ES2662529T3 - Procedimiento para mejorar la eliminación de virus en la purificación de proteínas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para mejorar la capacidad de filtración de un filtro de virus durante la purificación de proteínas, que consiste en someter una composición que comprende una proteína que se va a purificar a una etapa de intercambio catiónico y a una etapa de eliminación de endotoxinas, simultáneamente o en cualquier orden, antes de hacerla pasar a través de dicho filtro de virus.

Description

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Los términos "conjugar", "conjugado" y "conjugación" se refieren a cualquiera y a todas las formas de enlace covalente o no covalente, e incluyen, sin limitación, fusión genética o química directa, acoplamiento a través de un conector o un agente de entrecruzamiento, y asociación no covalente, por ejemplo, usando una cremallera de leucinas. Los conjugados de anticuerpos tienen otra entidad, tal como un compuesto citotóxico, fármaco, composición, compuesto, elemento radiactivo o etiqueta detectable, unida a un fragmento de anticuerpo o anticuerpo.

“Tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapéutico como profiláctico o a medidas preventivas. Quienes necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno, así como en los que se va a prevenir el trastorno.

"Mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, primates superiores no humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, para deportes o de compañía, tales como perros, caballos, conejos, ganado vacuno, cerdos, hámsteres, ratones, gatos, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

Un “trastorno” es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con la proteína. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es al menos la concentración mínima requerida para efectuar una mejora o prevención mensurable de un trastorno particular. Las cantidades terapéuticamente eficaces de proteínas conocidas se conocen bien en la técnica, si bien las cantidades eficaces de proteínas descubiertas posteriormente en el presente documento se pueden determinar mediante técnicas estándar que están por completo dentro de la experiencia de un experto en la técnica, tal como un médico ordinario.

II. Modos para llevar a cabo la invención

A. Preparación de la proteína

De acuerdo con la presente invención, la proteína se produce mediante técnicas de ADN recombinante, es decir, cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene un ácido nucleico que codifica la proteína, como se conoce bien en la técnica.

La preparación de la proteína por medios recombinantes se puede conseguir transfectando o transformando células huésped adecuadas con vectores de expresión o clonación y cultivados en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionando transformantes, o amplificando los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como los medios, temperatura, pH y similares, se pueden seleccionar por el experto en la técnica sin excesiva experimentación. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, Ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press. Los procedimientos de transfección se conocen por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la transfección con CaPO4 y CaCl2, electroporación, microinyección, etc. También se describen técnicas adecuadas en Sambrook et al., supra. Se describen técnicas de transfección adicionales en Shaw et al., Gene 23: 315 (1983); el documento WO 89/05859; Graham et al, Virology 52: 456-457 (1978) y la patente de EE. UU. 4.399.216.

El ácido nucleico que codifica la proteína deseada se puede insertar en un vector replicable para la clonación o expresión. Los vectores adecuados están disponibles públicamente y pueden adoptar la forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada se puede insertar en el vector mediante varios procedimientos. En general, el ADN se inserta en un(os) sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) usando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes del vector en general incluyen, pero no se limitan a, uno

o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de unión estándar que se conocen por el experto en la técnica.

Las formas de la proteína se pueden recuperar del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si está unida a la membrana, se puede liberar de la membrana usando un detergente adecuado o a través de escisión enzimática. Las células empleadas para la expresión se pueden romper también mediante diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, ultrasonido, ruptura mecánica o agentes de lisis celular.

La purificación de la proteína se puede efectuar mediante cualquier técnica adecuada conocida en la técnica, tal como, por ejemplo, fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía sobre sílice o resina de intercambio catiónico (por ejemplo, DEAE), cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, filtración en gel usando columnas de sefarosa-proteína A (por ejemplo, Sephadex® G-75) para eliminar contaminantes tales como IgG, y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo.

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anticuerpo-accima se pueden preparar como se describe en el presente documento para el suministro de la accima a una población de células tumorales.

Las enzimas de la presente invención se pueden unir covalentemente a los anticuerpos anti-IL-17 o anti-LIF mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como el uso de los agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales analizados anteriormente. De forma alternativa, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de unión a antígeno del anticuerpo de la invención unidas a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención se pueden construir usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)).

(iv) Anticuerpos biespecíficos y poliespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos (BsAb) son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Dichos anticuerpos se pueden derivar de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes. Millstein et al., Nature, 305:537539 (1983). Debido a la combinación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza normalmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos del producto son bajos. Se divulgan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpoantígeno) se pueden fusionar con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferente que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para obtener más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferente que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en modos de realización donde proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión donde la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o donde las proporciones no son de particular importancia.

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede genomanipular para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferente comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácido grandes con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales indeseados tales como homodímeros.

En un modo de realización preferente de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones indeseadas de cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se divulga en el documento WO 94/04690 publicado el 3 de marzo de 1994. Para obtener más detalles de

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la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado se puede acoplar a avidina, y el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células indeseadas (patente de EE. UU. n.º 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar usando cualquier procedimiento de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados se conocen bien en la técnica y se divulgan en la patente de EE. UU. n.º 4.676.980, junto con una serie de técnicas de entrecruzamiento.

También se han descrito en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Las siguientes técnicas también se pueden usar para la producción de fragmentos de anticuerpo bivalentes que no son necesariamente biespecíficos. Por ejemplo, los fragmentos Fab' recuperados de E. coli se pueden acoplar químicamente in vitro para formar anticuerpos bivalentes. Véase, Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992).

Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de F(ab’)2). También se han descrito en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando enlaces químicos. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab’)2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente que forma complejos con ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab’ generados se convierten luego en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte luego en el derivado de Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la producción de moléculas de F(ab’)2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab’ se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado se pudo unir a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, así como activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos frente a dianas de tumor de mama humanas.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo bivalentes directamente a partir de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido heterodímeros bivalentes usando cremalleras de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucinas de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y se reoxidaron luego para formar los heterodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos/bivalentes. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (Vl) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza a los dominios VH y VL de un fragmento a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos/bivalentes mediante el uso de dímeros de Fv monocatenarios (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos diferentes en una molécula dada. De forma alternativa, se puede combinar un brazo anti-proteína con un brazo que se una a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7) o receptores Fc para IgG (FcγR), tales como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa la proteína particular. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en las células que expresan una proteína particular. Dichos anticuerpos poseen un brazo de unión a proteína y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante de radionúclidos, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une a la proteína de interés y se une adicionalmente al factor tisular (TF).

(v) Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos

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heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para que las células del sistema inmunitario seleccionen como diana células no deseadas, patente de EE. UU. 4.676.980, y para el tratamiento de la infección por VIH, documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089. Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro usando procedimientos conocidos en química de proteínas sintéticas, que incluyan aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y 4-mercaptobutirimidato de metilo y los divulgados, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.º 4.676.980.

C. Purificación de las proteínas, incluyendo anticuerpos

Cuando el polipéptido diana se expresa en una célula recombinante distinta de una de origen humano, el polipéptido diana está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el polipéptido diana a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas en cuanto al polipéptido diana. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga típicamente para eliminar restos de partículas celulares. La membrana y las fracciones de proteína solubles luego se separan. El polipéptido diana luego se puede purificar a partir de la fracción de proteína soluble y a partir de la fracción de membrana del lisado de cultivo, dependiendo de si el polipéptido diana está unido a la membrana. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de proteína A-sefarosa para eliminar contaminantes tales como IgG.

La mayoría de las empresas que actualmente producen anticuerpos monoclonales (mAb) usan un enfoque de plataforma de tres columnas que comprende cromatografía de afinidad de proteína A para la captura del producto, seguida de cromatografía de intercambio aniónico en modo flujo pasante para extraer contaminantes cargados negativamente tales como proteína de células huésped (HCP), endotoxinas, ADN del huésped y proteína A lixiviada, y luego cromatografía de intercambio catiónico o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en modo de retención para eliminar las especies contaminantes cargadas positivamente, incluyendo HCP residual y agregados del producto. Un ejemplo de esto se puede ver en el documento WO 2009/017491.

Los virus que pueden estar presentes en las soluciones de proteínas son más grandes que las propias proteínas. Se presume así que los virus se pueden eliminar de las proteínas de acuerdo con el tamaño, mediante filtración.

La filtración de virus puede eliminar, retrovirus, por ejemplo, más grandes (80 – 100 nm de diámetro), usando típicamente membranas de alto rendimiento con un tamaño de poro nominal de aproximadamente 60 nm. Como las membranas de alto rendimiento con un tamaño de poro nominal de 20 nm también están disponibles comercialmente, es posible eliminar virus más pequeños mediante filtración, tales como, por ejemplo, parvovirus (1826 nm de diámetro), a la vez que se permite el paso de proteínas que son tan grandes como 160 kD (~ 8 nm), por ejemplo, anticuerpos monoclonales. La presente invención está destinada principalmente a solucionar problemas típicamente asociados con la filtración de dichos virus más pequeños, usando filtros de eliminación vírica de tamaño de poro más pequeño.

Típicamente, una etapa de filtración de virus se puede implementar en uno cualquiera de varios puntos en un procedimiento corriente abajo dado. Por ejemplo, en un procedimiento de purificación de anticuerpo monoclonal típico, la filtración de virus puede tener lugar a continuación de una etapa de inactivación vírica a pH bajo, o a continuación de una etapa intermedia de cromatografía en columna, o después de una etapa final de cromatografía en columna.

De acuerdo con la invención, la operación unitaria de filtración de virus se podría llevar a cabo en cualquier fase del procedimiento corriente abajo. La filtración de virus durante el procesamiento corriente abajo del anticuerpo monoclonal se realiza típicamente después de una etapa de cromatografía de afinidad (etapa de captura) y una etapa de purificación de intercambio iónico (etapa de pulido).

La configuración experimental usada en los experimentos divulgados en el presente documento se ilustra en la figura 1. Se enfatiza, sin embargo, que la invención no está limitada así. Otras disposiciones, bien conocidas en la técnica, también son adecuadas y se pueden usar en los procedimientos de la presente invención.

En la filtración de virus de flujo tangencial, la solución de proteínas normalmente se bombea alrededor a una tasa de flujo constante en el lado de retención. La presión diferencial generada a través del filtro de eliminación de virus, permite que la solución de proteínas penetre a través del filtro mientras que los virus se retienen en el lado del producto retenido.

En el caso de la denominada filtración de virus de "flujo normal" o "en línea", se puede usar el mismo filtro de virus usado en la filtración de virus tangencial, aunque el equipo periférico y los procedimientos operativos son mucho

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más simples y menos costosos que en el caso de la filtración de virus de flujo tangencial. Así, en principio, la filtración de "flujo normal" implica colocar la solución que contiene macromoléculas en un recipiente a presión antes de la filtración y ejercer presión sobre la solución a través del filtro de eliminación de virus con la ayuda de una fuente de presión, adecuadamente nitrógeno (gas) o aire. De forma alternativa, se podría usar una bomba en el lado del producto retenido para filtrar el líquido a través del filtro de eliminación de virus a un caudal predeterminado.

El grado de finura de los filtros, en general, se expresa normalmente como el tamaño de poro o el peso molecular aproximado (masa molecular relativa) en el que las moléculas se detienen por el filtro, el denominado valor de corte.

Los filtros de virus se conocen en la técnica y se suministran por Millipore de Massachusetts, EE. UU. y Asahi Chemical Industry Co., Ltd. de Japón, entre otros. Los filtros retentivos de parvovirus adecuados incluyen Viresolve® Pro (Millipore Corp., Billerica, MA). La membrana de Viresolve® Pro tiene una estructura de doble capa asimétrica y está fabricada de polietersulfona (PES). La estructura de la membrana se diseña para retener virus mayores a 20 nm de tamaño, a la vez que se permite que las proteínas de peso molecular inferior a 180 kDa penetren a través de la membrana. Otros filtros adecuados para la eliminación de virus pequeños, incluyendo parvovirus, a partir de soluciones de proteínas incluyen cápsulas de filtro de eliminación de virus Novasip™ DV20 y DV50 (Pall Corp., East Hills, NY), Virosart® CPV, Planova 20 N (Asahi Kasei) y BioEX (Asahi Kasei). El filtro de cápsulas Novasip de calidad DV20 utiliza un cartucho de membrana plisada de calidad DV20 de calidad VF Ultipor para eliminar parvovirus y otros virus tan pequeños como de 20 nm a partir de soluciones de proteínas de hasta 5 - 10 litros. El filtro de cápsula Novasip de calidad DV50 incorpora un cartucho de membrana Ultipleat® de calidad DV50 VF Ultipor para la eliminación de virus de 40 – 50 nm y más grandes. Los filtros de cápsula Novasip Ultipor VF se suministran sin esterilizar y también se pueden irradiar con rayos gamma. Virosart® CPV utiliza una membrana asimétrica de polietersulfona de doble capa y retiene más de 4 log de parvovirus y 6 log de retrovirus.

La prefiltración de la solución de alimentación puede tener un impacto considerable en el rendimiento del filtro. Típicamente, la prefiltración se dirige a eliminar impurezas y contaminantes que podrían dar lugar al ensuciamiento de los filtros de virus, tales como agregados de proteínas, ADN y otros materiales traza.

De acuerdo con la presente invención, se puede lograr una potenciación sorprendente de la eficacia de los filtros de virus mediante una etapa de prefiltración que incluye el uso de medios tanto de intercambio catiónico como de eliminación de endotoxinas. En este contexto, el término "medio" o "medios" se usa para cubrir cualquier medio para realizar las etapas de intercambio catiónico y eliminación de endotoxinas, respectivamente. Así, el término "medio de intercambio catiónico" incluye específicamente, sin limitación, resinas de intercambio catiónico, matrices, absorbentes y similares. El término "medio de eliminación de endotoxinas" incluye, sin limitación, cualquier superficie de membrana cargada positivamente, que incluye, por ejemplo, medios de eliminación de endotoxinas cromatográficos, medios de eliminación de afinidad de endotoxinas y similares.

Los medios de intercambio catiónico adecuados para su uso en la etapa de prefiltración de la presente invención incluyen, sin limitación, Mustang® S, Sartobind® S, Viresolve® Shield, SPFF, SPXL, Capto® S, Poros® 50 HS, Fractogel® S, Hypercel® D, etc., que están disponibles comercialmente.

Los medios de eliminación de endotoxinas adecuados para su uso en la etapa de prefiltración de la presente invención incluyen Mustang® E, Mustang® Q, Sartobind® Q, Chromasorb®, Possidyne®, Capto® Q, QSFF, Poros® Q, Fractogel® Q, etc., que están disponibles comercialmente

La etapa de prefiltración se puede realizar, por ejemplo, tomando el conjunto de cromatografía en proceso y procesando el conjunto en una cadena de filtración que comprenda la eliminación de endotoxinas y los medios de intercambio catiónico y el filtro de parvovirus. Los medios de eliminación de endotoxinas y de intercambio catiónico actúan como etapas de prefiltración y la capacidad del filtro de parvovirus es independiente de la secuencia de dos etapas en la cadena de filtración. La cadena de filtración puede funcionar continuamente como una etapa única o se puede hacer funcionar como diferentes operaciones unitarias. Por ejemplo, en un modo de realización, el conjunto de cromatografía se procesa en primer lugar sobre medios de eliminación de endotoxinas, el conjunto recogido se procesa luego sobre medios de intercambio catiónico y el conjunto posterior se filtra con el filtro de parvovirus. Como se mencionó anteriormente, el orden de aplicación de los medios de intercambio catiónico y los medios de eliminación de endotoxinas en la secuencia de procedimiento no afecta la capacidad de filtración de parvovirus. El procedimiento se puede hacer funcionar en un amplio intervalo de pH, como, por ejemplo, en el intervalo de pH de 4

– 10, con una capacidad del filtro óptima que depende del perfil de impurezas de la diana y de los atributos del producto. De manera similar, las concentraciones de proteína pueden variar en un amplio intervalo, tal como, por ejemplo, de 1 – 4 0 g/l, y no limita el rendimiento en masa de los filtros de parvovirus.

La invención se comprenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo

Materiales y procedimientos

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Claims (1)

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