulfato (por ejemplo, sulfato sódico), o una sal de potasio.

Como se usa en el presente documento, "disolvente" se refiere a una sustancia líquida capaz de disolver o dispersar

65 una o más de otras sustancias para proporcionar una solución. Los disolventes incluyen disolventes acuosos y orgánicos, de modo que los disolventes orgánicos útiles incluyen un disolvente no polar, etanol, metanol,

8

imagen7

imagen8

imagen9

E03756162

11-08-2015

los poros más grandes de una membrana cargada. El principio de intrusión de poro líquido-líquido es útil para medir la distribución de tamaño de poro (véase R. van Reis y A.L. Zydney, citado anteriormente, p. 2201). De acuerdo con este principio, dos líquidos altamente inmiscibles, tales como las soluciones de una sal sulfato y un poli(etilenglicol) se ponen en contacto a través de la mezcla para alcanzar el reparto en equilibrio. La membrana a analizar se ceba

5 con uno de los líquidos de manera que todos los poros se llenen. Después de drenar los canales de alimentación, el segundo fluido se introduce en el sistema. Después, el primer fluido es desplazado hacia fuera de los poros por el segundo líquido y el caudal se mide como una función de la presión transmembrana. Los datos resultantes proporcionan información sobre la distribución del tamaño de poro y pueden correlacionarse con el punto de corte nominal del peso molecular (véase R. van Reis y A.L. Zydney, citado anteriormente, p. 2201).

Por "carga neta", cuando se hace referencia a una carga de la membrana o la proteína se entiende una carga que es predominantemente positiva o negativa, pero no se refiere a un valor específico para el número de cargas positivas frente al número de cargas negativas sobre la membrana o proteína, a menos se indique lo contrario. Del mismo modo, "carga similar" y "la misma carga" se refieren a la situación en la que una proteína que tiene una carga dada,

15 positiva o negativa, se compara a una membrana u otra proteína que tiene una carga dada, sea positiva o negativa.

“Tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento aquéllos que ya padecen el trastorno así como aquéllos en los que se va a prevenir el trastorno.

Un "trastorno" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el polipéptido purificado tal como se describe en el presente documento. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluidas las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.

25 La palabra "marcador" cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el polipéptido. El propio marcador puede ser detectable (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.

B. Modos de llevar a cabo la invención

1. Purificación de proteínas

Los fabricantes de productos farmacéuticos basados en proteínas deben cumplir estrictas normas de regulación,

35 incluidos requisitos de pureza extremadamente rigurosos. Para garantizar la seguridad, los organismos reguladores, tales como Food and Drug Administration (FDA), requieren que los productos farmacéuticos basados en proteínas, incluidos los producidos mediante tecnología de ADN recombinante, estén sustancialmente libres de impurezas, tales como proteínas de la célula hospedadora, virus, ADN, endotoxinas, agregados, fragmentos y variantes de la proteína recombinante, y similares. Aunque se dispone de varios protocolos de purificación de proteínas se usan ampliamente en la industria farmacéutica, normalmente incluyen purificación por afinidad, tal como purificación de la proteína A en el caso de anticuerpos, a fin de alcanzar el grado requerido de pureza. Como se ha indicado anteriormente en el presente documento, aunque la afinidad por la proteína A elimina más del 99,5 % de las impurezas, este beneficio tiene un precio. La proteína A es significativamente más cara que el precio de los medios de no de afinidad y los métodos de purificación basados la proteína A a menudo plantean problemas asociados con

45 la estabilidad de la resina, la facilidad de limpieza y la vida útil, las fugas de ligando y la inmunogenicidad potencial de los residuos de proteína A que contaminan el producto purificado.

La presente invención implica la purificación de proteínas, en particular proteínas recombinantes, por un protocolo que no incluye una etapa de cromatografía de afinidad. Más específicamente, la invención proporciona métodos para la purificación de proteínas (recombinantes), incluyendo, entre otros, anticuerpos, por etapas que no incluyen cromatografía de afinidad, en un grado que permite el uso directo de las proteínas purificadas en la terapia humana, de modo que se eliminan las costosas etapas de la cromatografía de afinidad así como una ultrafiltración diafiltración final con frecuencia requerida para concentrar y formular una proteína terapéutica.

55 La presente invención se basa en hallazgos experimentales que demuestran que las proteínas recombinantes se pueden purificar a partir de una mezcla que comprende proteínas de la célula hospedadora mediante esquemas de purificación que no emplean la cromatografía de afinidad en la misma medida que procesos que incorporan una etapa de cromatografía de afinidad. En particular, se encontró que un proceso de purificación de no afinidad de tres etapas, incluyendo dos etapas de cromatografía de no afinidad, seguidas de filtración de flujo tangencial de alto rendimiento (FFTAR) como última etapa, puede producir un producto de alta pureza que contiene impurezas proteicas de la célula hospedadora en una cantidad de menos de 100 partes por millón (ppm).

La proteína a purificar utilizando el método descrito en el presente documento generalmente se produce utilizando técnicas recombinantes. Los métodos para producir proteínas recombinantes se describen en, por ejemplo, las 65 Patentes de Estados Unidos nº 5.534.615 y 4.816.567. En realizaciones preferidas, la proteína de interés se produce en una célula CHO (véase, por ejemplo, el documento WO 94/11026). Los ejemplos de proteínas que pueden

12

imagen10

E03756162

11-08-2015

concentraciones utilizadas pueden variar según el tipo de cromatografía practicada, las composiciones y concentraciones de dichos tampones y aditivos se determinan fácilmente mediante métodos estándar.

El pH del tampón de elución puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 9, como alternativa de

5 aproximadamente 3 a aproximadamente 8, de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, aunque el intervalo de pH o el pH para la elución se determina de acuerdo con la proteína de interés y el tipo de cromatografía y FFTAR practicada. Los intervalos de pH adecuados para una carga, lavado, o tampón de elución se determinan fácilmente mediante métodos estándar tales que la proteína de interés se recupera en una forma activa. Los ejemplos de tampones de elución para este propósito incluyen tampones de citrato o acetato.

La fuerza iónica de un tampón (medida como conductividad, por ejemplo) puede ser de aproximadamente 0,2-20 mS/cm, de forma alternativa de aproximadamente 0,2 -8 mS/cm, de aproximadamente 0,2-6 mS/cm, de aproximadamente 0,2-4 mS/cm, de aproximadamente 0,2-2 mS/cm, o de aproximadamente 1-2 mS/cm, aunque la

15 fuerza iónica o el intervalo de fuerza iónica para una carga, lavado, o tampón de elución se determinarán de acuerdo con la proteína de interés y el tipo de cromatografía practicado y lis tampones de diafiltración para el método de FFTAR practicado. Los intervalos de fuerza iónica adecuados para un tampón se determinan fácilmente mediante métodos estándar tales que la proteína de interés se recupera en una forma activa.

La etapa de cromatografía de intercambio catiónico normalmente elimina al menos parte de las proteínas de células hospedadoras, por ejemplo, CHOP, si la proteína se produjo en células CHO, y variantes, productos de degradación, y agregados de la proteína a purificar. La etapa de cromatografía de intercambio aniónico purifica adicionalmente la proteína a partir de las proteínas de la célula hospedadora restantes, por ejemplo, CHOP, variantes, productos de degradación y agregados de la proteína, y también de las endotoxinas y las impurezas de ADN.

25 Después de la cromatografía de no afinidad, la proteína eluida de interés se somete a FFTAR. La FFTAR es una operación unitaria bidimensional que separa de forma selectiva los solutos basándose tanto en el tamaño como en la carga. La FFTAR es capaz de proporcionar la alta selectividad requerida para una purificación de proteínas efectiva mediante la explotación de varios desarrollos recientes. En primer lugar, a diferencia de los procesos de membrana tradicionales, la FFTAR se hace funcionar en el régimen dependiente de la presión en condiciones que minimizan el ensuciamiento, explotan polarización de la concentración, optimizan la separación mediante el mantenimiento de un flujo casi uniforme y presión transmembrana a lo largo del módulo de separación (van Reis, R., Patente de EE.UU. Nº 5.256.694; 5.490.937; y 6.054.051, citado anteriormente). La selectividad de la separación se puede mejorar mediante el control de pH del tampón del filtrado y la fuerza iónica para maximizar las diferencias en volumen

35 efectivo de las diferentes especies en una mezcla (van Reis et al. (2001), citado anteriormente; van Reis et al. (1997), citado anteriormente; y Saksena, S. y Zydney, A.L., Biotechnol. Bioeng. 43:960 -968 (1994)). Además, la carga eléctrica de la membrana se puede modificar para aumentar la exclusión electrostática de todas las especies con carga similares. Por lo tanto, una membrana cargada positivamente rechazará una proteína cargada positivamente en mayor medida que una membrana cargada negativamente de un tamaño de poro similar (van Reis et al. (2001), citado anteriormente; Nakao, S. et al., Desalination 70:191 -205 (1988); y van Reis et al., J. Membr. Sci. 159:133 -142 (1999)). Además, las separaciones de proteínas en FFTAR se llevan a cabo usando un modo de diafiltración en el que la impureza (o producto) se elimina de la fracción retenida mediante lavado añadiendo simultáneamente tampón fresco al depósito de alimentación a medida que el filtrado se elimina a través de la membrana. Esta adición de tampón mantiene una concentración de proteína apropiada en la fracción retenida a lo

45 largo de la separación. La diafiltración también hace que sea posible obtener factores de purificación de los productos recogidos en la fracción retenida que son mayores que la selectividad de la membrana debido a la eliminación continua de las impurezas en el filtrado (van Reis et al. (2001), citado anteriormente; y van Reis, R. y Saksena, S., J. Membr. Sci. 129:19 -29 (1997)).

Una membrana de filtración de FFTAR útil para separaciones de proteínas es una barrera selectiva sintética (frecuentemente polimérica) para ultrafiltración a escala industrial o a escala de laboratorio (UF) (véase Leos J. Zeman y Andrew L. Zydney, "Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications," 1996, Marcel Dekker, Inc., p. 3). En estos procesos, ciertos componentes de la corriente de alimentación, tales como proteínas, pasan a través de poros de la membrana en un filtrado, mientras que otras, por lo general más grandes, proteínas o 55 componentes son retenidos por la membrana en la fracción retenida (véase Zeman y Zydney, citado anteriormente,

p. 3).

La ultrafiltración de proteínas es un proceso de membrana dirigido por presión utilizado para la concentración o purificación de soluciones de proteínas (Robert van Reis y Andrew L. Zydney, "Protein Ultrafiltration" in Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, M.C. Flickinger y S.W. Drew, eds., John Wiley & Sons, Inc. (1999), p. 2197). Las membranas de UF normalmente tienen un tamaño de poro medio entre 10 y 500 Angstroms, que está entre el tamaño medio de poro de las membranas de ósmosis inversa y de microfiltración. La ultrafiltración separa solutos basándose en las diferencias en la tasa de filtración de diferentes componentes a través de la membrana en respuesta a una fuerza motriz de presión dada (R. van Reis y A.L. Zydney, citado 65 anteriormente, p. 2197). Las tasas de filtración de solutos y, por lo tanto, la selectividad de la membrana, están determinados por interacciones tanto termodinámicas como hidrodinámicas (R. van Reis y AL Zydney, citado

14

imagen11

imagen12

E03756162

11-08-2015

mencionado en el presente documento. Los antígenos a los que los anticuerpos mencionados anteriormente se unen están específicamente incluidos dentro del alcance del presente documento.

Los antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moléculas, pueden

5 utilizarse como inmunógenos para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembrana, tales como receptores, fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) pueden utilizarse como inmunógeno. Como alternativa, las células que expresan la molécula transmembrana se pueden utilizar como inmunógeno. Tales células pueden derivarse de una fuente natural (por ejemplo, líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana.

Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos serán evidentes para los expertos en la técnica.

(b) Anticuerpos policlonales

15 Los anticuerpos policlonales se producen, preferentemente, en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno a una proteína que es inmunogénica en la especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, donde R y R 1 son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación de,

25 por ejemplo, 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes más tarde los animales, se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de antígeno o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días más tarde se extrae sangre de los animales y se analiza el suero para determinar el título de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta que el título se estabiliza-Preferentemente, el animal se estimula con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden hacer en cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, se usan adecuadamente agentes de agregación, tal como alúmina, para mejorar la respuesta inmunológica.

35 (c) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), o pueden fabricarse mediante métodos de ADN recombinante (patente de EE.UU. N 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se ha descrito anteriormente en el presente documento para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que s unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después, los linfocitos se fusionan con

45 células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59 -103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales sin condensar. Por ejemplo, su las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirán hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

55 Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, mantienen estable el nivel de producción elevado del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU. y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland, EE.UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-de ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51 -63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

65 El medio de cultivo en el que células de hibridoma crecen se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos

17

E03756162

11-08-2015

monoclonales producidos por las células de hibridoma 10 se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad

5 deseadas, los clones se subclonan mediante procedimientos de dilución límite y se cultivan mediante procedimientos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59 -103 (Academic Press, 1986)). Medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden separar adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Preferentemente se utiliza el procedimiento de cromatografía de Proteína A descrito en el presente documento.

15 El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede introducir en los vectores de expresión que después se transfectan en células hospedadoras tales como E. coli, células COS de simio, células de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que, de otro modo, no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes.

El DNA también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación de los dominios

25 constantes de la cadena pesada y la cadena ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante la unión covalente a la secuencia codificadora de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina.

Normalmente, tales polipéptidos no inmunoglobulina están sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo,

o están sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente.

35 Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552 -554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624 -628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 -597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) por barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779 -783 (1992)), así como la infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para la construcción de bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265 -2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

45 (d) Anticuerpos humanizados y humanos

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en él procedentes una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos de “importación”, que normalmente proceden de un dominio variable de “importación”: La humanización se puede realizar, esencialmente, siguiendo el método de Winter et al. (Jones et al., Nature, 321:522 -525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323 327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 -1536 (1988)), sustituyendo CDR o secuencias de CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. Nº 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana.

55 En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a usar la fabricar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigeneicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado de “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se somete a detección selectiva contra toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos. Por tanto, la secuencia humana más parecida a la del roedor se acepta como la estructura FR humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)). Otro método usa una región marco concreta derivada de la secuencia consenso de 65 todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligera o pesada. La misma región marco se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285

18

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

E03756162

11-08-2015

ψ Selectividad

Ejemplo 1

5 Dos etapas de purificación de no afinidad

En el presente ejemplo, la purificación de rhuMAb anti-CD11a, se realizó una FFTAR con procesos consistentes en dos etapas de purificación de no afinidad o tres etapas de purificación de no afinidad utilizando diferentes combinaciones de matrices de purificación de no afinidad.

10 El rendimiento de purificación de intercambio catiónico (tal como mediante el uso de una columna de S), de intercambio aniónico (tal como mediante el uso de una columna Q), de intercambio iónico de modo mixto (por ejemplo, mediante el uso de ABX), hidroxiapatita (HA), de interacción hidrofóbica (CIH) y resinas de inducción de carga hidrófoba (ICH) se examinaron en cada etapa del proceso de purificación cromatográfica para la proteína

15 rhuMAb anti-CD11a. La eliminación de impurezas proteicas de la célula hospedadora (CHOP) y el rendimiento de proteínas se determinó como se describe con detalle en el Ejemplo 2 y en comparación con los procesos tradicionales consistentes en dos o tres etapas y la incorporación de cromatografía de Proteína A (es decir, para procesos de dos etapas, ProA seguido de intercambio aniónico (tal como ProA-Q), y para procesos de tres etapas, ProA seguido de intercambio catiónico, después intercambio aniónico, tal como por ProA-SQ).

20 Resina SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ (S, resina de intercambio catiónico, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), resina Q-Sepharose Fast Flow™ (Q, resina de intercambio aniónico, Amersham Biosciences, citado anteriormente), resina Bakerbond ABx™ (ABx, resina de intercambio iónico de modo mixto, J.T. Baker, Inc., Phillipsburg, NJ), resina PHENYL-SEPHAROSE FAST FLOW™ (CIH, resina de interacción hidrofóbica, Amersham

25 Biosciences, citado anteriormente), resina Macroprep Ceramic Hydroxyapatite (HA, resina de hidroxiapatita, BioRad Laboratories, Hercules, CA) y resina MEP HYPERCEL™ (ICH, resina de inducción de carga hidrófoba, INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES™, LifeTechnologies, Inc., Rockville, MD) se empaquetaron cada una en columnas de cristal de 0,66 cm ed x 20 cm. Las condiciones de operación para la cromatografía se presentan en la Tabla 1.

30

Tabla 1. Condiciones de funcionamiento de la cromatografía

Resina

Tipo de resina Modo de operación Tampones Acondicionamiento de carga

SP Sepharose Fast Flow™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)

Intercambio aniónico (S) Unión y elusión inespecíficas MES 20 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5 10 CV gradiente a NaCl 500 mM < 5 mS/cm pH 5,5

Bakerbond ABx™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)

Intercambio iónico de modo mixto (ABx) Unión y elusión inespecíficas Igual que S Igual que S

Q Sepharose Fast Flow™ (Amersham Biosciences, NJ)

Intercambio aniónico (Q) Continuo Tris 25 mM, NaCl 50 mM, pH 8 < 7 mS/cm pH 8

Phenyl Sepharose Fast Flow™, low sub (Amersham Biosciences, NJ)

Interacción hidrofóbica (CIH) Unión y elusión inespecíficas MES 50 mM, Na2SO4 0,8 M pH 6 15 CV gradiente a MES 50 mM, pH 6 Na2SO4 0,8 M pH 6

Macro-Prep hidroxiapatita de cerámica, Tipo II (Bio-Rad, Hercules, CA)

Hidroxiapatita (HA) Unión y elusión inespecíficas Fosfato sódico 10 mM pH 6,8 10 CV gradiente a fosfato 400 mM, pH 6,8 < 3 mS/cm pH 6,8

MEP HYPERCEL™ (Life Technologies, Rockville, MD)

Inducción de carga hidrofóbica (ICH) Unión y elusión inespecíficas Tris 25 mM, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1 Etapa elusión con acetato 50 mM pH 4 pH > 7

Todas las columnas se cargaron hasta 10 mg de anticuerpo por ml de resina a un caudal de 100 cm/h (5 volúmenes de columna por hora).

35 Entre usos, las resinas de S, ICH y CIH se desinfectaron con ≥ 3 volúmenes de columna de NaOH 0,5 N. Las columnas que contienen resinas ABx, Q y HA se empaquetaron con resina fresca antes de cada uso.

Las células CHO que expresan rhuMAb anti-CD11a se cultivaron y se recogió una formulación de cultivo celular 40 recolectado que contiene el anticuerpo. La mezcla de cultivo celular bruta contenía aproximadamente 220.000 ppm de CHOP (equivalente a 220.000 ng DE CHOP/mg de rhuMAb anti-CD11a). Una parte alícuota de la mezcla bruta

23

E03756162

11-08-2015

se aplicó a cada una de las resinas para la etapa 1 en la Tabla 2. Una parte alícuota del eluato procedente de la Etapa 1 se aplicó después a cada una de las resinas alternativas en la etapa 2 de la Tabla 2, y el anticuerpo y las impurezas se separaron adicionalmente. Las condiciones del tampón para cada etapa se resumen en la Tabla 1. La mezcla bruta y cada conjunto de eluyente de la primera etapa se ajustaron al pH y la fuerza iónica de las condiciones tampón de la resina a la que se aplicó la mezcla bruta o el conjunto de eluato para la siguiente etapa de purificación. Un resumen de los resultados de purificación tal como se mide mediante las concentraciones de CHOP después de cada una de dos etapas de purificación de no afinidad se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Eliminación de CHOP en dos etapas de purificación de no afinidad

Resina usada en la etapa 1

CHOP (ppm; ng/mg de anticuerpo) Resinas alternativas usadas en la etapa 2 CHOP (ppm; ng/mg de anticuerpo)

Procesos de ensayo:

Q

23.000 Q CIH ABx S ICH 14.000 3.000 1.000 900 11.000

CIH

26.000 Q CIH ABx S 9.900 2.400 400 900

Abx

6.600 Q CIH ABx S ICH 3.100 2.400 1.700 1.000 2.800

S

14.000 Q CIH ABx S 80 600 140 2.100

Proceso control:

ProA

300 S 30

10 De las etapas de afinidad no examinadas, la columna de la ABx eliminó la mayoría de las impurezas de CHOP de la FCCR, lo que resulta en una concentración de 6600 ppm de CHOP. La pureza de los conjuntos resultantes de dos etapas de la purificación de no afinidad osciló entre 80 ppm y 14.000 ppm de CHOP. La purificación con purificación S como primera etapa de la purificación y Q como la segunda etapa resultó en una baja concentración de CHOP de

15 80 ppm. Sin embargo, cuando las etapas se invirtieron de manera que la purificación Q fuera la primera etapa y la purificación S fue la segunda etapa; el rendimiento de la purificación fue una concentración de 900 ppm CHOP. El orden de las etapas de los procesos de no afinidad afectó a los resultados de pureza.

La purificación adicional utilizando tres etapas de purificación de no afinidad se evaluó y se comparó con un proceso

20 de purificación de tres etapas que implica una etapa de afinidad de cromatografía de Proteína A, es decir, ProA-SQ, como se muestra en las Tablas 3 y 4. En cuanto a los estudios descritos anteriormente para un proceso de purificación de 2 etapas, partes alícuotas de una mezcla de cultivo celular en bruto que contiene 220.000 ppm de CHOP se ajustaron para el pH y la fuerza iónica de acuerdo con la Tabla 1 para la resina a la que se aplicaron en la etapa 1 de la Tabla 3, y de manera similar para las etapas 2 y 3 de la Tabla 3. Los resultados de eliminación de

25 CHOP utilizando procesos que implican tres etapas de purificación de no afinidad se muestran en la Tabla 3. Los rendimientos de rhuMAb anti-CD11a de algunos de los procesos de purificación DE no afinidad de tres etapas se muestran en la Tabla 4.

Tabla 3. Eliminación de CHOP en tres etapas de purificación de no afinidad

Resina usada en la etapa 1

[CHOP], ppm, después de la etapa 1 Resina usada en la etapa 2 [CHOP], ppm, después de la etapa 2 Resinas alternativas usadas en la etapa 3 [CHOP], ppm, después de la etapa 3

Procesos de ensayo:

CIH

26.000 ABx 400 ABx S CIH Q 13 14 20 22

24

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2