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JP6282745B2 - 修飾抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法 - Google Patents

修飾抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法 Download PDF

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Description

関連出願
２０１３年９月１２日出願の“修飾抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法”なる名称の米国仮特許出願６１／９６０,２５３号に基づく優先権を主張する。
本出願は、同日出願の“修飾抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法”なる名称の米国出願１４／４８５,６２０号に関係し、これは、米国仮特許出願６１／９６０,２５３号に基づく優先権を主張する。
本出願はまた、２０１３年３月８日出願の“条件付活性抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法”なる名称の米国出願１３／８１５,５５３号に関係し、これは、２０１２年３月８日出願の“条件付活性抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法”なる名称の米国仮特許出願６１／６８５,０８９号に基づく優先権を主張する。
本出願はまた、２０１３年３月８日出願の“条件付活性抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法”なる名称の国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／３００５５号に関係し、これは、２０１２年３月８日出願の“条件付活性抗上皮成長因子受容体抗体およびその使用法”なる名称の米国仮特許出願６１／６８５,０８９号に基づく優先権を主張する。
本出願はまた、２０１１年９月２７日出願の“条件付活性治療用タンパク質を評価および同定または発展させる方法”なる名称の米国出願１３／２００,６６６号に関係し、これは、２０１１年９月８日出願の“条件付活性治療用タンパク質を評価および同定または発展させる方法”なる名称の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１１／５０８９１号の一部継続出願であり、これは、２０１０年９月８日出願の“条件付活性治療用タンパク質を評価および同定または発展させる方法および条件付活性治療用タンパク質”なる名称の米国仮特許出願６１／４０２,９７９号に基づく優先権を主張する。
上記出願の各々の対象を、引用によりその全体をあらゆる目的で本明細書に包含させる。
電子的に提出した配列表の引用による取り込み
配列表の電子版は本明細書と共に提出し、その内容を引用によりその全体をあらゆる目的で本明細書に包含させる。電子ファイルは２０１４年９月１２日に作成し、７４４キロバイトのサイズであり、3118seqPC1.txtなる標題を付与している。
発明の分野
ここに提供されるのは、修飾、条件付活性抗ＥＧＦＲ抗体および修飾、修飾、条件付活性抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸分子である。
背景
抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト疾患、例えば癌の処置および診断のために臨床現場で使用されている。例えば、治療用抗体の例は、セツキシマブを含む。セツキシマブは、再発性または転移性頭頸部癌、結腸直腸癌ならびに他の疾患および状態の処置に承認されている。ＥＧＦＲの過発現またはＥＧＦＲの異常なシグナル伝達もしくは活性化が関与する他の疾患または状態の処置にも使用できる。投与された抗ＥＧＦＲ抗体は、健常な細胞および組織のＥＧＦＲに結合できる。これにより、投与できる用量が制限される。それゆえに、セツキシマブおよび他の抗ＥＧＦＲ抗体は、患者に投与する際に限界がある。したがって、非腫瘍環境と比較して、腫瘍微小環境において増加したＥＧＦＲ結合活性を示す改善された抗ＥＧＦＲ抗体を提供することが、ここでの目的の一つである。
要約
ここに提供されるのは、修飾抗上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)抗体およびその抗原結合フラグメントである。特に、本抗体およびその抗原結合フラグメントは、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブまたはその抗原結合フラグメントおよび他のセツキシマブ変異体および抗原結合フラグメントと比較して、アミノ酸置換を含む。本抗体は、可変重鎖における、配列番号２または７において１０４位に相当する位置にグルタミン酸(Ｅ)なるアミノ酸置換を含む。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、約７〜７.２の中性ｐＨを有する、皮膚の基底層に存在するような、非腫瘍組織に存在する中性ｐＨの条件下よりも、腫瘍微小環境に存在するような酸性ｐＨの条件下で、ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)およびその可溶性フラグメントに特異的に結合し、大きな活性(結合親和性)を示す。それゆえに、１０４位に対応する位置にアミノ酸置換グルタミン酸を含む、修飾セツキシマブ抗体およびそのフラグメントが提供される。これらは、セツキシマブおよびさらなる修飾を含むセツキシマブの修飾変異体ならびにそのフラグメントを含む。
抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ受容体と結合し、リガンド結合を阻害し、それによりリガンド結合により生ずるＥＧＦＲ介在活性を阻止するために、抗腫瘍性治療剤として用いられる。その結果、このような抗体は腫瘍を阻止または処置できる。皮膚における組織のような腫瘍以外の組織もＥＧＦＲを発現するため、抗ＥＧＦＲ抗体はまたこれらの受容体の活性も阻害し、それにより望ましくない副作用を引き起こす。ここに提供する抗体は、ｐＨ選択的結合活性を示さない抗体と比較しておよび／または酸性ｐＨ条件下のＥＧＦＲ結合活性と比較して、中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.０〜７.４)でＥＧＦＲ結合活性が低減するように、ｐＨ選択的結合活性を示す。ｐＨ選択的活性により、本抗ＥＧＦＲ抗体は、望ましくない副作用が少ないかまたは軽度でありおよび／または高用量で投与可能であるため対象の処置における効力の改善が示される。
例えば、ここに提供されるのは、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体が上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに特異的に結合する限り、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの可変重鎖における配列番号２または７におけるアミノ酸位置１０４位に相当する対応する位置にグルタミン酸(Ｅ)なるアミノ酸置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントであって、該非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合し、まだアミノ酸置換を含まないセツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体であり、対応するアミノ酸位置は、本抗体の可変重鎖と配列番号２または７に示す可変重鎖のアライメントにより同定される。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のこのような例のいずれにおいても、アミノ酸置換を行う非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２もしくは７に示す可変重鎖または配列番号２もしくは７と少なくとも７０％配列同一性を示すアミノ酸配列；および配列番号４、９もしくは１１に示す可変軽鎖または配列番号４、９もしくは１１と少なくとも７０％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。例えば、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２または７に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を示す可変重鎖；および／または配列番号４、９または１１に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示す可変軽鎖を含む。
例えば、グルタミン酸置換を行う非修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２に示す可変重鎖および配列番号４に示す可変軽鎖を含む。選択肢のいくつかにおいて、非修飾抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７に示す可変重鎖および配列番号９または１１に示す可変軽鎖を含む。
上記例のいずれにおいても、アミノ酸置換を行う提供される非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブのヒト化変異体である。このような例において、ヒト化非修飾セツキシマブは、配列番号１４に示す可変重鎖および配列番号１５に示す可変軽鎖を有してよく；または配列番号１６に示す可変重鎖および配列番号１７に示す可変軽鎖を有してよい。
上記例のあらゆる修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２もしくは７と少なくとも７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％または８５％配列同一性を示す可変重鎖を有し得る。
ここに提供するあらゆる修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは完全長抗体でも、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントから選択される抗原結合フラグメントでもよい。ある具体例において、抗原結合フラグメントはＦａｂまたはｓｃＦｖである。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントに含まれるのは、配列番号７４もしくは７５に示すアミノ酸配列または配列番号７４もしくは７５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変重(ＶＨ)鎖；および配列番号４、９もしくは１１に示すアミノ酸配列または配列番号４、９もしくは１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む可変軽(ＶＬ)鎖を有する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号２に示す可変重鎖および配列番号４に示す可変軽鎖を有し、修飾して、配列番号７５に示すアミノ酸配列または配列番号７５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む可変重(ＶＨ)鎖；および配列番号４に示すアミノ酸配列または配列番号４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む可変軽(ＶＬ)鎖を有する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する。他の例において、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体である非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号７に示す可変重鎖および配列番号９に示す可変軽鎖を有し、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７４に示すアミノ酸配列または配列番号７４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む可変重(ＶＨ)鎖および配列番号９に示すアミノ酸配列または配列番号９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む可変軽(ＶＬ)鎖を有する。他の例において、非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７に示す可変重鎖および配列番号１１に示す可変軽鎖を有し、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７４に示すアミノ酸配列または配列番号７４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む可変重(ＶＨ)鎖および配列番号１１に示すアミノ酸配列または配列番号１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む可変軽(ＶＬ)鎖を有する。
ここでの例のいずれかにおいて、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号７４または７５に示す重鎖可変ドメインおよび配列番号７２のアミノ酸１２０〜４４９に示す重鎖定常領域または配列番号７２のアミノ酸１２０〜４４９と少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体および配列番号４、９もしくは１１のいずれかに示す軽鎖可変ドメインおよび配列番号３もしくは１０のアミノ酸１０８〜２１３に示す定常領域またはそれと少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体または配列番号８もしくは１３のアミノ酸１０８〜２１４に示す定常領域またはそれと少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体を有する完全長ＩｇＧ抗体である。例えば、完全長重鎖は、配列番号７２に示す配列またはそれと少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体を有し、完全長軽鎖は、配列番号３、８、１０または１３のいずれかに示す配列またはそれと少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体を有する。
提供するあらゆる修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、非修飾抗体と比較して、可変重鎖に１個以上のさらなるアミノ酸置換を含み得る。さらなる修飾の非限定的例は、配列番号２または７において、アミノ酸置換Ｔ０２３Ｋ、Ｔ０２３Ｈ、Ｔ０２３Ｒ、Ｔ０２３Ａ、Ｔ０２３Ｃ、Ｔ０２３Ｅ、Ｔ０２３Ｇ、Ｔ０２３Ｉ、Ｔ０２３Ｍ、Ｔ０２３Ｎ、Ｔ０２３Ｐ、Ｔ０２３Ｓ、Ｔ０２３Ｖ、Ｔ０２３Ｗ、Ｔ０２３Ｌ、Ｖ０２４Ｒ、Ｖ０２４Ａ、Ｖ０２４Ｆ、Ｖ０２４Ｇ、Ｖ０２４Ｉ、Ｖ０２４Ｍ、Ｖ０２４Ｐ、Ｖ０２４Ｓ、Ｖ０２４Ｔ、Ｖ０２４Ｌ、Ｖ０２４Ｅ、Ｓ０２５Ｈ、Ｓ０２５Ｒ、Ｓ０２５Ａ、Ｓ０２５Ｃ、Ｓ０２５Ｄ、Ｓ０２５Ｅ、Ｓ０２５Ｆ、Ｓ０２５Ｇ、Ｓ０２５Ｉ、Ｓ０２５Ｍ、Ｓ０２５Ｐ、Ｓ０２５Ｑ、Ｓ０２５Ｔ、Ｓ０２５Ｖ、Ｓ０２５Ｌ、Ｇ０２６Ｈ、Ｇ０２６Ｒ、Ｇ０２６Ｄ、Ｇ０２６Ｆ、Ｇ０２６Ｍ、Ｇ０２６Ｎ、Ｇ０２６Ｐ、Ｇ０２６Ｑ、Ｇ０２６Ｓ、Ｇ０２６Ｙ、Ｇ０２６Ｌ、Ｆ０２７Ｈ、Ｆ０２７Ｒ、Ｆ０２７Ａ、Ｆ０２７Ｄ、Ｆ０２７Ｅ、Ｆ０２７Ｇ、Ｆ０２７Ｍ、Ｆ０２７Ｐ、Ｆ０２７Ｑ、Ｆ０２７Ｓ、Ｆ０２７Ｔ、Ｆ０２７Ｖ、Ｆ０２７Ｗ、Ｆ０２７Ｙ、Ｆ０２７Ｌ、Ｓ０２８Ｋ、Ｓ０２８Ｈ、Ｓ０２８Ｒ、Ｓ０２８Ａ、Ｓ０２８Ｄ、Ｓ０２８Ｉ、Ｓ０２８Ｍ、Ｓ０２８Ｐ、Ｓ０２８Ｑ、Ｓ０２８Ｖ、Ｓ０２８Ｗ、Ｓ０２８Ｌ、Ｓ０２８Ｃ、Ｌ０２９Ｋ、Ｌ０２９Ｈ、Ｌ０２９Ａ、Ｌ０２９Ｄ、Ｌ０２９Ｇ、Ｌ０２９Ｉ、Ｌ０２９Ｍ、Ｌ０２９Ｎ、Ｌ０２９Ｓ、Ｌ０２９Ｖ、Ｔ０３０Ｈ、Ｔ０３０Ｒ、Ｔ０３０Ｄ、Ｔ０３０Ｇ、Ｔ０３０Ｉ、Ｔ０３０Ｍ、Ｔ０３０Ｎ、Ｔ０３０Ｐ、Ｔ０３０Ｓ、Ｔ０３０Ｖ、Ｔ０３０Ｗ、Ｔ０３０Ｙ、Ｎ０３１Ｋ、Ｎ０３１Ｈ、Ｎ０３１Ｄ、Ｎ０３１Ｅ、Ｎ０３１Ｇ、Ｎ０３１Ｉ、Ｎ０３１Ｔ、Ｎ０３１Ｖ、Ｎ０３１Ｌ、Ｙ０３２Ｈ、Ｙ０３２Ｒ、Ｙ０３２Ｃ、Ｙ０３２Ｍ、Ｙ０３２Ｎ、Ｙ０３２Ｔ、Ｙ０３２Ｖ、Ｙ０３２Ｌ、Ｇ０３３Ｅ、Ｇ０３３Ｍ、Ｇ０３３Ｓ、Ｇ０３３Ｔ、Ｇ０３３Ｙ、Ｖ０３４Ａ、Ｖ０３４Ｃ、Ｖ０３４Ｉ、Ｖ０３４Ｍ、Ｖ０３４Ｐ、Ｖ０３４Ｌ、Ｈ０３５Ｉ、Ｈ０３５Ｑ、Ｗ０３６Ｋ、Ｗ０３６Ａ、Ｗ０３６Ｉ、Ｗ０３６Ｖ、Ｗ０３６Ｙ、Ｖ０５０Ｋ、Ｖ０５０Ｈ、Ｖ０５０Ａ、Ｖ０５０Ｄ、Ｖ０５０Ｅ、Ｖ０５０Ｇ、Ｖ０５０Ｉ、Ｖ０５０Ｎ、Ｖ０５０Ｑ、Ｖ０５０Ｔ、Ｖ０５０Ｌ、Ｉ０５１Ｋ、Ｉ０５１Ｈ、Ｉ０５１Ａ、Ｉ０５１Ｃ、Ｉ０５１Ｅ、Ｉ０５１Ｇ、Ｉ０５１Ｎ、Ｉ０５１Ｑ、Ｉ０５１Ｓ、Ｉ０５１Ｖ、Ｉ０５１Ｙ、Ｉ０５１Ｌ、Ｗ０５２Ｉ、Ｗ０５２Ｎ、Ｗ０５２Ｙ、Ｓ０５３Ｈ、Ｓ０５３Ｒ、Ｓ０５３Ａ、Ｓ０５３Ｃ、Ｓ０５３Ｇ、Ｓ０５３Ｉ、Ｓ０５３Ｍ、Ｓ０５３Ｐ、Ｓ０５３Ｑ、Ｓ０５３Ｌ、Ｓ０５３Ｔ、Ｓ０５３Ｖ、Ｓ０５３Ｙ、Ｇ０５４Ｈ、Ｇ０５４Ｒ、Ｇ０５４Ａ、Ｇ０５４Ｃ、Ｇ０５４Ｄ、Ｇ０５４Ｐ、Ｇ０５４Ｓ、Ｇ０５５Ｈ、Ｇ０５５Ｒ、Ｇ０５５Ｍ、Ｇ０５５Ｓ、Ｇ０５５Ｙ、Ｎ０５６Ｋ、Ｎ０５６Ａ、Ｎ０５６Ｐ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０５６Ｖ、Ｎ０５６Ｇ、Ｔ０５７Ｈ、Ｔ０５７Ｒ、Ｔ０５７Ｌ、Ｔ０５７Ａ、Ｔ０５７Ｃ、Ｔ０５７Ｄ、Ｔ０５７Ｆ、Ｔ０５７Ｍ、Ｔ０５７Ｎ、Ｔ０５７Ｑ、Ｔ０５７Ｗ、Ｔ０５７Ｙ、Ｄ０５８Ｌ、Ｄ０５８Ｇ、Ｄ０５８Ｍ、Ｄ０５８Ｎ、Ｄ０５８Ｑ、Ｙ０５９Ｈ、Ｙ０５９Ｒ、Ｙ０５９Ａ、Ｙ０５９Ｃ、Ｙ０５９Ｄ、Ｙ０５９Ｅ、Ｙ０５９Ｇ、Ｙ０５９Ｉ、Ｙ０５９Ｐ、Ｙ０５９Ｑ、Ｙ０５９Ｓ、Ｙ０５９Ｔ、Ｙ０５９Ｖ、Ｙ０５９Ｗ、Ｎ０６０Ｋ、Ｎ０６０Ａ、Ｎ０６０Ｃ、Ｎ０６０Ｄ、Ｎ０６０Ｆ、Ｎ０６０Ｇ、Ｎ０６０Ｐ、Ｎ０６０Ｑ、Ｎ０６０Ｓ、Ｎ０６０Ｔ、Ｎ０６０Ｙ、Ｔ０６１Ｎ、Ｔ０６１Ｑ、Ｐ０６２Ｇ、Ｆ０６３Ｈ、Ｆ０６３Ｒ、Ｆ０６３Ｌ、Ｆ０６３Ａ、Ｆ０６３Ｃ、Ｆ０６３Ｄ、Ｆ０６３Ｇ、Ｆ０６３Ｍ、Ｆ０６３Ｎ、Ｆ０６３Ｑ、Ｆ０６３Ｓ、Ｆ０６３Ｖ、Ｆ０６３Ｐ、Ｔ０６４Ｒ、Ｔ０６４Ｌ、Ｔ０６４Ｃ、Ｔ０６４Ｆ、Ｔ０６４Ｇ、Ｔ０６４Ｎ、Ｔ０６４Ｑ、Ｔ０６４Ｖ、Ｓ０６５Ｈ、Ｓ０６５Ｒ、Ｓ０６５Ｌ、Ｓ０６５Ｃ、Ｓ０６５Ｅ、Ｓ０６５Ｆ、Ｓ０６５Ｇ、Ｓ０６５Ｉ、Ｓ０６５Ｍ、Ｓ０６５Ｎ、Ｓ０６５Ｐ、Ｓ０６５Ｑ、Ｓ０６５Ｔ、Ｓ０６５Ｗ、Ｓ０６５Ｙ、Ｒ０６６Ｌ、Ｒ０６６Ａ、Ｒ０６６Ｃ、Ｒ０６６Ｅ、Ｒ０６６Ｆ、Ｒ０６６Ｎ、Ｒ０６６Ｐ、Ｒ０６６Ｑ、Ｒ０６６Ｓ、Ｒ０６６Ｔ、Ｒ０６６Ｖ、Ｒ０６６Ｇ、Ｌ０６７Ａ、Ｌ０６７Ｃ、Ｌ０６７Ｄ、Ｌ０６７Ｅ、Ｌ０６７Ｉ、Ｌ０６７Ｍ、Ｌ０６７Ｑ、Ｌ０６７Ｓ、Ｌ０６７Ｔ、Ｌ０６７Ｖ、Ｌ０６７Ｙ、Ｌ０６７Ｇ、Ｓ０６８Ｋ、Ｓ０６８Ｈ、Ｓ０６８Ｒ、Ｓ０６８Ｌ、Ｓ０６８Ｃ、Ｓ０６８Ｄ、Ｓ０６８Ｅ、Ｓ０６８Ｆ、Ｓ０６８Ｇ、Ｓ０６８Ｉ、Ｓ０６８Ｎ、Ｓ０６８Ｑ、Ｓ０６８Ｔ、Ｓ０６８Ｖ、Ｉ０６９Ａ、Ｉ０６９Ｃ、Ｉ０６９Ｇ、Ｉ０６９Ｙ、Ｎ０７０Ｈ、Ｎ０７０Ｒ、Ｎ０７０Ｌ、Ｎ０７０Ｄ、Ｎ０７０Ｅ、Ｎ０７０Ｆ、Ｎ０７０Ｇ、Ｎ０７０Ｉ、Ｎ０７０Ｐ、Ｎ０７０Ｑ、Ｎ０７０Ｓ、Ｎ０７０Ｔ、Ｎ０７０Ｖ、Ｎ０７０Ｙ、Ｋ０７１Ｈ、Ｋ０７１Ｒ、Ｋ０７１Ｌ、Ｋ０７１Ａ、Ｋ０７１Ｃ、Ｋ０７１Ｆ、Ｋ０７１Ｇ、Ｋ０７１Ｑ、Ｋ０７１Ｓ、Ｋ０７１Ｔ、Ｋ０７１Ｖ、Ｋ０７１Ｗ、Ｋ０７１Ｙ、Ｄ０７２Ｋ、Ｄ０７２Ｈ、Ｄ０７２Ｒ、Ｄ０７２Ｌ、Ｄ０７２Ａ、Ｄ０７２Ｇ、Ｄ０７２Ｉ、Ｄ０７２Ｍ、Ｄ０７２Ｎ、Ｄ０７２Ｑ、Ｄ０７２Ｓ、Ｄ０７２Ｖ、Ｄ０７２Ｗ、Ｄ０７２Ｙ、Ｄ０７２Ｐ、Ｎ０７３Ｈ、Ｎ０７３Ｒ、Ｎ０７３Ｌ、Ｎ０７３Ａ、Ｎ０７３Ｃ、Ｎ０７３Ｇ、Ｎ０７３Ｉ、Ｎ０７３Ｍ、Ｎ０７３Ｐ、Ｎ０７３Ｑ、Ｎ０７３Ｓ、Ｎ０７３Ｔ、Ｎ０７３Ｖ、Ｎ０７３Ｗ、Ｎ０７３Ｙ、Ｓ０７４Ｋ、Ｓ０７４Ｈ、Ｓ０７４Ｒ、Ｓ０７４Ｌ、Ｓ０７４Ａ、Ｓ０７４Ｃ、Ｓ０７４Ｄ、Ｓ０７４Ｅ、Ｓ０７４Ｇ、Ｓ０７４Ｉ、Ｓ０７４Ｍ、Ｓ０７４Ｐ、Ｓ０７４Ｔ、Ｓ０７４Ｖ、Ｓ０７４Ｙ、Ｋ０７５Ｈ、Ｋ０７５Ｒ、Ｋ０７５Ｌ、Ｋ０７５Ａ、Ｋ０７５Ｃ、Ｋ０７５Ｅ、Ｋ０７５Ｆ、Ｋ０７５Ｍ、Ｋ０７５Ｑ、Ｋ０７５Ｔ、Ｋ０７５Ｖ、Ｋ０７５Ｗ、Ｋ０７５Ｙ、Ｋ０７５Ｇ、Ｋ０７５Ｐ、Ｓ０７６Ｈ、Ｓ０７６Ｒ、Ｓ０７６Ｌ、Ｓ０７６Ａ、Ｓ０７６Ｃ、Ｓ０７６Ｄ、Ｓ０７６Ｅ、Ｓ０７６Ｆ、Ｓ０７６Ｍ、Ｓ０７６Ｐ、Ｓ０７６Ｑ、Ｓ０７６Ｔ、Ｓ０７６Ｙ、Ｓ０７６Ｉ、Ｓ０７６Ｖ、Ｑ０７７Ｈ、Ｑ０７７Ｒ、Ｑ０７７Ｌ、Ｑ０７７Ａ、Ｑ０７７Ｅ、Ｑ０７７Ｇ、Ｑ０７７Ｉ、Ｑ０７７Ｍ、Ｑ０７７Ｎ、Ｑ０７７Ｓ、Ｑ０７７Ｖ、Ｑ０７７Ｗ、Ｑ０７７Ｙ、Ｙ０９３Ｈ、Ｙ０９３Ｖ、Ｙ０９３Ｗ、Ｙ０９４Ｒ、Ｙ０９４Ｌ、Ｒ０９７Ｈ、Ｒ０９７Ｗ、Ａ０９８Ｐ、Ｌ０９９Ｎ、Ｌ０９９Ｗ、Ｔ１００Ｈ、Ｔ１００Ｌ、Ｔ１００Ａ、Ｔ１００Ｄ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｎ、Ｔ１００Ｐ、Ｔ１００Ｑ、Ｔ１００Ｓ、Ｔ１００Ｖ、Ｔ１００Ｙ、Ｙ１０１Ｈ、Ｙ１０１Ｅ、Ｙ１０１Ｆ、Ｙ１０１Ｍ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０２Ｒ、Ｙ１０２Ｃ、Ｙ１０２Ｄ、Ｙ１０２Ｉ、Ｙ１０２Ｎ、Ｙ１０２Ｗ、Ｄ１０３Ｒ、Ｄ１０３Ｌ、Ｄ１０３Ａ、Ｄ１０３Ｃ、Ｄ１０３Ｉ、Ｄ１０３Ｐ、Ｄ１０３Ｑ、Ｄ１０３Ｙ、Ｅ１０５Ｈ、Ｅ１０５Ｔ、Ｆ１０６Ｌ、Ｆ１０６Ｖ、Ｆ１０６Ｗ、Ｆ１０６Ｙ、Ａ１０７Ｋ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｌ、Ａ１０７Ｃ、Ａ１０７Ｄ、Ａ１０７Ｅ、Ａ１０７Ｇ、Ａ１０７Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｙ、Ｙ１０８Ｋ、Ｙ１０８Ｈ、Ｙ１０８Ｒ、Ｙ１０８Ｌ、Ｙ１０８Ｃ、Ｙ１０８Ｆ、Ｙ１０８Ｉ、Ｙ１０８Ｎ、Ｙ１０８Ｓ、Ｙ１０８Ｔ、Ｙ１０８Ｖ、Ｙ１０８Ｗ、Ｗ１０９Ｉ、Ｗ１０９Ｍ、Ｗ１０９Ｙ、Ｇ１１０Ｒ、Ｇ１１０Ａ、Ｇ１１０Ｍ、Ｇ１１０Ｐ、Ｇ１１０Ｔ、Ｑ１１１Ｋ、Ｑ１１１Ｈ、Ｑ１１１Ｒ、Ｑ１１１Ｌ、Ｑ１１１Ｄ、Ｑ１１１Ｅ、Ｑ１１１Ｇ、Ｑ１１１Ｍ、Ｑ１１１Ｐ、Ｑ１１１Ｓ、Ｑ１１１Ｔ、Ｑ１１１Ｗ、Ｑ１１１Ｙ、Ｑ１１１Ｖ、Ｑ１１１Ｉ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｎ、Ｇ１１２Ｐ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２Ｔおよび／またはＧ１１２Ｙを含む。
ここでの例のいずれかにおいて、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、非修飾抗体の可変重鎖に、配列番号２または７おいて、アミノ酸置換Ｖ２４Ｉ、Ｖ２４Ｌ、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｇ、Ｓ２５Ｉ、Ｓ２５Ｍ、Ｓ２５Ｖ、Ｓ２５Ｑ、Ｓ２５Ｔ、Ｓ２５Ｌ、Ｓ２５Ｈ、Ｓ２５Ｒ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２５Ｄ、Ｆ２７Ｒ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ２９Ｈ、Ｔ３０Ｆ、Ｎ３１Ｈ、Ｎ３１Ｉ、Ｎ３１Ｔ、Ｎ３１Ｖ、Ｙ３２Ｔ、Ｖ５０Ｌ、Ｓ５３Ｇ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｒ、Ｇ５４Ｃ、Ｇ５４Ｐ、Ｄ５８Ｍ、Ｙ５９Ｅ、Ｆ６３Ｒ、Ｆ６３Ｃ、Ｆ６３Ｇ、Ｆ６３Ｍ、Ｆ６３Ｖ、Ｆ６３Ｐ、Ｆ６３Ｓ、Ｔ６４Ｎ、Ｔ６４Ｖ、Ｌ６７Ｇ、Ｓ６８Ｆ、Ｓ６８Ｑ、Ｄ７２Ｋ、Ｄ７２Ｌ、Ｄ７２Ｐ、Ｄ７２Ｍ、Ｄ７２Ｗ、Ｎ７３Ｑ、Ｓ７４Ｈ、Ｓ７４Ｒ、Ｓ７４Ｄ、Ｓ７４Ｇ、Ｓ７４Ｙ、Ｋ７５Ｈ、Ｋ７５Ｇ、Ｋ７５Ｗ、Ｋ７５Ｐ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｖ、Ｑ７７Ｒ、Ｑ７７Ｅ、Ｒ９７Ｈ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｐ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０５Ｖ、Ａ１０７Ｎ、Ｑ１１１Ｉ、Ｑ１１１Ｐおよび／またはＱ１１１Ｖの１個以上を含む。このような例において、対応するアミノ酸位置は、本抗体の可変重鎖と配列番号２または７に示す可変重鎖のアライメントにより決定される。
例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、非修飾抗体の可変重鎖にアミノ酸置換Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｖ、Ｆ２７Ｒ、Ｔ３０Ｆ、Ｓ５３Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｒ９７Ｈおよび／またはＱ１１１に対応する１個以上のアミノ酸置換を含み得る。さらなる修飾を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗原結合フラグメントの非限定的例は、アミノ酸置換ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；またはＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐを有する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで、ＨＣは抗体または抗原結合フラグメントの重鎖における修飾を意味する。
ここに提供される修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗原フラグメントに含まれるのは、配列番号７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３に示すアミノ酸配列または配列番号７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変重(ＶＨ)鎖および配列番号４、９もしくは１１に示すアミノ酸配列または配列番号４、９もしくは１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖を含むものである。
例えば、配列番号２に示す可変重鎖と配列番号４に示す可変軽鎖を有する非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントを修飾して、配列番号８０、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０もしくは１２３に示すアミノ酸配列または配列番号８０、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０もしくは１２３のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変重(ＶＨ)鎖および配列番号４に示すアミノ酸配列または配列番号４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖を含む、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを産生できる。
他の例において、配列番号７に示す可変重鎖と配列番号９に示す可変軽鎖を有する非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントを修飾して、配列番号７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９もしくは１２２に示すアミノ酸配列または配列番号７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９もしくは１２２のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変重(ＶＨ)鎖および配列番号９に示すアミノ酸配列または配列番号９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖を含む、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを産生できる。
他の例において、配列番号７に示す可変重鎖と配列番号１１に示す可変軽鎖を有する非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントを修飾して、配列番号７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９もしくは１２２に示すアミノ酸配列または配列番号７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９もしくは１２２のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変重(ＶＨ)鎖および配列番号１１に示すアミノ酸配列または配列番号１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖を含む、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを産生できる。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの他の例は、配列番号７４、７７もしくは１０４に示すアミノ酸配列または配列番号７４、７７もしくは１０４のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変重(ＶＨ)鎖および配列番号４、９もしくは１１のいずれかに示すアミノ酸配列または配列番号４、９もしくは１１のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する可変軽(ＶＬ)鎖を含み得る。
いくつかの例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは完全長抗体である。このような修飾抗体は、配列番号７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかのアミノ酸１２０〜４４９に示す重鎖定常領域または配列番号７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかのアミノ酸１２０〜４４９と少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体および配列番号３もしくは１０のアミノ酸１０８〜２１３に示す軽鎖定常領域またはそれと少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体または配列番号８もしくは１３のアミノ酸１０８〜２１４に示す定常領域またはそれと少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体を有し得る。例えば、このような修飾抗体は、配列番号７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかに示すアミノ酸配列を有する完全長重鎖またはそれと少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体および配列番号３、８、１０もしくは１３のいずれかに示すアミノ酸配列を有する完全長軽鎖またはそれと少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体を有し得る。
上の修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントの例のいずれも、さらに、非修飾抗体の可変軽鎖に、配列番号４において、アミノ酸置換Ｄ００１Ｗ、Ｉ００２Ｃ、Ｉ００２Ｖ、Ｉ００２Ｗ、Ｌ００３Ｄ、Ｌ００３Ｆ、Ｌ００３Ｇ、Ｌ００３Ｓ、Ｌ００３Ｔ、Ｌ００３Ｖ、Ｌ００３Ｗ、Ｌ００３Ｙ、Ｌ００３Ｒ、Ｌ００４Ｃ、Ｌ００４Ｅ、Ｌ００４Ｆ、Ｌ００４Ｉ、Ｌ００４Ｐ、Ｌ００４Ｓ、Ｌ００４Ｔ、Ｌ００４Ｖ、Ｌ００４Ｗ、Ｌ００４Ｋ、Ｌ００４Ｈ、Ｌ００４Ｒ、Ｔ００５Ａ、Ｔ００５Ｃ、Ｔ００５Ｄ、Ｔ００５Ｅ、Ｔ００５Ｆ、Ｔ００５Ｇ、Ｔ００５Ｎ、Ｔ００５Ｓ、Ｔ００５Ｗ、Ｔ００５Ｌ、Ｔ００５Ｋ、Ｔ００５Ｈ、Ｔ００５Ｒ、Ｔ００５Ｐ、Ｒ０２４Ａ、Ｒ０２４Ｃ、Ｒ０２４Ｆ、Ｒ０２４Ｌ、Ｒ０２４Ｍ、Ｒ０２４Ｓ、Ｒ０２４Ｗ、Ｒ０２４Ｙ、Ｒ０２４Ｇ、Ａ０２５Ｃ、Ａ０２５Ｇ、Ａ０２５Ｌ、Ａ０２５Ｖ、Ｓ０２６Ａ、Ｓ０２６Ｃ、Ｓ０２６Ｄ、Ｓ０２６Ｉ、Ｓ０２６Ｍ、Ｓ０２６Ｎ、Ｓ０２６Ｖ、Ｓ０２６Ｗ、Ｓ０２６Ｌ、Ｓ０２６Ｇ、Ｓ０２６Ｈ、Ｓ０２６Ｒ、Ｑ０２７Ａ、Ｑ０２７Ｄ、Ｑ０２７Ｅ、Ｑ０２７Ｆ、Ｑ０２７Ｉ、Ｑ０２７Ｍ、Ｑ０２７Ｎ、Ｑ０２７Ｐ、Ｑ０２７Ｔ、Ｓ０２８Ａ、Ｓ０２８Ｄ、Ｓ０２８Ｎ、Ｓ０２８Ｑ、Ｓ０２８Ｌ、Ｓ０２８Ｋ、Ｓ０２８Ｈ、Ｉ０２９Ａ、Ｉ０２９Ｅ、Ｉ０２９Ｆ、Ｉ０２９Ｓ、Ｉ０２９Ｔ、Ｉ０２９Ｒ、Ｇ０３０Ａ、Ｇ０３０Ｅ、Ｇ０３０Ｆ、Ｇ０３０Ｉ、Ｇ０３０Ｍ、Ｇ０３０Ｐ、Ｇ０３０Ｑ、Ｇ０３０Ｓ、Ｇ０３０Ｖ、Ｇ０３０Ｙ、Ｇ０３０Ｌ、Ｇ０３０Ｋ、Ｇ０３０Ｈ、Ｇ０３０Ｒ、Ｔ０３１Ａ、Ｔ０３１Ｆ、Ｔ０３１Ｇ、Ｔ０３１Ｍ、Ｔ０３１Ｓ、Ｔ０３１Ｖ、Ｔ０３１Ｗ、Ｔ０３１Ｌ、Ｔ０３１Ｋ、Ｔ０３１Ｈ、Ｎ０３２Ｇ、Ｉ０３３Ｆ、Ｉ０３３Ｇ、Ｉ０３３Ｍ、Ｉ０３３Ｔ、Ｉ０３３Ｖ、Ｉ０３３Ｈ、Ｉ０４８Ｍ、Ｉ０４８Ｓ、Ｉ０４８Ｌ、Ｉ０４８Ｋ、Ｋ０４９Ａ、Ｋ０４９Ｅ、Ｋ０４９Ｆ、Ｋ０４９Ｇ、Ｋ０４９Ｎ、Ｋ０４９Ｑ、Ｋ０４９Ｓ、Ｋ０４９Ｔ、Ｋ０４９Ｖ、Ｋ０４９Ｙ、Ｋ０４９Ｌ、Ｋ０４９Ｈ、Ｋ０４９Ｒ、Ａ０５１Ｔ、Ａ０５１Ｌ、Ｓ０５２Ａ、Ｓ０５２Ｃ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｅ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｉ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｖ、Ｓ０５２Ｗ、Ｓ０５２Ｒ、Ｓ０５２Ｋ、Ｅ０５３Ｇ、Ｓ０５４Ｍ、Ｉ０５５Ａ、Ｉ０５５Ｆ、Ｓ０５６Ｇ、Ｓ０５６Ｌ、Ｓ０５６Ａ、Ｓ０５６Ｃ、Ｓ０５６Ｄ、Ｓ０５６Ｅ、Ｓ０５６Ｆ、Ｓ０５６Ｎ、Ｓ０５６Ｐ、Ｓ０５６Ｑ、Ｓ０５６Ｖ、Ｓ０５６Ｗ、Ｓ０５６Ｈ、Ｓ０５６Ｒ、Ｓ０５６Ｋ、Ｙ０８６Ｆ、Ｙ０８６Ｍ、Ｙ０８６Ｈ、Ｙ０８７Ｌ、Ｙ０８７Ｃ、Ｙ０８７Ｄ、Ｙ０８７Ｆ、Ｙ０８７Ｇ、Ｙ０８７Ｉ、Ｙ０８７Ｎ、Ｙ０８７Ｐ、Ｙ０８７Ｓ、Ｙ０８７Ｔ、Ｙ０８７Ｖ、Ｙ０８７Ｗ、Ｙ０８７Ｋ、Ｙ０８７Ｈ、Ｙ０８７Ｒ、Ｑ０８９Ｅ、Ｎ０９１Ｌ、Ｎ０９１Ａ、Ｎ０９１Ｃ、Ｎ０９１Ｉ、Ｎ０９１Ｍ、Ｎ０９１Ｓ、Ｎ０９１Ｔ、Ｎ０９１Ｖ、Ｎ０９１Ｈ、Ｎ０９１Ｒ、Ｎ０９２Ｃ、Ｎ０９２Ｄ、Ｎ０９２Ｌ、Ｎ０９２Ｍ、Ｎ０９２Ｓ、Ｎ０９２Ｔ、Ｎ０９２Ｖ、Ｎ０９２Ｗ、Ｎ０９２Ｙ、Ｎ０９２Ｈ、Ｎ０９２Ｋ、Ｎ０９２Ｒ、Ｎ０９３Ｔ、Ｔ０９６Ｌ、Ｔ０９６Ｃ、Ｔ０９６Ｍ、Ｔ０９６Ｖ、Ｔ０９７Ｌ、Ｔ０９７Ａ、Ｔ０９７Ｄ、Ｔ０９７Ｇ、Ｔ０９７Ｑ、Ｔ０９７Ｓ、Ｔ０９７Ｖ、Ｔ０９７Ｋ、Ｔ０９７Ｒ、Ｆ０９８Ａ、Ｆ０９８Ｍ、Ｆ０９８Ｓ、Ｆ０９８Ｖ、Ｆ０９８Ｙ、Ｇ０９９Ｌ、Ｇ０９９Ｄ、Ｇ０９９Ｅ、Ｇ０９９Ｆ、Ｇ０９９Ｉ、Ｇ０９９Ｍ、Ｇ０９９Ｎ、Ｇ０９９Ｓ、Ｇ０９９Ｔ、Ｇ０９９Ｖ、Ｇ０９９Ｋ、Ｇ０９９Ｈ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１００Ｄ、Ｑ１００Ｅ、Ｑ１００Ｆ、Ｑ１００Ｉ、Ｑ１００Ｍ、Ｑ１００Ｎ、Ｑ１００Ｐ、Ｑ１００Ｔ、Ｑ１００Ｖ、Ｑ１００Ｗ、Ｑ１００Ｙ、Ｑ１００Ｋ、Ｑ１００ＨおよびＱ１００Ｒに対応する１個以上を含んでよく、ここで、対応するアミノ酸位置は、抗体の可変軽鎖と配列番号４に示す可変軽鎖のアライメントにより決定する。
いくつかの例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４を参照して、非修飾抗体の可変軽鎖にアミノ酸置換Ｌ４Ｃ、Ｌ４Ｆ、Ｌ４Ｖ、Ｔ５Ｐ、Ｒ２４Ｇ、Ｉ２９Ｓ、Ｓ５６Ｈおよび／またはＮ９１Ｖに対応するアミノ酸置換を含み、ここで、対応するアミノ酸位置は、抗体の可変軽鎖と配列番号４に示す可変軽鎖のアライメントにより同定する。具体例では、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４を参照して、非修飾抗体の可変軽鎖においてアミノ酸置換Ｉ２９Ｓに対応するアミノ酸置換を含む。このような抗体の例は、アミノ酸置換がＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＬＣ−Ｉ２９ＳまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓであるものを含む。
修飾可変重鎖および修飾可変軽鎖を含む、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの例は、配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかに示すアミノ酸配列または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する修飾可変重(ＶＨ)鎖および配列番号１２５、１２６もしくは１２７に示すアミノ酸配列または配列番号１２５、１２６もしくは１２７のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する修飾可変軽(ＶＬ)鎖を含み得る。
例えば、それぞれ配列番号２および４に示す、非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントの可変重鎖および軽鎖を修飾して、配列番号８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０もしくは１２３に示すアミノ酸配列または配列番号８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０もしくは１２３のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する修飾可変重(ＶＨ)鎖および配列番号１２６に示すアミノ酸配列または配列番号１２６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含む修飾可変軽(ＶＬ)鎖を有する、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生できる。
他の例において、それぞれ配列番号７および９に示す非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントの可変重鎖および軽鎖を修飾して、配列番号７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９もしくは１２２に示すアミノ酸配列または配列番号７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９もしくは１２２のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する修飾可変重(ＶＨ)鎖および配列番号１２５に示すアミノ酸配列または配列番号１２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する修飾可変軽(ＶＬ)鎖を有する、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生できる。
さらなる例において、それぞれ配列番号７および１１に示す非修飾セツキシマブ抗体またはその抗原結合フラグメントの可変重鎖および軽鎖を修飾して、配列番号７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９もしくは１２２に示すアミノ酸配列または配列番号７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９もしくは１２２のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する修飾可変重(ＶＨ)鎖および配列番号１２７に示すアミノ酸配列または配列番号１２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する修飾可変軽(ＶＬ)鎖を有する、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生できる。
いくつかの例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかに示す修飾重鎖可変領域または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号７２、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかのアミノ酸１２０〜４４９に示す重鎖定常領域または配列番号７２、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかのアミノ酸１２０〜４４９と少なくとも８５％配列同一性を有するその変異体および配列番号１２５、１２６もしくは１２７に示すアミノ酸配列または配列番号１２５、１２６もしくは１２７のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する修飾可変軽(ＶＬ)鎖および配列番号１２４のアミノ酸１０８〜２１４に示す軽鎖定常領域または配列番号１２４のアミノ酸１０８〜２１４と少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体を有する、完全長ＩｇＧ抗体である。例えば、完全長ＩｇＧ抗体は、配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかに示す完全長修飾重鎖または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかと少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１２４に示す完全長軽鎖または配列番号１２４と少なくとも８５％配列同一性を示すその変異体を有し得る。
上に規定する修飾抗ＥＧＦＲ抗体例のいずれも、ヒト化されるようにさらに修飾され得る。ここに提供するヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２または７に示す可変重鎖と６５〜８５％の配列同一性を示す可変重鎖および配列番号４に示す可変軽鎖と６５〜８５％の配列同一性を示す可変軽鎖を含み得る。このようなヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２または７の１０４位に対応する位置にグルタミン酸(Ｅ)でのアミノ酸置換を含み得る。
ここに提供するヒト化および修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの例は、配列番号６１もしくは６３に示す可変重鎖または配列番号６１もしくは６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示す可変軽鎖または配列番号１８３、１８４もしくは１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。
いくつかの例において、配列番号２に示す可変重鎖および配列番号４に示す可変軽鎖を有する非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントをヒト化および修飾して、配列番号６３に示す可変重鎖または配列番号６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８４に示す可変軽鎖または配列番号１８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを産生する。
他の例において、配列番号７に示す可変重鎖および配列番号９に示す可変軽鎖を有する非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントをヒト化および修飾して、配列番号６１に示す可変重鎖または配列番号６１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３に示す可変軽鎖または配列番号１８３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを産生する。
さらなる例において、配列番号７に示す可変重鎖および配列番号１１に示す可変軽鎖を有する非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントをヒト化および修飾して、配列番号６１に示す可変重鎖または配列番号６１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８６に示す可変軽鎖または配列番号１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを産生する。
いくつかの例において、ヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５９に示すアミノ酸配列または配列番号５９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１８１に示すアミノ酸配列または配列番号１８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する軽鎖を有する完全長ＩｇＧ抗体である。
上に記載するヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれも、配列番号２または７に示す非修飾可変重鎖において、Ｔ０２３Ｋ、Ｔ０２３Ｈ、Ｔ０２３Ｒ、Ｔ０２３Ａ、Ｔ０２３Ｃ、Ｔ０２３Ｅ、Ｔ０２３Ｇ、Ｔ０２３Ｉ、Ｔ０２３Ｍ、Ｔ０２３Ｎ、Ｔ０２３Ｐ、Ｔ０２３Ｓ、Ｔ０２３Ｖ、Ｔ０２３Ｗ、Ｔ０２３Ｌ、Ｖ０２４Ｒ、Ｖ０２４Ａ、Ｖ０２４Ｆ、Ｖ０２４Ｇ、Ｖ０２４Ｉ、Ｖ０２４Ｍ、Ｖ０２４Ｐ、Ｖ０２４Ｓ、Ｖ０２４Ｔ、Ｖ０２４Ｌ、Ｖ０２４Ｅ、Ｓ０２５Ｈ、Ｓ０２５Ｒ、Ｓ０２５Ａ、Ｓ０２５Ｃ、Ｓ０２５Ｄ、Ｓ０２５Ｅ、Ｓ０２５Ｆ、Ｓ０２５Ｇ、Ｓ０２５Ｉ、Ｓ０２５Ｍ、Ｓ０２５Ｐ、Ｓ０２５Ｑ、Ｓ０２５Ｔ、Ｓ０２５Ｖ、Ｓ０２５Ｌ、Ｇ０２６Ｈ、Ｇ０２６Ｒ、Ｇ０２６Ｄ、Ｇ０２６Ｆ、Ｇ０２６Ｍ、Ｇ０２６Ｎ、Ｇ０２６Ｐ、Ｇ０２６Ｑ、Ｇ０２６Ｓ、Ｇ０２６Ｙ、Ｇ０２６Ｌ、Ｆ０２７Ｈ、Ｆ０２７Ｒ、Ｆ０２７Ａ、Ｆ０２７Ｄ、Ｆ０２７Ｅ、Ｆ０２７Ｇ、Ｆ０２７Ｍ、Ｆ０２７Ｐ、Ｆ０２７Ｑ、Ｆ０２７Ｓ、Ｆ０２７Ｔ、Ｆ０２７Ｖ、Ｆ０２７Ｗ、Ｆ０２７Ｙ、Ｆ０２７Ｌ、Ｓ０２８Ｋ、Ｓ０２８Ｈ、Ｓ０２８Ｒ、Ｓ０２８Ａ、Ｓ０２８Ｄ、Ｓ０２８Ｉ、Ｓ０２８Ｍ、Ｓ０２８Ｐ、Ｓ０２８Ｑ、Ｓ０２８Ｖ、Ｓ０２８Ｗ、Ｓ０２８Ｌ、Ｓ０２８Ｃ、Ｌ０２９Ｋ、Ｌ０２９Ｈ、Ｌ０２９Ａ、Ｌ０２９Ｄ、Ｌ０２９Ｇ、Ｌ０２９Ｉ、Ｌ０２９Ｍ、Ｌ０２９Ｎ、Ｌ０２９Ｓ、Ｌ０２９Ｖ、Ｔ０３０Ｈ、Ｔ０３０Ｒ、Ｔ０３０Ｄ、Ｔ０３０Ｇ、Ｔ０３０Ｉ、Ｔ０３０Ｍ、Ｔ０３０Ｎ、Ｔ０３０Ｐ、Ｔ０３０Ｓ、Ｔ０３０Ｖ、Ｔ０３０Ｗ、Ｔ０３０Ｙ、Ｎ０３１Ｋ、Ｎ０３１Ｈ、Ｎ０３１Ｄ、Ｎ０３１Ｅ、Ｎ０３１Ｇ、Ｎ０３１Ｉ、Ｎ０３１Ｔ、Ｎ０３１Ｖ、Ｎ０３１Ｌ、Ｙ０３２Ｈ、Ｙ０３２Ｒ、Ｙ０３２Ｃ、Ｙ０３２Ｍ、Ｙ０３２Ｎ、Ｙ０３２Ｔ、Ｙ０３２Ｖ、Ｙ０３２Ｌ、Ｇ０３３Ｅ、Ｇ０３３Ｍ、Ｇ０３３Ｓ、Ｇ０３３Ｔ、Ｇ０３３Ｙ、Ｖ０３４Ａ、Ｖ０３４Ｃ、Ｖ０３４Ｉ、Ｖ０３４Ｍ、Ｖ０３４Ｐ、Ｖ０３４Ｌ、Ｈ０３５Ｉ、Ｈ０３５Ｑ、Ｗ０３６Ｋ、Ｗ０３６Ａ、Ｗ０３６Ｉ、Ｗ０３６Ｖ、Ｗ０３６Ｙ、Ｖ０５０Ｋ、Ｖ０５０Ｈ、Ｖ０５０Ａ、Ｖ０５０Ｄ、Ｖ０５０Ｅ、Ｖ０５０Ｇ、Ｖ０５０Ｉ、Ｖ０５０Ｎ、Ｖ０５０Ｑ、Ｖ０５０Ｔ、Ｖ０５０Ｌ、Ｉ０５１Ｋ、Ｉ０５１Ｈ、Ｉ０５１Ａ、Ｉ０５１Ｃ、Ｉ０５１Ｅ、Ｉ０５１Ｇ、Ｉ０５１Ｎ、Ｉ０５１Ｑ、Ｉ０５１Ｓ、Ｉ０５１Ｖ、Ｉ０５１Ｙ、Ｉ０５１Ｌ、Ｗ０５２Ｉ、Ｗ０５２Ｎ、Ｗ０５２Ｙ、Ｓ０５３Ｈ、Ｓ０５３Ｒ、Ｓ０５３Ａ、Ｓ０５３Ｃ、Ｓ０５３Ｇ、Ｓ０５３Ｉ、Ｓ０５３Ｍ、Ｓ０５３Ｐ、Ｓ０５３Ｑ、Ｓ０５３Ｌ、Ｓ０５３Ｔ、Ｓ０５３Ｖ、Ｓ０５３Ｙ、Ｇ０５４Ｈ、Ｇ０５４Ｒ、Ｇ０５４Ａ、Ｇ０５４Ｃ、Ｇ０５４Ｄ、Ｇ０５４Ｐ、Ｇ０５４Ｓ、Ｇ０５５Ｈ、Ｇ０５５Ｒ、Ｇ０５５Ｍ、Ｇ０５５Ｓ、Ｇ０５５Ｙ、Ｎ０５６Ｋ、Ｎ０５６Ａ、Ｎ０５６Ｐ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０５６Ｖ、Ｎ０５６Ｇ、Ｔ０５７Ｈ、Ｔ０５７Ｒ、Ｔ０５７Ｌ、Ｔ０５７Ａ、Ｔ０５７Ｃ、Ｔ０５７Ｄ、Ｔ０５７Ｆ、Ｔ０５７Ｍ、Ｔ０５７Ｎ、Ｔ０５７Ｑ、Ｔ０５７Ｗ、Ｔ０５７Ｙ、Ｄ０５８Ｌ、Ｄ０５８Ｇ、Ｄ０５８Ｍ、Ｄ０５８Ｎ、Ｄ０５８Ｑ、Ｙ０５９Ｈ、Ｙ０５９Ｒ、Ｙ０５９Ａ、Ｙ０５９Ｃ、Ｙ０５９Ｄ、Ｙ０５９Ｅ、Ｙ０５９Ｇ、Ｙ０５９Ｉ、Ｙ０５９Ｐ、Ｙ０５９Ｑ、Ｙ０５９Ｓ、Ｙ０５９Ｔ、Ｙ０５９Ｖ、Ｙ０５９Ｗ、Ｎ０６０Ｋ、Ｎ０６０Ａ、Ｎ０６０Ｃ、Ｎ０６０Ｄ、Ｎ０６０Ｆ、Ｎ０６０Ｇ、Ｎ０６０Ｐ、Ｎ０６０Ｑ、Ｎ０６０Ｓ、Ｎ０６０Ｔ、Ｎ０６０Ｙ、Ｔ０６１Ｎ、Ｔ０６１Ｑ、Ｐ０６２Ｇ、Ｆ０６３Ｈ、Ｆ０６３Ｒ、Ｆ０６３Ｌ、Ｆ０６３Ａ、Ｆ０６３Ｃ、Ｆ０６３Ｄ、Ｆ０６３Ｇ、Ｆ０６３Ｍ、Ｆ０６３Ｎ、Ｆ０６３Ｑ、Ｆ０６３Ｓ、Ｆ０６３Ｖ、Ｆ０６３Ｐ、Ｔ０６４Ｒ、Ｔ０６４Ｌ、Ｔ０６４Ｃ、Ｔ０６４Ｆ、Ｔ０６４Ｇ、Ｔ０６４Ｎ、Ｔ０６４Ｑ、Ｔ０６４Ｖ、Ｓ０６５Ｈ、Ｓ０６５Ｒ、Ｓ０６５Ｌ、Ｓ０６５Ｃ、Ｓ０６５Ｅ、Ｓ０６５Ｆ、Ｓ０６５Ｇ、Ｓ０６５Ｉ、Ｓ０６５Ｍ、Ｓ０６５Ｎ、Ｓ０６５Ｐ、Ｓ０６５Ｑ、Ｓ０６５Ｔ、Ｓ０６５Ｗ、Ｓ０６５Ｙ、Ｒ０６６Ｌ、Ｒ０６６Ａ、Ｒ０６６Ｃ、Ｒ０６６Ｅ、Ｒ０６６Ｆ、Ｒ０６６Ｎ、Ｒ０６６Ｐ、Ｒ０６６Ｑ、Ｒ０６６Ｓ、Ｒ０６６Ｔ、Ｒ０６６Ｖ、Ｒ０６６Ｇ、Ｌ０６７Ａ、Ｌ０６７Ｃ、Ｌ０６７Ｄ、Ｌ０６７Ｅ、Ｌ０６７Ｉ、Ｌ０６７Ｍ、Ｌ０６７Ｑ、Ｌ０６７Ｓ、Ｌ０６７Ｔ、Ｌ０６７Ｖ、Ｌ０６７Ｙ、Ｌ０６７Ｇ、Ｓ０６８Ｋ、Ｓ０６８Ｈ、Ｓ０６８Ｒ、Ｓ０６８Ｌ、Ｓ０６８Ｃ、Ｓ０６８Ｄ、Ｓ０６８Ｅ、Ｓ０６８Ｆ、Ｓ０６８Ｇ、Ｓ０６８Ｉ、Ｓ０６８Ｎ、Ｓ０６８Ｑ、Ｓ０６８Ｔ、Ｓ０６８Ｖ、Ｉ０６９Ａ、Ｉ０６９Ｃ、Ｉ０６９Ｇ、Ｉ０６９Ｙ、Ｎ０７０Ｈ、Ｎ０７０Ｒ、Ｎ０７０Ｌ、Ｎ０７０Ｄ、Ｎ０７０Ｅ、Ｎ０７０Ｆ、Ｎ０７０Ｇ、Ｎ０７０Ｉ、Ｎ０７０Ｐ、Ｎ０７０Ｑ、Ｎ０７０Ｓ、Ｎ０７０Ｔ、Ｎ０７０Ｖ、Ｎ０７０Ｙ、Ｋ０７１Ｈ、Ｋ０７１Ｒ、Ｋ０７１Ｌ、Ｋ０７１Ａ、Ｋ０７１Ｃ、Ｋ０７１Ｆ、Ｋ０７１Ｇ、Ｋ０７１Ｑ、Ｋ０７１Ｓ、Ｋ０７１Ｔ、Ｋ０７１Ｖ、Ｋ０７１Ｗ、Ｋ０７１Ｙ、Ｄ０７２Ｋ、Ｄ０７２Ｈ、Ｄ０７２Ｒ、Ｄ０７２Ｌ、Ｄ０７２Ａ、Ｄ０７２Ｇ、Ｄ０７２Ｉ、Ｄ０７２Ｍ、Ｄ０７２Ｎ、Ｄ０７２Ｑ、Ｄ０７２Ｓ、Ｄ０７２Ｖ、Ｄ０７２Ｗ、Ｄ０７２Ｙ、Ｄ０７２Ｐ、Ｎ０７３Ｈ、Ｎ０７３Ｒ、Ｎ０７３Ｌ、Ｎ０７３Ａ、Ｎ０７３Ｃ、Ｎ０７３Ｇ、Ｎ０７３Ｉ、Ｎ０７３Ｍ、Ｎ０７３Ｐ、Ｎ０７３Ｑ、Ｎ０７３Ｓ、Ｎ０７３Ｔ、Ｎ０７３Ｖ、Ｎ０７３Ｗ、Ｎ０７３Ｙ、Ｓ０７４Ｋ、Ｓ０７４Ｈ、Ｓ０７４Ｒ、Ｓ０７４Ｌ、Ｓ０７４Ａ、Ｓ０７４Ｃ、Ｓ０７４Ｄ、Ｓ０７４Ｅ、Ｓ０７４Ｇ、Ｓ０７４Ｉ、Ｓ０７４Ｍ、Ｓ０７４Ｐ、Ｓ０７４Ｔ、Ｓ０７４Ｖ、Ｓ０７４Ｙ、Ｋ０７５Ｈ、Ｋ０７５Ｒ、Ｋ０７５Ｌ、Ｋ０７５Ａ、Ｋ０７５Ｃ、Ｋ０７５Ｅ、Ｋ０７５Ｆ、Ｋ０７５Ｍ、Ｋ０７５Ｑ、Ｋ０７５Ｔ、Ｋ０７５Ｖ、Ｋ０７５Ｗ、Ｋ０７５Ｙ、Ｋ０７５Ｇ、Ｋ０７５Ｐ、Ｓ０７６Ｈ、Ｓ０７６Ｒ、Ｓ０７６Ｌ、Ｓ０７６Ａ、Ｓ０７６Ｃ、Ｓ０７６Ｄ、Ｓ０７６Ｅ、Ｓ０７６Ｆ、Ｓ０７６Ｍ、Ｓ０７６Ｐ、Ｓ０７６Ｑ、Ｓ０７６Ｔ、Ｓ０７６Ｙ、Ｓ０７６Ｉ、Ｓ０７６Ｖ、Ｑ０７７Ｈ、Ｑ０７７Ｒ、Ｑ０７７Ｌ、Ｑ０７７Ａ、Ｑ０７７Ｅ、Ｑ０７７Ｇ、Ｑ０７７Ｉ、Ｑ０７７Ｍ、Ｑ０７７Ｎ、Ｑ０７７Ｓ、Ｑ０７７Ｖ、Ｑ０７７Ｗ、Ｑ０７７Ｙ、Ｙ０９３Ｈ、Ｙ０９３Ｖ、Ｙ０９３Ｗ、Ｙ０９４Ｒ、Ｙ０９４Ｌ、Ｒ０９７Ｈ、Ｒ０９７Ｗ、Ａ０９８Ｐ、Ｌ０９９Ｎ、Ｌ０９９Ｗ、Ｔ１００Ｈ、Ｔ１００Ｌ、Ｔ１００Ａ、Ｔ１００Ｄ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｎ、Ｔ１００Ｐ、Ｔ１００Ｑ、Ｔ１００Ｓ、Ｔ１００Ｖ、Ｔ１００Ｙ、Ｙ１０１Ｈ、Ｙ１０１Ｅ、Ｙ１０１Ｆ、Ｙ１０１Ｍ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０２Ｒ、Ｙ１０２Ｃ、Ｙ１０２Ｄ、Ｙ１０２Ｉ、Ｙ１０２Ｎ、Ｙ１０２Ｗ、Ｄ１０３Ｒ、Ｄ１０３Ｌ、Ｄ１０３Ａ、Ｄ１０３Ｃ、Ｄ１０３Ｉ、Ｄ１０３Ｐ、Ｄ１０３Ｑ、Ｄ１０３Ｙ、Ｅ１０５Ｈ、Ｅ１０５Ｔ、Ｆ１０６Ｌ、Ｆ１０６Ｖ、Ｆ１０６Ｗ、Ｆ１０６Ｙ、Ａ１０７Ｋ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｌ、Ａ１０７Ｃ、Ａ１０７Ｄ、Ａ１０７Ｅ、Ａ１０７Ｇ、Ａ１０７Ｎ、Ａ１０７Ｓ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｙ、Ｙ１０８Ｋ、Ｙ１０８Ｈ、Ｙ１０８Ｒ、Ｙ１０８Ｌ、Ｙ１０８Ｃ、Ｙ１０８Ｆ、Ｙ１０８Ｉ、Ｙ１０８Ｎ、Ｙ１０８Ｓ、Ｙ１０８Ｔ、Ｙ１０８Ｖ、Ｙ１０８Ｗ、Ｗ１０９Ｉ、Ｗ１０９Ｍ、Ｗ１０９Ｙ、Ｇ１１０Ｒ、Ｇ１１０Ａ、Ｇ１１０Ｍ、Ｇ１１０Ｐ、Ｇ１１０Ｔ、Ｑ１１１Ｋ、Ｑ１１１Ｈ、Ｑ１１１Ｒ、Ｑ１１１Ｌ、Ｑ１１１Ｄ、Ｑ１１１Ｅ、Ｑ１１１Ｇ、Ｑ１１１Ｍ、Ｑ１１１Ｐ、Ｑ１１１Ｓ、Ｑ１１１Ｔ、Ｑ１１１Ｗ、Ｑ１１１Ｙ、Ｑ１１１Ｖ、Ｑ１１１Ｉ、Ｇ１１２Ａ、Ｇ１１２Ｎ、Ｇ１１２Ｐ、Ｇ１１２Ｓ、Ｇ１１２ＴおよびＧ１１２Ｙから選択されるアミノ酸置換の１個以上および／または
配列番号４に示す可変軽鎖において、アミノ酸置換Ｄ００１Ｗ、Ｉ００２Ｃ、Ｉ００２Ｖ、Ｉ００２Ｗ、Ｌ００３Ｄ、Ｌ００３Ｆ、Ｌ００３Ｇ、Ｌ００３Ｓ、Ｌ００３Ｔ、Ｌ００３Ｖ、Ｌ００３Ｗ、Ｌ００３Ｙ、Ｌ００３Ｒ、Ｌ００４Ｃ、Ｌ００４Ｅ、Ｌ００４Ｆ、Ｌ００４Ｉ、Ｌ００４Ｐ、Ｌ００４Ｓ、Ｌ００４Ｔ、Ｌ００４Ｖ、Ｌ００４Ｗ、Ｌ００４Ｋ、Ｌ００４Ｈ、Ｌ００４Ｒ、Ｔ００５Ａ、Ｔ００５Ｃ、Ｔ００５Ｄ、Ｔ００５Ｅ、Ｔ００５Ｆ、Ｔ００５Ｇ、Ｔ００５Ｎ、Ｔ００５Ｓ、Ｔ００５Ｗ、Ｔ００５Ｌ、Ｔ００５Ｋ、Ｔ００５Ｈ、Ｔ００５Ｒ、Ｔ００５Ｐ、Ｒ０２４Ａ、Ｒ０２４Ｃ、Ｒ０２４Ｆ、Ｒ０２４Ｌ、Ｒ０２４Ｍ、Ｒ０２４Ｓ、Ｒ０２４Ｗ、Ｒ０２４Ｙ、Ｒ０２４Ｇ、Ａ０２５Ｃ、Ａ０２５Ｇ、Ａ０２５Ｌ、Ａ０２５Ｖ、Ｓ０２６Ａ、Ｓ０２６Ｃ、Ｓ０２６Ｄ、Ｓ０２６Ｉ、Ｓ０２６Ｍ、Ｓ０２６Ｎ、Ｓ０２６Ｖ、Ｓ０２６Ｗ、Ｓ０２６Ｌ、Ｓ０２６Ｇ、Ｓ０２６Ｈ、Ｓ０２６Ｒ、Ｑ０２７Ａ、Ｑ０２７Ｄ、Ｑ０２７Ｅ、Ｑ０２７Ｆ、Ｑ０２７Ｉ、Ｑ０２７Ｍ、Ｑ０２７Ｎ、Ｑ０２７Ｐ、Ｑ０２７Ｔ、Ｓ０２８Ａ、Ｓ０２８Ｄ、Ｓ０２８Ｎ、Ｓ０２８Ｑ、Ｓ０２８Ｌ、Ｓ０２８Ｋ、Ｓ０２８Ｈ、Ｉ０２９Ａ、Ｉ０２９Ｅ、Ｉ０２９Ｆ、Ｉ０２９Ｓ、Ｉ０２９Ｔ、Ｉ０２９Ｒ、Ｇ０３０Ａ、Ｇ０３０Ｅ、Ｇ０３０Ｆ、Ｇ０３０Ｉ、Ｇ０３０Ｍ、Ｇ０３０Ｐ、Ｇ０３０Ｑ、Ｇ０３０Ｓ、Ｇ０３０Ｖ、Ｇ０３０Ｙ、Ｇ０３０Ｌ、Ｇ０３０Ｋ、Ｇ０３０Ｈ、Ｇ０３０Ｒ、Ｔ０３１Ａ、Ｔ０３１Ｆ、Ｔ０３１Ｇ、Ｔ０３１Ｍ、Ｔ０３１Ｓ、Ｔ０３１Ｖ、Ｔ０３１Ｗ、Ｔ０３１Ｌ、Ｔ０３１Ｋ、Ｔ０３１Ｈ、Ｎ０３２Ｇ、Ｉ０３３Ｆ、Ｉ０３３Ｇ、Ｉ０３３Ｍ、Ｉ０３３Ｔ、Ｉ０３３Ｖ、Ｉ０３３Ｈ、Ｉ０４８Ｍ、Ｉ０４８Ｓ、Ｉ０４８Ｌ、Ｉ０４８Ｋ、Ｋ０４９Ａ、Ｋ０４９Ｅ、Ｋ０４９Ｆ、Ｋ０４９Ｇ、Ｋ０４９Ｎ、Ｋ０４９Ｑ、Ｋ０４９Ｓ、Ｋ０４９Ｔ、Ｋ０４９Ｖ、Ｋ０４９Ｙ、Ｋ０４９Ｌ、Ｋ０４９Ｈ、Ｋ０４９Ｒ、Ａ０５１Ｔ、Ａ０５１Ｌ、Ｓ０５２Ａ、Ｓ０５２Ｃ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｅ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｉ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｖ、Ｓ０５２Ｗ、Ｓ０５２Ｒ、Ｓ０５２Ｋ、Ｅ０５３Ｇ、Ｓ０５４Ｍ、Ｉ０５５Ａ、Ｉ０５５Ｆ、Ｓ０５６Ｇ、Ｓ０５６Ｌ、Ｓ０５６Ａ、Ｓ０５６Ｃ、Ｓ０５６Ｄ、Ｓ０５６Ｅ、Ｓ０５６Ｆ、Ｓ０５６Ｎ、Ｓ０５６Ｐ、Ｓ０５６Ｑ、Ｓ０５６Ｖ、Ｓ０５６Ｗ、Ｓ０５６Ｈ、Ｓ０５６Ｒ、Ｓ０５６Ｋ、Ｙ０８６Ｆ、Ｙ０８６Ｍ、Ｙ０８６Ｈ、Ｙ０８７Ｌ、Ｙ０８７Ｃ、Ｙ０８７Ｄ、Ｙ０８７Ｆ、Ｙ０８７Ｇ、Ｙ０８７Ｉ、Ｙ０８７Ｎ、Ｙ０８７Ｐ、Ｙ０８７Ｓ、Ｙ０８７Ｔ、Ｙ０８７Ｖ、Ｙ０８７Ｗ、Ｙ０８７Ｋ、Ｙ０８７Ｈ、Ｙ０８７Ｒ、Ｑ０８９Ｅ、Ｎ０９１Ｌ、Ｎ０９１Ａ、Ｎ０９１Ｃ、Ｎ０９１Ｉ、Ｎ０９１Ｍ、Ｎ０９１Ｓ、Ｎ０９１Ｔ、Ｎ０９１Ｖ、Ｎ０９１Ｈ、Ｎ０９１Ｒ、Ｎ０９２Ｃ、Ｎ０９２Ｄ、Ｎ０９２Ｌ、Ｎ０９２Ｍ、Ｎ０９２Ｓ、Ｎ０９２Ｔ、Ｎ０９２Ｖ、Ｎ０９２Ｗ、Ｎ０９２Ｙ、Ｎ０９２Ｈ、Ｎ０９２Ｋ、Ｎ０９２Ｒ、Ｎ０９３Ｔ、Ｔ０９６Ｌ、Ｔ０９６Ｃ、Ｔ０９６Ｍ、Ｔ０９６Ｖ、Ｔ０９７Ｌ、Ｔ０９７Ａ、Ｔ０９７Ｄ、Ｔ０９７Ｇ、Ｔ０９７Ｑ、Ｔ０９７Ｓ、Ｔ０９７Ｖ、Ｔ０９７Ｋ、Ｔ０９７Ｒ、Ｆ０９８Ａ、Ｆ０９８Ｍ、Ｆ０９８Ｓ、Ｆ０９８Ｖ、Ｆ０９８Ｙ、Ｇ０９９Ｌ、Ｇ０９９Ｄ、Ｇ０９９Ｅ、Ｇ０９９Ｆ、Ｇ０９９Ｉ、Ｇ０９９Ｍ、Ｇ０９９Ｎ、Ｇ０９９Ｓ、Ｇ０９９Ｔ、Ｇ０９９Ｖ、Ｇ０９９Ｋ、Ｇ０９９Ｈ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１００Ｄ、Ｑ１００Ｅ、Ｑ１００Ｆ、Ｑ１００Ｉ、Ｑ１００Ｍ、Ｑ１００Ｎ、Ｑ１００Ｐ、Ｑ１００Ｔ、Ｑ１００Ｖ、Ｑ１００Ｗ、Ｑ１００Ｙ、Ｑ１００Ｋ、Ｑ１００ＨおよびＱ１００Ｒから選択される１個以上のアミノ酸置換のようなさらなる修飾を含んでよく、
ここで、対応するアミノ酸位置は、抗体の可変軽鎖と配列番号４に示す可変軽鎖のアライメントにより決定する。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれも、配列番号２または７においてＶ２４Ｉ、Ｖ２４Ｌ、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｇ、Ｓ２５Ｉ、Ｓ２５Ｍ、Ｓ２５Ｖ、Ｓ２５Ｑ、Ｓ２５Ｔ、Ｓ２５Ｌ、Ｓ２５Ｈ、Ｓ２５Ｒ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２５Ｄ、Ｆ２７Ｒ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ２９Ｈ、Ｔ３０Ｆ、Ｎ３１Ｈ、Ｎ３１Ｉ、Ｎ３１Ｔ、Ｎ３１Ｖ、Ｙ３２Ｔ、Ｖ５０Ｌ、Ｓ５３Ｇ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｒ、Ｇ５４Ｃ、Ｇ５４Ｐ、Ｄ５８Ｍ、Ｙ５９Ｅ、Ｆ６３Ｒ、Ｆ６３Ｃ、Ｆ６３Ｇ、Ｆ６３Ｍ、Ｆ６３Ｖ、Ｆ６３Ｐ、Ｆ６３Ｓ、Ｔ６４Ｎ、Ｔ６４Ｖ、Ｌ６７Ｇ、Ｓ６８Ｆ、Ｓ６８Ｑ、Ｄ７２Ｋ、Ｄ７２Ｌ、Ｄ７２Ｐ、Ｄ７２Ｍ、Ｄ７２Ｗ、Ｎ７３Ｑ、Ｓ７４Ｈ、Ｓ７４Ｒ、Ｓ７４Ｄ、Ｓ７４Ｇ、Ｓ７４Ｙ、Ｋ７５Ｈ、Ｋ７５Ｇ、Ｋ７５Ｗ、Ｋ７５Ｐ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｖ、Ｑ７７Ｒ、Ｑ７７Ｅ、Ｒ９７Ｈ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｐ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０５Ｖ、Ａ１０７Ｎ、Ｑ１１１Ｉ、Ｑ１１１Ｐ、Ｑ１１１Ｖなるアミノ酸置換を、非修飾抗体の可変重鎖に含んでよく、ここで、対応するアミノ酸位置は、本抗体の可変重鎖と配列番号２または７に示す可変重鎖のアライメントにより決定される。
ここに提供するヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのこのような例のいずれかは、非修飾抗体のアミノ酸置換Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｖ、Ｆ２７Ｒ、Ｔ３０Ｆ、Ｓ５３Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｒ９７ＨおよびＱ１１１Ｐに対応する可変重鎖における１個以上のさらなるアミノ酸置換を含む。例えば、ここに記載するヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原フラグメントは、ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；またはＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐなるアミノ酸置換を、対応する可変重鎖または完全長重鎖に含み得る。具体例では、ヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントはアミノ酸置換ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１ＰまたはＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐを含む。
例えば、ここに提供するヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの非限定的例は、とりわけ、次の配列を含む抗体である。
ａ) 配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖または配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５５、１５６もしくは１５８に示す可変軽鎖または配列番号１５５、１５６もしくは１５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂ) 配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖または配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６２、１６３もしくは１６５に示す可変軽鎖または配列番号１６２、１６３もしくは１６５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃ) 配列番号１３７もしくは１３９に示す可変重鎖または配列番号１３７もしくは１３９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５５、１５６もしくは１５８に示す可変軽鎖または配列番号１５５、１５６もしくは１５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄ) 配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖または配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６９、１７０もしくは１７２に示す可変軽鎖または配列番号１６９、１７０もしくは１７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅ) 配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖または配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７６、１７７もしくは１７９に示す可変軽鎖または配列番号１７６、１７７もしくは１７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆ) 配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖または配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示す可変軽鎖または配列番号１８３、１８４もしくは１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇ) 配列番号１３７もしくは１３９に示す可変重鎖または配列番号１３７もしくは１３９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示す可変軽鎖または配列番号１８３、１８４もしくは１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｈ) 配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖または配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９０、１９１もしくは１９３に示す可変軽鎖または配列番号１９０、１９１もしくは１９３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｉ) 配列番号１４３もしくは１４５に示す可変重鎖または配列番号１４３もしくは１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示す可変軽鎖または配列番号１８３、１８４もしくは１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｊ) 配列番号１４９もしくは１５１に示す可変重鎖または配列番号１４９もしくは１５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９７、１９８もしくは２００に示す可変軽鎖または配列番号１９７、１９８もしくは２００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｋ) 配列番号１４３もしくは１４５に示す可変重鎖または配列番号１４３もしくは１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９７、１９８もしくは２００に示す可変軽鎖または配列番号１９７、１９８もしくは２００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｌ) 配列番号１４９もしくは１５１に示す可変重鎖または配列番号１４９もしくは１５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０４、２０５もしくは２０７に示す可変軽鎖または配列番号２０４、２０５もしくは２０７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｍ) 配列番号１４３もしくは１４５に示す可変重鎖または配列番号１４３もしくは１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０４、２０５もしくは２０７に示す可変軽鎖または配列番号２０４、２０５もしくは２０７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｎ) 配列番号２１１もしくは２１３に示す可変重鎖または配列番号２１１もしくは２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５３、２５４もしくは２５６に示す可変軽鎖または配列番号２５３、２５４もしくは２５６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｏ) 配列番号２１７もしくは２１９に示す可変重鎖または配列番号２１７もしくは２１９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５３、２５４もしくは２５６に示す可変軽鎖または配列番号２５３、２５４もしくは２５６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｐ) 配列番号２２３もしくは２２５に示す可変重鎖または配列番号２２３もしくは２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６０、２６１もしくは２６３に示す可変軽鎖または配列番号２６０、２６１もしくは２６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｑ) 配列番号２２９もしくは２３１に示す可変重鎖または配列番号２２９もしくは２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６０、２６１もしくは２６３に示す可変軽鎖または配列番号２６０、２６１もしくは２６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｒ) 配列番号２３５もしくは２３７に示す可変重鎖または配列番号２３５もしくは２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６７、２６８もしくは２７０に示す可変軽鎖または配列番号２６７、２６８もしくは２７０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｓ) 配列番号２４１もしくは２４３に示す可変重鎖または配列番号２４１もしくは２４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示す可変軽鎖または配列番号２７４、２７５もしくは２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｔ) 配列番号２２３もしくは２２５に示す可変重鎖または配列番号２２３もしくは２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示す可変軽鎖または配列番号２７４、２７５もしくは２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｕ) 配列番号２２９もしくは２３１に示す可変重鎖または配列番号２２９もしくは２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示す可変軽鎖または配列番号２７４、２７５もしくは２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｖ) 配列番号２３５もしくは２３７に示す可変重鎖または配列番号２３５もしくは２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｗ) 配列番号２４７もしくは２４９に示す可変重鎖または配列番号２４７もしくは２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｘ) 配列番号２２３もしくは２２５に示す可変重鎖または配列番号２２３もしくは２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｙ) 配列番号２２９もしくは２３１に示す可変重鎖または配列番号２２９もしくは２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｚ) 配列番号２３５もしくは２３７に示す可変重鎖または配列番号２３５もしくは２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖または配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ａａ) 配列番号２４７もしくは２４９に示す可変重鎖または配列番号２４７もしくは２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖または配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂｂ) 配列番号２２３もしくは２２５に示す可変重鎖または配列番号２２３もしくは２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖または配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃｃ) 配列番号２２９もしくは２３１に示す可変重鎖または配列番号２２９もしくは２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖または配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄｄ) 配列番号２３５もしくは２３７に示す可変重鎖または配列番号２３５もしくは２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９５、２９６もしくは２９８に示す可変軽鎖または配列番号２９５、２９６もしくは２９８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅｅ) 配列番号２４７もしくは２４９に示す可変重鎖または配列番号２４７もしくは２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０２、３０３もしくは３０５に示す可変軽鎖または配列番号３０２、３０３もしくは３０５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆｆ) 配列番号２１１もしくは２１３に示す可変重鎖または配列番号２１１もしくは２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０２、３０３もしくは３０５に示す可変軽鎖または配列番号３０２、３０３もしくは３０５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇｇ) 配列番号２１１もしくは２１３に示す可変重鎖または配列番号２１１もしくは２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；および
ｈｈ) 配列番号２１１もしくは２１３に示す可変重鎖または配列番号２１１もしくは２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖または配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列。
いくつかの例において、配列番号２に示す可変重鎖と配列番号４に示す可変軽鎖を有する非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを、ヒト化および修飾して、次の配列を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する。
ａ) 配列番号１３３に示す可変重鎖または配列番号１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５６に示す可変軽鎖または配列番号１５６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂ) 配列番号１３３に示す可変重鎖または配列番号１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６３に示す可変軽鎖または配列番号１６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃ) 配列番号１３９に示す可変重鎖または配列番号１３９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５６に示す可変軽鎖または配列番号１５６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄ) 配列番号１３３に示す可変重鎖または配列番号１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７０に示す可変軽鎖または配列番号１７０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅ) 配列番号１３３に示す可変重鎖または配列番号１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７７に示す可変軽鎖または配列番号１７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆ) 配列番号１３３に示す可変重鎖または配列番号１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８４に示す可変軽鎖または配列番号１８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇ) 配列番号１３９に示す可変重鎖または配列番号１３９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８４に示す可変軽鎖または配列番号１８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｈ) 配列番号１３３に示す可変重鎖または配列番号１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９１に示す可変軽鎖または配列番号１９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｉ) 配列番号１４５に示す可変重鎖または配列番号１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８４に示す可変軽鎖または配列番号１８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｊ) 配列番号１５１に示す可変重鎖または配列番号１５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９８に示す可変軽鎖または配列番号１９８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｋ) 配列番号１４５に示す可変重鎖または配列番号１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９８に示す可変軽鎖または配列番号１９８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｌ) 配列番号１５１に示す可変重鎖または配列番号１５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０５に示す可変軽鎖または配列番号２０５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｍ) 配列番号１４５に示す可変重鎖または配列番号１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０５に示す可変軽鎖または配列番号２０５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｎ) 配列番号２１３に示す可変重鎖または配列番号２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５４に示す可変軽鎖または配列番号２５４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｏ) 配列番号２１９に示す可変重鎖または配列番号２１９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５４に示す可変軽鎖または配列番号２５４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｐ) 配列番号２２５に示す可変重鎖または配列番号２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６１に示す可変軽鎖または配列番号２６１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｑ) 配列番号２３１に示す可変重鎖または配列番号２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６１に示す可変軽鎖または配列番号２６１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｒ) 配列番号２３７に示す可変重鎖または配列番号２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６８に示す可変軽鎖または配列番号２６８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｓ) 配列番号２４３に示す可変重鎖または配列番号２４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７５に示す可変軽鎖または配列番号２７５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｔ) 配列番号２２５に示す可変重鎖または配列番号２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７５に示す可変軽鎖または配列番号２７５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｕ) 配列番号２３１に示す可変重鎖または配列番号２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７５に示す可変軽鎖または配列番号２７５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｖ) 配列番号２３７に示す可変重鎖または配列番号２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８２に示す可変軽鎖または配列番号２８２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｗ) 配列番号２４９に示す可変重鎖または配列番号２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８２に示す可変軽鎖または配列番号２８２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｘ) 配列番号２２５に示す可変重鎖または配列番号２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８２に示す可変軽鎖または配列番号２８２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｙ) 配列番号２３１に示す可変重鎖または配列番号２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８２に示す可変軽鎖または配列番号２８２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｚ) 配列番号２３７に示す可変重鎖または配列番号２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８９に示す可変軽鎖または配列番号２８９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ａａ) 配列番号２４９に示す可変重鎖または配列番号２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８９に示す可変軽鎖または配列番号２８９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂｂ) 配列番号２２５に示す可変重鎖または配列番号２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８９に示す可変軽鎖または配列番号２８９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃｃ) 配列番号２３１に示す可変重鎖または配列番号２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８９に示す可変軽鎖または配列番号２８９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄｄ) 配列番号２３７に示す可変重鎖または配列番号２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９６に示す可変軽鎖または配列番号２９６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅｅ) 配列番号２４９に示す可変重鎖または配列番号２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０３に示す可変軽鎖または配列番号３０３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆｆ) 配列番号２１３に示す可変重鎖または配列番号２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０３に示す可変軽鎖または配列番号３０３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇｇ) 配列番号２１３に示す可変重鎖または配列番号２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８２に示す可変軽鎖または配列番号２８２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；および
ｈｈ) 配列番号２１３に示す可変重鎖または配列番号２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８９に示す可変軽鎖または配列番号２８９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列。
他の例において、配列番号７に示す可変重鎖と配列番号９に示す可変軽鎖を有する非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを、ヒト化および修飾して、次の配列を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する。
ａ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５５に示す可変軽鎖または配列番号１５５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６２に示す可変軽鎖または配列番号１６２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃ) 配列番号１３７に示す可変重鎖または配列番号１３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５５に示す可変軽鎖または配列番号１５５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６９に示す可変軽鎖または配列番号１６９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７６に示す可変軽鎖または配列番号１７６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３に示す可変軽鎖または配列番号１８３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇ) 配列番号１３７に示す可変重鎖または配列番号１３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３に示す可変軽鎖または配列番号１８３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｈ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９０に示す可変軽鎖または配列番号１９０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｉ) 配列番号１４３に示す可変重鎖または配列番号１４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３に示す可変軽鎖または配列番号１８３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｊ) 配列番号１４９に示す可変重鎖または配列番号１４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９７に示す可変軽鎖または配列番号１９７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｋ) 配列番号１４３に示す可変重鎖または配列番号１４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９７に示す可変軽鎖または配列番号１９７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｌ) 配列番号１４９に示す可変重鎖または配列番号１４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０４に示す可変軽鎖または配列番号２０４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｍ) 配列番号１４３に示す可変重鎖または配列番号１４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０４に示す可変軽鎖または配列番号２０４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｎ) 配列番号２１１に示す可変重鎖または配列番号２１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５３に示す可変軽鎖または配列番号２５３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｏ) 配列番号２１７に示す可変重鎖または配列番号２１７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５３に示す可変軽鎖または配列番号２５３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｐ) 配列番号２２３に示す可変重鎖または配列番号２２３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６０に示す可変軽鎖または配列番号２６０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｑ) 配列番号２２９に示す可変重鎖または配列番号２２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６０に示す可変軽鎖または配列番号２６０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｒ) 配列番号２３５に示す可変重鎖または配列番号２３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６７に示す可変軽鎖または配列番号２６７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｓ) 配列番号２４１に示す可変重鎖または配列番号２４１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４に示す可変軽鎖または配列番号２７４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｔ) 配列番号２２３に示す可変重鎖または配列番号２２３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４に示す可変軽鎖または配列番号２７４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｕ) 配列番号２２９に示す可変重鎖または配列番号２２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４に示す可変軽鎖または配列番号２７４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｖ) 配列番号２３５に示す可変重鎖または配列番号２３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１に示す可変軽鎖または配列番号２８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｗ) 配列番号２４７に示す可変重鎖または配列番号２４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１に示す可変軽鎖または配列番号２８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｘ) 配列番号２２３に示す可変重鎖または配列番号２２３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１に示す可変軽鎖または配列番号２８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｙ) 配列番号２２９に示す可変重鎖または配列番号２２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１に示す可変軽鎖または配列番号２８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｚ) 配列番号２３５に示す可変重鎖または配列番号２３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８に示す可変軽鎖または配列番号２８８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ａａ) 配列番号２４７に示す可変重鎖または配列番号２４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８に示す可変軽鎖または配列番号２８８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂｂ) 配列番号２２３に示す可変重鎖または配列番号２２３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８に示す可変軽鎖または配列番号２８８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃｃ) 配列番号２２９に示す可変重鎖または配列番号２２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８に示す可変軽鎖または配列番号２８８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄｄ) 配列番号２３５に示す可変重鎖または配列番号２３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９５に示す可変軽鎖または配列番号２９５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅｅ) 配列番号２４７に示す可変重鎖または配列番号２４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０２に示す可変軽鎖または配列番号３０２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆｆ) 配列番号２１１に示す可変重鎖または配列番号２１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０２に示す可変軽鎖または配列番号３０２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇｇ) 配列番号２１１に示す可変重鎖または配列番号２１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１に示す可変軽鎖または配列番号２８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；および
ｈｈ) 配列番号２１１に示す可変重鎖または配列番号２１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８に示す可変軽鎖または配列番号２８８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列。
さらなる例において、配列番号７に示す可変重鎖と配列番号１１に示す可変軽鎖を有する非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを、ヒト化および修飾して、次の配列を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する。
ａ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５８に示す可変軽鎖または配列番号１５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６５に示す可変軽鎖または配列番号１６５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃ) 配列番号１３７に示す可変重鎖または配列番号１３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５８に示す可変軽鎖または配列番号１５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７２に示す可変軽鎖または配列番号１７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７９に示す可変軽鎖または配列番号１７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８６に示す可変軽鎖または配列番号１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇ) 配列番号１３７に示す可変重鎖または配列番号１３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８６に示す可変軽鎖または配列番号１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｈ) 配列番号１３１に示す可変重鎖または配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９３に示す可変軽鎖または配列番号１９３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｉ) 配列番号１４３に示す可変重鎖または配列番号１４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８６に示す可変軽鎖または配列番号１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｊ) 配列番号１４９に示す可変重鎖または配列番号１４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２００に示す可変軽鎖または配列番号２００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｋ) 配列番号１４３に示す可変重鎖または配列番号１４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２００に示す可変軽鎖または配列番号２００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｌ) 配列番号１４９に示す可変重鎖または配列番号１４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０７に示す可変軽鎖または配列番号２０７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｍ) 配列番号１４３に示す可変重鎖または配列番号１４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０７に示す可変軽鎖または配列番号２０７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｎ) 配列番号２１１に示す可変重鎖または配列番号２１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５６に示す可変軽鎖または配列番号２５６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｏ) 配列番号２１７に示す可変重鎖または配列番号２１７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５６に示す可変軽鎖または配列番号２５６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｐ) 配列番号２２３に示す可変重鎖または配列番号２２３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６３に示す可変軽鎖または配列番号２６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｑ) 配列番号２２９に示す可変重鎖または配列番号２２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６３に示す可変軽鎖または配列番号２６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｒ) 配列番号２３５に示す可変重鎖または配列番号２３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７０に示す可変軽鎖または配列番号２７０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｓ) 配列番号２４１に示す可変重鎖または配列番号２４１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７７に示す可変軽鎖または配列番号２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｔ) 配列番号２２３に示す可変重鎖または配列番号２２３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７７に示す可変軽鎖または配列番号２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｕ) 配列番号２２９に示す可変重鎖または配列番号２２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７７に示す可変軽鎖または配列番号２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｖ) 配列番号２３５に示す可変重鎖または配列番号２３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｗ) 配列番号２４７に示す可変重鎖または配列番号２４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｘ) 配列番号２２３に示す可変重鎖または配列番号２２３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｙ) 配列番号２２９に示す可変重鎖または配列番号２２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｚ) 配列番号２３５に示す可変重鎖または配列番号２３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９１に示す可変軽鎖または配列番号２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ａａ) 配列番号２４７に示す可変重鎖または配列番号２４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９１に示す可変軽鎖または配列番号２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂｂ) 配列番号２２３に示す可変重鎖または配列番号２２３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９１に示す可変軽鎖または配列番号２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃｃ) 配列番号２２９に示す可変重鎖または配列番号２２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９１に示す可変軽鎖または配列番号２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄｄ) 配列番号２３５に示す可変重鎖または配列番号２３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９８に示す可変軽鎖または配列番号２９８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅｅ) 配列番号２４７に示す可変重鎖または配列番号２４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０５に示す可変軽鎖または配列番号３０５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆｆ) 配列番号２１１に示す可変重鎖または配列番号２１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０５に示す可変軽鎖または配列番号３０５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇｇ) 配列番号２１１に示す可変重鎖または配列番号２１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８４に示す可変軽鎖または配列番号２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；および
ｈｈ) 配列番号２１１に示す可変重鎖または配列番号２１１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９１に示す可変軽鎖または配列番号２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかにまた包含されるのは、上記ヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかと、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すあらゆるヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。配列同一性は、ギャップを伴うまたは伴わないグローバル・アライメントを使用して決定できる。
いくつかの例において、ヒト化、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、次の配列を含む完全長抗体である。
ａ) 配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５３に示す軽鎖または配列番号１５３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂ) 配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６０に示す軽鎖または配列番号１６０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃ) 配列番号１３５に示す重鎖または配列番号１３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５３に示す軽鎖または配列番号１５３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄ) 配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６７に示す軽鎖または配列番号１６７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅ) 配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７４に示す軽鎖または配列番号１７４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆ) 配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８１に示す軽鎖または配列番号１８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇ) 配列番号１３５に示す重鎖または配列番号１３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８１に示す軽鎖または配列番号１８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｈ) 配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８８に示す軽鎖または配列番号１８８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｉ) 配列番号１４１に示す重鎖または配列番号１４１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８１に示す軽鎖または配列番号１８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｊ) 配列番号１４７に示す重鎖または配列番号１４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９５を示す軽鎖または配列番号１９５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｋ) 配列番号１４１に示す重鎖または配列番号１４１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９５を示す軽鎖または配列番号１９５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｌ) 配列番号１４７に示す重鎖または配列番号１４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０２に示す軽鎖または配列番号２０２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｍ) 配列番号１４１に示す重鎖または配列番号１４１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０２に示す軽鎖または配列番号２０２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｎ) 配列番号２０９に示す重鎖または配列番号２０９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５１に示す軽鎖または配列番号２５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｏ) 配列番号２１５に示す重鎖または配列番号２１５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５１に示す軽鎖または配列番号２５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｐ) 配列番号２２１に示す重鎖または配列番号２２１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５８に示す軽鎖または配列番号２５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｑ) 配列番号２２７に示す重鎖または配列番号２２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５８に示す軽鎖または配列番号２５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｒ) 配列番号２３３に示す重鎖または配列番号２３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６５に示す軽鎖または配列番号２６５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｓ) 配列番号２３９に示す重鎖または配列番号２３９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７２に示す軽鎖または配列番号２７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｔ) 配列番号２２１に示す重鎖または配列番号２２１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７２に示す軽鎖または配列番号２７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｕ) 配列番号２２７に示す重鎖または配列番号２２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７２に示す軽鎖または配列番号２７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｖ) 配列番号２３３に示す重鎖または配列番号２３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｗ) 配列番号２４５に示す重鎖または配列番号２４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｘ) 配列番号２２１に示す重鎖または配列番号２２１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｙ) 配列番号２２７に示す重鎖または配列番号２２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｚ) 配列番号２３３に示す重鎖または配列番号２３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ａａ) 配列番号２４５に示す重鎖または配列番号２４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｂｂ) 配列番号２２１に示す重鎖または配列番号２２１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｃｃ) 配列番号２２７に示す重鎖または配列番号２２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｄｄ) 配列番号２３３に示す重鎖または配列番号２３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９３に示す軽鎖または配列番号２９３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｅｅ) 配列番号２４５に示す重鎖または配列番号２４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３００に示す軽鎖または配列番号３００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｆｆ) 配列番号２０９に示す重鎖または配列番号２０９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３００に示す軽鎖または配列番号３００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
ｇｇ) 配列番号２０９に示す重鎖または配列番号２０９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；および
ｈｈ) 配列番号２０９に示す重鎖または配列番号２０９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのあらゆる例において、抗体または抗原結合フラグメントは、ｐＨおよび乳酸濃度の差異以外同じ条件で測定したとき、正確にもしくは約７.４のｐＨおよび／または正確にもしくは約１mMの乳酸濃度の一方または両方の存在下と比較して、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)のｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方の存在下で、１.０を超えるＥＧＦＲに対する結合活性比を示し得る。いくつかの例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、ｐＨの差異以外同じ条件で測定したとき、正確にまたは約７.４のｐＨの存在下と比較して、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)のｐＨの存在下で１.０を超えるＥＧＦＲに対する結合活性比を示す。このような例において、結合活性比は、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、５０.０またはそれ以上であり得る。具体例では、結合活性比は少なくとも３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、５０.０またはそれ以上である。
ここでの例のいずれかにおいて、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントの結合親和性を、結合したＥＧＦＲまたはその可溶性フラグメントの解離定数(Ｋｄ)の観点で測定する。このような例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントは、酸性ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および１５mM〜２０mM乳酸(両端を含む)の一方または両方を含む条件下で１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍまたはそれ以下のＥＧＦＲに対する結合親和性(Ｋｄ)および／または正確にまたは約７.４のｐＨおよび１mM乳酸(両端を含む)の一方または両方を含む条件下で１×１０−８Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−６Ｍまたはそれ以上のＥＧＦＲに対するＫｄを有し得る。
ここでの例のいずれかにおいて、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントの結合親和性を半数効果濃度(ＥＣ５０)の観点で測定する。このような例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、結合しているＥＧＦＲまたはその可溶性フラグメントに対して酸性ｐＨ(ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む))および／または１５mM〜２０mM乳酸(両端を含む)の一方または両方を含む条件下、１０mM、５mM、４mM、３mM、２mM、１mMまたはそれ以下であるＥＣ５０および／または結合しているＥＧＦＲまたはその可溶性フラグメントに対して５mM、１０mM、１５mM、２０mM、２５mM、３０mM、４０mM、５０mM、６０mMまたはそれ以上であるＥＣ５０で結合活性を有し得る。
ここでの例のいずれかにおいて、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの結合活性は、例えば、ヒト血清のような血清中にまたはヒト血清アルブミンのような血清アルブミンとして提供され得る、少なくとも１２mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mL、４０mg／mL、４５mg／mLまたは５０mg／mLのタンパク質濃度存在下で測定できる。
ここでの例のいずれかにおいて、タンパク質を血清中に提供し、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびフラグメントの結合活性を試験するための結合アッセイを、２０％(vol/vol)〜９０％(vol/vol)血清、例えば２０％(vol/vol)〜５０％(vol/vol)または２０％(vol/vol)〜４０％(vol/vol)血清の存在下で実施する。具体例では、結合アッセイを、２５％(vol/vol)血清または約２５％(vol/vol)血清、例えばヒト血清の存在下で行う。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの可変重鎖は、配列番号２または７に示す非修飾可変重鎖のような非修飾可変重鎖と比較して、１〜５０個のアミノ酸置換、例えば１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個のアミノ酸置換を含む、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体のアミノ酸配列と比較して、１個以上のアミノ酸置換を含み得る。
ここに提供するあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲ結合フラグメントは、製造後単離または精製できる。
ここに提供されるのは、標的剤に直接的または間接的に結合した、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかを含む接合体である。このような接合体は、ＥＧＦＲ(Ａｂ)に結合する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント、１種以上の標的剤および任意にＡｂを標的剤に結合させるためのリンカー(Ｌ)を含む。いくつかの例において、０〜８個のリンカーにより抗体に結合した１〜８種の標的剤が存在する。
接合体の標的剤はタンパク質、ペプチド、核酸または小分子であり得る。具体例では、標的剤は細胞毒性部分、放射性同位体、化学療法剤、溶解性ペプチドまたはサイトカインのような治療部分である。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントのいずれかと結合できる治療部分の例は、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；臭化エチジウム；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テニポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；マイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体；アウリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体；ドラスタチン１０もしくは１５またはその類似体；イリノテカンまたはその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリチアマイシンまたはその類似体もしくは誘導体；代謝拮抗剤；アルキル化剤；白金誘導体；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラシェルマイシン(ＣＣ−１０６５)またはその類似体もしくは誘導体；抗生物質；ピロロ[２,１−ｃ][１,４]−ベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)；毒素；リボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)；デオキシリボヌクレアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡおよびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。
具体例では、治療部分は、アンサマイトシンまたはメルタンシン(ＤＭ１)のようなマイタンシノイド類であるマイタンシン誘導体；アウリスタチンまたはモノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)またはＦ(ＭＭＡＦ)のようなその機能的ペプチド類似体もしくは誘導体；メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビンまたはクラドリビンのような代謝拮抗剤；メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(ＢＣＮＵ)、ロムスチン(ＣＣＮＵ)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(ＤＴＩＣ)、プロカルバジンおよびマイトマイシンＣのようなアルキル化剤；シスプラチンまたはカルボプラチンのような白金誘導体；ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンおよびアントラマイシン(ＡＭＣ)のような抗生物質；ジフテリア毒素およびその活性フラグメントおよびハイブリッド分子、リシン毒素、コレラ毒素、志賀様毒素、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボウマン・バークプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ガラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシン毒素のような毒素；またはピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)である。ＰＢＤ接合体は天然に存在するまたは合成のＰＢＤを含み得る。天然に存在するＰＢＤは、アブベイマイシン、アントラマイシン、チカマイシン、ＤＣ−８１、マゼトラマイシン、ネオトラマイシンＡおよびＢ、ポロトラマイシン、プロトラカルシン、シバノマイシン(ＤＣ−１０２)、シビロマイシンおよびトママイシンを含む。接合体の例はまた、二量体の単量体ＰＢＤを連結する架橋を含む二量体を含む、ＰＢＤ二量体を含む。ＰＢＤ二量体はホモ二量体でもヘテロ二量体でもよい。
いくつかの例において、接合体の抗体と標的剤は直接的に結合される。他の例において、接合体の抗体と標的剤はリンカーを介して連結される。リンカーは、切断可能でも切断不可能でもよい、ペプチド、ポリペプチドまたは化学的リンカーであり得る。リンカーを、いくつかの手段により抗体に結合できる。例えば、リンカーを、抗体上の１個以上の遊離チオールにまたは抗体上の１個以上の１級アミンに結合できる。
またここに提供されるのは、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかの重鎖またはその抗原結合フラグメントをコードするもののようなコードする核酸分子である。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、ＥＧＦＲ結合フラグメントまたは重鎖のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターおよびここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、ＥＧＦＲ結合フラグメントまたは重鎖のいずれかをコードする核酸分子を含むここに提供するベクターを含む原核細胞または真核細胞のような細胞が提供される。
適当な宿主細胞中で、重鎖および軽鎖をコードするここに提供する１個以上のベクターから重鎖または軽鎖を発現させ、該抗体を回収することによる、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの製造法もここで提供される。
ここに提供されるのは、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントまたはここに提供する接合体および化学療法剤または抗癌剤を含む組み合わせ剤である。薬剤は、アルキル化剤、ニトロソウレア類、トポイソメラーゼ阻害剤および抗体から選択される。いくつかの例において、化学療法剤はイリノテカン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、ゼローダ、カンプトサール、エロキサチン、アドリアマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビンまたはカルボプラチンである。いくつかの例において、化学療法剤は第一抗体と異なるさらなる抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの例において、さらなる抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよびそれらの抗原結合フラグメントまたはそれらの変異体から選択される。
ここに提供されるのは、１個以上の容器中のここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントまたはここに提供する組み合わせ剤および使用指示書を含む、キットである。
ここに提供されるのは、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体、抗原結合フラグメントまたは接合体のいずれかおよび薬学的に許容される担体または添加物を含む、医薬組成物である。ここに提供する医薬組成物は、ゲル剤、軟膏剤、液剤、懸濁液剤、エアロゾル剤、錠剤、丸剤、散剤または凍結乾燥剤として製剤できおよび／または全身投与、非経腸投与、局所投与、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、皮下投与、噴霧投与、静脈内投与、気管支投与、肺投与、膣投与、外陰腟投与、食道投与または口腔食道投与用に製剤できる。ここに提供する医薬組成物を単回用量投与用または複数回用量投与用に製剤できる。いくつかの例において、ここに提供する医薬組成物は、徐放性製剤である。
ここに提供されるのは、ここに提供する医薬組成物の薬学的有効量を対象に投与することを含む、対象における抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態の処置法である。抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態の例は、固形腫瘍、癌または転移のような腫瘍、特に該腫瘍がＥＧＦＲを発現するときである。
いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態は頭頸部癌、非小細胞性肺癌または結腸直腸癌である。いくつかの例において、処置する対象は、抗ＥＧＦＲ治療に対する耐性を付与するＫＲＡＳ、ＮＲＡＳまたはＢＲＡＦのようなマーカーを有しない腫瘍を有する。それゆえに、いくつかの例において、対象は、ＫＲＡＳ変異陰性上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)発現結腸直腸癌を有し得る。
処置対象は、ヒトのような哺乳動物であり得る。対象を、ここに提供する医薬組成物の外用投与、非経腸投与、局所投与または全身投与により処置し得る。例えば、医薬組成物を鼻腔内に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、静脈内に、皮下に、経口でまたは肺投与により投与できる。
ここに提供する対象における抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態の処置法はまた、イリノテカン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、ゼローダ、カンプトサール、エロキサチン、アドリアマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、カルボプラチンおよび放射線のような１種以上の抗癌剤または処置の適用を含んでよく、またはセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよびその抗原結合フラグメントのような１種以上のさらなる抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含んでよい。
このような方法において、医薬組成物および抗癌剤は、単一組成物としてまたは別々の組成物として製剤してよく、医薬組成物および抗癌剤を逐次的に、同時にまたは断続的に投与してよい。
ここに提供する方法において、抗体を凡そまたは正確に０.１mg／kg〜凡そまたは正確に１００mg／kg、例えば、凡そまたは正確に０.５mg／kg〜凡そまたは正確に５０mg／kg、凡そまたは正確に５mg／kg〜凡そまたは正確に５０mg／kg、凡そまたは正確に１mg／kg〜凡そまたは正確に２０mg／kg、凡そまたは正確に１mg／kg〜凡そまたは正確に１００mg／kg、凡そまたは正確に１０mg／kg〜凡そまたは正確に８０mg／kgまたは凡そまたは正確に５０mg／kg〜凡そまたは正確に１００mg／kgまたはそれ以上の投与量で；または凡そまたは正確に０.０１mg／ｍ２〜凡そまたは正確に８００mg／ｍ２またはそれ以上、例えば、凡そまたは正確に０.０１mg／ｍ２、凡そまたは正確に０.１mg／ｍ２、凡そまたは正確に０.５mg／ｍ２、凡そまたは正確に１mg／ｍ２、凡そまたは正確に５mg／ｍ２、凡そまたは正確に１０mg／ｍ２、凡そまたは正確に１５mg／ｍ２、凡そまたは正確に２０mg／ｍ２、凡そまたは正確に２５mg／ｍ２、凡そまたは正確に３０mg／ｍ２、凡そまたは正確に３５mg／ｍ２、凡そまたは正確に４０mg／ｍ２、凡そまたは正確に４５mg／ｍ２、凡そまたは正確に５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に１００mg／ｍ２、凡そまたは正確に１５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に２００mg／ｍ２、凡そまたは正確に２５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に３００mg／ｍ２、凡そまたは正確に４００mg／ｍ２、凡そまたは正確に５００mg／ｍ２、凡そまたは正確に６００mg／ｍ２、凡そまたは正確に７００mg／ｍ２の投与量で投与できる。
またここに提供されるのは、対象における抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態の処置用医薬として製剤できる医薬組成物および対象における抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態の処置のための医薬組成物の使用である。このような医薬組成物または使用は、固形腫瘍および／またはＥＧＦＲを発現する腫瘍、癌または転移のような腫瘍に適用できる。具体例では、ここに提供する医薬組成物または使用により処置する状態は頭頸部癌、非小細胞性肺癌または結腸直腸癌である。
図１(Ａ〜Ｂ)は、当分野におけるセツキシマブの重鎖および軽鎖の例のアライメントを示す。例えば、図１Ａは、配列番号２に示す重鎖可変ドメイン(ＶＨ)および配列番号２１に示す重鎖定常ドメイン(ＣＨ)を含む配列番号５に示す重鎖アミノ酸配列；配列番号７に示すＶＨおよび配列番号２２に示すＣＨを含む配列番号６に示す重鎖配列；配列番号２に示すＶＨおよび配列番号２３に示すＣＨを含む配列番号１２に示す重鎖配列ならびに配列番号２に示すＶＨおよび配列番号２０に示すＣＨを含む配列番号１に示す重鎖配列のアラインメントを示す。重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、重鎖の３個の相補性決定領域(ＣＤＲ)(ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３)、重鎖定常ドメインの３個のサブドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３)およびヒンジ領域残基を、領域またはドメインの各々で標識した矢印により示す。図１Ｂは、配列番号４に示す軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)および配列番号３３に示す軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)を含む配列番号３に示す軽鎖配列；配列番号１１に示すＶＬおよび配列番号３３に示すＣＬを含む配列番号１０に示す軽鎖配列；配列番号１３に示す配列番号４に示すＶＬおよび配列番号３４に示すＣＬを含む軽鎖配列ならびに配列番号９に示すＶＬおよび配列番号３４に示すＣＬを含む配列番号８に示す軽鎖配列のアライメントを示す。軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)、軽鎖の３個の相補性決定領域(ＣＤＲ)(ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３)および軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)を、領域またはドメインの各々で標識した矢印により示す。示すアラインメントにおいて、“＊”は、整列させた残基が同一であることを意味し、“：”は、整列させた残基が同一ではないが、類似し、整列させた位置に保存的アミノ酸残基を含むことを意味し、そして“．”は、整列させた残基が類似しており、整列させた位置に半保存的アミノ酸残基を含むことを意味する。１０４位に対応するアミノ酸置換のための例示的、非限定的位置を強調表示により示す。
図２(Ａ〜Ｄ)は、整列させた複数抗体の間および中で対応する残基を同定するためのアライメントを示す。例えば、図２Ａは、配列番号２および７に示す重鎖可変ドメインと配列番号１４に示すＨ２２５と名づけた代表的非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変ドメインのアライメントを示す。図２Ｂは、配列番号２および７に示す重鎖可変ドメインと配列番号１６に示すＨｕ２２５と名づけた代表的非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変ドメインのアライメントを示す。重鎖定常ドメインの３個のサブドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３)を、ドメインの各々で標識した矢印により示す。図２Ｃは、配列番号４、９および１１に示す軽鎖可変ドメインと配列番号１５に示すＨ２２５と名づけた代表的非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変ドメインのアライメントを示す。図２Ｄは、配列番号４、９および１１に示す軽鎖可変ドメインと、配列番号１７に示すＨｕ２２５と名づけた代表的非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変ドメインのアライメントを示す。軽鎖の３個の相補性決定領域(ＣＤＲ)(ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３)を、ドメインの各々で標識した矢印により示す。示すアラインメントにおいて、“＊”は、整列させた残基が同一であることを意味し、“：”は、整列させた残基が同一ではないが、類似し、整列させた位置に保存的アミノ酸残基を含むことを意味し、そして“．”は、整列させた残基が類似しており、整列させた位置に半保存的アミノ酸残基を含むことを意味する。アミノ酸置換のための、例示的、非限定的、対応位置を強調表示により示す。
詳細な記載
概略
Ａ. 定義
Ｂ. ＥＧＦＲおよび抗ＥＧＦＲ抗体
１. ＥＧＦＲ
２. 抗ＥＧＦＲ抗体および副作用
３. セツキシマブ(アービタックス)およびその誘導体
ａ. 構造
ｂ. 機能
Ｃ. 酸性ｐＨ選択性を有する修飾活性抗ＥＧＦＲ抗体
１. １０４Ｅ修飾を含む抗ＥＧＦＲ抗体
ａ. さらなる修飾
ｉ. さらなる重鎖修飾
ii. さらなる軽鎖修飾
iii.他の修飾
ｂ. 代表的１０４Ｅ修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメント
２. ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体
３. １０４Ｄ修飾を含む抗ＥＧＦＲ抗体
４. 接合体
ａ. 標的剤
ｉ. マイタンシノイド薬物部分
ii. アウリスタチンおよびドラスタチン薬物部分
iii.ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)
iv. 細胞毒素部分
ｖ. 標的化送達用核酸
ｂ. リンカー
ｉ. ペプチドリンカー
ii. 化学的リンカー
ｃ. 代表的接合体
ｉ. 抗ＥＧＦＲ抗体−アウリスタチン接合体
ii. 抗ＥＧＦＲ抗体−マイタンシノイド接合体
Ｄ. 抗ＥＧＦＲ抗体の製造法
１. 抗ＥＧＦＲ抗体の産生および作製
ａ. ベクター
ｂ. 細胞および発現系
ｉ. 原核発現
ii. 酵母
iii. 昆虫
iv. 哺乳動物細胞
ｖ. 植物
２. 精製
Ｅ. 抗ＥＧＦＲ抗体特性および活性の同定および評価のための方法
１. 結合アッセイ
２. 細胞アッセイ
３. 動物モデル
４. 薬物動態および薬力学アッセイ
Ｆ. 医薬組成物、製剤、キット、製品および組み合わせ剤
１. 医薬組成物および製剤
２. 製品／キット
３. 組み合わせ剤
Ｇ. 治療用途
１. 疾患および状態の例
ａ. 癌
ｂ. 非癌過増殖性疾患
ｃ. 自己免疫疾患または障害
ｄ. 炎症性障害
ｅ. 感染症
ｆ. 他の疾患および状態
２. 治療の対象
ａ. ＥＧＦＲを過発現する対象の選択
ｂ. ＥＧＦＲ関連多型を示す対象の選択
ｃ. 抗ＥＧＦＲ関連副作用を示す対象の同定
ｉ. 皮膚毒性
ii. 低マグネシウム血症
ｄ. 処置対象を選択または同定する他の方法
３. 投与量
４. 投与経路
５. 組み合わせ治療
Ｈ. 実施例
Ａ. 定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。ここでの開示全体を通して引用されている全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、GenBank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公開された資料を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。ここでの用語について複数の定義が存在する場合、本章のものが優先する。ＵＲＬまたは他のこのような識別名またはアドレスが引用されているとき、このような識別名は変化する可能性があり、インターネット上の特定の情報は現れては消えることがあるが、同等な情報をインターネットでの検索により見つけることができる。これらの引用は、このような引用の利用可能性および公的頒布を証明する。
ここで使用する条件付活性タンパク質(例えば、抗体)は、第二の環境と比較して、ある環境、特にインビボ環境で、高活性である。それゆえに、条件付活性タンパク質は、他の環境と比較して、ある環境で選択的活性(例えば、結合活性)を示す。ここでの目的のために条件付活性タンパク質はｐＨ選択的活性を示し、皮膚、消化管または他の非腫瘍環境におけるような非腫瘍環境に存在するような７.０〜７.４(両端を含む)のｐＨおよび／または０.５mM〜５mM乳酸(例えば、１mM)(両端を含む)の一方または両方を含む条件下より、腫瘍環境に存在するような、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および／または１０mM〜２０mM乳酸(両端を含む)の一方または両方を含む条件下で高活性である。それゆえに、ここに提供する条件付活性タンパク質は、選択的活性を示し、皮膚、消化管または他の非腫瘍環境のような非腫瘍微小環境より腫瘍微小環境で高活性であるタンパク質である。条件付活性はインビボまたはインビトロで顕在化し得る。例えば、腫瘍環境における活性(例えば、結合活性)が非腫瘍環境より大きければ、例えば、非腫瘍微小環境と比較した腫瘍環境における活性比が少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、１６.０、１７.０、１８.０、１９.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上であるならば、条件付活性はインビボで存在する。
ここで使用する“腫瘍微小環境において条件付活性”を有するまたは“腫瘍微小環境において条件付活性である”治療剤またはこのバリエーションは、非腫瘍微小環境(例えば、皮膚の基底層のような健常もしくは非罹患組織または細胞)よりも腫瘍微小環境において治療剤として高活性である、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のような治療剤である。
ここで使用する“ｐＨ選択的活性”は、中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.０〜７.４および所望により正常乳酸濃度、例えば、０.５mM〜５mM)の環境より、酸性ｐＨ(例えば、ｐＨ６.０〜６.５および所望により高乳酸レベル、例えば、１０mM〜２０mM)含む条件下またはこの存在下で高活性であるタンパク質(例えば、抗体)をいう。ｐＨ選択的活性インビボまたはインビトロで顕在化し得る。ｐＨ選択的活性は、中性条件(例えば、ｐＨ７.０〜７.４および／または０.５mM〜５mM乳酸)下より酸性条件(例えば、ｐＨ６.０〜６.５および／または１０mM〜２０mM乳酸)下で活性(例えば、結合活性)が高いならば、存在する。例えば、ｐＨ選択的活性は、酸性条件下対中性条件下の活性比が少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、１６.０、１７.０、１８.０、１９.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上であるならば、存在する。
ここで使用する罹患または非罹患微小環境を“模倣する条件”は、インビボの環境で存在する１個以上の条件に対応する、インビトロまたはインビボアッセイ条件をいう。例えば、微小環境が低または酸性ｐＨにより特徴付けられるならば、該微小環境を模倣する条件は、低または酸性ｐＨを有する緩衝液またはアッセイ条件を含む。
ここで使用する腫瘍微小環境で存在する条件は、非腫瘍微小環境(例えば、健常もしくは非罹患細胞または組織)と比較して、そこに存在する条件である。腫瘍微小環境で存在する条件は、腫瘍の指標である血管新生増加、低酸素症、低ｐＨ、乳酸濃度増加、ピルビン酸濃度増加、間質液圧上昇および代謝物または代謝の変化を含む。例えば、腫瘍微小環境で存在する条件は低ｐＨ、すなわち、７.４未満のｐＨ、典型的に正確にまたは凡そ５.６〜６.８、例えばｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８未満または凡そもしくは正確にｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８である。腫瘍微小環境で存在する条件はまた正確にまたは凡そ５mM〜２０mM乳酸、例えば１０mM〜２０mM乳酸、例えば１５mM〜１８mM、特に少なくともまたは少なくとも凡そまたは正確に１６mM、１６.５mM、１６.７mMまたは１７mM乳酸の高乳酸濃度を含み得る。
ここで使用する非腫瘍微小環境で存在する条件は、腫瘍微小環境で存在しない１個以上の条件を含む。ここでの目的のために、該１個以上の条件は、ｐＨ、乳酸濃度またはピルビン酸濃度のような、腫瘍微小環境および非腫瘍環境に存在するが、これら２つの微小環境で異なる対応する特性または特徴である。非腫瘍微小環境(例えば、皮膚の基底層)で存在する条件は、約７.０〜約７.８のｐＨ、例えば少なくともまたは凡そまたは正確にｐＨ７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７または７.８である。例えば、ｐＨは、正確にまたは凡そ７.０〜７.４、例えば正確にまたは凡そｐＨ７.４の中性ｐＨである。非腫瘍微小環境(例えば、皮膚の基底層)で存在する条件はまた、０.５〜５mM乳酸、例えば０.５mM〜４mM乳酸、例えば凡そまたは正確に０.５mM、１mM、２mM、３mM、４mMまたは５mM乳酸である乳酸濃度である。
ここで使用する“低ｐＨ”または“酸性ｐＨ”(これらはここで交換可能に使用する)は、約５.６〜約６.８の範囲のｐＨ、例えば、ｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８未満または凡そまたは正確にｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８をいう。例えば、低ｐＨまたは酸性ｐＨは、６.０〜６.５(両端を含む)、例えば正確にまたは凡そｐＨ６.０またはｐＨ６.５である。
ここで使用する上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ；Uniprot Accession No. P00533および配列番号４３に示す)は、受容体チロシンキナーゼ群のＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、上皮成長因子(ＥＧＦ)ならびにＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ(ＨＢ−ＥＧＦ)およびベータセルリンを含む他の内在性ＥＧＦ様リガンドのようなリガンドと結合し、活性化する、チロシンキナーゼ増殖因子受容体である。活性化により、ＥＧＦＲは、細胞成長、増殖、生存および運動性に重要なシグナル伝達カスケードに関与する。腫瘍細胞上への存在に加えて、上皮成長因子受容体は遍在性であり、造血細胞および上皮起源の細胞を除く、正常細胞の表面上に無作為に分布する。例えば、ＥＧＦＲは皮膚ケラチン生成細胞上に発現される。
ここで使用する、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの結合活性と関連する活性比は、凡そまたは正確に７.４のｐＨおよび凡そまたは正確に１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む第二セットの条件下と比較した、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および乳酸濃度１５mM〜２０mM(両端を含む)の一方または両方を含む第一セットの条件下でのＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲまたはその可溶性フラグメント)に対する結合活性の比率をいう。活性が、結合活性と正に相関する限り、第一条件での活性を第二条件での活性で除した商により表す。ここでのいくつかの例において、結合活性を、結合活性と負に相関する指標として提供する(例えば、ＥＣ５０またはＫＤ)。このような例において、活性比を、最初に両セットの条件下の結合活性の逆数として表し、その後、第一条件での活性の逆数を第二条件での活性の逆数で除した商として表す。結合活性および結合活性比の決定において、第一および第二条件下の結合活性を、ｐＨおよび／または乳酸濃度の差異以外同様のアッセイ条件下で測定することは理解される。＞１の結合活性比は、結合活性が第二セットの条件下より第一セットの条件下で大きいまたは高いことを示す。
ここで使用する抗ＥＧＦＲ抗体は、上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに特異的に結合し、リガンドのＥＧＦＲへの結合を阻止し、それによりＥＧＦＲの競合的阻害およびＥＧＦＲ活性化の阻害を生じるあらゆる抗体をいう。それゆえに、抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＲ阻害剤である。ここでの抗ＥＧＦＲ抗体への言及は、ＥＧＦＲに特異的に結合する完全長抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。
ここで使用する上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)抗原は、上皮成長因子(ＥＧＦ)のようなリガンドにより結合されるチロシン増殖因子受容体をいう。ＥＧＦＲはヒトタンパク質および非ヒトタンパク質を含む。特に、ＥＧＦＲ抗原は、配列番号４３に示すアミノ酸配列を有する１７０kDa Ｉ型糖タンパク質である、ヒトＥＧＦＲを含む(例えば、Uniprot Accession No. P00533参照)。
ここで使用する可溶性ＥＧＦＲは、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを欠く可溶性ＥＧＦＲアイソフォーム(ｓＥＧＦＲ)をいう。それゆえに、可溶性ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)部分のみを含むタンパク質である。代表的可溶性ＥＧＦＲは、配列番号４３に示すＥＧＦＲのＥＣＤまたは配列番号４３のアミノ酸残基２５〜６４５に対応するＥＧＦに結合するのに十分なその一部またはＥＧＦに結合するのに十分なその一部しか含まない。可溶性ＥＧＦＲはまた、他のタンパク質の他のドメインまたは領域に、直接的または間接的に結合したタンパク質も含み得る。
ここで使用するセツキシマブ(２２５、アービタックスとして知られ、市販されている)は、ＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＧＦＲ阻害剤であるキメラ(マウス／ヒト)モノクローナル抗体である、抗ＥＧＦＲ抗体である。セツキシマブは、各４４９アミノ酸の２個の同一重鎖(例えば、配列番号１２に示す)および各２１４アミノ酸の２個の同一軽鎖(例えば、配列番号１３に示す)を含む、４個のポリペプチド鎖からなると報告されている(IMGT Acc. No. 7906参照)。Ｍ２２５の可変領域に対応する可変領域は、配列番号１２のアミノ酸残基１〜１１９(可変重鎖、配列番号２に示す)および配列番号１３のアミノ酸残基１〜１０７(可変軽鎖、配列番号４として示す)として示す。Ｃ２２５は、ＣＨ１(配列番号１２のアミノ酸残基１２０〜２１７)、ヒンジ領域(配列番号１２のアミノ酸残基２１８〜２３２)、ＣＨ２(配列番号１２のアミノ酸残基２３３〜３４２)およびＣＨ３(配列番号１２のアミノ酸残基３４３〜４４９)を含む、ヒト定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ヒンジ−ＣＨ３を含む配列番号１２のアミノ酸残基１２０〜４４９(配列番号２３に示す)として示すヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。Ｃ２２５はまた、配列番号１３のアミノ酸残基１０８〜２１３として示すヒトＣκ軽鎖定常領域も含む(配列番号３４として示す)。ここでのセツキシマブへの言及はまた、数アミノ酸のみ異なる、文献に報告された抗体もいう(例えば、米国特許７,０６０,８０８号；公開米国特許出願ＵＳ２０１１０１１７１１０号；米国特許公開ＵＳ２０１３０２６６５７９号；国際公開ＰＣＴ出願ＷＯ２００４０８５４７４号；GenBank Accession No. CAH61633；DrugBank Acc. No. DB00002；IMGT Acc. No. 7906参照)。それゆえに、ここでのセツキシマブの言及はまた、配列番号１(重鎖)および３(軽鎖)；配列番号５(重鎖)および３(軽鎖)；配列番号６(重鎖)および８(軽鎖)；または配列番号６(重鎖)および１０(軽鎖)に示すアミノ酸配列も含む。セツキシマブ配列および対応する配列番号は図１Ａおよび１Ｂならびに表５に提供する。
ここでのセツキシマブに関して、特定したとき、セツキシマブと同一の相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む、セツキシマブのヒト化または他の変異誘導体も含む。セツキシマブのＣＤＲは、ＶＨ ＣＤＲ１(カバトの定義によると、配列番号２または７のアミノ酸残基３１〜３５、配列番号３５に示す)；ＶＨ ＣＤＲ２(配列番号２または７のアミノ酸残基５０〜６５、配列番号３６に示す)；ＶＨ ＣＤＲ３(配列番号２または７のアミノ酸残基９８〜１０８、配列番号３７に示す)；ＶＬ ＣＤＲ１(配列番号４、９または１１のアミノ酸残基２４〜３４、配列番号３８に示す)；ＶＬ ＣＤＲ２(配列番号４、９または１１のアミノ酸残基５０〜５６、配列番号３９に示す)およびＶＬ ＣＤＲ３(配列番号４、９または１１のアミノ酸残基８９〜９７、配列番号４０に示す)を含み、例えば、米国公開ＵＳ２０１１０１１７１１０号を参照のこと。
ここで使用するセツキシマブの抗原結合フラグメントは、セツキシマブに由来するが、セツキシマブの完全長に満たず、しかし、抗原結合部位を形成するのに十分な抗体の可変領域の少なくとも一部分(例えば、１個以上のＣＤＲ)を含み、それゆえに、セツキシマブの結合特異性および／または活性を保持する抗体である。セツキシマブ重鎖の可変領域は配列番号２または７に示し、これは配列番号１、５、６または１２のアミノ酸１〜１１９に対応する。セツキシマブ軽鎖の可変領域は配列番号４、９または１１に示し、これは配列番号３、８、１０または１３のアミノ酸１〜１０７に対応する(図１Ａまたは１Ｂおよび表５参照)。それゆえに、セツキシマブの抗原結合フラグメントの例は、配列番号２に示すアミノ酸配列(可変重鎖)および配列番号４に示すアミノ酸配列(可変軽鎖)を含む抗体、配列番号７に示すアミノ酸配列(可変重鎖)および配列番号９に示すアミノ酸配列(可変軽鎖)を含む抗体、配列番号７に示すアミノ酸配列(可変重鎖)および配列番号１１に示すアミノ酸配列(可変軽鎖)を含む抗体または抗原に結合するのに十分な可変重鎖または軽鎖の一部である。例えば、セツキシマブの抗原結合フラグメントの例は、配列番号２または７に示すアミノ酸配列を含む、そして配列番号２３に示すＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域または配列番号１９〜２２のいずれかに示す他の報告されているＩｇＧ１のＣＨ１領域(ＶＨ−ＣＨ１)および配列番号３(軽鎖ＶＨ−ＣＬ)を含む、Ｆａｂ抗体である。
ここで使用する“非修飾抗体”は、ここに提供する修飾用に選択される、出発ポリペプチド重鎖および軽鎖またはそのフラグメントをいう。出発標的ポリペプチドは、それに対して活性を評価する優性基準ポリペプチドである、野生型または基準の型抗体であり得る。例えば、セツキシマブは、ここでの修飾のための優性または基準ポリペプチドである。非修飾または出発標的抗体は、優性型または対照の抗体と異なるが、それにもかかわらず、ここでは、ここで産生されるその後に修飾されるポリペプチドに対して出発非修飾標的タンパク質と言えるように改変または変異され得る(例えば、セツキシマブの抗原結合フラグメントまたは変異体)。それゆえに、非修飾基準タンパク質と比較して、特定の活性または特性が望ましい増加または減少をするように修飾されている、当分野で知られる存在するタンパク質を出発非修飾標的タンパク質として選択し、使用できる。
例えば、一箇所以上の単一アミノ酸変化により優性型または対照から修飾されており、免疫原性の減少のような望ましい特性が増加または減少したタンパク質は、同一のまたは異なる特性のさらなる修飾のために、ここでは非修飾と呼ぶ、標的タンパク質であってよい。対照または非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号１(重鎖)と３(軽鎖)、配列番号５(重鎖)と３(軽鎖)、配列番号１２(重鎖)と１３(軽鎖)または配列番号６(重鎖)と８(軽鎖)、配列番号６(重鎖)と１０(軽鎖)に示す完全長抗ＥＧＦＲ抗体ポリペプチドまたはその抗原結合フラグメントである。抗原結合フラグメントの例は、配列番号２(可変重鎖)および４(可変軽鎖)、配列番号７(可変重鎖)および９(可変軽鎖)または配列番号７(可変重鎖)および配列番号１１(可変軽鎖)に示すポリペプチドを含む抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントを含む。非修飾または対照抗体はまた、引用した配列番号のいずれかと少なくとも６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を示し、それにより得られた抗体がＥＧＦＲと特異的に結合する、重鎖もしくは軽鎖またはその一部を示すその抗体変異体を含む。
ここで使用する“修飾抗ＥＧＦＲ抗体”または“変異体抗ＥＧＦＲ抗体”は、対照または非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、アミノ酸配列にここに記載するような少なくとも１個のアミノ酸付加、欠失または置換を含む、抗ＥＧＦＲ抗体をいう。ここでの目的のために、少なくとも１個のアミノ酸置換は、配列番号２または７を参照して１０４位に対応する位置での可変重鎖におけるグルタミン酸(Ｅ)での置換である。修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、さらなる修飾(例えば、アミノ酸置換)を含んでよい。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、得られる修飾抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲに結合する限り、最大１５０個のアミノ酸置換を有し得る。典型的に、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾抗体と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個または５０個のアミノ酸置換を含む。修飾抗ＥＧＦＲ抗体はまた、ここに記載する少なくとも１個のアミノ酸付加、欠失または置換に加えて、任意の１個以上の他の修飾も含み得ると理解される。
ここで使用する可変重鎖、可変軽鎖または両方における修飾と関連する“両方”は、抗体が可変重鎖に１個以上の修飾および抗体の可変軽鎖に１個以上の修飾を含むことを意味する。
ここで使用する“修飾”は、ポリペプチドのアミノ酸配列または核酸分子のヌクレオチド配列の修飾に関し、それぞれアミノ酸またはヌクレオチドの欠失、挿入および置換を含む。ポリペプチドを修飾する方法は、組み換えＤＮＡ法を使用するような、当業者には日常的なものである。
ここで使用する“欠失”は、核酸配列またはポリペプチド配列に関係するとき、標的ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは天然もしくは野生型配列のような配列と比較して、１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失をいう。
ここで使用する“挿入”は、核酸配列またはポリペプチド配列に関係するとき、標的、天然、野生型または他の関連配列内の１個以上のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入をいう。それゆえに、野生型配列と比較して、１個以上の挿入を含む核酸分子は、配列の直線範囲内に１個以上のさらなるヌクレオチドを含む。ここで使用する、核酸およびアミノ酸配列への“付加”は、他方の配列と比較して、いずれかの末端へのヌクレオチドまたはアミノ酸の付加をいう。
ここで使用する“置換”または“置き換え”は、分子の長さ(残基数で表現して)を変えることなく、天然、標的、野生型または他の核酸またはポリペプチド配列における１個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸を別のヌクレオチドまたはアミノ酸に置き換えることをいう。それゆえに、分子における１個以上の置換は、分子のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を変化させない。特定のポリペプチドと比較したアミノ酸置換は、ポリペプチド配列の長さに沿ったアミノ酸残基の数の観点で表現できる。例えば、アミノ酸配列の１０４番目の位置に、チロシン(Ｔｙｒ；Ｙ)のグルタミン酸(Ｇｌｕ；Ｅ)への置換／置き換えであるアミノ酸の修飾を有する修飾ポリペプチドは、Ｙ１０４Ｅ、Ｔｙｒ１０４Ｇｌｕまたは１０４Ｅと表現できる。単純なＹ１０４を使用して、修飾された１０４番目の位置のアミノ酸がチロシンであると示すことができる。ここでの目的のために、修飾が抗体の重鎖(ＨＣ)または軽鎖(ＬＣ)であるため、修飾をまた改変されるポリペプチドの鎖を示すために、ＨＣ−またはＬＣ−を参照して示すこともできる。
ここで使用する、配列表に示すような開示した配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸位置“に対応する位置”または“に対応する”ヌクレオチドまたはアミノ酸位置の記述は、ＧＡＰアルゴリズムのような標準アライメントアルゴリズムを使用して同一性を最大化するために開示した配列とアライメントして同定されたヌクレオチドまたはアミノ酸位置をいう。ここでの目的のために、ここに提供する修飾のための残基は、配列番号２に示すまたは７に示す可変重鎖および配列番号４、９または１１に示す可変軽鎖に示すアミノ酸位置を参照する。それゆえに、対応する残基は、配列番号２または７に示す配列を有する対照重鎖配列またはその一部のアライメント(例えば、図２Ａまたは２Ｂ)および／または配列番号４、９または１１に示す配列を有する対照軽鎖配列またはその一部のアライメント(例えば、図２Ｃまたは２Ｄ)により決定できる。配列の整列により、当業者は、例えば、保存アミノ酸残基および同一アミノ酸残基を指針として使用して、対応する残基を同定できる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸配列を、最大のマッチが得られるように整列させる例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照)。代表的アライメントを図２Ａ〜Ｄに提供し、対応する整列させた残基に基づく代表的アミノ酸置換を表６および表８に示す。
ここで使用する配列のアライメントは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２個以上の配列を整列するための相同性の使用をいう。典型的に、５０％以上の同一性で関連している２個以上の配列を整列させる。整列させた配列のセットは、対応する位置で整列させた２個以上の配列をいい、ＥＳＴのようなＲＮＡ由来の整列配列およびゲノムＤＮＡ配列と整列させた他のｃＤＮＡを含み得る。関連または変異体ポリペプチドまたは核酸分子を、当業者に知られる任意の方法で整列できる。このような方法は、典型的にマッチを最大化し、手動アライメントを使用するおよび多数の利用可能なアライメントプログラム(例えば、ＢＬＡＳＴＰ)を使用することによる方法および当業者に知られるその他のものを含む。ポリペプチドまたは核酸の配列を整列することにより、当業者は、指針として保存アミノ酸残基および同一アミノ酸残基を使用して、類似部分または位置を同定できる。さらに、当業者はまたヒト配列および非ヒト配列の間および中で対応するアミノ酸またはヌクレオチド残基を発見する指針として保存アミノ酸またはヌクレオチド残基を用いることもできる。対応する位置はまた、例えば、タンパク質構造のコンピュータシミュレーションしたアライメントを使用することにより、構造的アライメントにも基づき得る。他の例において、対応する領域を同定できる。当業者はまたヒト配列および非ヒト配列の間および中で対応する対応するアミノ酸残基を発見する指針として保存アミノ酸残基も用いることができる。
ここで使用する、タンパク質を“同じ条件下で比較する”なる記載は、異なるタンパク質を、タンパク質または薬剤の活性または特性に影響を与え得る何らかの１個以上の条件が、試験薬剤間で変わらないかまたは実質的に変わらないように、等しくまたは実質的に等しく処理することを意味する。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較するとき、該ポリペプチドの量または濃度；活性剤(例えば、抗ＥＧＦＲ抗体)以外の添加物、担体または製剤中の他の成分の存在とその量；温度；ｐＨ；保存時間；保存容器；保存時の状態(properties of storage)(例えば、撹拌)および／または暴露または使用と関係する他の条件のような任意の１個以上の条件は、比較するポリペプチド間および中で同一または実質的に同一である。
ここで使用する“有害作用”または“副作用”または“有害事象”または“有害副作用”は、治療剤の投与と関係する傷害性の、危険なおよび／または望ましくない効果をいう。例えば、セツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関係する副作用は当業者に知られ、ここに記載する。このような副作用は、例えば、発疹のような皮膚または経皮毒性である。副作用または有害作用は、毒性で等級付けされ、各グレードの定義を提供する種々の毒性尺度が存在する。このような尺度の例は、国立癌研究所共通毒性基準バージョン２.０尺度、世界保健機関尺度または有害事象共通用語規準(ＣＴＣＡＥ)尺度の毒性尺度である。一般に、尺度は次のとおりである。グレード１＝軽度副作用；グレード２＝中程度副作用；グレード３＝重度副作用；グレード４＝生命の危険があるまたは身体障害性の副作用；グレード５＝致死的。重症度の等級の割り当ては、熟練した医師または他の医療従事者の技術の範囲内である。
ここで使用する抗体のようなポリペプチドの“特性”は、結合特異性、構造配置または立体構造、タンパク質安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、立体構造安定性、熱耐性およびｐＨ条件への耐性を含むが、これらに限定されない、ポリペプチドが示すあらゆる特性をいう。特性の変化は、ポリペプチドの“活性”を変え得る。例えば、抗体ポリペプチドの結合特異性の変化は、ポリペプチドの抗原に結合する能力および／または親和性もしくはアビディティーのような種々の結合活性またはインビボ活性を変え得る。
ここで使用する抗体のようなポリペプチドの“活性”または“機能的活性”は、該ポリペプチドが示すあらゆる活性をいう。このような活性は経験的に測定できる。活性の例は、生体分子と、例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合または二量体化を解して相互作用する能力、酵素活性、例えば、キナーゼ活性またはタンパク分解性活性を含むが、これらに限定されない。抗体(抗体フラグメントを含む)について、活性は、特定の抗原と特異的に結合する能力、抗原結合の親和性(例えば、高または低親和性)、抗原結合のアビディティー(例えば、高または低アビディティー)、オン・レート、オフ・レート、エフェクター機能、例えば抗原中和もしくはクリアランスを促進する能力、ウイルス中和およびインビボ活性、例えば病原体の感染もしくは侵襲を阻止するまたはクリアランスを促進する能力または体内の特定の組織または体液または細胞に親友する能力を含むが、これらに限定されない。活性を、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴またはオンもしくはオフ・レートを測定するための等価なアッセイ、免疫組織化学および免疫蛍光組織学および顕微鏡法、細胞アッセイ、フローサイトメトリーおよび結合アッセイ(例えば、パニングアッセイ)のような認められたアッセイを使用して、インビトロまたはインビボで評価できる。例えば、抗体ポリペプチドについて、活性を、インビトロで結合親和性、アビディティーおよび／または結合係数(例えば、オン／オフ・レートについて)および他の活性を測定することによりまたは免疫効果、例えば、抗原クリアランスのような種々の効果、組織への抗体の浸透または局在化、疾患、例えば、感染からの保護、血清または他の体液抗体力価をインビボで測定することによりまたは当分野で周知の他のアッセイ、評価できる。ポリペプチドが活性を発揮することを示すこのようなアッセイの結果を、インビボでのポリペプチドの活性と相関でき、ここで、インビボ活性を治療活性または生物活性ということができる。修飾ポリペプチドの活性は、非修飾ポリペプチドの活性と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上の活性を含むが、これに限定されない非修飾ポリペプチドの活性のあらゆるパーセンテージレベルであり得る。修飾(または変異体)抗体の機能性または活性を測定するためのアッセイは当分野で周知である。
ここで使用する“結合する”、“結合した”または文法的変異は、ある分子が他の分子との何らかの引力相互作用に参加し、２個の分子が互いに近位である安定な結合を生じることをいう。結合は、非共有結合、共有結合(例えば可逆性および不可逆性共有結合)を含むが、これらに限定されず、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質および小分子、例えば、薬物を含む化学化合物を含むが、これらに限定されない分子間の相互作用を含む。結合の例は、抗体−抗原相互作用および受容体−リガンド相互作用である。抗体が特定の抗原に“結合”するとき、結合は、抗体結合部位での、同族抗体−抗原相互作用による、抗体による抗原の特異的認識をいう。結合はまたジスルフィド結合により相互作用する抗体鎖のような、ポリペプチドの複数鎖の結合も含み得る。
ここで使用する結合活性は、それが１個以上の結合パートナーと結合するか否か、そしてどのように結合するかに関する、分子、例えば、ポリペプチドの特徴をいう。結合活性は、結合パートナーと結合する能力を含み、結合パートナーと結合する親和性(例えば、高親和性)、結合パートナーと結合するアビディティー、結合パートナーとの結合の強度および／または結合パートナーとの結合の特異性を含む。
ここで使用する“親和性”または“結合親和性”は、結合パートナーのような２個以上の分子の間の相互作用の強度、典型的に２個の結合パートナーの間の非共有結合性相互作用の強度をいう。抗原エピトープに対する抗体またはその抗原結合フラグメントの親和性は、単一抗体結合部位とエピトープの間の総非共有結合性相互作用の強度の指標である。低親和性抗体−抗原相互作用は弱く、分子は急速に解離する計項にあるが、高親和性抗体−抗原結合は強く、分子は長時間結合したままである。結合親和性は、結合(ｋａまたはｋｏｎ)および／または解離(ｋｄまたはｋｏｆｆ)の速度、半数効果濃度(ＥＣ５０)値および／または熱力学データ(例えば、ギブズ自由エネルギー(ΔＧ)、エンタルピー(ΔＨ)、エントロピー(−ＴΔＳ)の測定によりおよび／または結合(Ｋａ)または解離(Ｋｄ)定数の計算のような、結合反応速度の観点で決定できる。
見かけのＫｄとも呼ばれるＥＣ５０は、一定の量の抗原に対して最大結合の５０％が観察される抗体の濃度(例えば、ng／mL)である。典型的に、ＥＣ５０値は、シグモイド用量反応曲線から決定され、ここで、ＥＣ５０は屈曲点の濃度である。基質に対する高い抗体親和性は低いＥＣ５０値と相関し、低い親和性は高いＥＣ５０値と相関する。親和性定数は、抗体反応のための標準速度論法、例えば、ＥＬＩＳＡのような免疫アッセイと、続く曲線あてはめ解析により決定できる。
ここで使用する“親和性定数”は、抗体の抗原に対する親和性の測定に使用する結合定数(Ｋａ)である。親和性定数が高いほど、抗体の抗原に対する親和性は大きい。親和性定数は、逆数モル濃度の単位(すなわち、Ｍ−１)で表され、抗体反応の標準速度論法(例えば、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴または当分野で知られる他の動力学的相互作用アッセイ)により測定した結合−解離反応の速度定数から計算できる。抗体の結合親和性はまた解離定数またはＫｄとしても表すことができる。解離定数は結合定数の逆数であり、Ｋｄ＝１／Ｋａである。それゆえに、親和性定数もまたＫｄで表すことができる。親和性定数は、抗体反応のための標準速度論法、例えば、免疫アッセイ、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)(Rich and Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599)、等温滴定熱量計(ＩＴＣ)または当分野で知られる他の動力学的相互作用アッセイにより決定できる(例えば、Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989)参照；また抗体の結合親和性を計算するためのＳＰＲ法およびＩＴＣ法の例の記載について米国特許７,２２９,６１９も参照のこと)。結合速度のリアルタイム検出およびモニタリングのための計測手段および方法は知られ、市販されている(例えば、BIAcore 2000, BIAcore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335)。
ＥＣ５０値の決定法または結合／解離定数決定法のような親和性の計算法は周知である。例えば、ＥＣ５０の点で、高結合親和性は、抗体が標的タンパク質に約１０ng／mL、９ng／mL、８ng／mL、７ng／mL、６ng／mL、５ng／mL、３ng／mL、２ng／mL、１ng／mLまたはそれ以下のＥＣ５０で特異的に結合することを意味する。高結合親和性はまた１０−６Ｍ以下、例えば１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ以下の平衡解離定数(Ｋｄ)により特徴付けもできる。平衡結合定数(Ｋａ)の点で、高結合親和性は、一般に約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、約１０８Ｍ−１以上または約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１もしくは１０１２Ｍ−１以上のＫａ値と関係する。親和性は経験的に推定できまたは親和性を比較上、例えば、特定の抗原に対する２個以上の抗体の親和性を、例えば、試験する抗体の親和性の対での速度の計算により比較することにより、決定できる。例えば、このような親和性は、ＥＬＩＳＡ、平衡透析、表面プラズモン共鳴、放射標識標的抗原を使用する放射免疫アッセイまたは当業者に知られる他の方法のような慣用の技術を使用して容易に決定できる。例えば、Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)の方法または例えば、式ｙ＝((Ａ−Ｄ)／(１＋((ｘ／Ｃ)＾Ｂ)))＋Ｄ(式中、Ａは最小漸近線であり、Ｂは傾斜因子であり、Ｃは屈曲点(ＥＣ５０)であり、Ｄは最大漸近線である)を使用する４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを使用する曲線あてはめ解析を使用して、親和性データを解析できる。
ここで使用する抗体アビディティーは、反復エピトープ群またはエピトープアレイを有する抗原と結合する複数の結合部位を含む抗体でのような、多価抗体とその同族抗原の間の複数の相互作用の強度をいう。高アビディティー抗体は、低アビディティー抗体と比較して、このような相互作用の強度が高い。
ここで使用する“少なくとも１個の活性を示す”または“少なくとも１個の活性を保持する”は、修飾を含まない標的または非修飾ポリペプチドと比較して、変異体抗体または他の治療用ポリペプチド(例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント)のような修飾ポリペプチドが示す活性をいう。標的ポリペプチドの活性を保持する修飾ポリペプチドまたは変異体は、活性が改善されても、活性が低下しても、非修飾ポリペプチドの活性を維持してもよい。場合によっては、修飾ポリペプチドまたは変異体は、標的または非修飾ポリペプチドと比較して増加した活性を保持できる。ある場合には、修飾ポリペプチドまたは変異体は、非修飾または標的ポリペプチドと比較して低下した活性を保持できる。修飾ポリペプチドまたは変異体の活性は、非修飾または標的ポリペプチドの活性と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の活性を含むが、これに限定されない非修飾ポリペプチドの活性のあらゆるパーセンテージレベルであり得る。他の態様において、活性の変化は、非修飾または標的ポリペプチドより少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍またはそれ以上大きい。活性保持に関するアッセイは、保持すべき活性による。このようなアッセイをインビトロまたはインビボで実施できる。活性を、例えば、ＥＬＩＳＡおよびパニングアッセイを含むが、これらに限定されない、当分野で知られ、活性についての下の実施例に記載されたアッセイを使用して、測定できる。非修飾または標的ポリペプチドと比較した修飾ポリペプチドまたは変異体の活性も、ポリペプチドの投与後のインビボでの治療もしくは生物活性または結果の観点で評価できる。
ここで使用する修飾抗ＥＧＦＲ抗体に関連した“活性増加”は、同じ条件下で試験したとき、アミノ酸置換を含まない非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、修飾抗ＥＧＦＲ抗体が大きな活性を示すことを意味する。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾または対照抗ＥＧＦＲ抗体の少なくとも正確にまたは少なくとも凡そ１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上の活性を示す。
ここで使用する用語“同じ”は、抗体結合親和性と関連して使用するとき、ＥＣ５０、結合定数(Ｋａ)または解離定数(Ｋｄ)が、対照抗体の約１〜１００倍または１〜１０倍以内であることを意味する(対照抗体より１〜１００倍大きな親和性または１〜１００倍小さな親和性またはこのような範囲内の何らかの数値または範囲または値)。
ここで使用する“実質的に同じ”は、ＥＣ５０、結合定数(Ｋａ)または解離定数(Ｋｄ)と関連して使用するとき、Ｋａ、ＫｄまたはＥＣ５０が対照抗体のＫａ、ＫｄまたはＥＣ５０より約５〜５０００倍大きいまたは小さいことを意味する(対照抗体より５〜５０００倍大きいまたは５〜５０００倍小さい)。
抗体またはその抗原結合フラグメントと関連してここで使用する“特異的に結合する”または“免疫特異的に結合する”は、ここでは交換可能に使用し、抗体または抗原結合フラグメントが、抗体の抗体結合部位と抗原の間の非共有結合性相互作用により、同族抗原と１個以上の非共有結合を形成する能力をいう。典型的に、ＥＧＦＲに免疫特異的に結合する(または特異的に結合する)抗体は、ＥＧＦＲと凡そまたは正確に１×１０７Ｍ−１または１×１０８Ｍ−１またはそれ以上の親和性定数Ｋａ(または１×１０−７Ｍまたは１×１０−８Ｍまたはそれ以下の解離定数(Ｋｄ))で結合するものである。特定の抗原(例えば、ＥＧＦＲ)に免疫特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、表面プラズモン共鳴または当業者に知られる他の手法のような免疫アッセイにより同定できる。
ここで使用する用語“表面プラズモン共鳴”は、例えば、BIAcoreシステム(GE Healthcare Life Sciences)を使用する、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出により実時間相互作用の分析を可能にする光学現象である。
ここで使用する“抗体”は、天然であれ、一部または完全に合成により、例えば組み換えにより産生されたものであれ、免疫グロブリン、および、抗原結合部位を形成するのに、そして、集合したとき、抗原に特異的に結合するのに十分である、免疫グロブリン分子の可変重鎖および軽鎖領域の少なくとも一部を含むそのあらゆるフラグメントを含む、免疫グロブリンフラグメントをいう。それゆえに、抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン(抗体結合部位)に相同または実質的に相同な結合ドメインを有するあらゆるタンパク質を含む。例えば、抗体は、２個の重鎖(ＨおよびＨ’と示し得る)および２個の軽鎖(ＬおよびＬ’と示し得る)を含み、各重鎖が完全長免疫グロブリン重鎖でも抗原結合部位を形成するのに十分なその一部でもよく(例えば、ＶＨ鎖、ＶＨ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３鎖を含むが、これらに限定されない重鎖)そして、各軽鎖が完全長軽鎖でも抗原結合部位を形成するのに十分なその一部でもよい(例えば、ＶＬ鎖およびＶＬ−ＣＬ鎖を含むが、これらに限定されない軽鎖)、抗体である。各重鎖(ＨおよびＨ’)は１この軽鎖(各々ＬおよびＬ’)と対形成する。典型的に、抗体は、最小限可変重(ＶＨ)鎖および／または可変軽(ＶＬ)鎖のすべてまたは少なくとも一部を含む。抗体はまた定常領域の全てまたは一部も含み得る。
ここでの目的のために、用語抗体は、完全長抗体および抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントのような抗体フラグメントを含むその一部を含む。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合したＦｖｓ(ｄｓＦｖ)、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、一本鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、一本鎖Ｆａｂｓ(ｓｃＦａｂ)、二重特異性抗体、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体または上記のいずれかの抗原結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗体はまた、合成抗体、組み換えにより産生した抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および細胞内抗体も含む。ここに提供する抗体は、あらゆる免疫グロブリンクラス(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、あらゆるサブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブ・サブクラス(例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ)のメンバーを含む。
ここで使用する抗体の形態は、抗体の特定の構造をいう。ここでの抗体は、完全長抗体および、例えば、Ｆａｂフラグメントまたは他の抗体フラグメントのようなその一部を含む。それゆえに、Ｆａｂは特定の抗体の形態である。
ここで使用する、抗体の“対応する形態”への言及は、２個の抗体の特性または活性を比較するとき、特性を抗体の同じ形態を使用して比較することを意味する。例えば、ある抗体が対応する形態の第一抗体の活性と比較して低い活性を有すると記載されているとき、これは、その抗体のＦａｂのような特定の形態が、Ｆａｂ形態の第一抗体と比較して活性が低いことを意味する。
ここで使用する完全長抗体は、抗体分泌Ｂ細胞により産生されるヒト抗体および合成により産生される同様のドメインを有する抗体のような、２個の完全長重鎖(例えば、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３またはＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４)および２個の完全長軽鎖(ＶＬ−ＣＬ)およびヒンジ領域を有する抗体である。
ここで使用する抗体フラグメントまたは抗体部分は、完全長より短いが、抗原結合部位を形成するのに十分な抗体の可変領域の部分(例えば、１個以上のＣＤＲ)を少なくとも含み、それゆえに、完全長抗体の結合特異性および／または活性を保持する、完全長抗体のあらゆる部分をいい、抗体フラグメントは、完全長抗体の酵素処理により産生した抗体誘導体ならびに合成により、例えば、組み換えにより産生した誘導体を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ)２、一本鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄフラグメントを含むが、これらに限定されない(例えば、Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer 治療 Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov参照)。フラグメントは、ジスルフィド架橋および／またはペプチドリンカーによるように、互いに結合した複数の鎖を含み得る。抗体フラグメントは、一般に少なくとも約５０個のアミノ酸、典型的に少なくとも２００個のアミノ酸を含む。
ここで使用するＦｖ抗体フラグメントは、非共有結合性相互作用により結合した１個の可変重(ＶＨ)ドメインおよび１個の可変軽(ＶＬ)ドメインを含む。
ここで使用するｄｓＦｖは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化する、設計された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖをいう。
ここで使用するＦｄフラグメントは、抗体重鎖の可変ドメイン(ＶＨ)および１個の定常領域ドメイン(ＣＨ１)を含む抗体のフラグメントをいう。
ここで使用するＦａｂフラグメントは、完全長免疫グロブリンをパパインで消化して得られる抗体フラグメントまたは合成により、例えば、組み換え法により産生される同じ構造を有するフラグメントをいう。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖(ＶＬおよびＣＬを含む)および重鎖の可変ドメイン(ＶＨ)および重鎖の１個の定常領域ドメイン(ＣＨ１)を含む他の鎖を含む。
ここで使用するＦ(ａｂ’)２フラグメントは、免疫グロブリンをｐＨ４.０〜４.５でペプシンで消化して得られる抗体フラグメントまたは合成により、例えば、組み換え法により産生される同じ構造を有するフラグメントをいう。Ｆ(ａｂ’)２フラグメントは基本的に２個のＦａｂフラグメントを含み、ここで、各重鎖部分は、２個のフラグメントを連結するジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含み、さらに数アミノ酸含む。
ここで使用するＦａｂ’フラグメントは、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントの半分(１個の重鎖および１個の軽)を含む、フラグメントである。
ここで使用するＦｄ’フラグメントは、Ｆ(ａｂ’)２フラグメントの１個の重鎖部分を含む抗体のフラグメントである。
ここで使用するＦｖ’フラグメントは、抗体分子のＶＨドメインおよびＶＬドメインのみを含むフラグメントである。
ここで使用するｈｓＦｖは、Ｆａｂフラグメントに通常存在する定常ドメインがヘテロ二量体コイルドコイルドメインで置き換えられている、抗体フラグメントをいう(例えば、Arndt et al. (2001) JMol Biol. 7:312:221-228参照)。
ここで使用するｓｃＦｖフラグメントは、任意の順番でポリペプチドリンカーにより共有結合的に接続された、可変軽鎖(ＶＬ)および可変重鎖(ＶＨ)を含む抗体フラグメントをいう。リンカーは、２個の可変ドメインが実質的干渉無しに架橋されるような長さである。リンカーの例は、溶解度を高めるためにＧｌｕ残基またはＬｙｓ残基が至るところに分散された(Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ残基である。
ここで使用する二重特異性抗体は二量体ｃＦｖであり、二重特異性抗体は、典型的にｓｃＦｖｓより短いペプチドリンカーを有し、優先的に二量体化する。
ここで使用するポリペプチド“ドメイン”は、構造的におよび／または機能的に区別可能なまたは定義可能なポリペプチドの一部(３個以上、一般に５個、１０個またはそれ以上のアミノ酸の配列)である。ポリペプチドドメインの例は、１個以上の構造的モチーフからなるポリペプチド内に独立して折り畳まれた構造を形成できる(例えば、ループ領域により連結されたアルファらせんおよび／またはベータ鎖の組み合わせ)および／または特定の機能的活性、例えば酵素活性、二量体化または抗原結合により認識されるポリペプチドの一部分である。ポリペプチドは１個以上の、典型的に１個を超える、別個のドメインを有し得る。例えば、ポリペプチドは１個以上の構造的ドメインおよび１個以上の機能的ドメインを有し得る。単一ポリペプチドドメインは、構造および機能を元に区別できる。ドメインは、近接する直鎖状アミノ酸配列を含み得る。あるいは、ドメインはポリペプチドの直鎖状アミノ酸配列に沿って近接していない複数の非近接アミノ酸部分を含み得る。典型的に、ポリペプチドは複数のドメインを含む。例えば、抗体分子の各重鎖および各軽鎖は複数の免疫グロブリン(Ｉｇ)ドメインを含み、各々約１１０アミノ酸長である。当業者はポリペプチドドメインを熟知し、他のこのようなドメインとの構造的および／または機能的相同性によりこれらを同定できる。ここでの例示のために、定義を提供するが、特定のドメインを名前により認識するのは十分に当業者の技術範囲であると理解する。必要であれば、適切なソフトウェアを用いてドメインを同定できる。
ここで使用するポリペプチドの機能的領域は、少なくとも１個の機能的ドメイン(これは、例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合または二量体化または酵素活性、例えば、キナーゼ活性またはタンパク分解性活性により、生体分子と相互作用するような特定の機能を付与する)を含むポリペプチド領域を含み、ポリペプチドの機能的領域の例は、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のようなＣＤＲまたは抗体結合部位のような抗原結合部分を含むその一部のような抗体ドメインである。
ここで使用するポリペプチドの構造的領域は、少なくとも１個の構造的ドメインを含むポリペプチドの領域である。
ここで使用するＩｇドメインは、各々ループにより接続されたアミノ酸の逆平行ベータ鎖を含む２個のベータプリーツシートを含む、免疫グロブリン(Ｉｇ)折り畳みと呼ばれる構造により区別される、当分野でそのようなものとして認識されるドメインである。Ｉｇ折り畳みの２個のベータシートは、疎水性相互作用および保存鎖内ジスルフィド結合により一緒にサンドイッチされている。抗体鎖内の個々の免疫グロブリンドメインは、機能に基づきさらに区別できる。例えば、軽鎖は、１個の可変領域ドメイン(ＶＬ)および１個の定常領域ドメイン(ＣＬ)を含み、一方重鎖は１個の可変領域ドメイン(ＶＨ)および３個または４個の定常領域ドメイン(ＣＨ)と含む。各ＶＬドメイン、ＣＬドメイン、ＶＨドメインおよびＣＨドメインが免疫グロブリンドメインの例である。
抗体と関連してここで使用する可変ドメインは、異なる抗体間で変わるアミノ酸配列を含む、抗体重鎖または軽鎖の特異的Ｉｇドメインである。各軽鎖および各重鎖は１個の可変領域ドメイン(ＶＬおよびＶＨ)を有する。可変ドメインは抗原特異性を提供し、したがって抗原認識を担当する。各可変領域は、抗原結合部位ドメインおよびフレームワーク領域(ＦＲ)の一部であるＣＤＲを含む。
ここで使用する“超可変領域”、“ＨＶ”、“相補性決定領域”、“ＣＤＲ”および“抗体ＣＤＲ”は、交換可能に使用して、一体となって抗体の抗原結合部位を形成する、各可変領域内の複数の部分の一つをいう。各可変領域ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と名づけられた３個のＣＤＲを含む。３個のＣＤＲは、直鎖状アミノ酸配列に沿っては近接していないが、折り畳まれたポリペプチドでは接近している。ＣＤＲは、可変ドメインのベータシートの平行鎖を連結するループ内に位置する。
ここで使用する“抗原結合ドメイン”、“抗原結合部位”、“抗原結合位置”および“抗体結合部位”は同義的に用いて、同族抗原を認識し、物理的に相互作用する抗体内のドメインをいう。天然の通常の完全長抗体分子は２個の通常の抗原結合部位を含み、各々、重鎖可変領域の部分および軽鎖可変領域の部分を含む。通常の抗原結合部位は、可変領域ドメイン内の逆平行ベータ鎖を連結するループを含む。本抗原結合部位は可変領域ドメインの他の部分を含む。各通常の抗原結合部位は、重鎖からの３個の超可変領域および軽鎖からの３個の超可変領域を含む。超可変領域はまた相補性決定領域(ＣＤＲ)とも呼ばれる。
抗体重鎖もしくは軽鎖または可変重鎖もしくは軽鎖と関連してここで使用する“その一部”は、重鎖および軽鎖を含む抗体に集合したとき、全６個のＣＤＲを含む対応する完全長抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持するのに十分な、可変重(ＶＨ)鎖および可変軽(ＶＬ)鎖の少なくとも１個または２個、典型的に３個、４個、５個または全６個のＣＤＲを含むように抗原結合部位を形成するのに十分であるその近接部分をいう。一般に、十分な抗原結合部位は重鎖のＣＤＲ３(ＣＤＲＨ３)を必要とする。それは、典型的に軽鎖のＣＤＲ３(ＣＤＲＬ３)を必要とする。ここに記載するとおり、当業者はＣＤＲを知っており、KabatまたはChothia番号付けに基づき同定できる(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242およびChothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917参照)。
ここで使用するフレームワーク領域(ＦＲ)は、ベータシート内に位置する抗体可変領域ドメイン内のドメインであり、ＦＲ領域は、アミノ酸配列の観点で、超可変領域よりも比較的保存されている。
ここで使用する定常領域ドメインは、可変領域ドメインより抗体内で比較的保存されているアミノ酸配列を含む、抗体重鎖または軽鎖のドメインである。各軽鎖は単一軽鎖定常領域(ＣＬ)ドメインを含み、各重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む１個以上の重鎖定常領域(ＣＨ)ドメインを含む。完全長ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧアイソタイプはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域を含み、一方ＩｇＥおよびＩｇＭはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインは抗体分子のＦａｂアームに及び、そうして抗原との相互作用および抗体アームの回転に貢献する。抗体定常領域は、例えば、種々の細胞、生体分子および組織との相互作用により、抗体が特異的に結合する抗原、病原体および毒素のクリアランスのような、しかし、これに限定されないエフェクター機能に役立ち得る。
ここで使用する“Kabat番号付け”は、ＩｇＧ１ Kabat抗体の指標番号付けをいう(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)。例えば、Kabat番号付けに基づき、ＣＤＲ−ＬＩは残基Ｌ２４〜Ｌ３４に対応し、ＣＤＲ−Ｌ２は残基Ｌ５０〜Ｌ５６に対応し、ＣＤＲ−Ｌ３は残基Ｌ８９〜Ｌ９７に対応し、ＣＤＲ−Ｈ１は、長さによって残基Ｈ３１〜Ｈ３５、３５ａまたは３５ｂに対応し、ＣＤＲ−Ｈ２は残基Ｈ５０〜Ｈ６５に対応し、そしてＣＤＲ−Ｈ３は残基Ｈ９５〜Ｈ１０２に対応する。当業者はKabatを使用して定常領域の領域を同定できる。表１および２は、代表的抗体セツキシマブについてKabat番号付けスキームおよびＥＵ番号付けスキームを使用する対応する残基を示す。
ここで使用する“ＥＵ番号付け”または“ＥＵ指数”は、Edelman et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85に記載されたＥＵ抗体の番号付けスキームをいう。“KabatにおけるようなＥＵ指数”は、 Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242に示すようなヒトＩｇＧ１ Kabat抗体のＥＵ指数番号付けをいう。ＥＵ番号付けまたはKabatにおけるようなＥＵ番号付けは、抗体軽鎖および重鎖のＦｃ領域のアミノ酸残基に坂東を付すために当業者によりしばしば使用される。例えば、当業者は、ＥＵ番号付けを使用して定常領域の領域を同定できる。例えば、ＣＬドメインは、Kabat番号付けによると残基Ｌ１０８〜Ｌ２１６またはＥＵ番号付けによるとＬ１０８〜Ｌ２１４に対応する。ＣＨ１は、残基１１８〜２１５(ＥＵ番号付け)または１１４〜２２３(Kabat番号付け)に対応し、ＣＨ２は残基２３１〜３４０(ＥＵ番号付け)または２４４〜３６０(Kabat番号付け)に対応し、ＣＨ３は残基３４１〜４４６(ＥＵ番号付け)または３６１〜４７８(Kabat番号付け)ドメインに対応し、ＣＤＲ−Ｌ２は残基Ｌ５０〜Ｌ５６に対応し、ＣＤＲ−Ｌ３は残基Ｌ８９〜Ｌ９７に対応し、ＣＤＲ−Ｈ１は長さによって、残基Ｈ３１〜Ｈ３５、３５ａまたは３５ｂに対応し、ＣＤＲ−Ｈ２は残基Ｈ５０〜Ｈ６５に対応し、そしてＣＤＲ−Ｈ３は残基Ｈ９５〜Ｈ１０２に対応する。表１および２は、代表的抗体セツキシマブについてKabatおよびＥＵ番号付けを使用する対応する残基を示す。最上列(太字)はアミノ酸残基番号を示し、二番目の列(太字)は、最上列に番号で示す位置のアミノ酸残基の一文字表記を示し、三番目の列(斜体)は、Kabat番号付けに従う対応するKabat番号を示し、四番目の列(非太字、非斜体)は、ＥＵ番号付けに従う対応するＥＵ指数番号を示す。
ここで使用する“抗体ヒンジ領域”または“ヒンジ領域”は、ガンマ、デルタおよびアルファ抗体アイソタイプの重鎖のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に天然に存在する、他の抗体ドメインと相同性を有さない、ポリペプチド領域をいう。この領域はプロリン残基に共に、ＩｇＧ抗体、ＩｇＤ抗体およびＩｇＡ抗体に柔軟性を与え、それらが抗原に結合するときの、互いの種々の角度を考えると、Ｆａｂ部分の２個の“アーム”(各々１個の抗体結合部位を含む)が移動性となることを可能にする。この柔軟性により、細胞表面または他の抗原上のエピトープと相互作用するように抗体結合部位を配列させるためにＦａｂアームが移動できる。ヒンジ領域内の２個の鎖間ジスルフィド結合が２個の重鎖間の相互作用を安定化する。ここに提供するある態様において、合成により産生された抗体フラグメントは、例えば、２個の抗体鎖間の相互作用により安定性を促進するために、１個以上のヒンジ領域を含む。ヒンジ領域は、二量体化ドメインの例である。
ここで使用する用語“由来する”は、モノクローナル抗体のような他の抗体に由来する抗体フラグメントに関して、元の抗体の結合特異性を保持する、抗体フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメント)の操作をいう。このようなフラグメントは、酵素開裂、化学的架橋、組み換え手段またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない当分野で知られる多様な方法により、由来させ得る。一般に、由来抗体フラグメントは、抗体フラグメントおよび親抗体が同じエピトープに結合するように、親抗体と同一または実質的に同一の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)を共有する。
ここで使用する“親抗体”または“源抗体”は、抗体フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)、Ｆ(ａｂ)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメント)が由来する抗体をいう。
ここで使用する用語“エピトープ”は、抗体のパラトープが結合する、抗原のあらゆる抗原決定基をいう。エピトープ決定基は、典型的にアミノ酸または糖側鎖のような分子の化学活性表面基群を含み、典型的に特異的三次元構造的特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。
ここで使用するヒト化抗体は、ヒトへの投与が免疫応答を誘発しないように、“ヒト”アミノ酸配列を含むように修飾された抗体である。ヒト化抗体は、典型的に非ヒト種免疫グロブリンに由来する相補性決定領域(ＣＤＲまたは超可変ループ)を含み、該抗体分子の残りは主としてヒト免疫グロブリン由来である。このような抗体の製造法は知られている。例えば、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、組み換えＤＮＡ法により、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づく抗体をコードするように改変できる。このような領域を同定する方法は知られ、免疫グロブリンの可変領域および非可変領域を同定するように設計されたコンピュータープログラムを含む。それゆえに、一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全て(例えば、ＣＤＲ)が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１個、典型的に２個の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、所望によりまた免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にヒト免疫グロブリンのものも含む。
ここで使用する多量体化ドメインは、ポリペプチド分子の１個以上のさらなるポリペプチド分子との安定な相互作用を促進するアミノ酸配列をいい、各々相補的多量体化ドメインを含み、これは第一ドメインと安定な多量体を形成するために同じまたは異なる多量体化ドメインであってよい。一般に、ポリペプチドを、多量体化ドメインに直接的または間接的に接続する。多量体化ドメインの例は、免疫グロブリン配列またはその一部、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域および適合性のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを含む。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプを含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭおよびその修飾形態を含む、Ｆｃドメインまたはその一部のような、例えば、免疫グロブリン定常領域またはドメインであり得る。
ここで使用する二量体化ドメインは、２個のポリペプチド配列(抗体鎖のようなしかしこれに限定されない)の相互作用を促進する多量体化ドメインである。二量体化ドメインは、ポリペプチド間の相互作用を促進することが知られるアミノ酸配列(例えば、ロイシンジッパー、ＧＣＮ４ジッパー)である、完全長抗体ヒンジ領域または１個以上二量体化配列の全てまたは一部のような２個のポリペプチド配列間のジスルフィド結合の衛生を促進するシステイン残基のアミノ酸配列である。
ここで使用する“Ｆｃ”または“Ｆｃ領域”または“Ｆｃドメイン”は、第一定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドをいう。それゆえに、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの最後の２個の定常領域免疫グロブリンドメインまたはＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３個の定常領域免疫グロブリンドメインをいう。所望により、Ｆｃドメインは、これらのドメインの可動性ヒンジＮ末端の全てまたは一部を含み得る。ＩｇＡおよびＩｇＭに関して、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧのＦｃドメインの例として、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３および所望によりＣγ１とＣγ２の間のヒンジの全てまたは一部を含む。Ｆｃ領域の境界は変わり得るが、典型的に、ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。さらに、ＦｃはまたＦｃＲへの結合を変えるまたはＦｃ介在エフェクター機能を変える、あらゆる対立遺伝子もしくは種変異体またはあらゆる変異体または修飾形態のようなあらゆる変異体もしくは修飾形態を含む。
ここで使用する“Ｆｃキメラ”は、１個以上のポリペプチドがＦｃ領域またはその誘導体に直接的または間接的に結合しているキメラポリペプチドをいう。典型的に、Ｆｃキメラは、免疫グロブリンのＦｃ領域と他のポリペプチドを組み合わせる。Ｆｃポリペプチドの誘導体または修飾Ｆｃポリペプチドは当業者に知られる。
ここで使用するキメラポリペプチドは、少なくとも２個の異なるポリペプチド由来のまたは単ポリペプチドの２個の非近接部分由来の部分を含むポリペプチドをいう。それゆえに、キメラポリペプチドは、一般に一方のポリペプチドの全てまたは一部由来のアミノ酸配列残基と、他方の異なるポリペプチドの全てまたは一部由来のアミノ酸配列を含む。２個の部分を直接的または間接的に結合でき、等張ｐＨ７緩衝化食塩水のような平衡条件および生理的条件下、キメラポリペプチドのかなりの部分の完全性を維持するための十分な強度のペプチド結合、他の共有結合または他の非共有結合性相互作用により結合させ得る。
ここで使用する融合タンパク質は、ベクターの長さに沿って、互いに極めて接近した、例えば、隣接する、２個のポリペプチドをコードする２個の核酸を含むベクターから、融合タンパク質を発現するように、互いに連結した２個の別個のポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含むように操作したポリペプチドである。したがって、融合タンパク質は、ペプチド結合に直接的または間接的に結合する２個以上のタンパク質またはペプチドもしくは２個以上のタンパク質またはペプチド由来の部分を含む、キメラタンパク質である。２個の分子は構築物中で隣接しているかまたはリンカーまたはスペーサーポリペプチドにより分離されている。
ここで使用する“リンカー”または“スペーサー”ペプチドは、２個のポリペプチド配列を一緒にさせる短アミノ酸配列をいう(またはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸)。“ペプチドリンカー”は、２個のポリペプチド配列を連結する短アミノ酸配列をいう。ポリペプチドリンカーの例は、ペプチド伝達ドメインを抗体に連結するリンカーａまたはｓｃＦｖフラグメントのような合成抗体フラグメントの２個の抗体鎖を連結させるリンカーである。リンカーは周知であり、あらゆる既知リンカーを提供する方法において使用できる。ポリペプチドリンカーの例は、溶解度を高めるためにＧｌｕ残基またはＬｙｓ残基が至るところに分散された(Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎアミノ酸配列である。リンカーの他の例はここに記載され、これらのいずれかおよび他の既知リンカーを、提供される組成物および方法において使用できる。
ここで使用する“タグ”または“エピトープタグ”は、典型的にここに提供する抗体のようなポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されたアミノ酸配列である。ポリペプチドに融合したタグの包含は、ポリペプチド精製および／または検出を容易にする。典型的に、タグまたはタグポリペプチドは、抗体により認識されるエピトープを提供するのに十分な残基を有するまたは検出もしくは精製のために働くが、またそれが結合するポリペプチドの活性を妨げないように十分短い、ポリペプチドである。タグポリペプチドは、典型的に特異的に結合する抗体がポリペプチドにおけるエピトープと実質的に交差反応しないように十分に独特である。
適当なタグポリペプチドは、一般に少なくとも５個または６個のアミノ酸残基、通常約８〜５０個のアミノ酸残基、典型的に９〜３０残基を有する。タグを多量体における１個以上のキメラポリペプチドと結合でき、多量体の検出またはサンプルまたは混合物からのその回収を可能にする。このようなタグは周知であり、容易に合成および設計できる。タグポリペプチドの例は親和性精製に使用されるものを含み、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、インフルエンザ赤血球凝集素(ＨＡ)タグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５(Field et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165)、ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体(例えば、Evan et al. (1985) Molecular and Cellular Biology 5 :3610-3616参照)および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(ｇＤ)タグおよびその抗体(Paborsky et al. (1990) Protein Engineering 3:547-553)を含む。エピトープタグ付け抗体の検出に使用する抗体は、ここでは典型的に第二の抗体という。
ここで使用する標識または検出可能部分は、分子(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、例えばここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント)と直接的または間接的に結合または連結でき、またはそれと結合でき、インビボおよび／またはインビトロで検出できる検出可能マーカー(例えば、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、造影剤(例えば、金属)、放射性核種、発色団、検出可能ペプチドまたは検出可能産物の形成を触媒する酵素)である。検出法は、既知インビボおよび／またはインビトロ検出法を含む、当分野で知られるあらゆる方法であり得る(例えば、目視、磁気共鳴(ＭＲ)スペクトロスコピー、超音波シグナル、Ｘ線、ガンマ線スペクトロスコピー(例えば、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)走査、単光子放射型コンピュータ断層撮影法(ＳＰＥＣＴ))、蛍光スペクトロスコピーまたは吸収による造影)。間接的検出は、検出可能部分に間接的または直接的に結合する原子、分子または組成物のエネルギーまたは粒子放出または吸収のような物理的現象の測定をいう(例えば、一次抗体(例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント)に結合する標識した二次抗体またはその抗原結合フラグメントの検出)。
ここで使用する“核酸”は、典型的にホスホジエステル結合により互いに接続した、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)およびリボ核酸(ＲＮＡ)を含む、少なくとも２個の結合したヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体をいう。用語“核酸”にまた包含されるのは、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、ホスホロチオエートＤＮＡのような核酸アナログおよび他のこのようなアナログおよび誘導体またはこれらの組み合わせである。核酸はまた、例えば、ホスホジエステル結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合(ペプチド核酸)以外のヌクレオチドアナログまたは“主鎖”結合を含むＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体も含む。本用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログ、一本鎖(センスまたはアンチセンス)および二本鎖核酸からなるＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、変異体およびアナログも含む。デオキシリボヌクレオチドはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを含む。ＲＮＡに関して、ウラシル塩基はウリジンである。
ここで使用する単離核酸分子は、該核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものをいう。ｃＤＮＡ分子のような“単離”核酸分子は、組み換え法により産生したとき他の細胞性物質または培養培地が実質的になくまたは化学合成したとき化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない。ここに提供する単離核酸分子の例は、提供する抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離核酸分子を含む。
核酸配列、領域、要素またはドメインと関連してここで使用する“動作可能に結合した”は、核酸領域が互いに機能的に関係していることを意味する。例えば、リーダーペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸と動作可能に結合でき、それにより該核酸が転写および翻訳されて機能的融合タンパク質を発現でき、ここで、該リーダーペプチドは該融合ポリペプチドを分泌させる。場合によっては、第一ポリペプチド(例えば、リーダーペプチド)をコードする核酸を第二のポリペプチドをコードする核酸と動作可能に結合し、該核酸を単一ｍＲＮＡ転写物として転写させるが、該ｍＲＮＡ転写物の翻訳は、２個のポリペプチドのうち一方を発現させ得る。例えば、アンバー停止コドンは、部分的アンバーサプレッサー細胞に導入されたとき、得られた単一ｍＲＮＡ転写物が、第一および第二ポリペプチドを含む融合タンパク質を産生するように翻訳され得るかまたは第一ポリペプチドのみを産生するように翻訳され得るように、第一ポリペプチドをコードする核酸と第二ポリペプチドをコードする核酸の間に配置できる。他の例において、プロモーターをポリペプチドをコードする核酸に動作可能に結合でき、それにより該プロモーターが該核酸の転写を制御または仲介する。
例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドと関連してここで使用する“合成”は、組み換え法および／または化学合成法により産生される核酸分子またはポリペプチド分子をいう。
ここで使用する天然に存在するαアミノ酸の残基は、ヒトにおけるその同族ｍＲＮＡコドンによる荷電ｔＲＮＡ分子の特異的認識によりタンパク質に取り込まれる、天然に見られる２０種のαアミノ酸の残基をいう。
ここで使用する“ポリペプチド”は、共有結合により接続した２個以上のアミノ酸をいう。用語“ポリペプチド”および“タンパク質”は、ここでは交換可能に使用する。
ここで使用する“ペプチド”は、２〜凡そまたは正確に４０アミノ酸長であるポリペプチドをいう。
ここで使用する“アミノ酸”は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは２個以上のアミノ酸を含む。ここでの目的のために、提供される抗体に含まれるアミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸(表３)、非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログ(例えば、α炭素が側鎖を有するアミノ酸)を含む。ここで使用する、本明細書に記載するポリペプチドの種々のアミノ酸配列において見られるアミノ酸は、その周知の三文字または一文字表記により特定する(表３参照)。種々の核酸分子およびフラグメントにおいて見られるヌクレオチドは、当分野で日常的に使用される標準一文字表記により指定する。
ここで使用する“アミノ酸残基”は、ポリペプチドのペプチド結合での化学的消化(加水分解)により掲載されたアミノ酸をいう。ここに記載するアミノ酸残基は、一般に“Ｌ”異性体形態である。“Ｄ”異性体形態の残基は、ポリペプチドが所望の機能的特性を保持する限り、任意のＬ−アミノ酸残基と置き換え得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968)に記載され、37 C.F.R. §§1.821-1.822で選択された標準ポリペプチド命名法に沿って、アミノ酸残基の略語を表３に示す。
式によりここに示す全てのアミノ酸配列残基は、アミノ末端からカルボキシル末端への慣用の方向で左から右への配向である。さらに、用語“アミノ酸残基”は、対応表(表３)に挙げたアミノ酸、修飾、非天然および異常アミノ酸を含むと定義する。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、１個以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのまたはＮＨ２のようなアミノ末端基へのもしくはＣＯＯＨのようなカルボキシル末端基へのペプチド結合を示す。
ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適当な保存的置換は当業者に知られ、一般に得られる分子の生物活性を変えることなく行うことができる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における一アミノ酸置換が生物活性を実質的に変えないことは当業者は認識している(例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224参照)。
このような置換は、次の表４に示す例示的置換に従い、行い得る。
他の置換もまた許容され、経験的にまたは他の既知保存的もしくは非保存的置換に従い決定できる。
ここで使用する“天然に存在するアミノ酸”は、ポリペプチドに存在する２０種のＬ−アミノ酸をいう。
ここで使用する用語“非天然アミノ酸”は、天然アミノ酸に類似する構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に修飾されている、有機化合物である。天然に存在しないアミノ酸は、それゆえに、例えば、天然に存在する２０種のアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり、アミノ酸のＤ−立体異性体を含むが、これに限定されない。非天然アミノ酸の例は当業者に知られ、２−アミノアジピン酸(Ａａｄ)、３−アミノアジピン酸(ｂＡａｄ)、β−アラニン／β−アミノ−プロピオン酸(Ｂａｌａ)、２−アミノ酪酸(Ａｂｕ)、４−アミノ酪酸／ピペリジン酸(４Ａｂｕ)、６−アミノカプロン酸(Ａｃｐ)、２−アミノヘプタン酸(Ａｈｅ)、２−アミノイソ酪酸(Ａｉｂ)、３−アミノイソ酪酸(Ｂａｉｂ)、２−アミノピメリン酸(Ａｐｍ)、２,４−ジアミノ酪酸(Ｄｂｕ)、デスモシン(Ｄｅｓ)、２,２’−ジアミノピメリン酸(Ｄｐｍ)、２,３−ジアミノプロピオン酸(Ｄｐｒ)、Ｎ−エチルグリシン(ＥｔＧｌｙ)、Ｎ−エチルアスパラギン(ＥｔＡｓｎ)、ヒドロキシリシン(Ｈｙｌ)、アロヒドロキシリシン(Ａｈｙｌ)、３−ヒドロキシプロリン(３Ｈｙｐ)、４−ヒドロキシプロリン(４Ｈｙｐ)、イソデスモシン(Ｉｄｅ)、アロイソロイシン(Ａｉｌｅ)、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン(ＭｅＧｌｙ)、Ｎ−メチルイソロイシン(ＭｅＩｌｅ)、６−Ｎ−メチルリシン(ＭｅＬｙｓ)、Ｎ−メチルバリン(ＭｅＶａｌ)、ノルバリン(Ｎｖａ)、ノルロイシン(Ｎｌｅ)およびオルニチン(Ｏｒｎ)を含むが、これらに限定されない。
ここで使用するＤＮＡ構築物は、天然では見られない様式で合わされ、並置されたＤＮＡの複数セグメントを含む、一本鎖または二本鎖の、直鎖状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、ヒト操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
ここで使用するＤＮＡセグメントは、特定の性状を有する大型ＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミドフラグメントのような長いＤＮＡ分子の一部であり、これは、５’から３’方向に読んだとき、その特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする。
ここで使用する用語ポリヌクレオチドは、５’から３’末端に読む、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然源から単離しても、インビトロで合成してもまたは天然分子と合成分子の組み合わせから調製してもよい。ポリヌクレオチド分子の長さは、ここではヌクレオチド(“ｎｔ”と略称)または塩基対(“ｂｐ”と略称)の観点で示す。用語ヌクレオチドは、文脈上可能であるならば、一本鎖および二本鎖分子に対して使用する。本用語を二本鎖分子に適用するとき、それは全長を示すために使用し、用語塩基対と同意義であると解釈される。二本鎖ポリヌクレオチドの２個の鎖の長さがわずかに異なり、その末端がずれていることがあり、それゆえに、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対形成し得ないことは当業者に認識されている。このような不対末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。
ここで使用する、組み換えＤＮＡ法を使用する組み換え手段による産生は、クローン化ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の周知方法の使用を意味する。
ここで使用する“発現”は、ポリヌクレオチドの転写および翻訳によりポリペプチドが産生される過程をいう。ポリペプチドの発現レベルは、例えば、宿主細胞から産生されたポリペプチドの量を測定する方法を含む、当分野で知られる任意の方法を使用して評価できる。このような方法は、ＥＬＩＳＡ、クーマシーブルー染色と続くゲル電気泳動、ローリータンパク質アッセイおよびブラッドフォードタンパク質アッセイによる細胞ライセート中のポリペプチドの定量化を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する“宿主細胞”は、ベクターを受け入れ、維持し、複製および／または増幅するために使用する細胞である。宿主細胞はまたベクターによりコードされるポリペプチドの発現にも使用できる。ベクターに含まれる核酸は、宿主細胞が分裂したとき複製し、それにより核酸を増幅する。
ここで使用する“ベクター”は、該ベクターが適切な宿主細胞に形質転換されたとき、そこから１個以上の異種タンパク質を発現できる複製可能な核酸である。ベクターへの言及は、典型的に、制限消化およびライゲーションによりポリペプチドをコードする核酸またはそのフラグメントを導入できるベクターを含む。ベクターへの言及はまた、修飾抗ＥＧＦＲ抗体のようなポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む。ベクターを使用して、核酸の増幅または該核酸によりコードされるポリペプチドの発現／表示のために宿主細胞にポリペプチドをコードする核酸を導入する。ベクターは、典型的にエピソームのままであるが、ゲノムの染色体への遺伝子またはその一部の組込みをもたらすように設計できる。また企図されるのは、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体のような人工染色体であるベクターである。このような運搬体の選択および使用は当業者に周知である。ベクターはまた“ウイルスベクター”を含む。ウイルスベクターは、外来遺伝子を細胞内に導入(運搬体またはシャトルとして)するために該外来遺伝子と動作性に結合される、操作されたウイルスである。
ここで使用する“発現ベクター”は、ＤＮＡフラグメントの発現を引き起こすことができる、プロモーター領域のような制御配列と動作性に結合している、このようなＤＮＡの発現が可能であるベクターである。このようなさらなるセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含み、所望により１個以上の複製起点、１個以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含み得る。発現ベクターは、一般にプラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するかまたは両者の要素を含み得る。それゆえに、発現ベクターは、適切な宿主細胞への導入により、クローン化ＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組み換えウイルスまたは他のベクターのような組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物をいう。適切な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞および／または原核細胞で複製可能なものおよびエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノムに統合されるものを含む。
ここで使用する“一次配列”は、ポリペプチドのアミノ酸配列残基または核酸分子のヌクレオチド配列をいう。
ここで使用する“配列同一性”は、試験および対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較に際しての同一または類似アミノ酸またはヌクレオチド塩基の数をいう。配列同一性は、類似性または同一性の領域を同定するための核酸またはタンパク質配列の配列アライメントにより決定できる。ここでの目的のために、配列同一性は一般に同一残基を同定するためのアライメントにより決定する。アライメントは局所的でも全体的でもよい。マッチ、ミスマッチおよびギャップを比較する配列間で同定できる。ギャップは、同一または類似特徴が整列されるように、整列させた配列の残基間に挿入されるヌルアミノ酸またはヌクレオチドである。一般に、内部ギャップおよび末端ギャップが存在し得る。ギャップペナルティを使用するとき、配列同一性は、末端ギャップについてペナルティなしで決定できる(例えば、末端ギャップはペナルティーが科せられない)。あるいは、配列同一性を、ギャップを考慮せずに、同一位置の数／整列させた配列の総長×１００として決定できる。
ここで使用する“グローバル・アライメント”は、２個の配列を最初から最後まで整列するアライメントであり、各配列における各文字は一回しか整列させない。アライメントを、配列間に類似性または同一性が在るか否かに関係なく作製する。例えば、“グローバル・アライメント”に基づく５０％配列同一性は、各１００ヌクレオチド長の２個の比較配列の全配列のアライメントにおいて、残基の５０％が同一であることを意味する。整列させた配列の長さが同一でなくても、グローバル・アライメントを配列同一性の決定に使用できることも理解される。配列の端末側終端の差異を、“末端ギャップについてペナルティ無し”を選択しない限り、配列同一性の決定に際して考慮する。一般に、グローバル・アライメントを、それらの長さの大部分にわたり顕著な類似性がある配列に使用する。グローバル・アライメントを実施するためのアルゴリズムの例は、ニードルマン・ウンシュアルゴリズムを含む(Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970))。グローバル・アライメントを実施するためのプログラムの例は、公的に入手可能であり、米国国立バイオテクノロジーセンター(ＮＣＢＩ)ウェブサイト(ncbi.nlm.nih.gov/)で利用可能なGlobal Sequence Alignment ツールおよびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlで入手可能なプログラムを含む。
ここで使用する“局所アライメント”は、２個の配列を整列させるが、類似性または同一性がある配列の部分のみ整列させる、アライメントである。それゆえに、局所アライメントは、一方の配列のサブセグメントが他方の配列に存在するかどうかを決定する。類似性がなければ、アライメントは返されない。局所アライメントアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴまたはスミス・ウォーターマンアルゴリズムを含む(Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981))。例えば、“局所アライメント”に基づく５０％配列同一性は、任意の長さの２個の比較配列の全配列のアライメントにおいて、１００ヌクレオチド長の類似性または同一性の領域が、該類似性または同一性の領域中に５０％の同じである残基を有することを意味する。
ここでの目的のために、配列同一性は、各業者により確立されたデフォルトギャップペナルティと共に使用する標準アライメントアルゴリズムプログラムにより決定できる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、(１)Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)に記載のような単項比較マトリックス(同一性に対して１および非同一性に対して０の値を含む)およびGribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)の重み付け比較マトリックス；(２)各ギャップについて３.０のペナルティおよび各ギャップにおける各記号についてさらに０.１０のペナルティおよび(３)末端ギャップについてペナルティ無しを含み得る。任意の２個の核酸分子または任意の２個のポリペプチドが、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％“同一”であるかまたは同一性パーセントを引用する他の類似バリエーションに相当する
かヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するか否かは、局所アライメントまたはグローバル・アライメントに基づき、既知コンピューターアルゴリズムを使用して決定できる(例えば、多数の既知のおよび公的に入手可能なアライメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供するwikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_softwareを参照のこと)。一般に、ここでの目的のために、配列同一性を、ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴ(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome)から入手可能なニードルマン・ウンシュグローバル配列アライメントツールのようなグローバル・アライメント；LAlign(William Pearson implementing the Huang and Miller algorithm (Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357))およびdeepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.htmlで利用可能なXiaoqui Huangのプログラムに基づくコンピューターアルゴリズムを使用して決定する。グローバル・アライメントにおいては、典型的に、比較するポリペプチドまたはヌクレオチドの各々の完全長配列を、各配列の完全長にわたって整列させる。局所アライメントも、比較する配列が実質的に同じ長さであるならば、使用できる。
それゆえに、ここで使用する用語“同一性”は、試験および対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの比較またはアライメントを表す。ある非限定的例において、“少なくとも９０％同一”は、対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して９０〜１００％の同一性パーセントをいう。９０％以上のレベルの同一性は、例として１００アミノ酸またはヌクレオチド長の試験および対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを比較したと過程して、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸またはヌクレオチドが対照ポリペプチドと異なるのは１０％(すなわち、１００個中１０個)を超えないという事実の指標である。同様の比較を試験および対照ポリヌクレオチドで行い得る。このような差異は、アミノ酸配列の全長にわたり無作為に分布する点変異として表すことができ、または最大許容、例えば、１０／１００アミノ酸差異(約９０％同一性)までの種々の長さの一箇所以上に集まっていてよい。差異はまたアミノ酸残基の欠失または短縮化によるものでもあり得る。差異は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失として定義する。比較配列の長さによるが、約８５〜９０％を超える相同性または同一性のレベルで、結果はプログラムおよびギャップパラメータ設定と無関係となり得て、このような高レベルの同一性は、しばしば、ソフトウェアを頼らずとも容易に同定できる。
ここで使用するジスルフィド結合(Ｓ−Ｓ結合またはジスルフィド架橋ともいう)は、チオール基のカップリングに由来する共有結合性単結合である。タンパク質のジスルフィド結合はシステイン残基のチオール基間で形成され、抗体ドメインのようなポリペプチドドメイン間の相互作用を安定化する。
ここで使用する“共役”または“接合”は、共有結合性または非共有結合性相互作用による結合を意味する。
ここで使用する用語“抗体に接合した”または“抗体に結合した”または文法的変異は、診断部分または治療部分のようなある部分の抗体またはその抗原結合フラグメントへの結合をいうとき、該部分が、例えば、組み換え手段によりまたは翻訳後に化学的手段により融合タンパク質を産生するような、ペプチドを結合するためのあらゆる既知手段により抗体またはその抗原結合フラグメントに結合することを意味する。接合は、ペプチドまたは化合物リンカーまたは化学的架橋剤を含むが、これらに限定されない、接合を実施するための多様な結合剤のいずれかを用いることができる。
ここで使用する“アウリスタチン薬物部分”は、アウリスタチン(aurastin)誘導体の構造を有する抗体−薬物接合体の部分構造をいう。アウリスタチン類(aurastin)は、微小管運動、ＧＴＰ加水分解ならびに核および細胞分裂を妨害する合成分子の一群である。アウリスタチン具現化の例は、Ｎ末端およびＣ末端に結合したモノメチルアウリスタチン薬物部分ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む(Senter et al. (2004) “Proceedings of the American Association for Cancer Research,” Volume 45, Abstract Number 623および２００４年３月２８日発表；米国公開２０１１／００２０３４３号)。代表的アウリスタチン誘導体の合成および構造は米国特許出願公開２００３−００８３２６３号、２００５−０２３８６４９号および２００５−０００９７５１号；国際特許公開ＷＯ０４／０１０９５７号、国際特許公開ＷＯ０２／０８８１７２号および米国特許６,３２３,３１５号；６,２３９,１０４号；６,０３４,０６５号；５,７８０,５８８号；５,６６５,８６０号；５,６６３,１４９号；５,６３５,４８３号；５,５９９,９０２号；５,５５４,７２５号；５,５３０,０９７号；５,５２１,２８４号；５,５０４,１９１号；５,４１０,０２４号；５,１３８,０３６号；５,０７６,９７３号；４,９８６,９８８号；４,９７８,７４４号；４,８７９,２７８号；４,８１６,４４４号および４,４８６,４１４号に記載されており、この各々を引用によりその全体を本明細書に包含させる。
ここで使用する“マイタンシノイド薬物部分”は、マイタンシン化合物の構造を有する抗体−薬物接合体の部分構造をいう。マイタンシンは、最初に東アフリカの低木マイテナス・セラタ(Maytenus serrata)から単離された(米国特許３,８９６,１１１)。その後、ある種の微生物もマイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステルのようなマイタンシノイド類を産生することが発見された(米国特許４,１５１,０４２)。合成マイタンシノールおよびマイタンシノールアナログは報告されている。米国特許４,１３７,２３０号；４,２４８,８７０号；４,２５６,７４６号；４,２６０,６０８号；４,２６５,８１４号；４,２９４,７５７号；４,３０７,０１６号；４,３０８,２６８号；４,３０８,２６９号；４,３０９,４２８号；４,３１３,９４６号；４,３１５,９２９号；４,３１７,８２１号；４,３２２,３４８号；４,３３１,５９８号；４,３６１,６５０号；４,３６４,８６６号；４,４２４,２１９号；４,４５０,２３４号；４,３６２,６６３号および４,３７１,５３３号およびKawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3341-3351)を参照のこと。
“遊離システインアミノ酸”は、チオール官能基(−ＳＨ)を有し、分子内または分子間ジスルフィド架橋として対形成していないシステインアミノ酸残基をいう。親抗体に操作して入れることができる。
ここで使用する“リンカー”、“リンカー単位”または“リンク”は、抗体を薬物部分または治療部分に共有結合性に結合する原子の鎖を含む、ペプチドまたは化学的部分を意味する。
ここで使用する“抗体依存性細胞傷害”および“ＡＤＣＣ”は、Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞毒性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球およびマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて該標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在反応をいう。ＡＤＣＣに介在する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol, 9:457-92の４６４頁のTable 3に要約されている。興味ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイを実施し得る(米国特許５,５００,３６２；米国特許５,８２１,３３７)。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)およびナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。これとは別にまたはこれに加えて、興味ある分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えば、Clynes et al (1998) PNAS (USA), 95:652-656に開示されているような動物モデルで評価し得る。
ここで使用する“治療活性”は、治療用ポリペプチドのインビボ活性をいう。一般に、治療活性は、疾患または状態の処置と関係する活性である。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の治療活性は、ＥＧＦＲリン酸化、シグナル伝達および細胞増殖に対する阻害活性、特に腫瘍細胞増殖に対する阻害活性を含む。修飾ポリペプチドの治療活性は、非修飾ポリペプチドと比較して、１％の活性、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上の治療活性を含むが、これらに限定されない、非修飾ポリペプチドの治療活性のあらゆるパーセンテージであり得る。
ここで使用する用語“評価”は、サンプルに存在する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのようなタンパク質の活性の絶対値を得るおよびまた活性レベルの指標となる指数、比率、パーセンテージ、視覚的または他の値を得るという意味での定量的および定性的決定を含むことを意図する。評価は直接的でも間接的でもよい。
ここで使用する“疾患または障害”は、感染、後天性状態、遺伝的状態を含むが、これらに限定されない原因または状態に起因し、同定可能な症状により特徴付けられる生物の病態をいう。
ここで使用する“ＥＧＦＲ関連疾患または状態”または“抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答する状態”は、異常ＥＧＦＲシグナル伝達またはＥＧＦＲの過発現と関係するまたはこれが原因のあらゆる疾患または状態をいう。このような疾患および状態は当分野で知られ、これらの例をここに記載する。例えば、ＥＧＦＲ関連疾患または条件または抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答する状態は、結腸直腸癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌および非小細胞肺癌のような、しかしこれらに限定されない癌を含む。
ここで使用する疾患または状態を有する対象を“処置する”は、処置後に対象の症状が一部または完全に軽減するかまたは変化がないままであることを意味する。それゆえに、処置は予防、治療および／または治癒を含む。予防は、可能性のある疾患の阻止および／または症状の悪化または疾患の進行の阻止をいう。処置はまた提供するあらゆる抗体またはその抗原結合フラグメントまたはここに提供する組成物のあらゆる医薬使用も包含する。
ここで使用する“予防する”または予防および文法上その等価形態は、疾患または状態を発症するリスクを減らす方法をいう。
ここで使用する“薬学的に有効な薬剤”は、小分子薬物および治療用タンパク質を含む、例えば、麻酔剤、血管収縮剤、分散剤および慣用の治療剤を含むが、これらに限定されないあらゆる治療剤または生物活性剤を含む。
ここで使用する“治療効果”は、疾患または状態の症状を変える、典型的に改善または寛解させるまたは疾患または状態を治癒する、対象の処置に起因する効果である。
ここで使用する“治療有効量”または“治療有効用量”は、対象への投与後に治療効果を生じるのに少なくとも十分な薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の量をいう。それゆえに、疾患または障害の症状を予防し、治癒し、寛解させ、静止させまたは一部静止させるのに必要な量である。
ここで使用する“治療有効性”は、薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物が投与された対象において治療効果を生じる薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の能力をいう。
ここで使用する“予防有効量”または“予防有効用量”は、対象に投与したとき、意図する予防効果を有する、例えば、疾患または症状の発症または再発を阻止するまたは遅延する、疾患または症状の発症または再発の可能性を低減するまたはウイルス感染の頻度を低減する、薬剤、化合物、物質または化合物を含む組成物の量をいう。完全な予防効果は一投与量の投与で必ずしも生じず、一連の投与量の投与後にのみ生じ得る。それゆえに、予防有効量を１回以上の投与で投与してよい。
ここで使用する医薬組成物または他の治療剤の投与によるような処置による特定の疾患または障害の症状の改善は、組成物または治療剤の投与に起因し得るまたは関係し得る、永続的であれ一時的であれ、持続性であれ一過性であれ、症状のあらゆる軽減をいう。
ここで使用する“プロドラッグ”は、親薬物と比較して腫瘍細胞への細胞毒性が低く、高活性親形態に酵素により活性化されるかまたは変換されることができる、薬学的活性物質の前駆体または誘導体形態をいう(例えば、Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382; and Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.): 247-267, Humana Press, 1985参照)。
ここで使用する“抗癌剤”は、悪性細胞および組織にとって破壊性または毒性であるあらゆる薬剤をいう。例えば、抗癌剤は、癌細胞を死滅するかまたは腫瘍または癌細胞の増殖を他の方法で阻止または障害させる薬剤を含む。抗癌剤の例は化学療法剤である。
ここで使用する“抗血管形成剤”または“血管形成阻害剤”は、血管の発達を遮断または妨害する化合物である。
ここで使用する“過増殖性疾患”は、受容体のＥＧＦＲファミリーのメンバーを発現する非癌細胞の課増殖が原因の状態である。
ここで使用する用語“対象”は、ヒトのような哺乳動物を含む動物である。
ここで使用する患者はヒト対象である。
ここで使用する動物は、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；マウスおよびラットのような齧歯類；ニワトリのような家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジのような反芻動物；ブタおよび他の動物のような、しかし、これらに限定されないあらゆる動物を含む。非ヒト動物は、意図する動物としてヒトを除く。ここに提供するポリペプチドは、あらゆる源、動物、植物、原核および真菌由来である。大部分のポリペプチドは、哺乳動物起源を含む動物起源である。
ここで使用する“組成物”はあらゆる混合物をいう。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはこれらのいずれかの組み合わせであり得る。
ここで使用する安定化剤は、ここでの製剤を保存または使用する、条件(例えば温度)下のような、抗体または接合体を保護するために製剤に添加する化合物をいう。それゆえに、組成物中の他の成分からタンパク質の分解を防ぐ薬剤が含まれる。このような薬剤の例はアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン類、糖類、ポリオール類、塩類および緩衝液、界面活性剤、阻害剤または基質およびここに記載する他の薬剤である。
ここで使用する“組み合わせ”は、２個以上の物のあらゆる結び付きをいう。組み合わせは、２個の組成物または２個の収集物のような２個以上の別々の物、２個以上の物の単一混合物のようなそれらの混合物またはそのあらゆるバリエーションをいう。組み合わせの要素は一般に機能的に結合しているかまたは関連している。
ここで使用する組み合わせ治療は、抗ＥＧＦＲ抗体(またはその抗原結合フラグメント)と１種以上の治療剤のような２種以上の異なる治療剤の投与をいう。異なる治療剤を、別々に、逐次的に、間欠的に提供および投与してよく、または単一組成物で提供できる。
ここで使用するキットは、生物活性または特性の活性化、投与、診断および評価を含むが、これらに限定されない目的のための、所望によりさらなる薬剤および組み合わせまたはその要素の使用指示書のような他の要素を含む包装された組み合わせである。
ここで使用する“単位用量形態”は、当分野で知られるように、ヒト対象および動物対象に適し、個々に包装された物理的に別々の単位をいう。
ここで使用する“単回用量製剤”は直接投与用製剤をいう。
ここで使用する複数用量製剤は、治療剤の複数用量を含み、直接投与して治療剤の単回用量を数回分提供できる、製剤をいう。複数用量を数分、数時間、数週、数日または数ヶ月にわたり投与できる。複数用量製剤は用量調節、用量貯留および／または用量分割を可能にする。複数用量製剤を長時間使用するため、一般に微生物の増殖を阻止するために１種以上の防腐剤を含む。
ここで使用する“製品”は、製造・販売される製造品である。本明細書を通して使用される限り、本用語は、包装品に含まれる、ここに提供する組成物のいずれかを含むことを意図する。
ここで使用する“流体”は、流れることができるあらゆる組成物をいう。それゆえに、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形態の組成物および他のこのような組成物を含む。
ここで使用する単離または精製ポリペプチドまたはタンパク質(例えば、単離抗体またはその抗原結合フラグメント)またはその生物活性部分(例えば、単離抗原結合フラグメント)は、タンパク質が由来する細胞または組織由来の細胞性物質または他の混入タンパク質が実質的にないかまたは化学合成したとき化学的前駆体または他の化学物質が実質的にない。調製物は、このような純度を評価するために当業者により使用される、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)のような標準的分析法で測定して、容易に検出可能な不純物がないように見えるならばまたはさらなる精製が該物質の酵素活性および生物活性のような物理的特性および化学的特性を検出可能なほど変えないように十分に純粋であるならば、実質的にないと決定できる。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製法は当業者に知られる。実質的に化学的に純粋な化合物は、しかしながら、立体異性体の混合物であり得る。このような場合、さらなる精製が化合物の特異的活性を高めるはずである。ここで使用する“細胞抽出物”または“ライセート”は、溶解したまたは破壊した細胞から製造した調製物またはフラクションをいう。
ここで使用する“対照”は、試験パラメータで処理されていない以外試験サンプルと実質的に同一であるサンプルであるか、または、血漿サンプルであるならば、興味ある状態に罹患していない健常ボランティア由来であり得る。対照は内部対照であり得る。
ここで使用する単数表現は、文脈上明らかに反しない限り、複数表現を含む。それゆえに、例えば、“免疫グロブリンドメイン”を含むポリペプチドは、１個または複数個の免疫グロブリンドメインを伴う、複数ポリペプチドを含む。
ここで使用する用語“または”は、代替物のみをいうと明確に示していない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、“および／または”を意味するために使用する。
ここで使用する範囲および量は、“凡そ(約)”特定の値または範囲であると表し得る。凡そ(約)はまた正確な量も含む。それゆえに、“約５アミノ酸”は“約５アミノ酸”およびまた“５アミノ酸”を含む。
ここで使用する“任意”または“所望により”は、その後に記載する事象または状況が、生じるかまたは生じないことを意味し、本記載は該事象または状況が起きる例およびおきない例を含む。例えば、所望により変異体部分は、該部分が変異体または非変異体であることを意味する。
ここで使用するあらゆる保護基、アミノ酸および他の化合物に関する略語は、特に断らない限り、その一般的使用、認められている略語またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureに従う(Biochem. (1972) 11(9):1726-1732参照)。
開示を明確にするため、そして限定としてではなく、詳細な記載を以下のサブサブセクションに分ける。
Ｂ. ＥＧＦＲおよび抗ＥＧＦＲ抗体
ここに提供されるのは、中性ｐＨ／正常乳酸レベル(例えば、真皮で存在する)条件下よりも、酸性ｐＨおよび／または高乳酸レベル(例えば、腫瘍微小環境で存在する)条件下で大きな結合活性を示す、抗上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)抗体である。抗ＥＧＦＲ抗体は知られ、転移結腸直腸癌(ｍＣＲＣ)、頭頸部の扁平上皮細胞癌(ＳＣＣＨＮ)および非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)、膵臓癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、直腸癌、膀胱癌および他の固形腫瘍を含む種々の適応症について承認されている。抗ＥＧＦＲ抗体は、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ、Ｃ２２５またはＩＭＣ−Ｃ２２５)、Ｚｈｕの１１Ｆ８(ＷＯ２００５／０９０４０７)、ＥＭＤ ７２０００(マツズマブ)、ベクティビックスTM(パニツムマブ；ＡＢＸ−ＥＧＦ)、ＴｈｅｒａＣＩＭ(ニモツズマブ)およびＨｕ−Ｍａｘ−ＥＧＦＲ(ザルツムマブ)を含むが、これらに限定されない。しかしながら、これらの抗体は種々のｐＨ条件下でＥＧＦＲに対し実質的に類似した結合活性をしめし、それゆえにそれらの活性は腫瘍特異的ではなく、それにより皮膚のような非標的部位で望まない活性を生じる。それゆえに、対象に投与したとき、これらの治療用抗体は対象に有害副作用を生じる(Eng C. (2009) Nat. Rev. Clin. Oncol., 6:207-218)。これがその使用を制限している。
例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、しばしば投薬の中断および処置の中止に至らしめる皮膚毒性および消化器障害(悪心、嘔吐、下痢を含む)を含む顕著かつ特徴的な有害事象と関係する。例えば、ＥＧＦＲは皮膚の前角化細胞および基底細胞で高度に発現される。抗ＥＧＦＲ抗体による皮膚前駆体中のＥＧＦＲシグナル伝達遮断は、皮膚前駆体増殖阻害、アポトーシスおよび炎症を起こす。これは、発疹および他の皮膚病変のような皮膚毒性をもたらし得る。特に、現存する抗ＥＧＦＲ抗体(例えば、セツキシマブ、パニツムマブ)は、最大８０％が皮膚関連毒性が原因であり、そのうち２５％がグレード３〜４である高い毒性を示す(Cunningham et al. (2004) NEJM, 351:337)。特に、皮膚病変は膿疱に発達し得る痒い紅斑性濾胞性丘疹を伴う発疹を含み得る。
治療剤として、抗ＥＧＦＲ抗体の活性は、主に腫瘍環境を標的とし、それは酸性ｐＨおよび高乳酸レベル、例えば、１０〜１５mM乳酸を示す。対照的に、多くの副作用が局在化する場所である真皮は、中性ｐＨおよび正常乳酸レベルを示す。本発明により、腫瘍のような標的疾患組織では高い活性を示すが、非疾患組織または臓器、特に有害事象と関係する組織部位(例えば、皮膚の基底層または真皮)で活性が低下した抗体を提供することにより、副作用が軽減できることを発見した。低ｐＨおよび低酸素症のような固形腫瘍を特徴付ける条件の差異を利用して、腫瘍の罹患微小環境で高活性である抗体を提供できる。それゆえに、ここに提供されるのは、腫瘍微小環境で条件付活性であり、正常組織と比較して、腫瘍微小環境に存在する条件下、改変されたまたは増加した活性を示す、修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、ここに提供される抗体は、中性ｐＨまたは低乳酸より低ｐＨおよび／または高乳酸で高活性である。この改変された活性の結果、本抗体で処置される対象の副作用は少なくおよび／または軽減している。
特に、可変重鎖における配列番号２または７に示す可変重鎖を参照して１０４位に対応する位置に負に荷電したアミノ酸(例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ)を有するアミノ酸置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.４)よりも、腫瘍の酸性ｐＨ環境のような低または酸性ｐＨ、例えば、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)で活性、例えば結合活性が増加することが判明した。しかしながら、Ｇｌｕ(Ｅ)へのアミノ酸置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.４)でアミノ酸置換Ａｓｐ(Ｄ)を含む抗体より実質的に弱いまたは低い結合活性を示す。この差異は、分子の酸性度に影響する余分な−ＣＨ２基の存在によるものであろう。中性ｐＨでの結合の低減により、可変重鎖に、配列番号２または７に示す可変重鎖を参照して１０４位に対応する位置に負に荷電したアミノ酸Ｇｌｕ(Ｅ)でのアミノ酸置換(例えば、Ｙ１０４Ｅ)を含むここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、酸性ｐＨ結合選択性の改善、そしてそれにより、活性が望まれる場所である腫瘍標的選択性の改善を示す。このような修飾抗ＥＧＦＲ抗体はまた、１５〜２０mM乳酸濃度のような増加した乳酸濃度で増加した活性、例えば結合活性を示し得る。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、低ｐＨ(例えば、酸性ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む))および高乳酸レベル(例えば、１５mM〜２０mM乳酸)で、結合活性のような活性の増加を伴い結合する。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、投与したとき副作用の軽減または減少をさせるような改変された活性を示す。
１. ＥＧＦＲ
上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ；受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１としても知られる)(Uniprot Accession No. P00533；配列番号４３)は１７０kDa Ｉ型糖タンパク質である。ＥＧＦＲは受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、これはＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ(ＥｒｂＢ−２)、Ｈｅｒ３(ＥｒｂＢ−３)およびＨｅｒ４(ＥｒｂＢ−４)を含む。ＥＧＦＲは細胞表面に提示され、細胞外リガンド結合ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメインおよび膜貫通親油性セグメントを含む３個のドメインを含む。その腫瘍細胞上への存在に加えて、上皮成長因子受容体は遍在性であり、造血細胞および上皮起源の細胞を除く、正常細胞の表面上に無作為に分布する。
ＥＧＦＲは細胞成長、増殖、生存および運動性に重要なシグナル伝達カスケードに関与するチロシンキナーゼ増殖因子受容体である。ＥＧＦＲ活性は、上皮成長因子(ＥＧＦ)のような内在性リガンドならびにＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ(ＨＢ−ＥＧＦ)およびベータセルリンを含む他の内在性ＥＧＦ様リガンドの結合により刺激または活性化される。リガンド結合により、リガンド−ＥＧＦＲ複合体は、二量体化し、細胞内へ内部移行する。ＥＧＦＲは、他の単量体ＥＧＦＲ分子とホモ二量体化でき、あるいは、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４のような他のＨＥＲ受容体とヘテロ二量体化する。ＥＧＦＲ二量体化は、ＥＧＦＲの細胞質側末端のチロシン残基の自己リン酸化を誘発し、内因性細胞内タンパク質チロシンキナーゼ活性を活性化する。ＥＧＦＲホスホチロシン残基は、アダプター分子および酵素のような下流エフェクターのドッキング部位として作用し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)、Ａｋｔ／ホスファチジルイノシトール−３−ＯＨキナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ(ＪＮＫ)を含む多様なシグナル伝達経路の開始に至り、それによりＤＮＡ合成、細胞増殖、細胞遊走、細胞生存および細胞接着に関与する多様な分裂促進的機構を制御する。
ＥＧＦＲは細胞生存およびアポトーシス、血管形成、細胞運動性および転移の制御に重要である(Herbst et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1(4):719-732)。ＥＧＦＲ活性化は腫瘍血管形成の刺激因子である血管内皮細胞増殖因子の分泌の著しい上方制御と関係する(Petit at al. (1997) Am J Pathol 151:1523-1530)。異常ＥＧＦＲシグナル伝達およびＥＧＦＲ過発現は種々の癌で観察されており、予後不良および浸潤性または転移性疾患の高いリスクと相関する(Herbst et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1(4):719-732)。例えば、ＥＧＦＲの脱制御は、神経膠腫ならびに結腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、乳癌、腎癌、卵巣癌および膀胱癌を含む多様なヒト固形腫瘍で観察されている(Herbst and Hong (2002) Seminars in Oncology 29(5) Suppl. 14: 18-30)。そのようなものとして、ＥＧＦＲは抗癌治療剤の魅力的な標的である。
２. 抗ＥＧＦＲ抗体および副作用
異常ＥＧＦＲシグナル伝達を標的とし、阻害する治療剤は抗ＥＧＦＲ抗体を含む。抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＲと結合し、それによりＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインへの、ＥＧＦのリガンドの結合を阻害し、受容体二量体化、自己リン酸化および結果的なシグナル伝達事象を阻害する。それゆえに、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ介在細胞シグナル伝達および細胞増殖の遮断により有効な治療剤であり得る。抗ＥＧＦＲ抗体は当分野で知られ、その多くが癌の処置のために臨床開発中であるかまたは承認されている。ImCloneにより商品名アービタックス(登録商標)の下に市販されているセツキシマブは、ヒト化形態を含み米国特許４,９４３,５３３号および７,０６０,８０８号に記載されている。Abgenixにより商品名ベクティビックスの下に販売されているパニツムマブは米国特許６,２３５,８８３号に記載されている。Genmabにより開発されたザルツムマブ(HuMax-EGFr)はＷＯ０２／１００３４８およびＷＯ２００４／０５６８４７に記載されている。セツキシマブ、パニツムマブおよびザルツムマブは、ＥＧＦＲ上の同じエピトープに結合する。さらなるモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体は、ニモツズマブ(TheraCIM hR3；米国特許５,８９１,９９６号および米国特許６,５０６,８８３号)；ＩＣＲ６２(The Institute of Cancer Research；ＷＯ９５／２００４５)；ｍＡｂ８０６(Ludwig Institute of Cancer Research；ＷＯ０２／０９２７７１)およびマツズマブ(EMD72000, Merck-Serono；ＷＯ０２／６６０５８、ＷＯ９２／１５６８３)を含むが、これらに限定されない。
しかしながら、抗ＥＧＦＲ抗体は、癌細胞と正常細胞の表面上のＥＧＦ受容体を区別できず、ＥＧＦＲシグナル伝達の普遍的阻害は有害副作用を起こし得る。例えば、ＥＧＦＲは上皮性組織の至るところに広範に分布し、多くのＥＧＦＲ阻害剤を用いる処置は皮膚毒性を示す(Herbst and Hong (2002) Seminars in Oncology 29(5) Suppl. 14: 18-30)。ヒト皮膚において、ＥＧＦＲは基底ケラチン生成細胞で発現され、上皮増殖を促進し、分化を阻害し、創傷治癒を加速できる(Lacouture and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5; Nanney et al. (1990) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748; Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812)。ＥＧＦＲ機能の阻害は、ケラチン生成細胞の増殖および遊走を障害し、発疹を起こす炎症性ケモカイン発現をもたらし得る(Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812)。ＥＧＦＲ阻害剤での処置によるケラチン生成細胞のアポトーシス増加は、該ＥＧＦＲ阻害剤で処置された対象の発疹の発症と相関する(Lacouture, M.E. (2006) Nat Rev Cancer 6:803-812)。ケラチン生成細胞は、皮膚の最深層である基底細胞層に位置し、これは７.０〜７.２のｐＨを有する。真皮の血管は表皮に栄養物を提供し、廃棄物を除去し、そうして表皮、特に基底細胞層を、全身を循環する抗ＥＧＦＲ治療剤に対して最も感受性とする。
セツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体と関係する最も一般的な副作用は皮膚科学的反応であり、患者の４５〜１００％に見られる(Li and Perez-Soler (2009) Target Oncol 4:107-119))。一般的皮膚科学的反応は、ざ瘡様発疹、丘疹小水疱性皮疹、発毛異常、皮膚の乾燥および痒みならびに圧痛を伴う爪周囲炎を含む(Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218; Monti et al. (2007) Int J Biol Markers 22:S53-S61; Saif and Kim (2007) Expert Opin Drug Saf 6:175-182)。さらなる皮膚科学的反応は、毛細血管拡張症、色素増加症、発疹を伴わないそう痒、紅斑および口内炎を含む(Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218)。セツキシマブは、患者の約５〜１５％で免疫応答を起こし、一部の患者では重度アナフィラキシー反応が報告されている(Chung et al. (2008) N Engl JMed 358:1109-1117)。これらの過敏症反応は、ＩｇＧ抗体の産生を誘発するセツキシマブ上のガラクトース−アルファ−１,３−ガラクトースオリゴ糖と結び付けられている(Chung et al. (2008) N Engl JMed 358:1109-1117)。さらなる副作用は、呼吸困難、咳嗽、喘鳴、肺炎、低酸素血症、呼吸障害／不全、肺塞栓、胸水および非特異的呼吸器障害を含む肺毒性である(Hoag et al. (2009) J Experimental & Clinical Cancer Research 28:113)。他の副作用は発熱、悪寒、無力症／倦怠感、粘膜表面の問題、悪心、消化器の問題、腹痛、頭痛および低マグネシウム血症を含む(Eng (2009) Nat Rev Clin Oncol 6:207-218; Fakih and Vincent, (2010) Curr. Oncol. 17(S1):S18-S30；国際特許ＷＯ２０１１０５９７６２号)。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、基底ケラチン生成細胞および他の基底細胞のような非腫瘍細胞標的と比較して、腫瘍細胞に対する結合選択性を示す。それゆえに、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、現在利用可能な抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、患者に投与したとき、ＥＧＦＲシグナル伝達を遮断する能力を維持しながら、皮膚毒性を含む全身副作用の排除、最小化または減少を含み、副作用を減少できる。また存在する治療剤と比較して、高い有効性を達成するための投薬が可能である。
３. セツキシマブ
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体に含まれるのは、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ、その抗原結合フラグメントまたはその変異体(例えば、セツキシマブのヒト化形態、例えば、Ｈｕ２２５またはＨ２２５)と比較して、修飾されている(例えば、可変重鎖における１０４位に対応する位置にＧｌｕ(Ｅ)でのアミノ酸置換を含む)抗体である。セツキシマブ(Ｃ２２５またはＩＭＣ−Ｃ２２５としても知られる)は、ヒト上皮成長因子受容体に結合するマウス／ヒトキメラＩｇＧ１モノクローナル抗体である。セツキシマブは、免疫原としてヒトＡ４３１類表皮癌細胞からＥＧＦＲを使用して同定されたＭ２２５から導かれた(Gill et al. (1984) J Biol Chem 259:7755-7760; Sato et al., (1983) Mol Biol Med 1:511-529; Masui et al., (1984) Cancer Res 44:1002-1007; Kawamoto et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:1337-1341)。Ｍ２２５は、上皮成長因子のＥＧＦ受容体への結合を阻害し、インビボでＥＧＦ刺激チロシンキナーゼ活性のアンタゴニストである(Gill et al. (1984) J Biol Chem 259:7755-7760)。
ａ. 構造
セツキシマブは完全長マウス／ヒトキメラＩｇＧ１抗体である。完全長抗体は、２個の同一重(Ｈ)鎖(各々通常約４４０個のアミノ酸を含む)および２個の同一軽(Ｌ)鎖(各々約２２０個のアミノ酸を含む)の４個のポリペプチド鎖を含む。軽鎖は、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる２つの別個の形態で存在する。各鎖は、免疫グロブリン(Ｉｇ)ドメインとして構造化される一連のドメインに構造化される。Ｉｇドメインは、各々ループにより接続された逆平行ベータ鎖を含む２個のベータプリーツシートを含むＩｇ折り畳みと呼ばれる構造により特徴付けられる。Ｉｇ折り畳みの２個のベータシートは、疎水性相互作用および保存鎖内ジスルフィド結合により一緒にサンドイッチされている。抗体鎖内の複数のＩｇドメインが可変(Ｖ)および定数(Ｃ)領域ドメインに構造化される。
可変ドメインは、相補性決定領域(ＣＤＲ)または超可変(ＨＶ)領域と呼ばれる３個の部分により抗体に抗原特異性を付与する。ＣＤＲ領域は厳密に規定され、抗体で普遍的に番号付けされる(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; AbM (Martin et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol 203:121-153; Pedersen et al. (1992) Immunomethods 1:126参照)。合わせて、３個の重鎖ＣＤＲと３個の軽鎖ＣＤＲが、抗体の抗原結合部位(抗体結合部位)を形成し、これは、同族抗原と物理的に相互作用し、抗体の特異性を提供する。
定常領域は、補体およびエフェクター細胞の活性化を促進する。ＣＤＲ領域と同様、定常領域は厳密に規定され、ＥＵ指数およびKabat番号付けスキームを使用して抗体で普遍的に番号付けされる(例えば、Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)。
軽鎖は、Ｃ領域(ＣＬ)およびＶ領域(ＶＬ)に対応する２個のドメインを有する。重鎖は、４個のドメイン、Ｖ領域(ＶＨ)およびＣ領域に３個または４個のドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４)、そして、ある場合には、ヒンジ領域を含む。各重鎖は、ジスルフィド結合により軽鎖と結合し、２個の重鎖がジスルフィド結合により互いに結合する。重鎖の結合は、ヒンジ領域として知られる重鎖の可動性領域が介在する。
セツキシマブ(Ｃ２２５とも呼ばれる)は、マウスモノクローナル抗体２２５(Ｍ２２５)由来の可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域を含む、ヒト−マウスキメラ抗体である。抗体Ｍ２２５は米国特許４,９４３,５３３号に記載され、American Type Culture Collection(ATCC)に受託番号HB 11935として寄託されたハイブリドーマ細胞株から産生できる。Ｍ２２５の非ヒト定常領域をヒトＩｇＧ１定常領域に置き換えたキメラ形態が開発された(例えば、Prewett et al. (1996) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19:419-27参照)。Ｃ２２５はアービタックス(登録商標)(セツキシマブ)として商業的に知られ、米国ではImCloneおよびBristol-Myers Squibbおよび他国ではMerck KgaAにより販売されている。アービタックス(登録商標)は、２００６年３月に頭頸部の扁平上皮細胞癌(ＳＣＣＨＮ)の処置に放射線治療と組み合わせでの使用がまたは白金治療を以前に受けている患者への単剤として、ＦＤＡにより認可された。アービタックス(登録商標)はまた転移結腸癌の処置のために、ＤＮＡトポイソメラーゼブロッカーであるイリノテカン(カンプトサール(登録商標))と組み合わせて適用される。
セツキシマブは、各４４９アミノ酸の２個の同一重鎖(例えば、配列番号１２に示す)および各２１４アミノ酸の２個の同一軽鎖(例えば、配列番号１３に示す)を含む、４個のポリペプチド鎖からなると報告されている(IMGT Acc. No. 7906参照)。Ｍ２２５の可変領域に対応する可変領域を配列番号１２のアミノ酸残基１〜１１９(可変重鎖、配列番号２に示す)および配列番号１３のアミノ酸残基１〜１０７(可変軽鎖、配列番号４として示す)として示す。Ｃ２２５は、ＣＨ１(配列番号１２のアミノ酸残基１２０〜２１７)、ヒンジ領域(配列番号１２のアミノ酸残基２１８〜２３２)、ＣＨ２(配列番号１２のアミノ酸残基２３３〜３４２)およびＣＨ３(配列番号１２のアミノ酸残基３４３〜４４９)を含む、ヒト定常ドメインＣＨ１−ＣＨ２−ヒンジ−ＣＨ３を含む、配列番号１２のアミノ酸残基１２０〜４４９(配列番号２３に示す)として示すヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。Ｃ２２５はまた配列番号１３のアミノ酸残基１０８〜２１３(配列番号３４として示す)に示すヒトＣκ軽鎖定常領域も含む。
例えば、配列決定またはクローニングアーチファクトまたは他の産生された配列の多様性により、セツキシマブの報告されたおよび産生された配列にいくつかの変異が存在することが理解される。例えば、セツキシマブの種々の配列バージョンが文献に報告されている(例えば、米国特許７,０６０,８０８号；米国公開ＵＳ２０１１−０１１７１１０号およびＵＳ２０１３−０２６６５７９号；国際公開ＰＣＴ出願ＷＯ２００４０８５４７４号；GenBank Accession No. CAH61633；DrugBank Acc. No. DB00002；IMGT Acc. No. 7906)。表５は、重鎖および／または軽鎖の非ＣＤＲ領域の数アミノ酸残基のみが異なる対照セツキシマブ配列の例を示す(図１Ａおよび１Ｂも参照のこと)。
表５に示す対照配列の例に関して、重鎖はマウス可変ドメイン(ＶＨ、配列番号１、５、６または１２のアミノ酸残基１〜１１９、配列番号２または７に示す)からなり、軽鎖はマウス可変ドメイン(ＶＬ、配列番号３、８、１０または１３のアミノ酸残基１〜１０７、配列番号４、９または１１に示す)からなる。セツキシマブのＣＤＲは、ＶＨ ＣＤＲ１(カバトの定義による、配列番号２または７のアミノ酸残基３１〜３５、配列番号３５に示す)；ＶＨ ＣＤＲ２(配列番号２または７のアミノ酸残基５０〜６５、配列番号３６に示す)；ＶＨ ＣＤＲ３(配列番号２または７のアミノ酸残基９８〜１０８、配列番号３７に示す)；ＶＬ ＣＤＲ１(配列番号４、９または１１のアミノ酸残基２４〜３４、配列番号３８に示す)；ＶＬ ＣＤＲ２(配列番号４、９または１１のアミノ酸残基５０〜５６、配列番号３９に示す)およびＶＬ ＣＤＲ３(配列番号４、９または１１のアミノ酸残基８９〜９７、配列番号４０に示す)を含み、例えば、米国公開ＵＳ２０１１０１１７１１０号を参照のこと。
マウス重鎖および軽鎖の可変領域がフレームワーク領域のアミノ酸置換によりヒト化されているセツキシマブのヒト化バージョンが産生されている(表５参照)。例えば、米国特許７,０６０,８０８号は、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する可変重鎖と配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する可変軽鎖を含むＨ２２５を記載する。Ｈｕ２２５と名づけられたもう一つのヒト化変異体が米国公開出願ＵＳ２０１１／０１１７１１０号に記載され、これは、配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する可変重鎖および配列番号１７に示すアミノ酸配列を有する可変軽鎖を含む抗体である。ヒト化変異体のＣＤＲはＭ２２５およびＣ２２５ならびに上記の他の報告されたセツキシマブ抗体と同一である。これらのヒト化抗体は、セツキシマブと比較して免疫原性が低い。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ変異体と関連して本願明細書に記載するとおり、セツキシマブのヒト化変異体は完全長抗体でも、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよびｓｃＦｖフラグメントを含むその抗原結合フラグメントでもよい。完全長抗体として、ヒト化抗体はあらゆる免疫グロブリンアイソタイプまたはクラス(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、あらゆるサブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブ・サブクラス(例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ)を有し得る。
改変された特性または活性を示す他のセツキシマブ変異体も記載され、当分野で知られる(例えば、米国特許７,６５７,３８０号、７,９３０,１０７号、７,０６０,８０８号、７,７２３,４８４号、米国特許公開２０１１０１４８２２号、２００５１４２１３３号、２０１１１１７１１０号、国際特許公開ＷＯ２０１２００３９９５号、ＷＯ２０１００８０４６３号、ＷＯ２０１２０２００５９号、ＷＯ２００８１５２５３７号およびLippow et al. (2007) Nat Biotechnol. 25(10):1171-1176参照)。
ここに記載する修飾は、当分野で知られるあらゆるものを含む、あらゆるセツキシマブ、抗原結合フラグメントまたはその変異体に行い得る。
ｂ. 機能
セツキシマブはＥＧＦＲに特異的に結合する。ＥＧＦＲの細胞外ドメイン(ｓＥＧＦＲ)に結合するセツキシマブＦａｂの結晶構造は決定されている(Li et al., (2005) Cancer Cell 7:301-311)。セツキシマブは、天然リガンド上皮成長因子と一部重複するエピトープで上皮成長因子受容体のドメインIII(配列番号４３のアミノ酸３１０〜５１４)に結合する。セツキシマブの残基Ｌ２７Ｇｌｎ、Ｌ５０Ｔｙｒ、Ｌ９４Ｔｒｐ(例えば、配列番号４に示す可変領域を参照)およびＨ５２Ｔｒｐ、Ｈ５８Ａｓｐ、Ｈ１０１Ｔｙｒ、Ｈ１０２Ｔｙｒ、Ｈ１０３ＡｓｐおよびＨ１０４Ｔｙｒ(例えば、配列番号２に示す可変領域を参照)がｓＥＧＦＲのドメインIIIと接触する。セツキシマブの軽鎖は、セツキシマブのＶＬ ＣＤＲ１残基Ｌ２７ＧｌｎがｓＥＧＦＲの残基Ｎ４７３と結合することによりＥＧＦＲのＣ末端ドメインと結合する。ＶＨ ＣＤＲ３残基Ｈ１０２Ｔｙｒは、ドメインIIIの大きなβシートの表面上の疎水性ポケットに突出し、ｓＥＧＦＲのＱ３８４およびＱ４０８のグルタミン側鎖と水素結合を形成する。ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３は疎水性ポケットに重なり、Ｈ５２ＴｒｐとｓＥＧＦＲのＳ４１８およびＨ１０４ＴｙｒとｓＥＧＦＲのＳ４６８の間の側鎖−側鎖水素結合、Ｈ５４ＧｌｙおよびＨ１０３Ａｓｐのカルボニル酸素とｓＥＧＦＲ Ｓ４４０とＲ３５３の間の側鎖−主鎖相互作用ならびにＨ５６ＡｓｎとｓＥＧＦＲのＳ４１８およびＱ３８４の間の間接水素結合により固定される。ＥＧＦのｓＥＧＦＲへの結合の遮断に加えて、セツキシマブの可変重鎖はドメインＩを立体的に遮断し、それによりドメインIIが二量体化に必要な立体構造を採用することを妨げる。
セツキシマブは、正常細胞および腫瘍細胞両者のＥＧＦＲの細胞外ドメインと結合し、リガンド結合と続く活性化を阻止する(Li et al., (2005) Cancer Cell 7:301-311; Blick et al., (2007) Drugs 67(17):2585-2607)。セツキシマブは上皮成長因子とトランスフォーミング増殖因子アルファ(ＴＧＦ−アルファ)の結合を競合的に阻害し、細胞増殖および転移拡散を阻止する。すなわち、セツキシマブの結合はチロシン受容体キナーゼのリン酸化および活性化を阻止し、細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導、マトリックスメタロプロテアーゼ分泌減少および血管内皮細胞増殖因子産生減少を起こす。セツキシマブはまた血管形成阻害を経る抗腫瘍効果も誘発できる。セツキシマブは高度に転移性のヒトＴＣＣ ２５３ＪＢ−Ｖ細胞におけるＶＥＧＦ、ＩＬ−８およびｂＦＧＦの発現を用量依存的様式で阻害し、微小血管密度を低下させる(Perrotte et al. (1999), Clin. Cancer Res., 5:257-264)。セツキシマブは腫瘍細胞のＶＥＧＦ発現をインビトロおよびインビボで下方制御できる(Petit et al. (1997), Am. J. Pathol., 151:1523-1530; Prewett et al. (1998), Clin. Cancer Res. 4:2957-2966)。セツキシマブはまた補体活性化および抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)および受容体内部移行にも関与する。
Ｃ. 酸性ｐＨ選択性を有する修飾活性抗ＥＧＦＲ抗体
ここに提供されるのは、配列番号２または７を参照して、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖の可変ドメインの１０４位に対応する位置にグルタミン酸(Ｇｌｕ、Ｅ)でのアミノ酸置換(１０４Ｅと呼ぶ)を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントである。非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の１０４位に対応する位置は、配列番号２または７に示す可変重鎖との可変重鎖のアライメントにより決定できる(例えば、図２参照)。またここに提供されるのは、配列番号２または７を参照して、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖の可変ドメインの１０４位に対応する位置に保存的アミノ酸アスパラギン酸(Ｄ)への対応する置換(１０４Ｄと命名)を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントである。
１０４Ｅに対応するアミノ酸置換を含むここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに特異的に結合する。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の結合活性は、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下で高い。例えば、ｐＨ６.０〜６.５および１５mM〜２０mM乳酸の一方または両方を含む条件下の結合活性対正確にまたは約ｐＨ７.４および／または正確にまたは約１mM乳酸の一方または両方を含む条件下の結合活性の比は、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０を超えまたはそれ以上である。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、改変された結合活性を生理的濃度のタンパク質(例えば、２５％血清)の存在下で示すことができる。それゆえに、ここに提供する抗体は腫瘍選択的ＥＧＦＲ結合活性を示すことができ、それにより、結合活性は、非腫瘍微小環境で存在する条件と比較して、腫瘍微小環境で存在する条件下で大きい。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、最小限、抗体に集合したときにＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントと結合するのに十分な可変重鎖および可変軽鎖またはその一部を含み、それにより少なくとも可変重鎖が１０４Ｅでの置換により修飾される。得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体は完全長ＩｇＧ(例えば、ＩｇＧ１)抗体でも、そのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントでもよい。さらに、得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１以外のドメインを含み得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、可変重鎖にアミノ酸置換１０４Ｅまたは対応する保存的アミノ酸アスパラギン酸(Ｄ)への置換のみを含み得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の他の例において、重鎖または軽鎖の一方または両方におけるさらなるアミノ酸置換または修飾が、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体に含まれ得る。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、修飾を含まない抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上の修飾位置を含み得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の全ての例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較してアミノ酸置換１０４Ｅまたは対応する保存的アミノ酸置換を含み、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、結合活性６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下で大きな活性を示すと理解される。
非修飾抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブ抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体であり得る。アミノ酸置換１０４Ｅを含むここでのアミノ酸置換をなし得る非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号１、２、５、６、７、１２、１４または１６のいずれかに示す重鎖を含む抗ＥＧＦＲセツキシマブ抗体または抗原結合フラグメントまたはその変異体または配列番号１、２、５、６、７、１２、１４または１６のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含む抗原結合フラグメントまたはその変異体を含むが、これらに限定されない。例えば、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２に示す可変重鎖(ＶＨ)および配列番号４に示す可変軽鎖(ＶＬ)、配列番号７に示すＶＨおよび配列番号９に示すＶＬ、配列番号７に示すＶＨおよび配列番号１１に示すＶＬ、配列番号１４に示すＶＨまたは配列番号１５に示すＶＬまたは配列番号１６に示すＶＨまたは配列番号１７に示すＶＬまたは可変重鎖または軽鎖の配列番号のものと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を示す可変重鎖および／または可変軽鎖を含むその変異体を含む、アミノ酸配列を含み得る。非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は完全長抗体でもその抗原結合フラグメントでもよい。例えば、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、上記のいずれかのＶＨまたはＶＬ領域および配列番号１に示す重鎖と配列番号３に示す軽鎖、配列番号５に示す重鎖と配列番号３に示す軽鎖、配列番号１２に示す重鎖と配列番号１３に示す軽鎖、配列番号６に示す重鎖と配列番号８に示す軽鎖または配列番号６に示す重鎖と配列番号１０に示す軽鎖を含む重鎖および軽鎖の定常領域を含んでよく、または重鎖または軽鎖の配列番号の一方または両方と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を示す重鎖および／または軽鎖を含む完全長抗体またはその変異体の抗原結合フラグメントであってよい。このような例のいずれにおいても、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントはアミノ酸置換Ｙ１０４Ｅを有する可変重鎖を含んでよく、ここで、１０４位に対応する位置のチロシン(Ｙ)がＥで置換されている。いくつかの例において、１０４位に対応する位置で修飾(例えば、置換)されているアミノ酸残基は、配列番号２または７に示すアミノ酸の保存的残基または半保存的アミノ酸残基である。
ここでの目的のために、１個以上のアミノ酸置換を含む修飾のための位置およびアミノ酸への言及は、配列番号２または７に示す野生型セツキシマブ抗体の可変重鎖および配列番号４に示す野生型セツキシマブ抗体の可変軽鎖を参照する。配列番号２または７に示す可変重鎖または配列番号４に示す可変軽鎖の対照抗ＥＧＦＲと抗ＥＧＦＲ抗体重鎖または軽鎖をアライメントすることにより、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の可変重鎖または可変軽鎖における対応するアミノ酸残基を同定することにより、他の抗ＥＧＦＲ抗体における可変重鎖(１０４Ｅを含む)または可変軽鎖における修飾のいずれかを行うことは当業者のレベルの範囲内である。例えば、図２Ａおよび２Ｂは、代表的抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖と配列番号２および７のアライメントを記載し、図２Ｃおよび２Ｄは、代表的抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖と配列番号４、９または１１のアライメントを記載する。修飾(例えば、アミノ酸置換)の目的で、置換された位置の対応するアミノ酸残基はあらゆるアミノ酸残基であってよく、配列番号２もしくは７または配列番号４に示す残基と同一である必要はない。典型的に、配列番号２もしくは７または配列番号４における残基とのアライメントにより同定した対応するアミノ酸残基は、配列番号２もしくは７または配列番号４と同一であるアミノ酸残基またはそれの保存的または半保存的アミノ酸残基であるアミノ酸残基である(例えば、図２参照)。一例として、１０４位に対応する位置の残基は、配列番号２および７でＴｙｒ(Ｙ)である。それゆえに、グルタミン酸(Ｅ)に置き換えられる非修飾抗ＥＧＦＲ抗体における対応する残基、すなわち、配列番号２または７におけるＹ１０４Ｅに対応する残基は、トリプトファン(Ｔｒｐ、Ｗ１０４Ｅ)またはフェニルアラニン(Ｐｈｅ、Ｆ１０４Ｅ)のような保存的アミノ酸残基であり得る(表４参照)。
ここに提供する置換の例は、置換が抗ＥＧＦＲ抗体重鎖または軽鎖の非修飾形態に存在するアミノ酸と異なる限り、重鎖または軽鎖の可変領域におけるような、抗ＥＧＦＲ抗体重鎖または軽鎖における対応する残基で行い得ることも理解される。この記載および本明細書の他の箇所の記載に基づき、記載する変異のいずれか１個以上を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体を産生し、各々ここに記載する特性または活性について試験することは当業者のレベルの範囲内である。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、対応する形態の非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、例えば、対応する形態の配列番号２または７に示す重鎖可変ドメインアミノ酸を含む野生型セツキシマブと比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨを含む条件下でＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲまたはその可溶性形態)に大きなまたは増加した結合活性を示しおよび／または７.４の中性ｐＨを含む条件下で弱い結合を示す。典型的に、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、対応する形態の非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、例えば対応する形態の配列番号２または７に示す重鎖可変ドメインアミノ酸を含む野生型セツキシマブと比較して、７.４の中性ｐＨでＥＧＦＲ抗原またはその可溶性フラグメント(例えば、ヒトＥＧＦＲまたはその可溶性形態)に弱い結合活性を示す。具体例では、ここに提供する抗体は、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)で、同じ条件下の非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の結合活性と比較して、同等なまたは増加した結合活性を示すが、約ｐＨ７.４の中性ｐＨで減少した結合活性、例えばｐＨ７.４で対応する形態の非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％より少ない結合活性を示す。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、中性７.０〜７.４(両端を含む)のｐＨで、対応する形態の非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、少なくとも正確にまたは少なくとも凡そ２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれ以上弱い結合活性を示す。
ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲまたはその可溶性形態)への結合活性は、ＥＧＦＲ(例えば、ヒトＥＧＦＲ)への抗体または抗原結合フラグメントの結合を評価する当業者に知られるあらゆる方法に基づき、決定または評価できる。このようなアッセイの例はセクションＥに記載する。このようなアッセイは、固相結合アッセイ、例えば免疫アッセイ(例えば、酵素結合免疫吸着検定法；ＥＬＩＳＡ)、親和性ベースのバイオセンサーアッセイ(例えば、BIAcore technology)またはインビボ結合アッセイを含むが、これらに限定されない。このようなアッセイにおいて、結合活性は検出可能シグナル(例えば、結合の分光光度測定または蛍光測定)、最大半量結合濃度(ＥＣ５０)または結合の動力学的指標(例えば、解離定数、Ｋｄ、結合定数Ｋａ、オフ・レートまたは結合親和性の他の動力学的パラメータ)として測定でき、または表し得る。当業者は、使用する特定のアッセイによって、ある例では、高い結合活性は高い値で表すことができ、弱い結合活性は低い値で表すことができることを理解する(例えば、結合活性をＫＡとしてまたは結合シグナルの測定値として示すとき)。他の例において、高い結合活性は低い値で表すことができ、低い結合活性は高い値として測定され得る(例えば、結合活性をＫＤまたはオフ・レートとして表すとき)。
ここでの目的のために、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上の結合活性比は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体が、ｐＨ７.４および１mM乳酸を含む条件下より、ｐＨ６.０〜６.５および／または１５mM〜２０mM乳酸の一方または両者を含む条件下で、ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲまたはその可溶性フラグメント)に対して示す倍率差の高い結合活性(例えば、高いまたは密接な結合親和性)を示すことを意味すると理解される。例えば、少なくとも２.０の結合活性比は少なくとも２倍密接な親和性を意味し、少なくとも３.０の結合活性比は少なくとも３倍密接な親和性を意味し、少なくとも４.０の結合活性比は少なくとも４倍密接な親和性を意味し、少なくとも５.０の結合活性比は少なくとも５倍密接な親和性を意味し、少なくとも１０.０の結合活性比は少なくとも１０倍密接な親和性を意味する。
他の例において、少なくとも２.０の結合活性比は、抗体が少なくとも２倍遅いオフ・レートを示し、少なくとも３.０の結合活性比は、抗体が少なくとも３倍遅いオフ・レートを示し、少なくとも４.０の結合活性比は、抗体が少なくとも４倍遅いオフ・レートを示し、少なくとも５.０の結合活性比は、抗体が少なくとも５倍遅いオフ・レートを示し、少なくとも１０.０の結合活性比は、抗体が少なくとも１０倍遅いオフ・レートを示すことを意味する。このような例において、結合活性をＥＣ５０、ＫＤとして示すとき、高い結合活性(例えば、密接な結合親和性)は低い濃度により表され、例えば、ｐＨ６.０〜６.５および／または１５mM〜２０mM乳酸対ｐＨ７.４、１mM乳酸の結合活性比は、ｐＨ６.０〜６.５および／または１５mM〜２０mM乳酸のＥＣ５０またはＫｄの逆数対ｐＨ７.４、１mM乳酸のＥＣ５０またはＫＤの逆数の商として表される。一例として、ｐＨ６.０〜６.５および１５mM〜２０mM乳酸で４mMのＥＣ５０を有し、ｐＨ７.４、１mM乳酸で１６mMのＥＣ５０を有する抗体の結合活性比は４.０(1/4／1/16)である。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントは、典型的に、結合ＥＧＦＲ(例えば、ヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに対して、酸性ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および／または１５mM〜２０mM乳酸を含む条件下で、１×１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１×１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１×１０−１１Ｍまたはそれ以下の解離定数(ＫＤ)を有する。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、典型的に、酸性ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および／または１５mM〜２０mM乳酸を含む条件下、結合ＥＧＦＲ(例えば、ヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに対して、１×１０８Ｍ−１、５×１０９Ｍ−１、１×１０９Ｍ−１、５×１０１０Ｍ−１、１×１０１０Ｍ−１、５×１０１１Ｍ−１、１×１０１１Ｍ−１またはそれ以上の結合定数(ＫＡ)を有する。他の例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、典型的に、酸性ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および／または１５mM〜２０mM乳酸を含む条件下、結合ＥＧＦＲ(例えば、ヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに対して、１０mM、５mM、４mM、３mM、２mM、１mMまたはそれ以下のＥＣ５０を有する。具体例では、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、ｐＨ７.４、１mM乳酸では、ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲまたは可溶性フラグメント)に対する結合親和性(例えば、ＫｄまたはＥＣ５０)が少なくとも１.５倍、２倍、２.５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上減少しているが、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)、１６.６mM乳酸ではＥＧＦＲに対して同等な結合を維持し、それゆえに、ｐＨ７.４、１mM乳酸と比較して、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および／または１５mM〜２０mM乳酸で、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上の結合活性比(例えば、高い親和性または密接な親和性結合)を示す。
それゆえに、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の改変された結合活性により、本抗体は、非腫瘍微小環境(例えば、皮膚の基底層)よりも腫瘍微小環境でＥＧＦＲ抗原に対する増加した結合選択性または活性を示す。ｐＨ微小環境の変更は、腫瘍微小環境で見られる最も一般的な微小環境である(例えば、Fogh Andersen et al. (1995) Clin. Chem., 41:1522-1525; Bhujwalla et al. (2002) NMR Biomed., 15:114-119; Helmlinger et al. (1997) Nature Med., 3:177; Gerweck and Seetharaman (1996), Cancer Res. 56(6):1194-1198参照)。例えば、多くの腫瘍において、‘ワールブルグ効果’により、５.６〜６.８の範囲のｐＨの微小環境が作られる。また、頭頸部、転移結腸直腸癌、頸部癌および扁平上皮細胞癌を含むが、これらに限定されない多様な腫瘍に関連して、高乳酸レベルが発見されている(例えば、Walenta et al. (1997) American Journal of Pathology 150(2): 409-415; Schwickert et al. (1995) Cancer Research 55: 4757-4759; Walenta et al. (2000) Cancer Research 60: 916-921; Guo et al. (2004) J Nucl Med 45: 1334-1339; Mathupala et al. (2007) J Bioenerg Biomembr 39: 73-77; Holroyde et al. (1979) Cancer Research 39: 4900-4904; Schurr and Payne (2007) Neuroscience 147: 613-619; Quennet et al. (2006) Radiotherapy and Oncology 81: 130-135参照)。多くの腫瘍において、‘ワールブルグ効果’により、１０〜２０mMの乳酸濃度の微小環境が作られる。腫瘍微小環境とは対照的に、抗ＥＧＦＲ抗体の投与に起因する多くの副作用が局在化する場所である真皮は中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.４)および正常乳酸レベル(例えば、０.５mM〜２mM)を示す。
一般に、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、生理学的レベルのタンパク質の存在下でこの活性比を示す。インビボまたは生理学的環境において、間質性タンパク質濃度(例えばアルブミン)は、血漿の２０〜５０％の間である。血清は約６０〜８０ｇ／Ｌタンパク質を含み、種々の組織は１２mg／mL〜４０mg／mLの間質性タンパク質を示すことが証明されている(例えば、Aukland and Reed (1993) Physiological Reviews, 73:1-78参照)。それゆえに、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、ヒト血清のような血清またはヒト血清アルブミンのような血清アルブミンとしてまたは抗体または受容体と相互作用しないか他に抗体−受容体相互作用を直接変える他のタンパク質において提供され得るような、１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質、例えば少なくとも１２mg／mL〜４０mg／mLタンパク質(例えば、少なくとも１２mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mLまたは４０mg／mLタンパク質)の存在下でこの結合活性比を示すことができる。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、２０％〜５０％血清(vol/vol)、例えば２０％〜５０％ヒト血清、例えば少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％血清(vol/vol)の存在下、この結合活性比を示すことができる。
それゆえに、７.４の中性ｐＨおよび１mM乳酸を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM乳酸の一方または両方を含む条件下の大きな結合活性比により、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、皮膚または皮膚の基底層に見られるような非罹患または非腫瘍微小環境である環境よりも、腫瘍微小環境でＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)への大きな結合活性を示す。それゆえに、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍に対する選択的活性および非腫瘍微小環境の細胞への減少した結合活性を示す。条件付結合活性により達成されるこのような選択性は、皮膚の基底ケラチン生成細胞のような非腫瘍細胞に対する望ましくない活性を最小化する。それゆえに、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、対象に投与したとき、副作用を軽減するかまたは減らす。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非罹患環境と比較して、腫瘍微小環境におけるＥＧＦＲに対して増加した阻害活性を示し得る。このような阻害活性は、リガンド誘発リン酸化、二量体化および／または細胞増殖の阻害を含むが、これらに限定されない。このような活性の結果として、ここに提供する抗体は、固形腫瘍のような腫瘍を有する対象にインビボで投与したとき、腫瘍増殖を阻害する。腫瘍増殖は、抗体を投与しないときの腫瘍増殖と比較して、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上阻害され得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の機能的活性は、非罹患組織への活性が減少している限り、腫瘍モデルで評価したとき、セツキシマブでの治療のような現存する抗ＥＧＦＲ治療剤より低いか、同等かまたは大きくてよい。減少した活性は、例えば、皮膚発疹の発生率または重症度の減少により示される。例えば、提供される抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、皮膚毒性が減少している。皮膚発疹のような皮膚毒性は、当業者に知られ、ここに記載する標準アッセイにより評価できる。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、霊長類モデルで評価して、発疹が少なくとも１.５倍、２倍、２.５倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上減少する。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、当業者に知られる標準組み換えＤＮＡ技術により産生できる。標的タンパク質の任意の１個以上のアミノ酸を変異させる当分野で知られるあらゆる方法を用いることができる。方法は、コード化核酸分子の標準的部位特異的突然変異誘発もしくはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法を含む。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸分子を、コード化核酸のランダム突然変異誘発のような突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発、重複ＰＣＲ、遺伝子混合または他の組み換え法に付し得る。抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸を、その後、異種性に発現させる宿主細胞に導入できる。それゆえに、またここに提供されるのは、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかをコードする核酸分子である。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の非限定的例を次に記載する。
１. Ｙ１０４Ｅを含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体
ここに提供されるのは、配列番号２または７に示す位置を参照して、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の１０４位にアミノ酸置換グルタミン酸(Ｅ)(１０４Ｅ)を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントが正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または１mM乳酸濃度を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度を含む条件下で大きな結合活性を示す限り、抗ＥＧＦＲ抗体およびＥＧＦＲ結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖に、１０４Ｅアミノ酸置換に加えて、下記のいずれかのようなさらなる修飾(例えば、アミノ酸置換)を取り込んでよい。さらなる修飾は、抗体またはその抗原結合フラグメントの可変重鎖および／または可変軽鎖であり得る。さらなる修飾はまた、抗体の可変領域における修飾および抗体の定常領域における修飾、例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＬ領域における修飾を含む、他の修飾も含む抗ＥＧＦＲ抗体にも行い得る。
また、下記のとおり重鎖および／または軽鎖に１個以上のさらなる修飾を含むあらゆるものを含む１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントが正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度を含む条件下で大きな結合活性を示す限り、さらにヒト化により修飾できる。
アミノ酸置換１０４Ｅを含むアミノ酸置換は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する可変重鎖と配列番号４に示すアミノ酸配列を有する可変軽鎖、配列番号７に示すアミノ酸配列を有する可変重鎖と配列番号９に示すアミノ酸配列を有する可変軽鎖または配列番号７に示すアミノ酸配列を有する可変重鎖と配列番号１１に示すアミノ酸配列を有する可変軽鎖を含む非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはそれらと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列番号２または７に示す可変重鎖の変異体を含むおよび／または配列番号４、９または１１に示す軽鎖の変異体を含む非修飾抗ＥＧＦＲ抗体に行い得る。例えば、アミノ酸置換は、配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する可変重鎖と配列番号１５に示すアミノ酸配列を有する可変軽鎖または配列番号１６に示すアミノ酸配列を有する可変重鎖および配列番号１７に示すアミノ酸配列を有する可変軽鎖を含むヒト化セツキシマブ抗体または配列番号１４または１６に示す可変重鎖および／または配列番号１５または１７に示す可変軽鎖と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列変異体で行い得る。
例えば、ここに提供されるのは、配列番号７４もしくは７５のいずれかに示すアミノ酸配列または配列番号７４もしくは７５のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有し、少なくともアミノ酸置換１０４Ｅを含む重鎖可変ドメインおよび配列番号４、９、１１、１５または１７のいずれかに示す軽鎖可変ドメインまたは配列番号４、９、１１、１５または１７のいずれかと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、アミノ酸置換１０４Ｅを含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、完全長抗体または抗体に集合したとき、抗原に結合するのに十分な可変重鎖または可変軽鎖の部分を含むその抗原結合フラグメントを含み、ここで、可変重鎖は少なくともアミノ酸置換１０４Ｅを含む。このような修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例を下に提供する。
ａ. さらなる修飾
またここに提供されるのは、１０４Ｅアミノ酸置換に加えて修飾を含み得る１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。さらなる修飾は一アミノ酸修飾、たとえば一アミノ酸置換または置換、挿入または欠失または複数のアミノ酸修飾、例えば複数のアミノ酸置換、挿入または欠失であり得る。修飾の例は、１個または複数のアミノ酸置換を含むアミノ酸置換である。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、修飾を含まない非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上の修飾位置を含む。アミノ酸置換は表４に示すような保存的置換またはここに記載する任意のもののような非保存的置換であり得る。
ｉ. さらなる重鎖修飾
ここに提供されるのは、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体(例えば、セツキシマブ)、その抗原結合フラグメントまたはその変異体の可変重鎖に、１０４位にＧｌｕ(Ｅ)のアミノ酸置換(すなわち、１０４Ｅ)および所望により１個以上のアミノ酸置換のようなさらなる修飾を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。得られた修飾は、配列番号２または７に示す可変重鎖またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体にあり得る。例えば、得られた修飾は、配列番号１４に示す可変重鎖または配列番号１６またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体またはその一部を含む、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体にあり得る。修飾はまた配列番号１、５、６または１２のいずれかに示すような任意の上記可変重鎖のいずれかを含む完全長重鎖またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体またはその一部にあり得る。修飾は相補性決定領域(ＣＤＲ)またはフレームワーク領域にあり得る。
例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、表３２に示す任意の１個以上のアミノ酸置換を含み得る。特に、ここに提供されるのは、配列番号２または７に示すアミノ酸配列において、アミノ酸置換１０４Ｅおよび２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、５０位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、５７位、５８位、５９位、６０位、６１位、６２位、６３位、６４位、６５位、６６位、６７位、６８位、６９位、７０位、７１位、７２位、７３位、７４位、７５位、７６位、７７位、９３位、９４位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１０位、１１１位または１１２位のいずれかに１個以上の他のアミノ酸置換を有する、可変重鎖またはその一部を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列において、２３位でのスレオニン(Ｔ)の置換(Ｔ２３)、Ｖ２４、Ｓ２５、Ｇ２６、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｌ２９、Ｔ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｇ３３、Ｖ３４、Ｈ３５、Ｗ３６、Ｖ５０、Ｉ５１、Ｗ５２、Ｓ５３、Ｇ５４、Ｇ５５、Ｎ５６、Ｔ５７、Ｄ５８、Ｙ５９、Ｎ６０、Ｔ６１、Ｐ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ｓ６５、Ｒ６６、Ｌ６７、Ｓ６８、Ｉ６９、Ｎ７０、Ｋ７１、Ｄ７２、Ｎ７３、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｓ７６、Ｑ７７、Ｙ９３、Ｙ９４、Ｒ９７、Ａ９８、Ｌ９９、Ｔ１００、Ｙ１０１、Ｙ１０２、Ｄ１０３、Ｅ１０５、Ｆ１０６、Ａ１０７、Ｙ１０８、Ｗ１０９、Ｇ１１０、Ｑ１１１またはＧ１１２に対応するアミノ酸置換であり得る。いくつかの例において、上記位置のいずれかに対応するで修飾(例えば、置換)されたアミノ酸残基は、配列番号２または７に示すアミノ酸の保存的残基または半保存的アミノ酸残基である(例えば、図２Ａまたは２Ｂ参照)。
この位置のアミノ置換は、得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントがＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)への特異的結合を示す限り、この位置の任意の他のアミノ酸の代替であってよい。典型的に、さらなる修飾を含む得られた抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記のとおり結合活性比が１.０より大きい、例えば１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、２０.０、４０.０、３０.０、４０.０またはそれ以上であるように、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度を含む条件下で大きな結合活性を示す。
ここに提供されるのは、配列番号２または７に示す位置を参照して、アミノ酸置換１０４Ｅおよび表６に示す置換に対応する１個以上の他のアミノ酸置換を含む、可変重鎖またはその一部を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。
例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２または７おいて、アミノ酸置換１０４Ｅおよび２４、２５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、５０、５３、５４、５８、５９、６３、６４、６７、６８、７２、７３、７４、７５、７６、７７、９７、１００、１０１、１０７、１１１に１個以上の他のアミノ酸置換を有する可変重鎖またはその一部を含む。例えば、さらなる置換は、配列番号２または７において、２４位のバリン(Ｖ)(Ｖ２４)、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｓ２８、Ｌ２９、Ｔ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｖ５０、Ｓ５３、Ｇ５４、Ｄ５８、Ｙ５９、Ｆ６３、Ｔ６４、Ｌ６７、Ｓ６８、Ｄ７２、Ｎ７３、Ｓ７４、Ｋ７５、Ｓ７６、Ｑ７７、Ｒ９７、Ｔ１００、Ｙ１０１、Ａ１０７、Ｑ１１１に対応するアミノ酸置換であり得る。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗の例は、重鎖置換Ｖ２４Ｉ、Ｖ２４Ｌ、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｇ、Ｓ２５Ｉ、Ｓ２５Ｍ、Ｓ２５Ｖ、Ｓ２５Ｑ、Ｓ２５Ｔ、Ｓ２５Ｌ、Ｓ２５Ｈ、Ｓ２５Ｒ、Ｓ２５Ａ、Ｓ２５Ｄ、Ｆ２７Ｒ、Ｓ２８Ｃ、Ｌ２９Ｈ、Ｔ３０Ｆ、Ｎ３１Ｈ、Ｎ３１Ｉ、Ｎ３１Ｔ、Ｎ３１Ｖ、Ｙ３２Ｔ、Ｖ５０Ｌ、Ｓ５３Ｇ、Ｇ５４Ｄ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５４Ｒ、Ｇ５４Ｃ、Ｇ５４Ｐ、Ｄ５８Ｍ、Ｙ５９Ｅ、Ｆ６３Ｒ、Ｆ６３Ｃ、Ｆ６３Ｇ、Ｆ６３Ｍ、Ｆ６３Ｖ、Ｆ６３Ｐ、Ｆ６３Ｓ、Ｔ６４Ｎ、Ｔ６４Ｖ、Ｌ６７Ｇ、Ｓ６８Ｆ、Ｓ６８Ｑ、Ｄ７２Ｋ、Ｄ７２Ｌ、Ｄ７２Ｐ、Ｄ７２Ｍ、Ｄ７２Ｗ、Ｎ７３Ｑ、Ｓ７４Ｈ、Ｓ７４Ｒ、Ｓ７４Ｄ、Ｓ７４Ｇ、Ｓ７４Ｙ、Ｋ７５Ｈ、Ｋ７５Ｇ、Ｋ７５Ｗ、Ｋ７５Ｐ、Ｓ７６Ｉ、Ｓ７６Ｖ、Ｑ７７Ｒ、Ｑ７７Ｅ、Ｒ９７Ｈ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｐ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０５Ｖ、Ａ１０７Ｎ、Ｑ１１１Ｉ、Ｑ１１１Ｐおよび／またはＱ１１１Ｖに対応する１個以上のさらなるアミノ酸置換を含む。
具体例では、ここに提供するさらなる修飾の例は、配列番号２または７において、２４位、２５位、２７位、３０位、５３位、７２位、９７位および１１１位における、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変ドメインの修飾を含む。例えば、さらなるアミノ酸位置は、配列番号２または７において、２４位のバリン(Ｖ)(Ｖ２４)、Ｓ２５、Ｆ２７、Ｔ３０、Ｓ５３、Ｄ７２、Ｒ９７またはＱ１１１に対応するアミノ酸置換であり得る。例えば、置換１０４Ｅに加えて、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体におけるさらなるアミノ酸置換は、２４位におけるグルタミン酸(Ｅ)；２５位でのＣ；２５でのＶ；２７位でのＲ；３０位でのＦ；５３位でのＧ；７２位でのＬ；９７位でのＨ；または１１１位でのＰによる重鎖残基の置換を含む。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２または７おいて、Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｖ、Ｆ２７Ｒ、Ｔ３０Ｆ、Ｓ５３Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｒ９７ＨまたはＱ１１１Ｐの重鎖置換に対応する、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のアミノ酸置換のような１個以上のさらなるアミノ酸置換を含み得る。
上に提供する可変重鎖のアミノ酸置換のいずれにおいても、置換を、配列番号２または７に示す配列との、対応する位置が整列させた位置であるアライメントにより他の抗ＥＧＦＲ抗体の対応する位置で行うことができることは理解される(例えば、図２Ａまたは２Ｂ参照)。それゆえに、抗体は重鎖定常領域またはその一部を含み得る。具体例では、アミノ酸置換は、配列番号１、２、５、６、７、１２、１４または１６のいずれかに示すようなセツキシマブ重鎖またはその一部またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体の対応する位置であり得る。一般に、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、結合活性比が１.０を超える、例えば１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、２０.０、３０.０、４０.０、５０.０またはそれ以上であるように、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度を含む条件下で大きな結合活性を示す。
非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖可変ドメインの非限定的アミノ酸置換を表７に示す。本表は、配列番号により指定する重鎖アミノ酸配列の例を示す。修飾重鎖および軽鎖を含むこのような修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例を下に提供する。修飾抗ＥＧＦＲまたはその抗原結合フラグメントは、さらに、例えば、次のサブセクション(Ｃ.１.ａ.ii)に記載するとおり軽鎖にさらなる修飾を含んでよく、または、例えば、サブセクションＣ.２に記載するとおりここに記載する抗体のヒト化の結果としてさらなる修飾を含んでよい。
ii. さらなる軽鎖修飾
ここに提供されるのは、１０４位のＧｌｕ(Ｅ)のアミノ酸置換(すなわち、１０４Ｅ)および、所望により、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体(例えば、セツキシマブ)、その抗原結合フラグメントまたはその変異体の可変軽鎖に１個以上のアミノ酸置換のようなさらなる修飾を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。得られた修飾は、配列番号４、９または１１のいずれかに示す可変軽鎖またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体にあり得る。例えば、得られた修飾は、配列番号１５に示す可変軽鎖または配列番号１７を含む非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体にあり得る。修飾はまた配列番号３、８、１０または１３のいずれかに示すような上記可変軽鎖のいずれかを含む完全長軽鎖またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体にあり得る。修飾は、相補性決定領域(ＣＤＲ)またはフレームワーク領域にあり得る。
例えば、ここに提供されるのは、アミノ酸置換１０４Ｅを有する可変重鎖を含み、可変軽鎖またはその一部に、配列番号４において、１位、２位、３位、４位、５位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、４８位、４９位、５１位、５２位、５３位、５４位、５５位、５６位、８６位、８７位、８９位、９１位、９２位、９３位、９６位、９７位、９８位、９９位または１００位に少なくとも１個のアミノ置換を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、アミノ酸位置は、配列番号４において、１位のアスパラギン酸(Ｄ)(Ｄ１)、Ｉ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｔ５、Ｒ２４、Ａ２５、Ｓ２６、Ｑ２７、Ｓ２８、Ｉ２９、Ｇ３０、Ｔ３１、Ｎ３２、Ｉ３３、Ｉ４８、Ｋ４９、Ａ５１、Ｓ５２、Ｅ５３、Ｓ５４、Ｉ５５、Ｓ５６、Ｙ８６、Ｙ８７、Ｑ８９、Ｎ９１、Ｎ９２、Ｎ９３、Ｔ９６、Ｔ９７、Ｆ９８、Ｇ９９またはＡ１００の置換であり得る。いくつかの例において、上記位置のいずれかに対応する位置で修飾(例えば、置換)されているアミノ酸残基は、配列番号４に示すアミノ酸の保存的残基または半保存的アミノ酸残基である。
この位置のアミノ置換は、得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントがＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)への特異的結合を示す限り、この位置の任意の他のアミノ酸の代替であってよい。典型的に、さらなる修飾を含む得られた抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記のとおり結合活性比が１.０より大きい、例えば１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、２０.０、４０.０、３０.０、４０.０またはそれ以上であるように、正確にまたは約ｐＨ７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度を含む条件下に大きな結合活性を示す。
ここに提供されるのは、アミノ酸置換１０４Ｅを有する可変重鎖またはその一部および配列番号４において、可変軽鎖において表８に示す置換に対応する１個以上の他のアミノ酸置換を含む可変軽鎖を含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントである。
例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの例は、アミノ酸置換１０４Ｅを有する可変重鎖またはその一部および配列番号４に示す位置を参照して、４位、５位、２４位、２９位、５６位または９１位に対応する一箇所以上に１個以上のアミノ酸置換を有する可変軽鎖またはその一部を含む。例えば、アミノ酸位置は、配列番号４に示すアミノ酸位置を参照して、４位のロイシン(Ｌ)(Ｌ４)、Ｔ５、Ｒ２４、Ｉ２９、Ｓ５６またはＮ９１の置換に対応する位置での置換であり得る。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、１個以上の軽鎖置換Ｌ４Ｃ、Ｌ４Ｆ、Ｌ４Ｖ、Ｔ５Ｐ、Ｒ２４Ｇ、Ｉ２９Ｓ、Ｓ５６ＨまたはＮ９１Ｖに対応する少なくとも１個、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸置換のような１個以上のアミノ酸置換を含む。例えば、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列におけるＩ２９Ｓの軽鎖置換に対応するアミノ酸置換を含む。
上に提供する可変軽鎖のアミノ酸置換のいずれにおいても、置換を、配列番号４に示す配列との、対応する位置が整列させた位置であるアライメントにより他の抗ＥＧＦＲ抗体の対応する位置で行うことができることは理解される。具体例では、アミノ酸置換は、配列番号３、４、８〜１１、１３、１５または１７のいずれかに示すようなセツキシマブ軽鎖またはその一部またはそれと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するその変異体における対応する位置にあり得る。一般に、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、結合活性比が１.０を超える、例えば１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、２０.０、３０.０、４０.０、５０.０またはそれ以上であるように、正確にまたは約ｐＨ７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度を含む条件下、大きな結合活性を示す。
非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの、可変重鎖における置換１０４Ｅに加えて、可変軽鎖における非限定的アミノ酸置換を表９に示す。本表は、配列番号により指定する、重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列の例を示す。修飾重鎖および修飾軽鎖を含むこのような修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例を下に提供する。修飾抗ＥＧＦＲまたはその抗原結合フラグメントは、例えば、上のサブセクションに記載のように重鎖にさらなる修飾を含んでよく、または、例えば、サブセクションＣ.２に記載するとおりここに記載する抗体のヒト化の結果としてさらなる修飾を含んでよい。さらに、上記の重鎖の修飾のいずれもおよびここに記載する軽鎖の修飾のいずれも、抗ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲ結合そのフラグメントで組み合わせ得る。
iii.他の修飾
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のいずれも、重鎖または軽鎖の可変領域または定常領域に１個以上の他のさらなる修飾を含み得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体に包含させ得る他のさらなる修飾の例は、米国特許７,６５７,３８０号、７,９３０,１０７号、７,０６０,８０８号、７,７２３,４８４号、米国特許公開２０１１０１４２８２２号、２００５１４２１３３号、２０１１１１７１１０号、国際特許公開ＷＯ２０１２００３９９５号、ＷＯ２０１００８０４６３号、ＷＯ２０１２０２００５９号、ＷＯ２００８１５２５３７号およびLippow et al. (2007) Nat Biotechnol. 25(10):1171-1176に記載のものを含むが、これらに限定されない。ここに提供する任意の抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントに包含できる、文献に記載された代表的アミノ酸修飾の非限定的例は次のものを含む。
配列番号４において、１位のアスパラギン酸のグルタミン酸(Ｄ１Ｅ)、Ｄ１Ｃ、Ｉ２Ｔ、Ｉ２Ｃ、Ｌ３Ｖ、Ｌ３Ｔ、Ｌ３Ｃ、Ｌ４Ｃ、Ｔ５Ｃ、Ｑ６Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｐ８Ｃ、Ｖ９Ｃ、Ｖ９Ａ、Ｖ９Ｄ、Ｖ９Ｇ、Ｖ９Ｐ、Ｖ９Ｓ、Ｉ１０Ｔ、Ｉ１０Ｓ、Ｉ１０Ｆ、Ｉ１０Ｃ、Ｌ１１Ｑ、Ｌ１１Ｃ、Ｓ１２Ａ、Ｓ１２Ｃ、Ｖ１３Ｌ、Ｖ１３Ｍ、Ｖ１３Ｓ、Ｖ１３Ａ、Ｖ１３Ｃ、Ｓ１４Ｔ、Ｓ１４Ｃ、Ｐ１５Ｖ、Ｐ１５Ｌ、Ｐ１５Ｃ、Ｇ１６Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｅ１７Ｄ、Ｅ１７Ｋ、Ｅ１７Ｃ、Ｒ１８Ｖ、Ｒ１８Ｋ、Ｒ１８Ｃ、Ｖ１９Ａ、Ｖ１９Ｔ、Ｖ１９Ｃ、Ｓ２０Ｔ、Ｓ２０Ｃ、Ｓ２０Ａ、Ｆ２１Ｉ、Ｆ２１Ｌ、Ｆ２１Ｃ、Ｓ２２Ｔ、Ｓ２２Ｃ、Ｒ２４Ｐ、Ａ２５Ｖ、Ａ２５Ｓ、Ａ２５Ｉ、Ａ２５Ｐ、Ａ２５Ｔ、Ａ２５Ｙ、Ａ２５Ｃ、Ａ２５Ｆ、Ａ２５Ｍ、Ａ２５Ｌ、Ａ２５Ｗ、Ｓ２６Ｄ、Ｑ２７Ｗ、Ｑ２７Ｅ、Ｑ２７Ｆ、Ｑ２７Ｙ、Ｑ２７Ｔ、Ｑ２７Ｈ、Ｓ２８Ｒ、Ｓ２８Ｆ、Ｇ３０Ｙ、Ｇ３０Ｃ、Ｇ３０Ｈ、Ｇ３０Ｋ、Ｇ３０Ｑ、Ｇ３０Ｒ、Ｇ３０Ｗ、Ｇ３０Ｆ、Ｇ３０Ｔ、Ｇ３０Ｍ、Ｇ３０Ｓ、Ｇ３０Ａ、Ｔ３１Ｅ、Ｔ３１Ｖ、Ｔ３１Ｄ、Ｔ３１Ｒ、Ｎ３２Ｈ、Ｉ３３Ｌ、Ｈ３４Ｃ、Ｑ３８Ｋ、Ｒ３９Ｋ、Ｔ４０Ｐ、Ｔ４０Ｓ、Ｎ４１Ｇ、Ｎ４１Ｄ、Ｇ４２Ｑ、Ｇ４２Ｋ、Ｇ４２Ｅ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｐ、Ｒ４５Ｋ、Ｋ４９Ｙ、Ｋ４９Ｆ、Ｙ５０Ｇ、Ｓ５３Ｖ、Ｓ６０Ｄ、Ｓ６０Ａ、Ｇ６４Ｓ、Ｇ６４Ａ、Ｄ７０Ｅ、Ｄ７０Ｖ、Ｆ７１Ｙ、Ｓ７４Ｔ、Ｎ７６Ｓ、Ｎ７６Ｔ、Ｓ７７Ｒ、Ｓ７７Ｇ、Ｖ７８Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｅ８１Ａ、Ｉ８３Ｆ、Ｉ８３Ｓ、Ｉ８３Ｖ、Ｉ８３Ａ、Ｄ８５Ｖ、Ｄ８５Ｔ、Ｄ８５Ｉ、Ｄ８５Ｍ、Ｙ８７Ｓ、Ｑ８９Ｃ、Ｑ８９Ｈ、Ｑ９０Ｃ、Ｎ９１Ｃ、Ｎ９１Ｑ、Ｎ９１Ｌ、Ｎ９２Ｃ、Ｎ９２Ｌ、Ｎ９２Ｒ Ｎ９２Ｋ、Ｎ９２Ｍ、Ｎ９２Ｙ、Ｎ９２Ｈ、Ｎ９２Ｅ、Ｎ９２Ｆ、Ｎ９３Ａ、Ｎ９３Ｄ、Ｎ９３Ｅ、Ｎ９３Ｖ、Ｎ９３Ｋ、Ｎ９３Ｃ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｐ９５Ｃ、Ｔ９６Ｃ、Ｔ９６Ｌ、Ｔ９６Ｅ、Ｔ９７Ｃ、Ｔ９７Ａ、Ｔ９７Ｄ、Ｔ９７Ｅ、Ｔ９７Ｐ、Ｔ９７Ｋ、Ｔ９７Ｎ、Ｔ９７Ｑ、Ｔ９７Ｉ、Ｔ９７Ｇ、Ｔ９７Ｌ、Ｔ９７Ｈ、Ｔ９７Ｒ、Ｔ９７Ｓ、Ｇ９９Ａ、Ａ１００Ｇ、Ａ１００Ｑ、Ｋ１０３Ｔ、Ｌ１０４ＶおよびＬ１０６Ｉの置換に対応する１箇所以上での可変軽鎖(ＶＬ)におけるアミノ酸置換を含む変異体；
配列番号２または７においてで、１位のグルタミンのグルタミン酸(Ｑ１Ｅ)、Ｑ１Ｃ、Ｖ２Ｃ、Ｑ３Ｔ、Ｑ３Ｃ、Ｌ４Ｃ、Ｋ５Ｑ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ｃ、Ｑ６Ｅ、Ｑ６Ｃ、Ｓ７Ｃ、Ｇ８Ｃ、Ｐ９Ａ、Ｐ９Ｇ、Ｐ９Ｃ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１０Ｃ、Ｌ１１Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｑ１３Ｋ、Ｑ１３Ｒ、Ｑ１３Ｃ、Ｐ１４Ｃ、Ｓ１５Ｇ、Ｓ１５Ｔ、Ｓ１５Ｃ、Ｑ１６Ｇ、Ｑ１６Ｒ、Ｑ１６Ｅ、Ｑ１６Ｃ、Ｓ１７Ｔ、Ｓ１７Ｃ、Ｌ１８Ｃ、Ｓ１９Ｋ、Ｓ１９Ｒ、Ｓ１９Ｔ、Ｓ１９Ｃ、Ｉ２０Ｌ、Ｉ２０Ｃ、Ｔ２１Ｓ、Ｔ２１Ｃ、Ｔ２３Ａ、Ｔ２３Ｋ、Ｔ２３Ｃ、Ｖ２４Ａ、Ｖ２４Ｃ、Ｓ２５Ｃ、Ｆ２７Ｇ、Ｓ２８Ｎ、Ｓ２８Ｔ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ、Ｔ３０Ｋ、Ｎ３１Ｖ、Ｎ３１Ｄ、Ｎ３１Ｉ、Ｎ３１Ｔ、Ｎ３２Ｓ、Ｙ３２Ｒ、Ｙ３２Ｗ、Ｇ３３Ａ、Ｇ３３Ｄ、Ｇ３３Ｅ、Ｇ３３Ｙ、Ｖ３４Ｌ、Ｖ３４Ｎ、Ｖ３４Ｅ、Ｖ３４Ｑ、Ｖ３４Ｓ、Ｖ３４Ｗ、Ｈ３５Ｓ、Ｖ３７Ｉ、Ｓ４０Ａ、Ｓ４０Ｐ、Ｐ４１Ｔ、Ｇ４４Ａ、Ｌ４８Ｖ、Ｌ４８Ｉ、Ｇ４９Ｓ、Ｇ４９Ａ、Ｖ５０Ｌ、Ｖ５０Ｑ、Ｖ５０Ｅ、Ｖ５０Ｉ、Ｖ５０Ｙ、Ｖ５０Ｎ、Ｉ５１Ｇ、Ｉ５１Ｍ、Ｉ５１Ｓ、Ｉ５１Ｑ、Ｉ５１Ａ、Ｉ５１Ｃ、Ｉ５１Ｖ、Ｗ５２Ｆ、Ｗ５２Ｙ、Ｗ５２Ｇ、Ｗ５２Ｔ、Ｓ５３Ｑ、Ｓ５３Ｔ、Ｓ５３Ｎ、Ｓ５３Ｙ、Ｇ５４Ａ、Ｇ５４Ｖ、Ｇ５４Ｌ、Ｇ５４Ｉ、Ｇ５４Ｓ、Ｇ５５Ｄ、Ｇ５５Ａ、Ｇ５５Ｅ、Ｇ５５Ｈ、Ｇ５５Ｆ、Ｎ５６Ａ、Ｎ５６Ｇ、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｔ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｄ、Ｔ５７Ｇ、Ｔ５７Ｓ、Ｔ５７Ｅ、Ｔ５７Ｐ、Ｄ５８Ｙ、Ｄ５８Ｎ、Ｙ５９Ａ、Ｙ５９Ｃ、Ｙ５９Ｅ、Ｙ５９Ｆ、Ｙ５９Ｇ、Ｙ５９Ｓ、Ｙ５９Ｗ、Ｔ５９Ｈ、Ｙ５９Ｐ、Ｙ５９Ｑ、Ｎ６０Ｄ、Ｎ６０Ａ、Ｔ６１Ｅ、Ｔ６１Ｐ、Ｐ６２Ｓ、Ｆ６３Ｌ、Ｆ６３Ｖ、Ｔ６４Ｋ、Ｔ６４Ｅ、Ｔ６４Ａ、Ｔ６４Ｎ、Ｔ６４Ｄ、Ｓ６５Ｇ、Ｌ６７Ｆ、Ｌ６７Ｖ、Ｓ６８Ｔ、Ｎ７０Ｓ、Ｎ７０Ｔ、Ｋ７１Ｖ、Ｄ７２Ｅ、Ｎ７３Ｔ、Ｓ７４Ａ、Ｓ７６Ｎ、Ｑ７７Ｔ、Ｑ７７Ｓ、Ｖ７８Ｌ、Ｖ７８Ｆ、Ｖ７８Ａ、Ｆ７９Ｙ、Ｆ７９Ｓ、Ｆ７９Ｖ、Ｆ８０Ｌ、Ｆ８０Ｍ、Ｋ８１Ｑ、Ｋ８１Ｔ、Ｋ８１Ｅ、Ｋ８１Ｑ、Ｍ８２Ｌ、Ｎ８３Ｔ、Ｎ８３Ｓ、Ｓ８４Ｎ、Ｌ８５Ｍ、Ｌ８５Ｖ、Ｑ８６Ｒ、Ｑ８６Ｄ、Ｑ８６Ｔ、Ｓ８７Ａ、Ｓ８７Ｐ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｉ９２Ｔ、Ｉ９２Ｖ、Ａ９６Ｃ、Ｒ９７Ｃ、Ａ９８Ｃ、Ｌ９９Ｃ、Ｌ９９Ｅ、Ｔ１００Ｄ、Ｔ１００Ｃ、Ｔ１００Ａ、Ｙ１０１Ｃ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０１Ａ、Ｙ１０２Ｃ、Ｙ１０２Ｆ、Ｙ１０２Ａ、Ｙ１０２Ｗ、Ｄ１０３Ｅ、Ｄ１０３Ｐ、Ｄ１０３Ｃ、Ｅ１０５Ｃ、Ｅ１０５Ｎ、Ｅ１０５Ｄ、Ｅ１０５Ｙ、Ｆ１０６Ｃ、Ｆ１０６Ｄ、Ｆ１０６Ｙ、Ａ１０７Ｃ、Ａ１０７Ｄ、Ｙ１０８ＣおよびＹ１０８Ｆに対応する可変重鎖(ＶＨ)におけるアミノ酸置換を含む変異体；および
ＥＵ指数番号付けに従い、２３０位のプロリンのアラニン(Ｐ２３０Ａ)、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｔ、Ｓ２６７Ｈ、Ｓ２６７Ｄ、Ｓ２６７Ｎ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｅ２６９Ｔ、Ｅ２６９Ｌ、Ｅ２６９Ｎ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｔ、Ｄ２７０Ｈ、Ｅ２７２Ｓ、Ｅ２７２Ｋ、Ｅ２７２Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｖ２７３Ｉ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｓ、Ｎ２７６Ｅ、Ｎ２７６Ｒ、Ｎ２７６Ｌ、Ｎ２７６Ｙ、Ｙ２７８Ｔ、Ｙ２７８Ｅ、Ｙ２７８Ｋ、Ｙ２７８Ｗ、Ｅ２８３Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ｓ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｖ３０２Ｉ、Ｗ３１３Ｆ、Ｅ３１８Ｒ、Ｋ３２０Ｔ、Ｋ３２０Ｄ、Ｋ３２０Ｉ、Ｋ３２２Ｔ、Ｋ３２２Ｈ、Ｖ３２３Ｉ、Ｓ３２４Ｔ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｒ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｓ３２４Ｌ、Ｓ３２４Ｙ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｋ３２６Ｌ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ａ３２７Ｄ、Ａ３２７Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｗ、Ａ３３０Ｍ、Ｐ３３１Ｖ、Ｐ３３１Ｈ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｅ３３３Ｔ、Ｅ３３３Ｈ、Ｅ３３３Ｉ、Ｅ３３３Ｙ、Ｋ３３４Ｉ、Ｋ３３４Ｔ、Ｋ３３４Ｆ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、Ｔ３３５Ｙ、Ｄ２２１Ｋ、Ｄ２２１Ｙ、Ｋ２２２Ｅ、Ｋ２２２Ｙ、Ｔ２２３Ｅ、Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｅ、Ｈ２２４Ｙ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｅ、Ｔ２２５Ｋ、Ｔ２２５Ｗ、Ｐ２２７Ｅ、Ｐ２２７Ｋ、Ｐ２２７Ｙ、Ｐ２２７Ｇ、Ｐ２２８Ｅ、Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２２８Ｙ、Ｐ２２８Ｇ、Ｐ２３０Ｅ、Ｐ２３０Ｙ、Ｐ２３０Ｇ、Ａ２３１Ｅ、Ａ２３１Ｋ、Ａ２３１Ｙ、Ａ２３１Ｐ、Ａ２３１Ｇ、Ｐ２３２Ｅ、Ｐ２３２Ｋ、Ｐ２３２Ｙ、Ｐ２３２Ｇ、Ｅ２３３Ｎ、Ｅ２３３Ｑ、Ｅ２３３Ｋ、Ｅ２３３Ｒ、Ｅ２３３Ｓ、Ｅ２３３Ｔ、Ｅ２３３Ｈ、Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｖ、Ｅ２３３Ｌ、Ｅ２３３Ｉ、Ｅ２３３Ｆ、Ｅ２３３Ｍ、Ｅ２３３Ｙ、Ｅ２３３Ｗ、Ｅ２３３Ｇ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｍ、Ｌ２３４Ｗ、Ｌ２３４Ｐ、Ｌ２３４Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｍ、Ｌ２３５Ｗ、Ｌ２３５Ｐ、Ｌ２３５Ｇ、Ｇ２３６Ｄ、Ｇ２３６Ｅ、Ｇ２３６Ｎ、Ｇ２３６Ｑ、Ｇ２３６Ｋ、Ｇ２３６Ｒ、Ｇ２３６Ｓ、Ｇ２３６Ｔ、Ｇ２３６Ｈ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３６Ｖ、Ｇ２３６Ｌ、Ｇ２３６Ｉ、Ｇ２３６Ｆ、Ｇ２３６Ｍ、Ｇ２３６Ｙ、Ｇ２３６Ｗ、Ｇ２３６Ｐ、Ｇ２３７Ｄ、Ｇ２３７Ｅ、Ｇ２３７Ｎ、Ｇ２３７Ｑ、Ｇ２３７Ｋ、Ｇ２３７Ｒ、Ｇ２３７Ｓ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｈ、Ｇ２３７Ｖ、Ｇ２３７Ｌ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｆ、Ｇ２３７Ｍ、Ｇ２３７Ｙ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｐ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２３８Ｅ、Ｐ２３８Ｎ、Ｐ２３８Ｑ、Ｐ２３８Ｋ、Ｐ２３８Ｒ、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ２３８Ｔ、Ｐ２３８Ｈ、Ｐ２３８Ｖ、Ｐ２３８Ｌ、Ｐ２３８Ｉ、Ｐ２３８Ｆ、Ｐ２３８Ｍ、Ｐ２３８Ｙ、Ｐ２３８Ｗ、Ｐ２３８Ｇ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｋ、Ｓ２３９Ｒ、Ｓ２３９Ｖ、Ｓ２３９Ｌ、Ｓ２３９Ｉ、Ｓ２３９Ｍ、Ｓ２３９Ｗ、Ｓ２３９Ｐ、Ｓ２３９Ｇ、Ｆ２４１Ｄ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４３Ｅ、Ｋ２４６Ｄ、Ｋ２４６Ｅ、Ｋ２４６Ｈ、Ｋ２４６Ｙ、Ｄ２４９Ｑ、Ｄ２４９Ｈ、Ｄ２４９Ｙ、Ｒ２５５Ｅ、Ｒ２５５Ｙ、Ｅ２５８Ｓ、Ｅ２５８Ｈ、Ｅ２５８Ｙ、Ｔ２６０Ｄ、Ｔ２６０Ｅ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｙ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６２Ｆ、Ｖ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｅ、Ｖ２６４Ｎ、Ｖ２６４Ｑ、Ｖ２６４Ｋ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｈ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｐ、Ｖ２６４Ｇ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｋ、Ｄ２６５Ｒ、Ｄ２６５Ｓ、Ｄ２６５Ｔ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｍ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｗ、Ｄ２６５Ｐ、Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｋ、Ｓ２６７Ｒ、Ｓ２６７Ｖ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｉ、Ｓ２６７Ｆ、Ｓ２６７Ｍ、Ｓ２６７Ｙ、Ｓ２６７Ｗ、Ｓ２６７Ｐ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｈ２６８Ｋ、Ｈ２６８Ｒ、Ｈ２６８Ｔ、Ｈ２６８Ｖ、Ｈ２６８Ｌ、Ｈ２６８Ｉ、Ｈ２６８Ｆ、Ｈ２６８Ｍ、Ｈ２６８Ｗ、Ｈ２６８Ｐ、Ｈ２６８Ｇ、Ｅ２６９Ｋ、Ｅ２６９Ｓ、Ｅ２６９Ｖ、Ｅ２６９Ｉ、Ｅ２６９Ｍ、Ｅ２６９Ｗ、Ｅ２６９Ｐ、Ｅ２６９Ｇ、Ｄ２７０Ｒ、Ｄ２７０Ｓ、Ｄ２７０Ｌ、Ｄ２７０Ｉ、Ｄ２７０Ｆ、Ｄ２７０Ｍ、Ｄ２７０Ｙ、Ｄ２７０Ｗ、Ｄ２７０Ｐ、Ｄ２７０Ｇ、Ｐ２７１Ｄ、Ｐ２７１Ｅ、Ｐ２７１Ｎ、Ｐ２７１Ｑ、Ｐ２７１Ｋ、Ｐ２７１Ｒ、Ｐ２７１Ｓ、Ｐ２７１Ｔ、Ｐ２７１Ｈ、Ｐ２７１Ａ、Ｐ２７１Ｖ、Ｐ２７１Ｌ、Ｐ２７１Ｉ、Ｐ２７１Ｆ、Ｐ２７１Ｍ、Ｐ２７１Ｙ、Ｐ２７１Ｗ、Ｐ２７１Ｇ、Ｅ２７２Ｄ、Ｅ２７２Ｒ、Ｅ２７２Ｔ、Ｅ２７２Ｈ、Ｅ２７２Ｖ、Ｅ２７２Ｌ、Ｅ２７２Ｆ、Ｅ２７２Ｍ、Ｅ２７２Ｗ、Ｅ２７２Ｐ、Ｅ２７２Ｇ、Ｋ２７４Ｄ、Ｋ２７４Ｎ、Ｋ２７４Ｓ、Ｋ２７４Ｈ、Ｋ２７４Ｖ、Ｋ２７４Ｉ、Ｋ２７４Ｆ、Ｋ２７４Ｍ、Ｋ２７４Ｗ、Ｋ２７４Ｐ、Ｋ２７４Ｇ、Ｆ２７５Ｌ、Ｎ２７６Ｄ、Ｎ２７６Ｔ、Ｎ２７６Ｈ、Ｎ２７６Ｖ、Ｎ２７６Ｉ、Ｎ２７６Ｆ、Ｎ２７６Ｍ、Ｎ２７６Ｗ、Ｎ２７６Ｐ、Ｎ２７６Ｇ、Ｙ２７８Ｄ、Ｙ２７８Ｎ、Ｙ２７８Ｑ、Ｙ２７８Ｒ、Ｙ２７８Ｓ、Ｙ２７８Ｈ、Ｙ２７８Ｖ、Ｙ２７８Ｌ、Ｙ２７８Ｉ、Ｙ２７８Ｍ、Ｙ２７８Ｐ、Ｙ２７８Ｇ、Ｄ２８０Ｋ、Ｄ２８０Ｌ、Ｄ２８０Ｗ、Ｄ２８０Ｐ、Ｄ２８０Ｇ、Ｇ２８１Ｄ、Ｇ２８１Ｋ、Ｇ２８１Ｙ、Ｇ２８１Ｐ、Ｖ２８２Ｅ、Ｖ２８２Ｋ、Ｖ２８２Ｙ、Ｖ２８２Ｐ、Ｖ２８２Ｇ、Ｅ２８３Ｋ、Ｅ２８３Ｈ、Ｅ２８３Ｌ、Ｅ２８３Ｙ、Ｅ２８３Ｐ、Ｅ２８３Ｇ、Ｖ２８４Ｅ、Ｖ２８４Ｎ、Ｖ２８４Ｔ、Ｖ２８４Ｌ、Ｖ２８４Ｙ、Ｈ２８５Ｄ、Ｈ２８５Ｅ、Ｈ２８５Ｑ、Ｈ２８５Ｋ、Ｈ２８５Ｙ、Ｈ２８５Ｗ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ２８６Ｙ、Ｎ２８６Ｐ、Ｎ２８６Ｇ、Ｋ２８８Ｄ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ２８８Ｙ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｗ、Ｐ２９１Ｄ、Ｐ２９１Ｅ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｔ、Ｐ２９１Ｈ、Ｐ２９１Ｉ、Ｐ２９１Ｇ、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｔ、Ｒ２９２Ｙ、Ｅ２９３Ｎ、Ｅ２９３Ｒ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９３Ｈ、Ｅ２９３Ｖ、Ｅ２９３Ｌ、Ｅ２９３Ｉ、Ｅ２９３Ｆ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｙ、Ｅ２９３Ｗ、Ｅ２９３Ｐ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９４Ｋ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｓ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｈ、Ｅ２９４Ｖ、Ｅ２９４Ｌ、Ｅ２９４Ｉ、Ｅ２９４Ｆ、Ｅ２９４Ｍ、Ｅ２９４Ｙ、Ｅ２９４Ｗ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｇ、Ｑ２９５Ｄ、Ｑ２９５Ｅ、Ｑ２９５Ｎ、Ｑ２９５Ｒ、Ｑ２９５Ｓ、Ｑ２９５Ｔ、Ｑ２９５Ｈ、Ｑ２９５Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｆ、Ｑ２９５Ｍ、Ｑ２９５Ｙ、Ｑ２９５Ｗ、Ｑ２９５Ｐ、Ｑ２９５Ｇ、Ｙ２９６Ｋ、Ｙ２９６Ｒ、Ｙ２９６Ａ、Ｙ２９６Ｖ、Ｙ２９６Ｍ、Ｙ２９６Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｋ、Ｎ２９７Ｒ、Ｎ２９７Ｔ、Ｎ２９７Ｈ、Ｎ２９７Ｖ、Ｎ２９７Ｌ、Ｎ２９７Ｉ、Ｎ２９７Ｆ、Ｎ２９７Ｍ、Ｎ２９７Ｙ、Ｎ２９７Ｗ、Ｎ２９７Ｐ、Ｎ２９７Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｅ、Ｓ２９８Ｑ、Ｓ２９８Ｋ、Ｓ２９８Ｒ、Ｓ２９８Ｉ、Ｓ２９８Ｆ、Ｓ２９８Ｍ、Ｓ２９８Ｙ、Ｓ２９８Ｗ、Ｔ２９９Ｄ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｎ、Ｔ２９９Ｑ、Ｔ２９９Ｋ、Ｔ２９９Ｒ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｍ、Ｔ２９９Ｙ、Ｔ２９９Ｗ、Ｔ２９９Ｐ、Ｔ２９９Ｇ、Ｙ３００Ｄ、Ｙ３００Ｅ、Ｙ３００Ｎ、Ｙ３００Ｑ、Ｙ３００Ｋ、Ｙ３００Ｒ、Ｙ３００Ｓ、Ｙ３００Ｔ、Ｙ３００Ｈ、Ｙ３００Ａ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｍ、Ｙ３００Ｗ、Ｙ３００Ｐ、Ｙ３００Ｇ、Ｒ３０１Ｄ、Ｒ３０１Ｅ、Ｒ３０１Ｈ、Ｒ３０１Ｙ、Ｖ３０３Ｄ、Ｖ３０３Ｅ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｄ、Ｓ３０４Ｎ、Ｓ３０４Ｔ、Ｓ３０４Ｈ、Ｓ３０４Ｌ、Ｖ３０５Ｅ、Ｖ３０５Ｔ、Ｖ３０５Ｙ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３１７Ｑ、Ｅ３１８Ｑ、Ｅ３１８Ｈ、Ｅ３１８Ｌ、Ｅ３１８Ｙ、Ｋ３２０Ｎ、Ｋ３２０Ｓ、Ｋ３２０Ｈ、Ｋ３２０Ｖ、Ｋ３２０Ｌ、Ｋ３２０Ｆ、Ｋ３２０Ｙ、Ｋ３２０Ｗ、Ｋ３２０Ｐ、Ｋ３２０Ｇ、Ｋ３２２Ｄ、Ｋ３２２Ｓ、Ｋ３２２Ｖ、Ｋ３２２Ｉ、Ｋ３２２Ｆ、Ｋ３２２Ｙ、Ｋ３２２Ｗ、Ｋ３２２Ｐ、Ｋ３２２Ｇ、Ｓ３２４Ｈ、Ｓ３２４Ｆ、Ｓ３２４Ｍ、Ｓ３２４Ｗ、Ｓ３２４Ｐ、Ｓ３２４Ｇ、Ｎ３２５Ｋ、Ｎ３２５Ｒ、Ｎ３２５Ｓ、Ｎ３２５Ｆ、Ｎ３２５Ｍ、Ｎ３２５Ｙ、Ｎ３２５Ｗ、Ｎ３２５Ｐ、Ｎ３２５Ｇ、Ｋ３２６Ｐ、Ａ３２７Ｅ、Ａ３２７Ｋ、Ａ３２７Ｒ、Ａ３２７Ｈ、Ａ３２７Ｖ、Ａ３２７Ｉ、Ａ３２７Ｆ、Ａ３２７Ｍ、Ａ３２７Ｙ、Ａ３２７Ｗ、Ａ３２７Ｐ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｋ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ３２８Ｓ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｙ、Ｌ３２８Ｗ、Ｌ３２８Ｐ、Ｌ３２８Ｇ、Ｐ３２９Ｄ、Ｐ３２９Ｅ、Ｐ３２９Ｎ、Ｐ３２９Ｑ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｒ、Ｐ３２９Ｓ、Ｐ３２９Ｔ、Ｐ３２９Ｈ、Ｐ３２９Ｖ、Ｐ３２９Ｌ、Ｐ３２９Ｉ、Ｐ３２９Ｍ、Ｐ３２９Ｙ、Ｐ３２９Ｗ、Ｐ３２９Ｇ、Ａ３３０Ｅ、Ａ３３０Ｎ、Ａ３３０Ｔ、Ａ３３０Ｐ、Ａ３３０Ｇ、Ｐ３３１Ｄ、Ｐ３３１Ｑ、Ｐ３３１Ｒ、Ｐ３３１Ｔ、Ｐ３３１Ｌ、Ｐ３３１Ｉ、Ｐ３３１Ｆ、Ｐ３３１Ｍ、Ｐ３３１Ｙ、Ｐ３３１Ｗ、Ｉ３３２Ｋ、Ｉ３３２Ｒ、Ｉ３３２Ｓ、Ｉ３３２Ｖ、Ｉ３３２Ｆ、Ｉ３３２Ｍ、Ｉ３３２Ｗ、Ｉ３３２Ｐ、Ｉ３３２Ｇ、Ｅ３３３Ｌ、Ｅ３３３Ｆ、Ｅ３３３Ｍ、Ｅ３３３Ｐ、Ｋ３３４Ｐ、Ｔ３３５Ｎ、Ｔ３３５Ｓ、Ｔ３３５Ｈ、Ｔ３３５Ｖ、Ｔ３３５Ｌ、Ｔ３３５Ｉ、Ｔ３３５Ｆ、Ｔ３３５Ｍ、Ｔ３３５Ｗ、Ｔ３３５Ｐ、Ｔ３３５Ｇ、Ｉ３３６Ｅ、Ｉ３３６Ｋ、Ｉ３３６Ｙ、Ｓ３３７Ｅ、Ｓ３３７Ｎ、Ｓ３３７Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｓ、Ｋ３２６Ｎ、Ｋ３２６Ｑ、Ｋ３２６Ｄ、Ｋ３２５Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｙ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｅ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｌ、Ｑ２９５Ｋ、Ｅ２９４Ｎ、Ｓ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｄ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｄ２８０Ｑ、Ｄ２８０Ｙ、Ｋ２９０Ｇ、Ｋ２９０Ｔ、Ｋ２９０Ｙ、Ｔ２５０Ｑ、Ｔ２５０Ｅ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｅ、Ｙ２７８Ｔ、Ｎ２９７Ｄ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｈ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ａ、Ｌ３２８Ｈ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２ＮおよびＩ３３２Ｑの置換を含む、重鎖定常領域、例えば
、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域におけるアミノ酸置換を含む変異体。
ｂ. 代表的１０４Ｅ修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメント
配列番号２または７に示す重鎖可変ドメインにおいて、１０４位に対応するアミノ酸のグルタミン酸での置換(すなわち、１０４Ｅ)および所望により抗体の重鎖または軽鎖における１個以上のさらなるアミノ酸置換を含む、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例を次に記載する。ここに記載するいずれかのような、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、最小限、抗体に集合したとき、特異的に結合ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)に特異的に結合するのに十分な修飾可変重鎖および／または修飾可変軽鎖またはその一部を含む。１０４Ｅ含有抗ＥＧＦＲ抗体は、結合活性比が１.０を超える、例えば、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、２０.０、３０.０、４０.０、５０.０またはそれ以上であるように、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度を含む条件下で大きな結合活性を示し得る。
例えば、ここに提供されるのは、ｉ)配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２または１２３のいずれかに示す修飾可変重鎖または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列およびii)配列番号４、９または１１のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号４、９または１１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む、１０４Ｅ修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
他の例において、ここに提供されるのは、ｉ)配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２または１２３のいずれかに示す可変重鎖または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２、１２３のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列およびii)配列番号１２５〜１２７のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号１２５〜１２７のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む、１０４Ｅ修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
具体例では、ここに提供されるのは、ｉ)配列番号７４または７５に示す可変重鎖または配列番号７４または７５のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列およびii)配列番号１２５〜１２７のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号１２５〜１２７のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む、１０４Ｅ修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
特定の例において、ここに提供されるのは、ｉ)配列番号７７または７８に示す可変重鎖または配列番号７７または７８のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列およびii)配列番号１２５〜１２７のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号１２５〜１２７のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む、可変重鎖および可変軽鎖の両者にさらなる修飾を含む１０４Ｅ修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、完全長ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の中の他のサブタイプであり得る。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、カッパ軽鎖定常領域(配列番号３１または３３に示す)またはＩｇＧ１重鎖定常領域(配列番号１９〜２３のいずれかに示す)を含む完全長ＩｇＧ１抗体であり得る。重鎖定常領域はまたＩｇＧ２(配列番号２４に示す)、ＩｇＧ３(配列番号２５に示す)またはＩｇＧ４(配列番号２６に示す)のようなＩｇクラス由来であり得る。軽鎖定常領域もヒトラムダ軽鎖(配列番号３２に示す)であり得る。
例えば、ここに提供されるのは、ｉ)さらに配列番号１９〜２３のいずれかに示すＩｇＧ１定常領域に対応するアミノ酸配列を含む、配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかに示すアミノ酸配列または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を有し、かつアミノ酸置換１０４Ｅを含む重鎖可変およびii)軽鎖を含む、完全長抗体である修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。軽鎖は、配列番号４、９もしくは１１のいずれかに示すアミノ酸配列または配列番号４、９もしくは１１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含んでよく、さらに、配列番号３１、３３または３４のいずれかに示すカッパ軽鎖定常領域または配列番号３２に示すラムダ軽鎖定常領域またはその変異体を含む。例えば、軽鎖は、配列番号３、８、１０もしくは１３に示すアミノ酸配列または配列番号３、８、１０もしくは１３のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含み得る。軽鎖はまた配列番号１２５〜１２７のいずれかに示すアミノ酸配列または配列番号１２５〜１２７のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を有する修飾軽鎖可変ドメインを含み、さらに配列番号３１、３３または３４のいずれかに示すカッパ軽鎖定常領域または配列番号３２に示すラムダ軽鎖定常領域またはその変異体に対応するアミノ酸配列を含むものであり得る。
特に、ここに提供されるのは、ｉ)アミノ酸置換１０４Ｅを含む、配列番号７２、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかに示す重鎖または配列番号７２、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列およびii)軽鎖を含む、完全長抗体である修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。軽鎖は、配列番号３、８、１０または１３のいずれかに示すアミノ酸配列または配列番号３、８、１０または１３のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を有し得る。軽鎖はまた配列番号１２４に示すアミノ酸配列または配列番号１２４と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を有し得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体はまた、完全長抗体の全配列未満を含むが、完全長抗体の特異的結合能の少なくとも一部を保持する完全長抗体の誘導体である抗体フラグメント、例えば、重鎖および軽鎖の可変部分も含む。抗体フラグメントはまた、親抗体の結合親和性を保持するために、抗体フレームワークに挿入できる抗体の抗原結合部分(例えば、キメラ抗体)も含み得る。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントおよび修飾フラグメントを含む他のフラグメントを含むが、これらに限定されない(例えば、Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov参照)。
抗体フラグメントは、ジスルフィド架橋によるように、互いに連結された複数の鎖を含むことができ、組み換えにより製造できる。抗体フラグメントはまた、２個以上のドメインを結合するための合成リンカー、例えばペプチドリンカーも含み得る。抗原結合フラグメントの製造法は当分野で周知であり、ここに提供するあらゆる抗体の修飾に使用できる。抗体分子のフラグメントは、例えば、酵素開裂によるように製造できる。例えば、パパインによるプロテアーゼ開裂により、重鎖定常領域の二量体、Ｆｃドメインを２個のＦａｂ領域から開裂する(すなわち、可変領域を含む部分)。あるいは、ペプシン開裂を使用して、抗体の二価Ｆ(ａｂ’)２フラグメントを産生できる。抗体フラグメントはまた合成によりまたは組み換えＤＮＡ法により産生できる。
一本鎖抗体は、特異的抗体の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)の連結により、組み換えにより操作され得る。可変領域の特定の核酸配列は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)および他の組み換え核酸技術によるような、標準分子生物法により、クローン化され得る。ｓｃＦｖｓの製造法は、例えば、Whitlow and Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77および米国特許４,９４６,７７８号、５,８４０,３００号、５,６６７,９８８号、５,６５８,７２７号、５,２５８,４９８号に記載されている。
上記のいずれかのようなここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のフラグメントは、ｉ)配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかに示す修飾可変重鎖または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示し、かつアミノ酸置換１０４Ｅを含むその抗原結合フラグメントもしくはその変異体およびii)配列番号４、９、１１、１５、１７または１２５〜１２７のいずれかに示す可変軽鎖ドメインまたは配列番号４、９、１１、１５、１７または１２５〜１２７のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を示すその抗原結合フラグメントもしくはその変異体を含む。例えば、抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントを含むが、これらに限定されない。
例えば、このような抗ＥＧＦＲ抗体はＦａｂフラグメント(ＶＨ−ＣＨ１およびＣＬ−ＣＬ)であり得る。このような例において、上記の１０４Ｅ可変重鎖領域は、さらに、ＩｇＧ１(例えば、配列番号１９〜２３のいずれかのアミノ酸残基１〜９８に対応)または他のサブタイプまたはアイソタイプ(例えば、配列番号２４〜２７のアミノ酸残基１〜９８に対応)からの重鎖ＣＨ１定常領域を含み得る。上記の可変軽鎖領域は、さらに配列番号３１、３３または３４のいずれかに示すカッパ軽鎖定常領域または配列番号３２に示すラムダ軽鎖定常領域を含み得る。例えば、ここに提供されるのは、ｉ)アミノ酸置換１０４Ｅを含み、さらに配列番号１９〜２３のいずれかに示すＩｇＧ１定常領域のアミノ酸１〜９８に対応するアミノ酸配列またはその変異体を含む、配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２または１２３のいずれかに示す可変重鎖または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２または１２３のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列およびii)配列番号３、８、１０、１３または１２４のいずれかに示すアミノ酸配列を有する軽鎖または配列番号３、８、１０、１３または１２４のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含む、修飾抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ抗体である。
具体例では、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかの抗原結合ドメインから産生できる。例えば、Marasco et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893, Whitlow and Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77および米国特許４,９４６,７７８号、５,８４０,３００号、５,６６７,９８８号、５,６５８,７２７号に記載のもののような、組み換え法を使用して一本鎖抗体を産生する方法は当分野で知られる。
一本鎖抗体は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの軽鎖可変(ＶＬ)ドメインまたはその機能的領域および重鎖可変(ＶＨ)ドメインまたはその機能的領域を含む。いくつかの例において、一本鎖抗体のＶＬドメインまたはその機能的領域は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの相補性決定領域１(ＣＤＲ１)、相補性決定領域２(ＣＤＲ２)および／または相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含む。いくつかの例において、一本鎖抗体のＶＨドメインまたはその機能的領域は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントいずれかの相補性決定領域１(ＣＤＲ１)、相補性決定領域２(ＣＤＲ２)および相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含む。
いくつかの例において、一本鎖抗体は、さらにペプチドリンカーを含む。このような例において、ペプチドリンカーは、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)と重鎖可変ドメイン(ＶＨ)の間に位置できる。一本鎖抗体は、抗体の１個以上のドメインの間にペプチドスペーサーまたはリンカーを含み得る。例えば、抗体の軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)は、可動性リンカーペプチドを解して重鎖可変ドメイン(ＶＨ)と共役する。一般に、リンカーペプチドは約１〜５０アミノ酸長である。ここで使用するリンカーはまた細胞内利用可能性、血清安定性、特異性および溶解度を上昇できるかまたは柔軟性を増加するかまたは立体障害を軽減させる。結合部分は、例えば、Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883, Whitlow et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995, and Newton et al., (1996) Biochemistry 35:545-553に記載されている。
種々のペプチドリンカーは当分野で周知であり、ここに提供する方法において用いることができる。ペプチドリンカーは、一連のグリシン残基(Ｇｌｙ)またはセリン(Ｓｅｒ)残基を含み得る。ポリペプチドリンカーの例は、溶解度を高めるためにグルタミン酸(Ｇｌｕ)またはリシン(Ｌｙｓ)残基が至るところに分散された、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ、(ＧｌｙｍＳｅｒ)ｎまたは(ＳｅｒｍＧｌｙ)ｎ(ここで、ｍは１〜６、一般に１〜４、典型的に２〜４であり、ｎは１〜３０または１〜１０、典型的に１〜４である)を有するペプチドである(例えば、接合体におけるリンカーの例を提供する国際ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０６６４１号参照)。ペプチドリンカーの例は、配列(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号４６)、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ(配列番号３２７)、ＧＳＧＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号３２８)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ(配列番号３２９)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＱ(配列番号３３０)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ(配列番号３３１)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号３３２)、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ(配列番号３３３)およびＥＳＧＳＶＳＳＥＥＬＡＦＲＳＬＤ(配列番号３３４)を有するペプチドを含むが、これらに限定されない。他の適当なペプチドリンカーは、引用により本明細書に包含させる米国特許４,７５１,１８０号または４,９３５,２３３号に記載のものを含む。
２. ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体
ここに提供されるのは、ヒトまたはヒト化抗ＥＧＦＲ抗体である。例えば、上記サブセクションＣ.１に示したような修飾重鎖および／または修飾軽鎖を含むあらゆる修飾抗ＥＧＦＲをヒト化できる。例えば、ヒト化は、上記のあらゆる例示抗体を含む、配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２または１２３のいずれかに示す可変重鎖または配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２または１２３のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し、１０４Ｅを含む配列および配列番号４、９、１１または１２４〜１２７のいずれかに示す可変軽鎖または配列番号４、９、１１または１２４〜１２７のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を示す配列を含む、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかを参照して実施できる。ヒト化の方法は当業者に周知である。抗体ヒト化は、マウスまたは他の非ヒト抗体をヒト抗体に発展されるために使用できる。得られた抗体は、出発抗体と同等の結合親和性および特異性を維持しながら、ヒト配列が増加されており、非ヒト(例えば、マウス)抗体配列を減少または除去されている。
非ヒト抗体またはヒト抗体を操作またはヒト化する方法を使用でき、当分野で周知である。一般に、ヒト化または操作抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類または他の哺乳動物であるが、これらに限定されない非ヒトである源からの１個以上のアミノ酸残基を含む。ヒトアミノ酸残基をそこに移入し、それゆえに、“移入”残基と呼ばれることもあり、これは、典型的に既知ヒト配列の“移入”可変ドメイン、定常ドメインまたは他のドメインから得る。既知ヒトＩｇ配列は、例えば、ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; atcc.org/phage/hdb.html; sciquest.com/; www.abcam.com/; antibodyresource.com/onlinecomp.html; public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html; antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html. immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; m.ehime-u.ac.jp/.about.yasuhito/Elisa.html; biodesign.com/table.asp; icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; isac-net.org/sites_geo.html; aximt1.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/links1.html; recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwvu.edu/; mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; jerini.de/fr_products.htm; patents.ibm.con/ibm.html; Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)に開示されている。このような移入配列を使用して、免疫原性を軽減するかまたは結合、親和性、オン・レート、オフ・レート、アビディティー、特異性、半減期もしくは当分野で知られる任意の他の適当な特徴を軽減、増強または修飾することができる。一般に、元の非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部または全てが維持されるが、非ヒト配列の可変領域(例えば、フレームワーク領域)および定常領域はヒト配列または他のアミノ酸と置き換わる。
抗体はまた所望により抗原への高親和性および他の好都合な生物学的特性を維持しながらヒト化できる。この目標を達成するために、ヒト化抗体は、所望により親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列および種々の概念的ヒト化産物の解析の工程により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者には馴染み深い。選択した候補免疫グロブリン配列の推定三次元高次構造を模式化および表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の解析が可能となる。この方法で、標的抗原への親和性の増加のような所望の抗体特徴が達成されるように、コンセンサスおよび移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。
一般に、ＣＤＲ残基は直接的に、かつ最も実質的に抗原結合への影響に関わる。それゆえに、ＣＤＲ残基は、一般にヒト化の標的とされない。抗体のヒト化または操作は、Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)、米国特許５,７２３,３２３号、５,９７６,８６２号、５,８２４,５１４号、５,８１７,４８３号、５,８１４,４７６号、５,７６３,１９２号、５,７２３,３２３号、５,７６６,８８６号、５,７１４,３５２号、６,２０４,０２３号、６,１８０,３７０号、５,６９３,７６２号、５,５３０,１０１号、５,５８５,０８９号、５,２２５,５３９号；４,８１６,５６７号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０号、ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８号、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０号、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９号、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４号、ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１３４４号、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号、ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号；ＷＯ９０／１４４４３号、ＷＯ９０／１４４２４号、ＷＯ９０／１４４３０号、ＥＰ２２９２４６号(これらの各々は、その中に引用されている引用文献を含み、その全体を引用により本明細書に包含させる)に記載されているような、しかし、これらに限定されないあらゆる既知法を使用して実施できる。
例えば、抗体ヒト化は、例えば、個々のヒトフレームワークのプールにフレーム内で融合した、ヒト化すべき標的抗体の６ＣＤＲ(例えば、上記の修飾抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかのＣＤＲ)を含む、コンビナトリアルライブラリーの合成により実施できる。例えば、ＣＤＲは、配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２または１２３のいずれかに示すＣＤＲＨ１(ＡｂＭ定義によるとアミノ酸残基２６〜３５またはカバトの定義によるとアミノ酸残基３１〜３５)、ＣＤＲＨ２(アミノ酸残基５０〜６５)またはＣＤＲＨ３(アミノ酸残基９５〜１０２)の任意の１個以上に由来してよくおよび／または配列番号４、９、１１または１２５〜１２７のいずれかに示すＣＤＲＬ１(アミノ酸残基２４〜３４)、ＣＤＲＬ２(アミノ酸残基５０〜５６)またはＣＤＲＬ３(アミノ酸残基８９〜９７)の任意の１個以上に由来してよい。全ての既知重鎖および軽鎖ヒト生殖系列遺伝子の代表的遺伝子を含むヒトフレームワークライブラリーを利用できる。得られたコンビナトリアルライブラリーを、その後、ここに記載する興味ある抗原への条件付結合についてスクリーニングできる。この方法により、親抗体の親和性および条件付結合活性の維持の観点で、完全ヒトフレームワークの最も好都合な組み合わせの選択が可能となる。その後、ヒト化抗体を多様な技術により最適化できる。
ヒト化を行うために当業者が実施できるアミノ酸置換または置き換えの数は、上記のものを含む多くの因子による。一般に、抗ＥＧＦＲ抗体、フラグメントまたは変異体についてアミノ酸置き換え(置換)、挿入または欠失の数は、ここに特定するように、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１を超えず、例えば１〜３０またはその中の任意の範囲または値である。機能に必須な抗ＥＧＦＲ抗体のアミノ酸を、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発のような当分野で知られる方法により同定できる(例えば、Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989))。後者の方法は、分子の全ての残基に一アラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子を、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＥＧＦＲへの結合のような、しかしこれに限定されない生物活性を試験する。抗体結合に重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識のような構造的解析によっても道程できる(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992))。
ここに提供するヒト化抗体はまた、既知ヒト化骨格または対照抗ＥＧＦＲ抗体に基づき産生できる。例えば、基地ヒト化抗体Ｈ２２５(配列番号１４に示すＶＨおよび配列番号１５に示すＶＬ)またはＨｕ２２５(配列番号１６に示すＶＨまたは配列番号１７に示すＶＬ)を非修飾または対照抗ＥＧＦＲ抗体として使用して、それに１０４Ｅアミノ酸置換および所望により１個以上の他のアミノ酸置換を導入する。例えば、ヒト化セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体、例えば配列番号１４に示す可変重鎖と配列番号１５に示す可変軽鎖を有するＨ２２５および配列番号１６に示す可変重鎖と配列番号１７に示す可変軽鎖を有するＨｕ２２５を、部位特異的突然変異誘発により修飾して、ヒト化１０４Ｅ(Ｅ−ｈ)抗体およびその変異体を産生できる。
他の例では、米国特許出願１３／８１５,５５３号に記載のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかを非修飾または対照抗ＥＧＦＲ抗体として使用して、それに１０４Ｅアミノ酸置換および所望により１個以上の他のアミノ酸置換を導入する。非修飾または対照抗ＥＧＦＲ抗体として使用できるヒト化抗体は、表１１に示すアミノ酸置換１０４Ｄを含むあらゆるヒト化抗体(例えば、命名ＤＰ−ｈ１−ｈ１０、ＤＰ−ｈ１２−ｈ１４またはＦＤＰ−ｈ１−ｈ２１)を含むが、これらに限定されない。例えば、ヒト化対照または骨格抗体の例は、Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(ＤＰ−ｈ０７)(例えば、配列番号５５に示す重鎖と配列番号１８１に示す軽鎖を有する)と名づけた抗ＥＧＦＲ抗体またはＴ０３０Ｆ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(ＦＤＰ−ｈ０３)(例えば、配列番号６５に示す重鎖と配列番号２５８に示す軽鎖を有する)と名づけた抗ＥＧＦＲ抗体またはＹ１０４Ｄ(Ｄ−ｈ０７)(例えば、配列番号５７に示す重鎖と配列番号１８１に示す軽鎖を有する)と名づけた抗ＥＧＦＲ抗体を含む。このような非修飾または対照ヒト化配列のいずれも、アミノ酸置換１０４Ｅおよび所望により１個以上の他のアミノ酸置換を含むヒト化抗ＥＧＦＲ抗体を産生するための部位特異的突然変異誘発に付し得る。
１０４Ｅヒト化クローンの非限定的例を表１０に示し、これは、各クローンの重鎖および軽鎖の配列番号を示す。
ここに提供するヒト化抗ＥＧＦＲ抗体の例は、次に示すアミノ酸配列を有する、可変重鎖(ＶＨ)および可変軽鎖(ＶＬ)を有するあらゆるものを含む。
配列番号６１もしくは６３に示すＶＨまたは配列番号６１もしくは６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示すＶＬまたは配列番号１８３、１８４もしくは１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３１もしくは１３３に示すＶＨまたは配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５５、１５６もしくは１５８に示すＶＬまたは配列番号１５５、１５６もしくは１５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３１もしくは１３３に示すＶＨまたは配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６２、１６３もしくは１６５に示すＶＬまたは配列番号１６２、１６３もしくは１６５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３７もしくは１３９に示すＶＨまたは配列番号１３７もしくは１３９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５５、１５６もしくは１５８に示すＶＬまたは配列番号１５５、１５６もしくは１５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３１もしくは１３３に示すＶＨまたは配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６９、１７０もしくは１７２に示すＶＬまたは配列番号１６９、１７０もしくは１７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３１もしくは１３３に示すＶＨまたは配列番号１３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７６、１７７もしくは１７９に示すＶＬまたは配列番号１７６、１７７もしくは１７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３１もしくは１３３に示すＶＨまたは配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示すＶＬまたは配列番号１８３、１８４もしくは１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３７もしくは１３９に示すＶＨまたは配列番号１３７もしくは１３９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示すＶＬまたは配列番号１８３、１８４もしくは１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３１もしくは１３３に示すＶＨまたは配列番号１３１もしくは１３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９０、１９１もしくは１９３に示すＶＬまたは配列番号１９０、１９１もしくは１９３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４３もしくは１４５に示すＶＨまたは配列番号１４３または１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示すＶＬまたは配列番号１８３、１８４もしくは１８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４９もしくは１５１に示すＶＨまたは配列番号１４９もしくは１５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９７、１９８もしくは２００に示すＶＬまたは配列番号１９７、１９８もしくは２００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４３もしくは１４５に示すＶＨまたは配列番号１４３または１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９７、１９８もしくは２００に示すＶＬまたは配列番号１９７、１９８もしくは２００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４９もしくは１５１に示すＶＨまたは配列番号１４９もしくは１５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０４、２０５もしくは２０７に示すＶＬまたは配列番号２０４、２０５もしくは２０７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４３もしくは１４５に示すＶＨまたは配列番号１４３または１４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０４、２０５もしくは２０７に示すＶＬまたは配列番号２０４、２０５もしくは２０７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２１１もしくは２１３に示すＶＨまたは配列番号２１１もしくは２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５３、２５４もしくは２５６に示すＶＬまたは配列番号２５３、２５４もしくは２５６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２１７もしくは２１９に示すＶＨまたは配列番号２１７もしくは２１９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５３、２５４もしくは２５６に示すＶＬまたは配列番号２５３、２５４もしくは２５６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２３もしくは２２５に示すＶＨまたは配列番号２２３もしくは２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６０、２６１もしくは２６３に示すＶＬまたは配列番号２６０、２６１もしくは２６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２９もしくは２３１に示すＶＨまたは配列番号２２９もしくは２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６０、２６１もしくは２６３に示すＶＬまたは配列番号２６０、２６１もしくは２６３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３５もしくは２３７に示すＶＨまたは配列番号２３５もしくは２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６７、２６８もしくは２７０に示すＶＬまたは配列番号２６７、２６８もしくは２７０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２４１もしくは２４３に示すＶＨまたは配列番号２４１もしくは２４３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示すＶＬまたは配列番号２７４、２７５もしくは２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２３もしくは２２５に示すＶＨまたは配列番号２２３もしくは２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示すＶＬまたは配列番号２７４、２７５もしくは２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２９もしくは２３１に示すＶＨまたは配列番号２２９もしくは２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示すＶＬまたは配列番号２７４、２７５もしくは２７７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３５もしくは２３７に示すＶＨまたは配列番号２３５もしくは２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示すＶＬまたは配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２４７もしくは２４９に示すＶＨまたは配列番号２４７もしくは２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示すＶＬまたは配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２３もしくは２２５に示すＶＨまたは配列番号２２３もしくは２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示すＶＬまたは配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２９もしくは２３１に示すＶＨまたは配列番号２２９もしくは２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示すＶＬまたは配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３５もしくは２３７に示すＶＨまたは配列番号２３５もしくは２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示すＶＬまたは配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２４７もしくは２４９に示すＶＨまたは配列番号２４７もしくは２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示すＶＬまたは配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２３もしくは２２５に示すＶＨまたは配列番号２２３もしくは２２５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示すＶＬまたは配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２９もしくは２３１に示すＶＨまたは配列番号２２９もしくは２３１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示すＶＬまたは配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３５もしくは２３７に示すＶＨまたは配列番号２３５もしくは２３７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９５、２９６もしくは２９８に示すＶＬまたは配列番号２９５、２９６もしくは２９８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２４７もしくは２４９に示すＶＨまたは配列番号２４７もしくは２４９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０２、３０３もしくは３０５に示すＶＬまたは配列番号３０２、３０３もしくは３０５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２１１もしくは２１３に示すＶＨまたは配列番号２１１もしくは２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３０２、３０３もしくは３０５に示すＶＬまたは配列番号３０２、３０３もしくは３０５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２１１もしくは２１３に示すＶＨまたは配列番号２１１もしくは２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示すＶＬまたは配列番号２８１、２８２もしくは２８４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２１１もしくは２１３に示すＶＨまたは配列番号２１１もしくは２１３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示すＶＬまたは配列番号２８８、２８９もしくは２９１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列。
上記ＥＧＦＲ抗体のいずれも重鎖定常領域または軽鎖定常領域またはその一部をさらに含み得る。定常領域は、任意の免疫グロブリンクラス(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、任意のサブクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブ・サブクラス(例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ)であり得る。具体例では、ここに提供する抗体は、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の中の他のサブタイプからの定常領域をさらに含む完全長抗体である。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体はカッパ軽鎖定常領域(配列番号３１または３３に示す)またはＩｇＧ１重鎖定常領域(配列番号１９〜２３のいずれかに示す)を含む完全長ＩｇＧ１抗体であり得る。重鎖定常領域はまたＩｇＧ２(配列番号２４に示す)、ＩｇＧ３(配列番号２５に示す)またはＩｇＧ４(配列番号２６に示す)のようなＩｇクラスからであり得る。軽鎖定常領域はヒトラムダ軽鎖(配列番号３２に示す)でもよい。
ここに提供するヒト化抗ＥＧＦＲ抗体の例は、次に示すアミノ酸配列を有する、重鎖および軽鎖を有するあらゆるものを含む。
配列番号５９に示す重鎖または配列番号５９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８１に示す可変軽鎖または配列番号１８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５３に示す可変軽鎖または配列番号１５３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６０に示す可変軽鎖または配列番号１６０と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３５に示す重鎖または配列番号１３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１５３に示す可変軽鎖または配列番号１５３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１６７に示す可変軽鎖または配列番号１６７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１７４に示す可変軽鎖または配列番号１７４と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８１に示す可変軽鎖または配列番号１８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１３５に示す重鎖または配列番号１３５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８１に示す可変軽鎖または配列番号１８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１２９に示す重鎖または配列番号１２９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８８に示す可変軽鎖または配列番号１８８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４１に示す重鎖または配列番号１４１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１８１に示す可変軽鎖または配列番号１８１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４７に示す重鎖または配列番号１４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９５に示す可変軽鎖または配列番号１９５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４１に示す重鎖または配列番号１４１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号１９５に示す可変軽鎖または配列番号１９５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４７に示す重鎖または配列番号１４７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０２に示す可変軽鎖または配列番号２０２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号１４１に示す重鎖または配列番号１４１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２０２に示す可変軽鎖または配列番号２０２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２０９に示す重鎖または配列番号２０９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５１に示す可変軽鎖または配列番号２５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２１５に示す重鎖または配列番号２１５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５１に示す可変軽鎖または配列番号２５１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２１に示す重鎖または配列番号２２１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５８に示す可変軽鎖または配列番号２５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２７に示す重鎖または配列番号２２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２５８に示す可変軽鎖または配列番号２５８と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３３に示す重鎖または配列番号２３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２６５に示す可変軽鎖または配列番号２６５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３９に示す重鎖または配列番号２３９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７２に示す可変軽鎖または配列番号２７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２１に示す重鎖または配列番号２２１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７２に示す可変軽鎖または配列番号２７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２７に示す重鎖または配列番号２２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７２に示す可変軽鎖または配列番号２７２と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３３に示す重鎖または配列番号２３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す可変軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２４５に示す重鎖または配列番号２４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す可変軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２１に示す重鎖または配列番号２２１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す可変軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２７に示す重鎖または配列番号２２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す可変軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３３に示す重鎖または配列番号２３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す可変軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２４５に示す重鎖または配列番号２４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す可変軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２１に示す重鎖または配列番号２２１と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す可変軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２２７に示す重鎖または配列番号２２７と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す可変軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２３３に示す重鎖または配列番号２３３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２９３に示す可変軽鎖または配列番号２９３と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２４５に示す重鎖または配列番号２４５と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３００に示す可変軽鎖または配列番号３００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２０９に示す重鎖または配列番号２０９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号３００に示す可変軽鎖または配列番号３００と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２０９に示す重鎖または配列番号２０９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２７９に示す可変軽鎖または配列番号２７９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列；
配列番号２０９に示す重鎖または配列番号２０９と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列および配列番号２８６に示す可変軽鎖または配列番号２８６と少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸配列。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体はまた、完全長抗体の完全配列未満を含むが、完全長抗体の特異的結合能の少なくとも一部を保持する、完全長抗体の誘導体である抗体フラグメント、例えば重鎖および軽鎖の可変部分も含む。本抗体フラグメンはまた親抗体の結合親和性を保持するために抗体フレームワーク(例えば、キメラ抗体)に挿入できる、抗体の抗原結合部分も含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントおよび修飾フラグメントを含む他のフラグメントを含むが、これらに限定されない(例えば、Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov参照)。抗体フラグメントは、ジスルフィド架橋によるように連結された複数の鎖を含んでよく、組み換えにより産生できる。抗体フラグメントはまた２個以上のドメインを結合するためのペプチドリンカーのような合成リンカーも含み得る。抗原結合フラグメントを産生する方法は当分野で周知であり、ここに提供するあらゆる抗体を修飾するために使用できる。抗体分子のフラグメントは、例えば、酵素開裂によるように産生できる。例えば、パパインによるプロテアーゼ開裂により、重鎖定常領域の二量体、Ｆｃドメインを２個のＦａｂ領域から開裂する(すなわち、可変領域を含む部分)。あるいは、ペプシン開裂を使用して、抗体の二価Ｆ(ａｂ’)２フラグメントを産生できる。抗体フラグメントはまた合成によりまたは組み換えＤＮＡ法により産生できる。
一本鎖抗体は、特異的抗体の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)の連結により、組み換えにより操作され得る。可変領域の特定の核酸配列は、例えば、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)および他の組み換え核酸技術によるような、標準分子生物法により、クローン化され得る。ｓｃＦｖｓの製造法は、例えば、Whitlow and Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Pack et al. (1993) Bio/Technology 11:1271-77および米国特許４,９４６,７７８号、５,８４０,３００配列番号、５,６６７,９８８号、５,６５８,７２７号、５,２５８,４９８号に記載されている。
上記のここに提供されるヒト化抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントのいずれも、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度を含む条件下、結合活性比が１.０を超える、例えば、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、３.０、４.０、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、２０.０、３０.０、４０.０、５０.０またはそれ以上であるように大きな結合活性を示す。また、典型的に、上記のヒト化抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれも、特に非ヒト化親抗体と比較したとき、哺乳動物細胞において産生したとき顕著な生産性を生じる。例えば、上記ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかをコードする核酸を含む哺乳動物宿主細胞(例えば、表１０に示す重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むもの)は、正確にまたは凡そ１mg／mL、１.５mg／mL、２.０mg／mL、２.５mg／mL、３.０mg／mL、３.５mg／mL、４.０mg／mL、４.５mg／mL、５.０mg／mL、５.５mg／mL、６.０mg／mL、６.５mg／mL、７.０mg／mL、８.０mg／mL、９.０mg／mL、１０.０mg／mLより多いまたは少なくとも１mg／mL、１.５mg／mL、２.０mg／mL、２.５mg／mL、３.０mg／mL、３.５mg／mL、４.０mg／mL、４.５mg／mL、５.０mg／mL、５.５mg／mL、６.０mg／mL、６.５mg／mL、７.０mg／mL、８.０mg／mL、９.０mg／mL、１０.０mg／mLまたはそれ以上の濃度で、抗体の発現を生じる。
３. １０４Ｄ修飾を含む抗ＥＧＦＲ抗体
またここに提供されるのは、配列番号２または７を参照して、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖の可変ドメインの１０４位に対応する位置にアスパラギン酸(Ｄ)のアミノ酸置換を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体(命名１０４Ｄ)である。非修飾抗ＥＧＦＲ抗体における１０４位に対応する一は、配列番号２または７に示す可変重鎖と可変重鎖のアライメントにより決定できる(例えば、図２参照)。１０４位のグルタミン酸(Ｅ)のアスパラギン酸(Ｄ)への置換は保存的変異である。それゆえに、ここに記載するあらゆる１０４Ｅ抗体を、対応する１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体を産生するために保存的に変異させ得る。
ここに提供する修飾１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、最小限、抗体に集合したとき、ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントと結合するのに十分な可変重鎖および可変軽鎖またはその一部を含み、それにより少なくとも可変重鎖は１０４Ｄへの置換により修飾されている。得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体は完全長ＩｇＧ１抗体でも、そのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントでもよい。さらに、得られた修飾抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１以外のドメインを含み得る。
１０４Ｄ修飾を、ここに記載するまたは既知のあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体、例えば非修飾抗ＥＧＦＲ抗体(例えば、セツキシマブ抗体)、その抗原結合フラグメントまたはその変異体に導入できる。ここでのアミノ酸置換を行い得る非修飾抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号１、２、５、６、７、１２、１４または１６のいずれかに示す重鎖または配列番号１、２、５、６、７、１２、１４または１６のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含む抗原結合フラグメントまたはその変異体を含む、抗ＥＧＦＲセツキシマブ抗体または抗原結合フラグメントまたはその変異体である。例えば、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２に示す可変重鎖(ＶＨ)および配列番号４に示す可変軽鎖(ＶＬ)、配列番号７に示すＶＨおよび配列番号９に示すＶＬ、配列番号７に示すＶＨおよび配列番号１１に示すＶＬ、配列番号１４に示すＶＨまたは配列番号１５に示すＶＬまたは配列番号１６に示すＶＨまたは配列番号１７に示すＶＬまたは可変重鎖または軽鎖の配列番号のものと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を示す可変重鎖および／または可変軽鎖を含むその変異体を含むアミノ酸配列を含み得る。
非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は完全長抗体でもその抗原結合フラグメントでもよい。例えば、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、上記のいずれかのＶＨまたはＶＬ領域および配列番号１に示す重鎖と配列番号３に示す軽鎖、配列番号５に示す重鎖と配列番号３に示す軽鎖、配列番号１２に示す重鎖と配列番号１３に示す軽鎖、配列番号６に示す重鎖と配列番号８に示す軽鎖または配列番号６に示す重鎖と配列番号１０に示す軽鎖を含む重鎖および軽鎖の定常領域を含んでよくまたは重鎖または軽鎖の配列番号の一方または両方と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を示す重鎖および／または軽鎖を含む完全長抗体またはその変異体の抗原結合フラグメントでよい。このような例のいずれにおいても、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、１０４位に対応する位置のチロシン(Ｙ)がＤで置き換えられた、アミノ酸置換Ｙ１０４Ｄを有する可変重鎖を含み得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較して可変重鎖にアミノ酸置換１０４Ｄのみ含んでよくまたは１０４Ｄに加えて、重鎖または軽鎖の一方または両方にアミノ酸置換または修飾を含み得る。例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、修飾を含まない抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、少なくともまたは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上の修飾位置を含み得る。重鎖または軽鎖におけるさらなる修飾の例は、上記セクションＣ.１に示すものを含む(例えば、表６および８)。ここに提供する修飾１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体の全てにおいて、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非修飾抗ＥＧＦＲ抗体と比較してアミノ酸置換１０４Ｄを含み、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１０mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下、大きな結合活性を示すと理解される。
ここに提供する修飾１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体は、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１０mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下で大きな結合活性を示す。例えば、ｐＨ６.０〜６.５および／または１０mM〜２０mM乳酸の一方または両方を示す条件下の結合活性対または約ｐＨ７.４および／または凡そまたは正確に１mM乳酸の一方または両方を含む条件下の結合活性の比は、少なくとも１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、４.５、５.０、６.０、７.０、８.０、９.０、１０.０、１１.０、１２.０、１３.０、１４.０、１５.０、２０.０、２５.０、３０.０、３５.０、４０.０、４５.０、５０.０またはそれ以上である。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、生理的濃度のタンパク質(例えば、２５％血清)の存在下、改変された結合活性を示し得る。それゆえに、１０４Ｄここに提供する抗体は、腫瘍選択的ＥＧＦＲ結合活性を示すことができ、それにより結合活性は、非腫瘍微小環境で存在する条件と比較して、腫瘍微小環境で存在する条件下で大きい。
ここに提供する組み合わせ変異体抗体およびここに提供するヒト化抗体を含む、ここに記載するあらゆる抗体を、１０４Ｄ置換を含むために修飾できる。非限定的例示的１０４Ｄ修飾抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖配列および軽鎖配列を下の表１１に示す。またここに提供されるのは、得られた抗体が正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１０mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下で大きな結合活性を示す限り、表１１に示す重鎖および／または軽鎖のいずれかの配列番号と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体である。
４. 接合体
またここに提供されるのは、１種以上の標的剤に直接的にまたはリンカーを介して結合したここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む、接合体である。これらの接合体は次の成分、抗体(Ａｂ)、(リンカー(Ｌ))ｑ、(標的剤)ｍを含み、式：Ａｂ−(Ｌ)ｑ−(標的剤)ｍ(ここで、ｑは０以上であり、ｍは少なくとも１である)で表される。それゆえに、ここに提供する接合体は、ここに提供する修飾抗体に共有結合性に結合した１種以上の標的剤を含む。接合体は、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、６.０〜６.５(両端を含む)の酸性ｐＨおよび／または１０mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下で、ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントへの大きな結合活性を示す。
それゆえに、抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)または免疫接合体とも呼ばれるこれらの接合体を使用して、細胞毒性または細胞増殖抑制剤、すなわち、癌の処置においてＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞を死滅させるまたは阻害する薬物の標的化送達に使用できる。このような接合体は、非罹患細胞よりも排除されることが望まれる腫瘍細胞に選択性を示し、それにより正常細胞に許容されないレベルの毒性をもたらさない。それゆえに、接合体は、最大有効性を、最小の毒性と軽減した副作用と共に達成する。それゆえに、このような化合物癌および他の疾患または障害の診断または処置のここに記載する方法に使用できる。
上記のとおり、標的剤の数を変数ｍ(ここで、ｍは１以上の整数である)で示す。標的剤は、変数ｑ(ここで、ｑは０または任意の整数である)により指定する数のリンカーにより、ここに提供する抗体と接合する。変数ｑおよびｍは、得られた接合体が標的細胞、特に、腫瘍細胞のＥＧＦＲと相互作用し、標的剤が標的細胞により内部移行するように選択する。典型的に、ｍは１〜８である。ｑは、リンカーの結合したターゲッティングおよび標的剤および／または機能により０またはそれ以上であり、ｑは一般に０〜４である。１個を超える標的剤が接合体に存在するとき、標的剤は同一でも異なってもよい。
標的剤を、修飾抗ＥＧＦＲ抗体に直接的にまたは１個以上のリンカーを介して共有結合性に結合できる。得られた接合体が、結合標的剤の内部移行が行われるように標的細胞のＥＧＦＲと相互作用する限り、接合体の要素間のあらゆる適当な結合が意図される。それゆえに、ここに提供する接合体は融合タンパク質として産生でき、化学的に共役でき、または融合タンパク質部分および化学的に結合した部分またはこれらのいずれかの組み合わせを含み得る。
標的剤をまた修飾して、リンカーおよび／または修飾抗ＥＧＦＲ抗体との接合により適するようにするかまたは細胞内活性を増強させ得る。例えば、ポリペプチド標的剤の場合、このような修飾は、Ｎ末端またはＣ末端またはその近位へのＣｙｓ残基導入、反応性基、例えばチオール基を導入するための誘導体化および／または好ましくは、標的剤のカルボキシ末端への局在化シグナル、例えば、標的剤を小胞体に向ける(Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ)ｎ(配列番号３５０)(ここで、ＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇ、好ましくはＬｙｓであり、ｎは１〜６、好ましくは１〜３である)の付加(例えば、Seetharam et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17376-17381; and Buchner et al. (1992) Anal. Biochem. 205:263-270参照)を含む、がこれらに限定されない。
他の例において、標的剤を修飾して１個以上のシステイン残基を除去し、例えば、好ましい位置でのより予測可能なチオール接合を提供できる。得られた修飾標的剤の特性の改変を、そのような改変が望まれる以外は避けるように注意すべきである。全例で、特定の修飾を経験的に決定できる。
リンカーＬは、共有結合性結合により抗体を標的剤と結合する。リンカーはペプチドでも非ペプチドでもよく、標的剤と修飾抗ＥＧＦＲ抗体が近いことによる立体障害を軽減または減少させるおよび／または接合体の他の特性、例えば特異性、毒性、溶解度、血清安定性および／または標的部分の細胞内利用可能性を増加または改変するおよび／または抗ＥＧＦＲ抗体と標的剤の間の結合の柔軟性を高めるように選択できる。
融合タンパク質が企図されるとき、リンカーを、得られた核酸分子がＥＧＦＲを発現する腫瘍微小環境の細胞と結合し、内部移行し、内部移行したタンパク質の全てまたは一部が好ましくは細胞質に輸送される融合タンパク質をコードするように選択する。各リンカーの有益な特性を用いるために、数個のリンカーを連結し得ることも企図される。このような場合、接合体のリンカー部分は５０個を超えるアミノ酸残基を含み得る。残基数は、得られた融合タンパク質が標的細胞のＥＧＦＲと結合し、結合した標的剤を、該標的剤を細胞質および／または核に輸送する経路を通って内部移行させる限り、重要ではない。
標的剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、治療部分または選択した腫瘍細胞集団への標的化送達が望ましい他の薬剤であり得る。このような標的剤は、細胞毒性剤、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレアーゼ、毒素、薬物または他の薬剤を含むが、これらに限定されない。治療部分は、細胞毒性部分、放射性同位体、化学療法剤、溶解性ペプチドおよびサイトカインを含むが、これらに限定されない。治療部分の例は、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；臭化エチジウム；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テニポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；マイタンシンまたはその類似体または誘導体；アウリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体または誘導体；ドラスタチン１０または１５またはその類似体；イリノテカンまたはその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリチアマイシンまたはその類似体または誘導体；代謝拮抗剤；アルキル化剤；白金誘導体；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラシェルマイシン(ＣＣ−１０６５)またはその類似体または誘導体；抗生物質；ピロロ[２,１−ｃ][ｌ,４]−ベンゾジアゼピン(ＰＤＢ)；毒素；リボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)；デオキシリボヌクレアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡおよびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含むが、これらに限定されない。
これらの方法において薬物も標的剤として使用できる。このような薬物は、５−フルオロウラシル、ビンカアルカロイドおよび抗生物質、例えばダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンおよびアントラマイシン(ＡＭＣ)、ネオカルジノスタチンおよびビンデシンを含むが、これらに限定されない。
抗体−毒素接合体で使用する毒素は、細菌毒素、例えばジフテリア毒素およびその活性フラグメントおよびハイブリッド分子、植物毒素、例えばリシン毒素、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン、マイタンシノイド、例えばＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４およびカリチアマイシンを含む。最後に、アウリスタチンペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)、モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)およびモノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)、ドラスタチンの合成アナログを使用できる。他の毒素は、コレラ毒素、志賀様毒素、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボウマン・バークプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ガラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシン毒素を含む。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構により、細胞毒性および細胞増殖抑制活性を発揮できる。
ａ. 標的剤
標的剤はタンパク質、ペプチド、核酸、小分子、治療部分または選択した腫瘍細胞集団への標的化送達が望ましい他の薬剤であり得る。このような標的剤は、細胞毒性剤、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレアーゼ、毒素、薬物または他の薬剤を含むが、これらに限定されない。
ｉ.マイタンシノイド薬物部分
接合体における標的剤としての細胞毒性部分は、米国特許８,１４２,７８４号に記載のものを含むマイタンシノイド薬物部分を含む。マイタンシン化合物は、微小管タンパク質であるチューブリンの重合化の阻害により、有糸分裂中の微小管形成を阻害することにより細胞増殖を阻害する(Remillard et al. (1975) Science 189:1002-1005；米国特許５,２０８,０２０)。マイタンシンおよびマイタンシノイドは高度に細胞毒性であるが、それらの癌治療における臨床使用は主に腫瘍への選択性が低いことが原因の、重度全身副作用により非常に制限されている。マイタンシンの臨床試験は、中枢神経系および消化器系への重篤な有害作用により中止されている(Issell et al. (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207)。
マイタンシノイド薬物部分は、(ｉ)発酵または、発酵産物の化学的修飾、誘導体化による製造に比較的利用しやすい、(ii)抗体への非ジスルフィドリンカーによる接合に適する官能基での誘導体化がしやすい、(iii)血漿中で安定であるそして(iv)多様な腫瘍細胞株に対して有効であるために、抗体−薬物接合体で魅力的な薬物部分である。
マイタンシノイド薬物部分として適するマイタンシン化合物は当分野で周知であり、既知法により天然源から単離でき、遺伝子操作技術を使用して製造でき(Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973参照)またはマイタンシノールおよびマイタンシノールアナログは、既知法に従い合成的に製造できる。
マイタンシノイド薬物部分の例は、修飾芳香環、例えばＣ−１９−デクロロ(米国特許４,２５６,７４６)(アンサマイトシンＰ２のリチウムアルミニウムハイドライド還元により製造)；Ｃ−２０−ヒドロキシ(またはＣ−２０−デメチル)＋／−Ｃ−１９−デクロロ(米国特許４,３６１,６５０配列同一性および４,３０７,０１６配列同一性)(ストレプトマイセス属もしくはアクチノマイセス属を使用するデメチル化またはＬＡＨを使用する脱塩素により製造)およびＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ(−ＯＣＯＲ)、＋／−デクロロ(米国特許４,２９４,７５７配列同一性)(アシルクロライドを使用するアシル化により製造)を有するものおよび他の位置に修飾を有するものを含む。
マイタンシノイド薬物部分の例はまた、Ｃ−９−ＳＨ(マイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５の反応により製造)(米国特許４,４２４,２１９号)；Ｃ−１４−アルコキシメチル(デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ)(米国特許４,３３１,５９８号)；Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル(ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ)(ノカルジア属から製造)(米国特許４,４５０,２３４)；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ(ストレプトマイセス属によるマイタンシノールの変換により製造)(米国特許４,３６４,８６６号)；Ｃ−１５−メトキシ(マロツス・ヌディフロールスから単離)(米国特許４,３１３,９４６号および米国特許４,３１５,９２９号)；Ｃ−１８−Ｎ−デメチルストレプトマイセス属によるマイタンシノールのデメチル化により製造)(米国特許４,３６２,６６３号および米国特許４,３２２,３４８号)および４,５−デオキシ(マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により製造)(米国特許４,３７１,５３３号)のような修飾を有するものも含む。
マイタンシン化合物上の多くの位置が、結合のタイプによって結合位置として有用であることが知られる。例えば、エステル結合形成のために、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位が全て適する。
マイタンシノイド薬物部分は、直接接合によりまたはここに提供するリンカーのいずれかを用いて修飾抗ＥＧＦＲ抗体に結合できる。具体例では、細胞毒製剤または薬物は、ＤＭ１(Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−(３−メルカプト−１−オキソプロピル)−マイタンシン)としても知られるメルタンシンである。メルタンシンは４−メルカプト吉草酸を介して結合できる。エムタンシン接合体も、ここでの抗体とリンカー４−(３−メルカプト−２,５−ジオキソ−１−ピロリジニルメチル)−シクロヘキサンカルボン酸(ＭＣＣ)を使用して形成できる。
ii. アウリスタチンおよびドラスタチン薬物部分
接合体における標的剤としての細胞毒性部分は、米国公開ＵＳ２０１１／０２１７３２１号に記載のものを含む、アウリスタチンおよびドラスタチンを含む。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解ならびに核および細胞分裂を妨害することが示されており(Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)、抗癌(米国特許５,６６３,１４９号)および抗真菌活性を有する(Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)。さらに、アウリスタチンは非常に強力であり、人工であり、安定であり、リンカー結合を可能にする化学的修飾がしやすい(Senter (2009) Curr Opin Chem Biol 13:235-244)。
アウリスタチンが人工であるため、完全構造的修飾を行い、親薬物の特性を顕著に改変できる。例えば、モノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)はアミノ酸残基フェニルアラニンで終わり、これは細胞膜透過性を障害する(Doronina et al., (2006) Bioconjug Chem. 17:114-124)。それゆえに、ＭＭＡＦのＡＤＣへの接合は、抗原陽性細胞による選択的薬物取り込みを促進できる(Doronina et al., (2006) Bioconjug Chem. 17:114-124;Doronina et al., (2003) Nat Biotechnol. 21:778-78４)。
ドラスタチンまたはアウリスタチン薬物部分は、ペプチド性薬物部分のＮ(アミノ)末端またはＣ(カルボキシル)末端を介して抗体と結合できる(ＷＯ２００２／０８８１７２)。アウリスタチン具現化の例は、Ｎ末端およびＣ末端に結合したモノメチルアウリスタチン薬物部分ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む(Senter et al. (2004) “Proceedings of the American Association for Cancer Research,” Volume 45, Abstract Number 623および２００４年３月２８日に発表；米国公開２０１１／００２０３４３号)。
ドラスタチンまたはアウリスタチンは、直接接合によりまたはここに提供するリンカーのいずれかを使用して、修飾抗ＥＧＦＲ抗体に結合できる。具体例では、ドラスタチンまたはアウリスタチンは、ペプチドリンカー、例えばバリン−シトルリン(Ｖａｌ−Ｃｉｔ)を介して抗ＥＧＦＲ抗体と結合できる。
iii.ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)
接合体における標的剤としての細胞毒性部分は、顕著な抗腫瘍特性を有する配列選択的ＤＮＡアルキル化抗生物質である、ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)(またはピロロ[２,１−ｃ][１,４]−ベンゾジアゼピン)を含む。ＰＢＤはＤＮＡの特異的配列を認識し、結合する能力を有し、好ましいＤＮＡ配列はＰｕＧＰｕ(プリン−グアニン−プリン)である。ＰＢＤはまた、ＰｕＧＰｙ(プリン−グアニン−ピリミジン)配列またはＰｙＧＰｕ配列に、好ましくはＰｙＧＰｙ配列に結合できる。
ＰＢＤは天然に存在するかまたは合成であり得る。天然に存在するＰＢＤはアブベイマイシン(Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987))、アントラマイシン(Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc, 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc, 87, 5791 -5793 (1965))、チカマイシン(Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984))、ＤＣ−８１(Thurston, et al., Chem. Brit, 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751 -758 (1992))、マゼトラマイシン(Kunimoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980))、ネオトラマイシンＡおよびＢ(Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976))、ポロトラマイシン(Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988))、プロトラカルシン(Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492- 2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987))、シバノマイシン(ＤＣ−１０２)(Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988))、シビロマイシン(Leber, et al., J. Am. Chem. Soc, 110, 2992-2993 (1988))およびトママイシン(Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972))を含む。ＰＢＤの合成および合成アナログの産生も記載されている(例えば、米国特許６,５６２,８０６号、６,６０８,１９２号、６,７４７,１４４号および７,０４９,３１１号、７,５２８,１２６号参照)。
ＰＢＤは、次の一般式のものである：(式１)
ＰＢＤは、芳香族Ａ環およびピロロＣ環の両者における置換基の数、タイプおよび位置ならびにＣ環の飽和度が様々である。Ｂ環において、ＤＮＡのアルキル化を担う求電子中心であるＮ１０−Ｃ１１位置にイミン(Ｎ＝Ｃ)、カルビノールアミン(ＮＨ−ＣＨ(ＯＨ))またはカルビノールアミンメチルエーテル(ＮＨ−ＣＨ(ＯＭｅ))のいずれかがある。既知天然産物の全てが、Ｃ環からＡ環方向を見たとき、右撚りとする位置であるキラルＣ１１が(Ｓ)配置を有する。これにより、Ｂ形態ＤＮＡの副溝を伴うイソヘリシティーのための適切な三次元形状を与える(Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986))。ＰＢＤは、ＰｕＧＰｕコンセンサス配列中のグアニンの環外Ｎ２と共有結合性アミナール結合を形成し、ＰＢＤ／ＤＮＡ付加物を形成し、これはＤＮＡプロセシングを妨害し、細胞周期停止およびアポトーシスに至る。それゆえに、ＰＢＤは有効な抗腫瘍剤である。
ＰＢＤの二量体も有効な抗腫瘍剤である。ＰＢＤ二量体は、ＰＢＤ単量体により覆われる３個の塩基対の代わりに６個の塩基対を覆う。さらに、二量体のＰＢＤは、ＤＮＡの相補鎖における配列を結合でき(すなわち、鎖間グアニン−グアニン架橋)、配列選択的ＤＮＡ架橋に至る。ＰＢＤ二量体誘発架橋は鎖分離を阻止し、それによりＤＮＡ複製を阻止する。これによりＧ２／Ｍ界面での細胞周期停止およびアポトーシスが起こる。ＰＢＤ単量体と比較したＰＢＤ二量体の被覆の増加は、ＤＮＡ架橋に加えて、抗癌剤としての有効性を実質的に高める。
ＰＢＤ二量体はホモ二量体でもヘテロ二量体でもよく、２個の単量体ＰＢＤ単位を、可動性リンカーによりそれらのＣ８位を一緒に合わせて合成する。一般的に使用されるリンカーは、プロピルジオキシ(ＰＢＤ−Ｃ８−Ｏ−(ＣＨ２)３−Ｏ−Ｃ８’−ＰＢＤ’)およびペンチルジオキシ(ＰＢＤ−Ｃ８−Ｏ−(ＣＨ２)５−Ｏ−Ｃ８’−ＰＢＤ’)を含む。リンカーの特性、例えばリンカーの長さを、二量体を特異的ＤＮＡ配列に標的化させるために選択できる(Rahman et al., (2011) Nucleic Acids Res. 39(13): 5800-5812 and Gregson et al., (2004) J Med Chem 47:1161-1174)。ＰＢＤ間リンカーの例は、Bose et al., (1992) J Am Chem Soc. 114:4939-4941, Bose et al., (1992) J Chem Soc Chem Commun. 14:1518-1520, Thurston et al., (1996) J Org Chem. 61:8141-8147, Gregson et al., (2001) J Med Chem. 44:737-748, and Gregson et al., J Med Chem 2004;47:1161-1174に記載されている。ＰＢＤ二量体の例は、文献に記載されており(例えば、米国特許６,５６２,８０６号、６,６０８,１９２号、６,７４７,１４４号、７,０４９,３１１号、７,５２８,１２６号、７,７４１,３１９号、８,５９２,５７６号)、ＤＳＢ−１２０(ＵＳ７,０４９,３１１号)、ＤＲＨ−１６５(ＵＳ７,０４９,３１１号)、ＥＬＢ２１(Rahman et al., (2011) Nucleic Acids Res. 39(13): 5800-5812)、ＳＧ２０００／ＳＪＧ１３６(Rahman et al., (2011) Nucleic Acids Res. 39(13): 5800-5812；ＵＳ７,０４９,３１１号)、ＳＧ２０５７／ＤＲＧ１６(Rahman et al., (2011) Nucleic Acids Res. 39(13): 5800-5812)、ＳＧ２２０２(ＵＳ７,７４１,３１９号；Hartley et al., (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858)、ＳＧ２２８５(Hartley et al., (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858)、ＳＧ３１３２(ＵＳ２０１３００２８９１９号)と名付けられた化合物を含むが、これらに限定されない。
ＰＢＤおよびＰＢＤ二量体は、チオール、アミンおよびフェノール接合を含むが、これらに限定されないあらゆる方法によりここに提供する抗体のいずれかに接合できる。典型的に、ＰＢＤまたはＰＢＤ二量体を、標的細胞内でのリンカーの開裂後、抗体からＰＢＤまたはＰＢＤ二量体が放出されるように、インビボ循環で安定である切断可能リンカーを使用して、抗体と接合する。いくつかの例において、ＰＢＤまたはＰＢＤ二量体鎖間システインに接合できる。いくつかの例において、抗体を修飾して、鎖間システインを挿入または除去するようにアミノ酸を置き換えて、ＰＢＤまたはＰＢＤ二量体の定方向チオール結合を促進できる。
iv. 細胞毒素部分
本方法および組成物に使用するのに適当な細胞毒素は、小分子、例えばＤＮＡ開裂剤ならびに細菌毒素、真菌毒素、植物毒素、昆虫毒素、ヘビ毒素およびクモ毒素を含むが、これらに限定されないタンパク性細胞毒素を含む。ここに提供する接合体への取り込みが企図される細胞毒素を表１２に示す。
(ａ)ＤＮＡ開裂剤
本方法の実施に際して使用されるキメラリガンド−毒素における細胞毒素として挿入するのに適するＤＮＡ開裂剤の例は、アントラキノン−オリゴピロール−カルボキサミド、ベンゾイミダゾール、レイナマイシン；ダイネミシンＡ；エンジイン；ならびにその生物学的活性アナログまたは誘導体(すなわち、実質的に等価な生物活性を有するもの)を含むが、これらに限定されない。既知アナログおよび誘導体は、例えばIslam et al., J. Med. Chem. 34 2954-61, 1991; Skibo et al., J. Med. Chem. 37:78-92, 1994; Behroozi et al., Biochemistry 35:1768-74, 1996; Helissey et al., Anticancer Drug Des. 11:527-51, 1996; Unno et al., Chem. Pharm. Bull. 45:125-33, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5:903-19, 1997; Unno et al., Bioorg. Med. Chem., 5: 883-901, 1997; およびXu et al., Biochemistry 37:1890-7, 1998に記載されている。他の例は、エンジインキノンイミン類(米国特許５,６２２、９５８号)；２,２ｒ−ビス(２−アミノエチル)−４−４’−ビチアゾール(Lee et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 40:151-7, 1996)；エリプチシン−サレン・銅複合物(Routier et al., Bioconjug. Chem., 8: 789-92, 1997)を含むが、これらに限定されない。
(ｂ)代謝拮抗剤
キメラリガンド−毒素に細胞毒素として挿入するのに有用な代謝拮抗剤の例は、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、メルファラン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、窒素マスタードおよびマイトマイシンｃを含むが、これらに限定されない。
(ｃ)タンパク性細胞毒素
本方法において使用するキメラリガンド−毒素に取り込むのに有用なタンパク性細胞毒素の例は、タイプＩおよびタイプIIリボソーム不活性化タンパク質(ＲＩＰ)を含むが、これらに限定されない。有用なタイプＩ植物ＲＩＰは、ジアンチン３０、ジアンチン３２、リクニン(lychnin)、サポリン１〜９、ヨウシュヤマゴボウ活性化タンパク質(ＰＡＰ)、ＰＡＰ II、ＰＡＰ−Ｒ、ＰＡＰ−Ｓ、ＰＡＰ−Ｃ、マパルミン(mapalmin)、ドデカンドリン、ブリオジン−Ｌ、ブリオジン、コリシン１および２、ルフィン−Ａ、ルフィン−Ｂ、ルフィン−Ｓ、１９Ｋ−タンパク質合成阻害タンパク質(ＰＳＩ)、１５Ｋ−ＰＳＩ、９Ｋ−ＰＳＩ、アルファ−キリロウィン、ベータ−キリロウィン、ゲロニン、モモルジン、モモルジン−II、モモルジン−Ｉｃ、ＭＡＰ−３０、アルファ−モモルカリン、ベータ−モモルカリン、トリコサンチン、ＴＡＰ−２９、トリコキリン；オオムギＲＩＰ；アマＲＩＰ、トリチン、トウモロコシＲＩＰ、アスパリン１および２を含むが、これらに限定されない。有用なタイプII ＲＩＰは、ボルケンシン、リシン、ニグリン−ｂ、ＣＩＰ−２９、アブリン、モデシン、エブリチン(ebulitin)−α、エブリチン−β、エブリチン−γ、ビルクミン(vircumin)、ポレクチンならびにこれらの生物学的活性酵素サブユニッを含むが、これらに限定されない(Stirpe et al., Bio/Technology 10:405-12, 1992; Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994; and Sandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996)。
(ｄ)細菌毒素
細胞毒素として有用な細菌毒素の例は、志賀毒素および志賀様毒素(すなわち、同じ活性または構造を有する毒素)、ならびにその触媒的サブユニットおよび生物学的に機能的なフラグメントを含むが、これらに限定されない。これらの細菌毒素もまたタイプII ＲＩＰである(Sandvig and Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996; Armstrong, J. Infect. Dis., 171:1042-5, 1995; Kim et al., Microbiol. Immunol. 41:805-8, 1997およびSkinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998)。有用な細菌毒素のさらなる例は、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素を含むが、これらに限定されない(Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; and Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994)。毒素酵素サブユニットの切断型および変異体も細胞毒素部分として使用できる(Pastan et al., Annu. Rev. Biochem. 61:331-54; Brinkmann and Pastan, Biochim. et Biophys. Acta 1198:27-45, 1994; Mesri et al., J. Biol. Chem. 268:4853-62, 1993; Skinner et al., Microb. Pathog. 24:117-22, 1998および米国特許５,０８２,９２７号)。他の標的剤は、コリシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ１−９、クロアシンＤＦ１３および真菌ＲＮａｓｅ、αサルシンを含む、記載された３４種を超えるＲＮａｓｅ毒素のコリシンファミリーを含むが、これらに限定されない(Ogawa et al. Science 283: 2097-100, 1999; Smarda et al., Folia Microbiol (Praha) 43:563-82, 1998; Wool et al., Trends Biochem. Sci., 17: 266-69, 1992)。
(ｅ)ポルフィリンおよび他の光活性化毒素
ポルフィリンは、タンパク質に容易に架橋できる、周知の光活性化可能毒素である(例えば、米国特許５,２５７,９７０号；５,２５２,７２０号；５,２３８,９４０号；５,１９２,７８８号；５,１７１,７４９号；５,１４９,７０８号；５,２０２,３１７号；５,２１７,９６６号；５,０５３,４２３号；５,１０９,０１６号；５,０８７,６３６号；５,０２８,５９４号；５,０９３,３４９号；４,９６８,７１５号；４,９２０,１４３号および国際公開ＷＯ９３／０２１９２号参照)。
ｖ. 標的化送達用核酸
ここに提供する接合体を使用して、核酸を標的細胞に送達もできる。核酸は、細胞のゲノムを修飾し、それにより遺伝子治療を行うことが意図されるＤＮＡならびにアンチセンス剤として使用するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。核酸は、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス剤として使用ことが意図される他のオリゴヌクレオチドを含む。核酸は、ＲＮＡ輸送シグナル、例えばウイルスパッケージング配列も含み得る(例えば、Sullenger et al. (1994) Science 262:1566-1569参照)。核酸はまた無傷の遺伝子をコードするまたは遺伝子治療として使用することが意図されるタンパク質をコードするＤＮＡ分子も含む。
遺伝子治療を行うために細胞に送達され得るＤＮＡ(またはＲＮＡ)は、腫瘍特異的細胞毒性分子、例えば腫瘍壊死因子、ウイルス抗原および細胞を抗癌剤に感受性とさせる他のタンパク質をコードするＤＮＡおよび欠陥遺伝子を置き換えるための嚢胞性線維症と関連する欠陥遺伝子(ＣＦＴＲ)のような遺伝子をコードするＤＮＡ(例えば、国際出願ＷＯ９３／０３７０９およびRiordan et al. (1989) Science 245:1066-1073参照)を含む。
ここに記載するとおり使用するための核酸およびオリゴヌクレオチドは、当業者に知られるあらゆる方法により合成できる(例えば、ＷＯ９３／０１２８６および米国特許５,２１８,０８８号；５,１７５,２６９号および５,１０９,１２４号参照)。アンチセンス剤として使用するためのオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの同定は、十分に当業者の技術範囲内である。遺伝子治療のために標的化送達する遺伝子をコードするＤＮＡの選択も、十分に当業者のレベルの範囲内である。例えば、このようなオリゴヌクレオチドの望ましい特性、長さおよび他の特徴は周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、内在性核酸分解酵素による分解に耐えるように設計し、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ホスフェートエステルおよび他のこのような結合を含む(例えば、Agrawal et al. (1987) Tetrahedron Lett. 28:3539-3542; Miller et al. (1971) J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665; Stec et al. (1985) Tetrahedron Lett. 26:2191-2194; Moody et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:4769-4782; Letsinger et al. (1984) Tetrahedron 40:137-143; Eckstein (1985) Annu. Rev. Biochem. 54:367-402; Eckstein (1989) Trends Biochem. Sci. 14:97-100; Stein (1989) In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed, Macmillan Press, London, pp. 97-117; Jager et al. (1988) Biochemistry 27:7237-7246参照)。
(ａ)アンチセンスオリゴヌクレオチド；三重分子；亜鈴状オリゴヌクレオチド；ＤＮＡ；細胞外タンパク質結合オリゴヌクレオチドおよび小ヌクレオチド分子を含むアンチセンスヌクレオチド
アンチセンスヌクレオチドは、相補配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合し、それによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するオリゴヌクレオチドである(例えば、Altman et al.の米国特許５,１６８,０５３号、Inouyeの米国特許５,１９０,９３１号、Burchの米国特許５,１３５,９１７号；Smithの米国特許５,０８７,６１７号および亜鈴状アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載するClusel et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21:3405-3411参照)。三重分子は、二本鎖ＤＮＡを標的とし、それにより転写を阻止する単ＤＮＡ鎖をいう(例えば、二本鎖ＤＮＡ上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドの製造法を記載する米国特許５,１７６,９９６参照号)。
(ｂ)リボザイム
リボザイムは、メッセンジャーＲＮＡを特異的に開裂するＲＮＡ構築物である。ＲＮＡ鎖の開裂および／またはライゲーションに関与することが知られる、少なくとも５クラスのリボザイムがある。リボザイムは任意のＲＮＡ転写物を標的化でき、このような転写物を触媒的に開裂する(例えば、リボザイムおよびその製造法を記載する米国特許５,２７２,２６２号；５,１４４,０１９号、５,１６８,０５３号；５,１８０,８１８号；５,１１６,７４２号および５,０９３,２４６号参照)。任意のこのようなリボソームを、酸性条件下、ＥＧＦＲ担持細胞に送達するために条件付活性抗ＥＧＦＲ抗体に結合させ得る。
リボザイムを、核への導入後、リボザイムが直接転写されるように、真核プロモーター、例えば真核ウイルスプロモーター、一般に後期プロモーターに結合したリボザイムをコードするＤＮＡとして、標的細胞に送達させ得る。このような場合、構築物はまた結合した核酸の核への送達に適するようにするために、一般にターゲティング剤の一部としてまたはリンカーの一部として、核移行配列も含む。
(ｃ)標的化送達のための治療用産物をコードする核酸
とりわけ使用が企図される治療用産物をコードするＤＮＡは、腫瘍壊死因子のような抗癌因子およびＥＧＦＲ担持腫瘍細胞への志賀Ａ１毒素またはサポリンのような細胞毒性剤の正しいコピーをコードするＤＮＡである。接合体は核移行配列(ＮＴＳ)を含まなければならない。接合体が、ターゲティング剤と結合したＤＮＡが細胞質で開裂されるように設計されるならば、ＮＴＳは、内部移行により、接合体が核に輸送されるように、ＤＮＡに結合したままであるリンカーの部分に含まれなければならない。核移行配列(ＮＴＳ)は異種配列であっても、選択したケモカイン受容体ターゲティング剤に由来してもよい。典型的コンセンサスＮＴＳ配列は、７〜９個のアミノ酸のアレイにアミノ末端プロリンまたはグリシンと、続く少なくとも３個の塩基性残基を含む(例えば、Dang et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:18019-18023参照)。
(ｄ)核酸のタンパク質へのカップリング
ここでの化学的接合をさせるために、ターゲティング剤を、直接的にまたは１個以上のリンカーを介して核酸と結合させる。核酸を５’末端、３’末端およびどこかで、タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端および他の部位と接合させる方法は当業者に知られる(レビューのために例えば、Goodchild, (1993) In: Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Mears, Ed., American Chemical Society, Washington, D.C. pp. 77-99参照)。例えば、タンパク質は、紫外線照射(Sperling et al. (1978) Nucleic Acids Res. 5:2755-2773; Fiser et al. (1975) FEBS Lett. 52:281-283)、二官能性化学物質(Baeumert et al. (1978) Eur. J. Biochem. 89:353-359; and Oste et al. (1979) Mol. Gen. Genet. 168:81-86)および光化学架橋(Vanin et al. (1981) FEBS Lett. 124:89-92; Rinke et al. (1980) J.Mol.Biol. 137:301-304; Millon et al. (1980) Eur. J. Biochem. 110:485-492)を使用して核酸と結合されている。
特に、試薬(Ｎ−アセチル−Ｎ’−(ｐ−グリオキシリルベンゾリル)シスタミンおよび２−イミノチオランが、混合ジスルフィド形成を介してＤＮＡをタンパク質、例えばα２−マクログロブリン(α２Ｍ)に結合させるために使用されている(Cheng et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:659-669参照)。Ｎ−アセチル−Ｎ’−(ｐ−グリオキシリルベンゾリル)シスタミンは、非対形成グアニン残基と特異的に結合し、還元により、遊離スルフヒドリル基を産生する。２−イミノチオランはタンパク質と反応してスルフヒドリル基を産生し、これがその後、分子間ジスルフィド相互変換反応により誘導体化ＤＮＡと接合する。接合体の内部移行により標的核酸が活性である限り、あらゆる結合を使用し得る。それゆえに、結合の開裂が恐らく必須であると考えられるが、ある試薬、例えばプロモーターに結合したリボザイムをコードするＤＮＡまたは核に送達するための治療剤をコードするＤＮＡでは、このような開裂は必須ではない可能性が予測される。
チオール結合は、ヘテロ二官能性試薬を使用して容易に形成できる。アミンもまた、５’ホスホロイミダゾリドを産生するために、ｐＨ６のイミダゾール緩衝液中、核酸と水溶性カルボジイミド、例えば１−エチル−３’[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド(ＥＤＣ)またはＮ−エチル−Ｎ’(３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣＩ)を反応させることにより、水溶液中で非保護オリゴヌクレオチドまたは核酸の末端５’ホスフェートにも結合されている。５’ホスホロイミダゾリドとアミン含有分子およびエチレンジアミンの接触により、安定なホスホロアミデートが生じる(例えば、Chu et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:6513-6529およびＷＯ８８／０５０７７参照)。特に、ＤＮＡ溶液を、ｐＨ６でＥＤＣで飽和させ、撹拌しながら４℃で一夜する。次いで、得られた溶液を、例えば約３体積の１００mMクエン酸緩衝液の添加によりｐＨ８.５に緩衝化し、約５μg〜約２０μgのケモカイン受容体ターゲティング剤を添加し、得られた混合物を４℃で約４８時間撹拌する。未反応タンパク質を、例えば、溶出緩衝液として０.１Ｍ炭酸アンモニウム溶液、ｐＨ７.０を使用する、SEPHADEX G75(Pharmacia)を使用するカラムクロマトグラフィーにより混合物から除き得る。単離接合体を凍結乾燥し、使用するまで保存し得る。
米国特許５,２３７,０１６号は、５’末端がブロモアセチル化されたヌクレオチドを製造し、得られたオリゴヌクレオチドとチオール基を反応させる方法を記載する。５’末端ブロモアセチル基で誘導体化されたオリゴヌクレオチドは、米国特許５,２３７,０１６号に記載のように、５’−アミノヘキシル−ホスホロアミデートオリゴヌクレオチドとブロモ酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの反応により製造できる。米国特許５,２３７,０１６号はまたチオール誘導体化ヌクレオチドの製造法も記載し、これはその後選択した増殖因子上のチオール基と反応させ得る。簡単にいうと、チオール誘導体化ヌクレオチドを、２工程で５’リン酸化ヌクレオチドから製造する。(１)一反応工程でジイミドの存在下ホスフェート基とイミダゾールを反応させ、イミダゾール脱離基をシスタミンで除去し、そして(２)シスタミンリンカーのジスルフィド結合をジチオスレイトールで還元する(また、類似法を記載するChu et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:3671-3691も参照のこと)。５’リン酸化出発オリゴヌクレオチドは、当業者に知られる方法により製造できる(例えば、Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p. 122参照)。
アンチセンスオリゴマーまたは核酸、例えばメチルホスホネートオリゴヌクレオチド(ＭＰ−オリゴマー)は、ＳＰＤＰまたはＳＭＰＢとの反応により由来し得る。得られたＭＰ−オリゴマーをＨＰＬＣにより精製し、その後ケモカイン受容体ターゲティング剤と共役させ得る。ＭＰ−オリゴマー(約０.１μM)を約４０〜５０μlの１：１アセトニトリル／水に溶解し、そこに約１mLリン酸緩衝化食塩水中のリン酸緩衝液(ｐＨ７.５、最終濃度０.１Ｍ)および１mg ＭＰ−オリゴマーを添加する。約５〜１０時間、室温で反応を進行させ、約１５μＬ ０.１ヨードアセトアミドで反応停止させる。接合体をヘパリンセファロースHi Trapカラム(１mL、Pharmacia)で精製し、直線状または段階勾配により溶出させる。接合体は０.６Ｍ ＮａＣｌに溶出するはずである。
ｂ.リンカー
リンカーＬは、共有結合性結合により抗体を標的剤に結合させる。リンカーは、抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)を形成するために、１種以上の標的剤を抗ＥＧＦＲ抗体に結合するのに使用できる二官能性または多官能性部分である。ＡＤＣは、標的剤および抗ＥＧＦＲ抗体への結合のための反応性官能基を有するリンカーを使用して容易に製造できる。抗ＥＧＦＲ抗体のシステインチオール基またはアミン基、例えば、Ｎ末端またはリシン側鎖は、リンカー試薬、標的剤または標的剤−リンカー試薬の官能基と結合を形成できる。
リンカーは、標的細胞への輸送または送達前に、抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)が安定であり、無傷のままであるように、すなわち、抗体が標的剤に結合したままであるように、好ましくは細胞外環境で安定である。それゆえに、リンカーは標的細胞外では安定であり、細胞に入ると、ある効果的速度で抗体と標的剤を開裂し得るか、解離可能とさせる。意図されるリンカーは(ｉ)抗体の特異的結合特性を妨害しない；(ii)接合体または標的剤の細胞内送達を可能にする；(iii)接合体が標的部位に送達または輸送されるまで、安定で無傷なままである、すなわち、開裂しない、そして(iv)標的剤の細胞毒性、殺細胞効果または細胞増殖抑制効果を妨害しない。ＡＤＣの安定性は、マススペクトロメトリーおよび／またはＨＰＬＣのような標準的分析技術により測定し得る。
リンカーは、抗体と標的剤の両者への共有結合性結合を可能にするために２個の反応性官能基を有し、それゆえに、反応性の観念で二価性を示す。２個以上の機能的または生物学的活性部分、例えばペプチド、核酸、薬物、毒素、抗体、ハプテンおよびレポーター基の結合に有用なこのような化学的架橋剤は知られ、接合体の産生におけるその使用法は記載されている(Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p234-242)。
いくつかの例において、リンカーは、抗体に存在する求電子基と反応性である求核性基を有する反応性官能基である。抗体上の有用な求電子基は、アルデヒド基およびケトンカルボニル基を含むが、これらに限定されない。リンカーの求核性基のヘテロ原子は、抗体の求電子基と反応し、抗体単位への共有結合性結合を結合できる。リンカーの有用な求核性基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレートおよびアリールヒドラジドを含むが、これらに限定されない。抗体の求電子基は、リンカーの結合に便利な場所を提供する。
ｉ. ペプチドリンカー
リンカーは、１個以上のアミノ酸単位を含むペプチド性であり得る。ペプチドリンカー試薬は、Rainin Symphony Peptide Synthesizer(Protein Technologies, Inc.)またはモデル４３３(Applied Biosystems)のような自動化シンセサイザー上で、ｔ−ＢＯＣ化学(Geiser et al. “Automation of solid-phase peptide synthesis” in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218)およびＦｍｏｃ／ＨＢＴＵ化学(Fields, G. and Noble, R. (1990) “Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids”, Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214)を含むペプチド化学の分野で周知の固相または液相合成法により製造できる(E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, volume 1, pp. 76-136 (1965) Academic Press)。ペプチドリンカーは、タンパク質分解が酵素的であり、酵素を腫瘍細胞内での優先的発現用に選択できるため、加水分解的にまたは還元的に不安定であるリンカーを超える利点がある。カテプシンＢ切断可能ペプチドリンカー、バリン−シトルリン(Ｖａｌ−Ｃｉｔ)およびその修飾体、例えばマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン(ｍｃ−ｖｃ)、フェニルアラニン−リシン、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ(配列番号３５１)、他のトリ／テトラペプチドが、ＡＤＣで用いられているペプチドリンカーの例である(osio et al., (2010) Toxins 3:848-883; Doronina et al., (2006) Bioconjug Chem. 17:114-124; Doronina et al., (2003) Nat Biotechnol. 21:778-784; Sanderson et al., (2005) Clin Cancer Res 11:843-852; Ducry and Stump (2010) Bioconjug Chem. 21:5-13)。非切断可能ペプチドリンカーの例はＮ−メチル−バリン−シトルリンを含む。他のペプチドリンカーは米国公開２０１１／００２０３４３号に記載されている。
好ましいペプチドリンカーは融合タンパク質内に取り込まれ、宿主細胞、例えば大腸菌で発現さ得るものである。このようなリンカーは酵素基質、例えばカテプシンＢ基質、カテプシンＤ基質、トリプシン基質、トロンビン基質、スブチリシン基質、第Ｘａ因子基質およびエンテロキナーゼ基質を含み、溶解度、柔軟性および／または細胞内切断性を増加するリンカーは(ｇｌｙｍｓｅｒ)ｎおよび(ｓｅｒｍｇｌｙ)ｎ(ここで、ｍは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４であり、ｎは１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４である)(例えば、接合体で使用するリンカーの例を提供する国際ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０６６４１号を参照)。いくつかの態様において、各リンカーの望ましい特性を利用するために、数個のリンカーを包含させ得る。
ii. 化学的リンカー
ＡＤＣはまた非切断可能部分または化学的架橋剤であるリンカーを使用して製造できる。非切断可能リンカーの例は、アミドリンカーならびにスクシネートスペーサーとのアミド結合およびエステル結合を含む(Dosio et al., (2010) Toxins 3:848-883)。化学的架橋リンカーの例は、ＳＭＣＣ(スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート)およびＳＩＡＢ(スクシンイミジル(４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート)を含む。ＳＭＣＣは、中鎖長シクロヘキサン安定化スペーサーアームの逆末端にＮＨＳ−エステル反応性基とマレイミド反応性基を含む、アミン−スルフヒドリルクロスリンカーである。ＳＩＡＢはアミン−スルフヒドリル接合のための、短い、ＮＨＳ−エステルおよびヨードアセチルクロスリンカーである。他の架橋剤の例は、チオエーテルリンカー、化学的に不安定なヒドラゾンリンカー、４−メルカプト吉草酸、ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣおよびスルホ−ＳＭＰＢおよびＳＶＳＢ(スクシンイミジル−(４−ビニルスルホン)ベンゾエート)およびビス−マレイミド試薬、例えばＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ(ＰＥＯ)３およびＢＭ(ＰＥＯ)４を含むが、これらに限定されず、これらは市販されている(Pierce Biotechnology, Inc.)。ビス−マレイミド試薬は、連続的または同時的形式で、抗体のシステイン残基の遊離チオール基の、チオール含有標的剤またはリンカー中間体への結合を可能にする。マレイミド以外の他のチオール−反応性官能基はヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネートおよびイソチオシアネートを含む。他のリンカーおよび使用法の例は、米国公開２００５／０２７６８１２号およびDucry and Stump (2010) Bioconjug Chem. 21:5-13に記載されている。
リンカーは、所望により溶解度または反応性を修飾する基に置換され得る。例えば、スルホネート置換基は、試薬の水溶解度を高め、ＡＤＣの製造に用いる合成経路によって、リンカー試薬と抗体または薬物部分のカップリング反応を促進するかまたは抗ＥＧＦＲ Ａｂ−Ｌと標的剤または標的剤−Ｌと抗ＥＧＦＲ Ａｂのカップリング反応を促進する。
他のリンカー試薬も業者、例えば分子Biosciences Inc.(Boulder, Colo.)から得ることができまたはToki et al. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872；米国特許６,２１４,３４５；ＷＯ０２／０８８１７２；Ｕ.Ｓ。２００３１３０１８９；Ｕ.Ｓ。２００３０９６７４３；ＷＯ０３／０２６５７７；ＷＯ０３／０４３５８３およびＷＯ０４／０３２８２８に記載の方法に従い合成できる。例えば、リンカー試薬、例えばＤＯＴＡ−マレイミド(４−マレイミドブチルアミドベンジル−ＤＯＴＡ)は、Axworthy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807)の方法に従う、アミノベンジル−ＤＯＴＡとクロロギ酸イソプロピル(Aldrich)で活性化した４−マレイミド酪酸(Fluka)の反応により合成できる。ＤＯＴＡ−マレイミド試薬はシステイン操作抗体の遊離システインアミノ酸と反応し、抗体上に金属錯化リガンドを提供する(Lewis et al. (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86)。キレート化リンカー標識試薬、例えばＤＯＴＡ−ＮＨＳ(１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−１,４,７,１０−テトラ酢酸モノ(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル)は市販されている(Macrocyclics, Dallas, Tex.)。
リンカーは、抗体への分枝、多官能性リンカー部分を介する１個を超える薬物部分の共有結合性結合のために樹状タイプリンカーであり得る(Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King et al. (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990)。樹状リンカーは、標的剤対抗体のモル比、すなわち、負荷を上げることができ、これはＡＤＣの効力を増加し得る。それゆえに、抗体が反応性システインチオール基を１個しか有していないとき、多数の薬物部分を、樹状リンカーを介して結合し得る。樹状リンカー試薬の例は、米国特許公開２００５／０２７６８１２号に記載されている。
ｃ. 代表的接合体
ここに提供されるのは、アウリスタチンまたはマイタンシノイドである細胞毒性部分に直接的または間接的に結合したここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかを含む、Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体接合体およびＹ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体接合体である。本抗体接合体は式(Ａｂ)、(Ｌ)ｑおよび(標的剤)ｍを有し、ここで、抗体(Ａｂ)はＥＧＦＲに結合する変異体Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体もしくはＹ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり；ＬはＡｂを標的剤に結合するためのリンカーであり；標的剤はアウリスタチンまたはマイタンシノイドであり、ｍは少なくとも１であり；ｑは得られた接合体がＥＧＦＲに結合する限り０またはそれ以上である。いくつかの例において、ｍ は１〜８であり、ｑは０〜８である。典型的に、接合体中の成分の配向はＡｂ−[(Ｌ)ｑ−(標的剤)ｍ]であり、それによりＡｂは、リンカーを介して標的剤、すなわちアウリスタチンまたはマイタンシノイドに間接的に結合している。一般に、ｍおよびｑは互いに独立して２〜６である。具体例では、得られた接合体が式Ａｂ−[(Ｌ)−(標的剤)]ｐ(ここで、ｐは２〜６、例えば一般に少なくとも正確にまたは約２、３、４、５または６である)を有するように、ｍおよびｑが同じである。
ｉ. 抗ＥＧＦＲ抗体−アウリスタチン接合体
ここに提供されるのは、アウリスタチン細胞毒性部分に直接的または間接的に結合したここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかを含む、抗体接合体、Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体接合体およびＹ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体接合体である。このような例において、抗体接合体は式(Ａｂ)、(Ｌ)ｑおよび(アウリスタチン)ｍを有し、ここで、抗体(Ａｂ)はＥＧＦＲに結合する変異体Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体もしくはＹ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ＬはＡｂをアウリスタチンに結合させるリンカーであり、ｍは少なくとも１(例えばｍは１〜８)であり、ｑは、得られた接合体がＥＧＦＲに結合する限り１またはそれ以上(例えば０〜８)である。典型的に、接合体中の成分の配向はＡｂ−[(Ｌ)ｑ−(アウリスタチン)ｍ]を有し、それによりＡｂはリンカーを介してアウリスタチン剤に間接的に結合している。具体例では、得られた接合体が式Ａｂ−[(Ｌ)−(アウリスタチン)]ｐ(ここで、ｐは２〜６、例えば一般に少なくとも正確にまたは約２、３、４、５または６である)を有するように、ｍおよびｑは同じである。
例において、抗体成分はここに記載するあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。一例において、抗体成分はＹ１０４Ｅ変異体抗体、例えば上記サブセクションＣ.１およびＣ.２に示したいずれかであり得る。特に、ここに提供するアウリスタチン含有接合体のＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号７２に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖または配列番号７２のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖(すなわち、配列番号７４に示す)および配列番号８のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖(すなわち配列番号９に示す)を含むその抗原結合フラグメントを含む抗体またはそれらと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す重鎖および／または軽鎖またはその一部を含み、可変重鎖にアミノ酸置換Ｙ１０４Ｅを含む抗体またはそのヒト化形態である。例えば、アウリスタチン含有接合体におけるＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体は、表７、９または表１０のいずれかに示すようなここに提供する変異体Ｙ１０４Ｅ抗体または各重鎖のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および各軽鎖のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントを含む。一例として、アウリスタチン含有接合体のＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号５９に示す重鎖および配列番号１８１に示す軽鎖を含む、Ｅ−ｈと名付けたヒト化Ｙ１０４Ｅ抗体または配列番号５９のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および配列番号１８１のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントを含む。本抗体成分は完全長抗体でも抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントでもよい。
他の例において、抗体成分は、Ｙ１０４Ｄ変異体抗体、例えばサブセクションＣ.３に示したいずれかであり得る。特に、ここに提供するアウリスタチン含有接合体におけるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体は、
配列番号６７に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖を含む抗体または配列番号６７のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および配列番号８のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントまたはそれらと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す重鎖および／または軽鎖またはその一部を含み、可変重鎖にアミノ酸置換Ｙ１０４Ｄを含む抗体またはそのヒト化形態である。例えば、ここに提供するアウリスタチン含有接合体におけるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の例は、表１１に示すいずれかまたは各重鎖のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および各軽鎖のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントである。一例として、アウリスタチン含有接合体におけるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号５に示す重鎖７および配列番号１８１に示す軽鎖を含むＤ−ｈと名付けたヒト化Ｙ１０４Ｄ抗体または配列番号５７のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および配列番号１８１のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントである。本抗体成分は完全長抗体でも抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントでもよい。
接合体におけるアウリスタチンは、サブセクションＣ.４.ａ.iiに記載するものを含む、文献に記載された既知のあらゆるものであり得る。また、公開国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１２０５４７４８号および米国特許出願ＵＳ２０１１／００２０３４３号参照。一例において、アウリスタチンは、構造
を有するＭＭＡＥまたはその薬学的に許容される塩形態である。他の例において、アウリスタチンは、構造
を有するＭＭＡＦまたはその薬学的に許容される塩形態である。
このような例のいずれにおいても、リンカーは、サブセクションＣ.４.ｂにおいて上記したあらゆるリンカーであり得る。典型的に、リンカーは、抗体上のスルフヒドリル基と反応できるリンカーである。リンカーは、式Ａａ−Ｙｙ−Ｚｚ−Ｘｘを有するかまたはその薬学的に許容される塩であり、ここで、Ａは抗体のスルフヒドリル基と反応できる架橋単位であり；ａは０または１であり；ＹおよびＺの各々は独立してアミノ酸単位であり；ＹおよびＺの各々は独立して０〜１２の整数であり；Ｘはスペーサー単位であり、Ｘは０、１または２である。
このような例において、架橋単位は、抗体をアミノ酸Ｙまたは、存在するならばＷ、存在するならば、スペーサー単位Ｘまたは標的剤と結合できる。このような例において、抗体上のスルフヒドリル基は、架橋単位と反応できる官能基である。一例において、スルフヒドリル基は、抗体の分子内ジスルフィド結合の還元により産生され得る。ジスルフィドを、標準法を使用して、例えば、ジチオスレイトール、メルカプトエタノールまたはトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィンで還元できる。他の例において、スルフヒドリル基は、抗体のリシン部分のアミノ基と２−イミノチオラン(トラウト試薬)または他のスルフヒドリル産生試薬と反応させることにより産生できる。抗体の硫黄原子と結合できる反応性リンカーは当分野で知られる(例えば公開国際ＰＣＴ出願号ＷＯ２０１２０５４７４８号およびＷＯ２００５／００７１９７号参照)。
一例において、架橋単位の官能性または反応性部分は、チオール基に広く選択的なもの、例えばヨードアセトアミド、マレイミド、ビニルスルホン、ビニルピリジンならびにアクリレートエステルおよびメタクリレートエステルを含む。このようなチオール選択的接合部分は、抗体と単チオエーテル接合結合を産生できる。例えば、架橋は、マレイミドである反応性基を含み得る。具体例では、架橋単位はマレイミドカプロイル(ＭＣ)またはマレイミドプロパノイル(ＭＰ)である。例えば、架橋はを含む。
他の例において、架橋単位の反応性部分は、抗体の鎖間ジスルフィド結合を維持する二官能性リンカーである。例えば、架橋単位は、公開米国特許出願ＵＳ２０１３／０２２４２２８号に記載のような二官能性ピロール−２,５−ジオン−およびピロリジン−２,５−ジオン−ベースのリンカーを含み得る。このような例において、二官能性リンカーと２個のシステインの反応は、２個のチオエーテル結合により接続したジスルフィドあたり１個のリンカーと“綴じられた”ジチオスクシンイミドまたはジチオマレイミド抗体接合体を与える。他の例において、二官能性リンカーは、国際ＰＣＴ出願ＷＯ２００５／００７１９７号に記載のようなビス−チオールアルキル化試薬であり得る。ビス−チオールアルキル化試薬は、還元ジスルフィドに由来する両システインチオールへの結合のためにビス−アルキル化に付される。形成されたら、試薬は双方向性マイケルおよび逆マイケル反応に付されて、２個の遊離チオールが３−炭素架橋を横切って再アニーリングされ得る、生成物の形成を可能にする。一例において、ビス−チオールアルキル化試薬は構造
を有し、ここで、(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎは親水性ＰＥＧスペーサーである。例えば、ビス−チオールアルキル化試薬は、構造
を有する４−(３−トシル−２−(トシルメチル)プロパノイル)ベンズアミド−ＰＥＧであり得る。
アウリスタチンベースの接合体いずれの接合体においても、アミノ酸ＹおよびＺは、各々が独立して存在するならば、天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよい。例えば、ＹおよびＺは、各々が独立して存在するならば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンであるアミノ酸であり得る。Ｙ−Ｚは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドまたは高次単位ペプチドであるアミノ酸単位であり得る。アミノ酸単位は、標的剤を放出するために、癌または腫瘍関連プロテアーゼを含む１種以上の酵素で酵素的に開裂される。例えば、Ｙはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはプロリンであるアミノ酸であってよく、Ｚはリシン、アセチルもしくはホルミルで保護されたリシン、アルギニン、トシル基もしくはニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルもしくはホルミルで保護されたオルニチンまたはシトルリンであり得る。具体例では、Ｙ−Ｚはフェニルアラニン−リシン、バリン−シトルリンまたはバリン−リシンである。
リンカーにおいて、Ｘはスペーサー単位である。スペーサー単位は、非自壊型でも自壊型でもよい。非自壊型スペーサー単位は、スペーサー単位の一部または全てが、抗体薬物接合体からのアミノ酸単位Ｙ−Ｚの開裂、例えば酵素開裂後に標的剤に結合したままであるものである。非自壊型スペーサー単位の例は、(グリシン−グリシン)スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位を含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、スペーサー単位(−Ｘ−)は−Ｇｌｙ−である。他の例において、スペーサー単位(−Ｘ−)は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−である。他の例では、スペーサー単位は、２個の間隔が開いた化学的部分を安定な三部分子合わせる共有結合性結合が可能な二官能性化学的部分である。その第一部分への結合が開裂されたら、第二化学的部分からは自然に離れる。例えば、スペーサー単位(−Ｘ)はｐ−アミノベンジルアルコール(ＰＡＢ)であり得る。スペーサー単位(−Ｘ−)はまた、ＰＡＢと電子的に類似する芳香族化合物、例えば２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体(Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタール類でもあり得る。置換および非置換４−アミノ酪酸アミド類(Rodrigues et ah (1995) Chemistry Biology 2:223)、適当に置換されたビシクロ[２.２.１]およびビシクロ[２.２.２]環系(Storm et. al (1972). Amer. Chem. Soc. 94:5815)および２−アミノフェニルプロピオン酸アミド類(Amsberry et. al (1990) Org. Chem. 55:5867)のようなアミド結合加水分解により環化されるスペーサーを使用できる。特に、スペーサーは、次の構造
を有する、ｐ−アミノベンジルを含む。
ここに提供する接合体の具体例において、リンカーＬは、６−マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル(ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ)または４−(３−トシル−２−(トシルメチル)プロパノイル)ベンズアミド−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニルである。
一例において、とりわけここに提供されるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体またはＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体は、標的剤がＭＭＡＦであり、Ｌ−(標的剤)が構造
を有する接合体である。
他の例において、とりわけここに提供されるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体またはＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体は、標的剤がＭＭＡＥであり、Ｌ−(標的剤)が構造
を有する接合体である。
さらなる例において、とりわけここに提供されるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体またはＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体は、標的剤がＭＭＡＥであり、Ｌ−(標的剤)が構造
を有する接合体である。
このような例のいずれにおいても、ｍおよびｑは同じであり、接合体は式Ａｂ−[(Ｌ)−(標的剤)]ｐを有する。例えば、ｐは２〜６であってよく、例えば一般に凡そまたは少なくとも２、３、４、５または６である。最終接合体は、抗体あたり２〜６個、例えば一般に凡そまたは少なくとも２個、３個、４個、５または６個のアウリスタチン(例えばＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ)分子を含む。
ii. 抗ＥＧＦＲ抗体−マイタンシノイド接合体
ここに提供されるのは、マイタンシノイド細胞毒性部分に直接的または間接的に結合したここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかを含む、抗体接合体Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体接合体およびＹ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体接合体ｃである。このような例において、抗体接合体は式(Ａｂ)、(Ｌ)ｑおよび(マイタンシノイド)ｍを有し、ここで、抗体(Ａｂ)はＥＧＦＲに結合する変異体Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体もしくはＹ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ＬはＡｂをマイタンシノイドに結合するリンカーであり、ｍは少なくとも１(例えばｍは１〜８)であり、ｑは、得られた接合体がＥＧＦＲに結合する限り１またはそれ以上(例えば０〜８)である。典型的に、接合体中の成分の配向はＡｂ−[(Ｌ)ｑ−(マイタンシノイド)ｍ]であり、それによりＡｂはマイタンシノイド剤にリンカーを介して結合している。具体例では、得られた接合体が式Ａｂ−[(Ｌ)−(マイタンシノイド)]ｐ(ここで、ｐは２〜６、例えば一般に少なくとも正確にまたは約２、３、４、５または６である)を有するように、ｍおよびｑは同じである。
例において、抗体成分はここに記載するあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。一例において、抗体成分はＹ１０４Ｅ変異体抗体、例えば上記サブセクションＣ.１およびＣ.２に示したいずれかであり得る。特に、ここに提供するマイタンシノイド含有接合体におけるＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号７２に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖または配列番号７２のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖を含むその抗原結合フラグメント(すなわち、配列番号７４に示す)および配列番号８のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖(すなわち、配列番号９に示す)を示す抗体またはそれらと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し、可変重鎖にアミノ酸置換Ｙ１０４Ｅを含む重鎖および／または軽鎖またはその一部を含む抗体またはそのヒト化形態である。例えば、マイタンシノイド含有接合体におけるＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体は、表７、９または表１０のいずれかに示すようなここに提供する変異体Ｙ１０４Ｅ抗体または各重鎖のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および各軽鎖のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントを含む。一例として、マイタンシノイド含有接合体におけるＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号５９に示す重鎖および配列番号１８１に示す軽鎖を含む、Ｅ−ｈと名付けたヒト化Ｙ１０４Ｅ抗体または配列番号５９のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および配列番号１８１のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントを含む。本抗体成分は完全長抗体でも抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントでもよい。
他の例において、抗体成分はＹ１０４Ｄ変異体抗体、例えばサブセクションＣ.３に示したいずれかであり得る。特に、ここに提供するマイタンシノイド含有接合体におけるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の例は、配列番号６７に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖を含む抗体または配列番号６７のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および配列番号８のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントまたはそれらと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示す重鎖および／または軽鎖またはその一部を含み、可変重鎖にアミノ酸置換Ｙ１０４Ｄを含む抗体またはそのヒト化形態である。例えば、ここに提供するマイタンシノイド含有接合体におけるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の例は、表１１に示すいずれかまたは各重鎖のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および各軽鎖のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントである。一例として、マイタンシノイド含有接合体におけるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号５に示す重鎖７および配列番号１８１に示す軽鎖を含むＤ−ｈと名付けたヒト化Ｙ１０４Ｄ抗体または配列番号５７のアミノ酸１〜１１９に対応する可変重鎖および配列番号１８１のアミノ酸１〜１０７に対応する可変軽鎖を含むその抗原結合フラグメントを含む。本抗体成分は完全長抗体でも抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントでもよい。
接合体におけるマイタンシノイドは、サブセクションＣ.４.ａ.ｉに記載するあらゆるものを含む、当分野で知られるあらゆるものであり得る。また、米国特許７,０９７,８４０号；ＥＰ１９２８５０３号も参照のこと。マイタンシノイドは当分野で周知であり、既知技術により合成するか天然源から単離できる。適当なマイタンシノイドは、例えば、米国特許５,２０８,０２０および上記の他の特許および非特許文献に開示されている。特に、マイタンシノイドはマイタンシノールおよびマイタンシノール分子の芳香環または他の位置を修飾されたマイタンシノールアナログ、例えば種々のマイタンシノールエステルである。
マイタンシノイドの例は、次の構造
を有するＤＭ１である。
本構造中、“Ｒ”は、選択したリンカーと化学的結合できる多様な基により占拠され得る。例えば、“Ｒ”はＳＨでもＳＳＲ１(式中、Ｒ１はメチル、直鎖状アルキル、分枝アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリールまたはヘテロ環である)でもよい。典型的に、“Ｒ”は、リンカーとＳ−Ｓ結合を形成するＳＨ基またはその保護誘導体である。例えば、マイタンシノイドＤＭ１を形成するために、マイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基の側鎖を修飾して遊離スルフヒドリル基(ＳＨ)を作製する。このチオール化形態のマイタンシンは修飾抗体と反応して、接合体を形成できる。
このような例のいずれにおいても、リンカーは、サブセクションＣ.４.ｂにおいて上記したあらゆるリンカーであり得る。リンカーは、典型的に二官能性架橋剤であり、抗体は、二官能性架橋剤と抗体の反応により修飾されており、それによりリンカー分子の抗体への共有結合性結合がもたらされる。リンカーの例は、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣｌ)、活性エステル(例えばスベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えばグルタラルデヒド)、ビス−アジド化合物(例えばビス(ｐ−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(例えばビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトルエン２,６−ジイソシアネート)およびビス−活性フッ素化合物(例えば１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン)を含むが、これらに限定されない。例えば、ジスルフィド結合を提供するためのリンカーはＮ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)(Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978])およびＮ−スクシンイミジル−４−(２−ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ)を含み得る。リンカーは切断可能または非切断可能リンカーであり得る。非切断可能リンカーの例は、スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(ＳＭＣＣ)である。
例えば、とりわけここに提供されるＹ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体またはＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体は、標的剤がＤＭ１であり、Ｌ−(標的剤)が構造
を有する接合体である。
このような例において、ｍおよびｑは同じであり、接合体は式Ａｂ−[(Ｌ)−(標的剤)]ｐを有する。例えば、ｐは２〜６であってよく、例えば一般に凡そまたは少なくとも２、３、４、５または６である。最終接合体は、抗体あたり２〜６個、例えば一般に凡そまたは少なくとも２個、３個、４個、５または６個のＤＭ１分子を含む。
Ｄ. 抗ＥＧＦＲ抗体の製造法
１. 抗ＥＧＦＲ抗体の産生および作製
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、標準細胞培養および当分野で知られる他の発現系を使用して発現できる。ここに提供する方法において使用する前に、タンパク質を精製できる。あるいは、全上清または希釈上清をここに使用する方法に使用できる。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、当分野の技術範囲内である組み換えＤＮＡ法により産生できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体をコードするＤＮＡは、慣用法を使用して合成により産生できまたは容易に単離および配列決定できる(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブの使用により)。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を産生または発現することが知られるあらゆる細胞源が、このようなＤＮＡの好ましい源として働き得る。他の例において、修飾抗ＥＧＦＲをコードするＤＮＡの配列が決定されたら、核酸配列を遺伝子合成技術を使用して構築できる。
さらに、突然変異誘発技術も、抗ＥＧＦＲ抗体のさらに修飾形態を産生するために用い得る。ＤＮＡも修飾できる。例えば、遺伝子合成または日常的分子生物学技術を使用して、ヌクレオチドの挿入、欠失、付加または置換を行い得る。例えば、付加的ヌクレオチド配列を核酸配列に連結できる。一例において、抗体遺伝子をベクター、例えば、タンパク質発現ベクターにクローニングする目的で、リンカー配列、例えば制限エンドヌクレアーゼ部位を含む配列を付加できる。さらに、機能的ＤＮＡ要素を特定化する付加的ヌクレオチド配列を核酸分子に動作性に結合できる。このような配列の例は、細胞内タンパク質発現を促進するために設計されたプロモーター配列およびタンパク質分泌を促進するために設計されたリーダーペプチド配列を含むが、これらに限定されない。
ここに提供するアミノ酸配列のいずれも、対応するコード化核酸配列を産生するために当業者により一般的に使用される標準法を使用して逆翻訳でき、これをベクターにクローン化し、発現させてここに提供する抗体およびフラグメントを産生できることは理解される。抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は完全長タンパク質としてまたは完全長未満のタンパク質として発現され得る。例えば、抗体フラグメントが発現され得る。ここに提供する核酸分子およびタンパク質は当業者に知られる任意の方法により製造できる。このような方法は日常的なものであり、当業者に周知である。それらは遺伝子合成、ＰＣＲ、ライゲーション、クローニング、トランスフェクションおよび精製技術を含む日常的分子生物学技術を含む。このような方法を下に記載する。
単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いでこれを宿主細胞にトランスフェクトする。ベクターの選択は所望の適用に依存し得る。例えば、核酸挿入後、ベクターは、典型的に、例えば、複製および／または発現のためのタンパク質遺伝子の増幅のために、宿主細胞の形質転換に使用される。このような例において、高レベル発現に適するベクターを使用する。
抗体の発現のために、一般に、抗体の重鎖をコードする核酸をベクターにクローン化し、抗体の軽鎖をコードする核酸をベクターにクローン化する。遺伝子を、その二重発現のための単ベクターにまたは別々のベクターにクローン化し得る。望むならば、ベクターは、他の抗体形態を産生するために付加的定常領域またはヒンジ領域をコードするさらなる配列も含み得る。ベクターを、宿主細胞にトランスフェクトし、発現させ得る。発現は、当業者に知られるあらゆる細胞発現系においてであり得る。例えば、宿主細胞は、組み換え宿主細胞内で抗体の合成を得るために、こうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない細胞である。例えば、宿主細胞は、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、２９３ＦＳ細胞、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞、ＮＳＯ細胞または他の骨髄腫細胞を含むが、これらに限定されない。他の発現ベクターおよび宿主細胞はここに記載する。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、完全長抗体としてまたは抗原結合フラグメント、例えば、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂヒンジ、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、ｓｃＦｖタンデム、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖヒンジ、ｓｃＦｖヒンジ(ΔＥ)二重特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’フラグメントを含むが、これらに限定されない完全長未満の抗体として産生または発現され得る。抗体フラグメントの産生のための種々の技術が開発されている。例えば、フラグメントは、無傷抗体のタンパク分解性消化に由来し得る(例えば、Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117; Brennan et al. (1985) Science, 229:81参照)。あるいは、フラグメントは、組み換え宿主細胞から直接産生できる。例えば、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体フラグメントは全て宿主細胞、例えば大腸菌中での発現および分泌が可能であり、それによりこれらのフラグメントの大量生産が促進される。Ｆ(ａｂ’)２フラグメントは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントの化学カップリングにより産生でき(Carter et al. (1992) Bio/Technology, 10:163-167)またはそれらは組み換え宿主細胞培養から直接単離され得る。いくつかの例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント(ｓｃＦｖ)である(例えば、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許５,５７１,８９４号および５,５８７,４５８号)。ＦｖおよびｓｃＦｖフラグメントは無傷の結合部位を有するが、定常領域を欠き、それゆえに、インビボ使用の間の非特異的結合を低減するのに適する。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端にエフェクタータンパク質を結合するために構築できる。本抗体フラグメントはまた直鎖状抗体であり得る(例えば、米国特許５,６４１,８７０号参照)。このような直鎖状抗体フラグメントは単一特異性または二重特異性であり得る。抗体フラグメントを産生する他の技術は当業者に知られる。
発現により、抗体重鎖および軽鎖またはそのフラグメントは、鎖間ジスルフィド結合により対形成して、完全長抗体またはそのフラグメントを形成する。例えば、完全長Ｉｇの発現のために、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードする配列を第一発現ベクターにクローン化し、ＶＬ−ＣＬドメインをコードする配列を第二発現ベクターにクローン化し得る。共発現により、完全長重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合により連結して完全長抗体を産生する。他の例において、Ｆａｂを産生するために、ＶＨおよびＣＨ１領域を含むフラグメントをコードする配列を第一発現ベクターにクローン化し、ＶＬ−ＣＬドメインをコードする配列を第二発現ベクターにクローン化し得る。共発現により、重鎖は軽鎖と対形成して、Ｆａｂ単量体を産生する。
全抗体および抗体フラグメントの発現のためにベクターに挿入できる配列の例は、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかの対応する重鎖または軽鎖またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、ここに記載する抗体またはフラグメントのいずれかの可変重鎖および可変軽鎖配列のいずれかをコードするヌクレオチド配列を、ここに記載するまたは当業者に知られる適当な発現ベクターに挿入できる。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびＥＧＦＲ結合フラグメントのアミノ酸配列のいずれかを、標準法を使用して逆翻訳(戻し翻訳ともいう)して、該タンパク質をコードする核酸配列、例えばＤＮＡ配列を産生できる。例えば、bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html; biophp.org/minitools/protein_to_dna/demo.php; vivo.colostate.edu/molkit/rtranslate/; ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/; molbiol.ru/eng/scripts/01_19.html; and geneinfinity.org/sms/sms_backtranslation.htmlのようなタンパク質配列をコード化ＤＮＡ配列に変換するために数種のオンラインツールが利用可能である。このような逆翻訳配列を、提供する抗体またはフラグメントの発現および産生のために、ここに提供する発現ベクターのいずれかに挿入できる。
特に、１０４Ｅアミノ酸置換を有する修飾抗ＥＧＦＲ抗体をコードするヌクレオチドの配列は、配列番号７３に示す可変重鎖をコードするヌクレオチドの配列および配列番号５１に示す可変軽鎖をコードするヌクレオチドの配列を有する。適当な発現ベクターに挿入できる、可変重鎖および軽鎖をコードする核酸配列の他の非限定的例は表１０に示し、配列番号６０、６２、１３０、１３２、１３６、１３８、１４２、１４４、１４８、１５０、２１０、２１２、２１６、２１８、２２２、２２４、２２８、２３０、２３４、２３６、２４０、２４２、２４６、２４８に示すヌクレオチド配列およびそのあらゆる縮重配列を有する可変重鎖および配列番号１５４、１５７、１６１、１６４、１６８、１７１、１７５、１７８、１８２、１８５、１８９、１９２、１９６、１９９、２０３、２０６、２５２、２５５、２５９、２６２、２６６、２６９、２７３、２７６、２８０、２８３、２８７、２９０、２９４、２９７、３０１、３０４に示すヌクレオチド配列およびそのあらゆる縮重配列を有する可変軽鎖をコードするものを含む。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現に関するここでの目的のために、ベクターは、抗体の可変領域をコードする核酸配列と動作可能に結合した抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ベクターは、ＣＨ１、ＣＨ２、ヒンジ、ＣＨ３またはＣＨ４および／またはＣＬの１個または全てのための配列を含み得る。一般に、例えばＦａｂｓの発現のために、ベクターはＣＨ１またはＣＬ(カッパまたはラムダ軽鎖)の配列を含む。定常領域またはヒンジ領域の配列は当業者に知られる(例えば、米国公開出願２００８０２４８０２８号参照)。このような配列の例をここに提供する。
ＩｇＧ抗体またはそのフラグメントの発現のために、重鎖または軽鎖の定常領域の全てまたは一部も、ベクターに挿入できまたは含まれ得る。例えば、非限定的例は、配列番号５８、７１、１２８、１３４、１４０、１４６、２０８、２１４、２２０、２２６、２３２、２３８、２４４に示すヌクレオチド配列およびそのあらゆる縮重配列を有する完全長重鎖および配列番号５０、１５２、１５９、１６６、１７３、１８０、１８７、１９４、２０１、２５０、２５７、２６４、２７１、２７８、２８５、２９２、２９９に示すヌクレオチド配列またはその縮重配列を有する可変軽鎖をコードするものを含む。
さらに、Ｆａｂ分子の発現のために、ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬ配列を適当な発現ベクターに挿入し得る。抗体の可変重鎖および可変軽鎖ドメインをコードする核酸を、適当な発現ベクター、例えば一本鎖抗体を産生するために可変重鎖と可変軽鎖の間のリンカーをコードするベクターで発現できる。リンカーの例はグリシン富可動性リンカー(−Ｇ４Ｓ−)ｎ(ここで、ｎは正の整数、例えば１(配列番号３４６)、２(配列番号３４７)、３(配列番号４６)、４(配列番号３４８)、５(配列番号３４９)またはそれ以上である)を含む。
ａ. ベクター
ベクターの選択は所望の適用に依存し得る。抗ＥＧＦＲ抗体またはその一部、例えば抗原結合フラグメントの発現のために多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に知られる。発現ベクターの選択は宿主発現系の選択に影響を受ける。このような選択は十分に当業者の技術レベルの範囲内である。一般に、発現ベクターは、転写プロモーターおよび所望によりエンハンサー、翻訳シグナルならびに転写および翻訳停止シグナルを含み得る。安定な形質転換に使用される発現ベクターは、典型的に形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択可能マーカーを有する。ある場合には、複製起点を使用して、細胞内のベクターのコピー数を増幅できる。ベクターはまた一般に連結核酸分子(例えば、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ)に動作可能に結合した付加的ヌクレオチド配列を含み得る。抗体での適用のために、ベクターは、一般に定常領域をコードする配列を含む。それゆえに、抗体またはその一部はタンパク質融合体として発現され得る。例えば、融合タンパク質は、ポリペプチドに付加的機能性を追加するために産生できる。融合タンパク質の例は、シグナル配列、局在化のためのようなエピトープタグ、例えば、Ｈｉｓ６タグまたはｍｙｃタグまたは精製用タグ、例えばＧＳＴタグおよび／またはタンパク質分泌および／または膜結合を支持する配列の融合を含むが、これらに限定されない。
例えば、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現は、当分野で知られるあらゆるプロモーター／エンハンサーにより制御できる。適当な細菌プロモーターは当分野で周知であり、下に記載する。哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞用の他の適当なプロモーターは当分野で周知であり、いくつかを下に例示する。異種核酸の発現を指示するために使用するプロモーターの選択は特定の適用による。使用できるプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981))、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982))を含む真核発現ベクター；原核発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター(Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543)またはｔａｃプロモーター(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983))；(Scientific American 242:74-94 (1980))の“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”も参照のこと)；ノパリンシンセターゼプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1983))またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター(Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981))および光合成酵素リブロース二リン酸脱炭酸酵素のプロモーター(Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984))を含む植物発現ベクター；酵母および他の真菌由来のプロモーター要素、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターおよび組織特異性を示し、トランスジェニック動物で使用されている次の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域(wift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987))；膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985))、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987))、精巣、乳、リンパ系および肥満細胞で活性なマウス乳腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al., Cell 45:485-495 (1986))、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987))、肝臓で活性なアルファ−フェトタンパク質遺伝子制御領域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987))、肝臓で活性なアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987))、骨髄球性細胞で活性なベータグロビン遺伝子制御領域(Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986))、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域(Shani, Nature 314:283-286 (1985))および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))を含むが、これらに限定されない。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的に宿主細胞における抗体またはその一部の発現に必要な付加的要素全てを含む転写単位または発現カセットを含む。典型的発現カセットは、本タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に結合したプロモーターおよび転写物の効率的ポリアデニル化、リボソーム結合部位および翻訳停止に必要なシグナルを含む。カセットの付加的要素はエンハンサーを含み得る。さらに、カセットは、典型的に効率的に停止させるために構造的遺伝子の下流に転写停止領域を含む。停止領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ても、異なる遺伝子から得てもよい。
ある発現系は、チミジンキナーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼのような遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの下、タンパク質をコードする核酸配列と共に昆虫細胞内でバキュロウイルスベクターを使用するような、遺伝子増幅に関与しない高収率発現系も適当である。
発現ベクターの例は、例えば、ｐＣＭＶおよびｐＣＤＮＡ３.１のようなあらゆる哺乳動物発現ベクターを含む。他の真核ベクター、例えば真核ウイルス由来の制御要素を含むいずれも、真核発現ベクターとして使用できる。これらは、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルスに由来するベクターを含む。真核ベクターの例は、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴ０１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＣＥおよびＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドロンプロモーターまたは真核生物での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示の下にタンパク質を発現させるあらゆる他のベクターを含む。細菌発現のために、このようなベクターはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄおよび融合ベクター、例えばＭＢＰ、ＧＳＴおよびＬａｃＺを含む。
ベクターにＤＮＡフラグメントを挿入するための当業者に知られるあらゆる方法を使用して、タンパク質または抗体鎖をコードする核酸を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法は、インビトロ組み換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組み換えを含む(遺伝的組換え)。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補付着末端を有するクローニングベクターへのＤＮＡフラグメントの連結により達成できる。ＤＮＡの断片化に使用する相補制限部位がクローニングベクターに存在しないならば、ＤＮＡ分子の末端を酵素修飾できる。あるいは、あらゆる所望の部位をＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列(リンカー)を連結することにより産生でき、これらの連結リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成された核酸を含む。
一例において、抗体の重鎖をコードする核酸を第一発現ベクターにライゲートし、抗体の軽鎖をコードする核酸を第二発現ベクターにライゲートする。発現ベクターは同一でも異なってもよいが、一般に重鎖と軽鎖の同等なタンパク質発現を可能にするために十分に適合性である。第一および第二発現ベクターを、一般に、典型的１：１比で宿主細胞に共トランスフェクトする。ベクターの例は、ｐγ１ＨＣおよびｐκＬＣ(Tiller et al. (2008) J Immunol. Methods, 329:112-24)を含むが、これらに限定されない。他の発現ベクターは軽鎖発現ベクターｐＡＧ４６２２および重鎖発現ベクターｐＡＨ４６０４を含む(Coloma et al. (1992) J Immunol. Methods, 152:89-104)。ｐＡＧ４６２２ベクターは、ヒトκ Ｌ鎖のＣ−領域ドメインをコードするゲノム配列およびｇｐｔ選択可能マーカーを含む。ｐＡＨ４６０４ベクターはｈｉｓＤ選択可能マーカーおよびヒトＨ鎖γ１ Ｃ−領域ドメインをコードする配列を含む。他の例において、重鎖と軽鎖を、重鎖および軽鎖の両者のための発現カセットを有する単ベクターにクローン化できる。
いくつかの例において、ベクターは、重鎖および軽鎖をコードするオープンリーディングフレームの間に内部リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)を含むバイシストロニックベクターである。例えば、ベクターの例は、ｐｃＤＮＡ３−アービタックス−ＬＣ−ＩＲＥＳ−ＨＣ−ＷＴ(例えば、配列番号３０６)と名づけたベクターであり、ここでここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかの重鎖(ＨＣ)または軽鎖(ＬＣ)をコードする核酸が、その中の配列と置き換えられ得る。このようなベクターの例は配列番号３０７〜３１４のいずれかに示す。
ｂ. 細胞および発現系
一般に、異種ＤＮＡを発現するように操作でき、分泌経路を有するあらゆる細胞型が、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現に適する。発現宿主は、細菌細胞(例えば、大腸菌)、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞およびヒト細胞を含む動物細胞のような原核生物および真核生物を含む。発現宿主は、タンパク質産生レベルならびに発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾タイプが異なる。さらに、発現宿主の選択は、しばしば使用するベクターならびに転写要素および翻訳要素の選択と関連する。例えば、発現宿主の選択は、常にではないが、しばしば、使用する前駆体配列の選択による。例えば、多くの異種シグナル配列は、同じ種の宿主細胞でしか発現され得ない(すなわち、昆虫細胞シグナル配列は昆虫細胞で最適に発現される)。対照的に、例えば、酵母で十分作用するヒト血清アルブミン(ｈＨＳＡ)シグナル配列、昆虫または哺乳動物宿主細胞および昆虫および哺乳動物細胞で機能することが証明されている組織プラスミノーゲンアクティベータープレ／プロ配列のような、他のシグナル配列を、異種宿主で使用できる(Tan et al., (2002) Protein Eng. 15:337)。発現宿主の選択は、これらおよび他の因子、例えば制御および安全性懸念、製造費ならびに精製の必要性と方法に基づきなし得る。それゆえに、ベクター系は使用する宿主細胞と適合性でなければならない。
真核宿主での発現は、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリス、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ細胞および鱗翅目細胞、植物および植物細胞、例えばタバコ、トウモロコシ、稲、藻類およびアオウキクサ属での発現を含み得る。発現用の真核細胞は哺乳動物細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞またはベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)細胞を含む。真核発現宿主はトランスジェニック動物も含み、例えば、血清、乳および卵への産生を含む。
組み換え分子を、遺伝子配列の多くのコピーが産生されるように、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションを経て、宿主細胞に導入できる。一般に、標準トランスフェクション法を使用して、大量の抗体鎖を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株を産生し、これを次いで標準技術を使用して精製する(例えば、Colley et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:17619-17622; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed.), 1990参照)。真核細胞および原核細胞の形質転換は標準技術に従い実施する(例えば、Morrison (1977) J. Bact. 132:349-351; Clark-Curtiss and Curtiss (1983) Methods in Enzymology, 101, 347-362参照)。例えば、外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する周知の方法のいずれかを使用できる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクターおよびクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子物質を宿主細胞に導入するための他の周知法のいずれかの使用を含む。一般に、抗体を発現する目的で、宿主細胞を、少なくともＶＨ鎖をコードする第一ベクターおよび少なくともＶＬ鎖をコードする第二ベクターでトランスフェクトする。それゆえに、抗体ポリペプチドまたはその修飾形態を発現できる宿主細胞に少なくとも両遺伝子を成功裏に導入できる特定の遺伝子操作法を使用することのみが必要である。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、抗体をコードする核酸分子の宿主細胞または宿主動物への導入と、組み換えた抗体をコードする核酸分子のインビトロでの発現のような、インビトロおよびインビボ法を含む、タンパク質産生について当分野で知られるあらゆる方法により産生できる。原核生物、特に大腸菌は、大量の再集合した抗体またはその一部を産生するための系を提供し、タンパク質の発現および精製の適用において特に望まれる。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の単純かつ迅速な技術である。ハイスループット発現のための大腸菌宿主株は、ＢＬ２１(EMD Biosciences)およびＬＭＧ１９４(ATCC)を含むが、これらに限定されない。このような大腸菌宿主株の特定の例はＢＬ２１である。ハイスループット発現のためのベクターは、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣベクターを含むが、これらに限定されない。
ｉ. 原核発現
原核生物、特に大腸菌は、大量の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその一部を産生するための系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の単純かつ迅速な技術である。大腸菌のための発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現を導入し、宿主細胞にある毒性を示す抗体の発現に有用な誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターの例は、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターおよび温度制御λＰＬプロモーターを含む。
抗体またはその一部は、大腸菌の細胞質環境で発現できる。細胞質は還元性環境であり、ある抗体においては、これは不溶性封入体の形成を起こし得る。還元剤、例えばジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールおよび変性剤(例えば、例えばグアニジン−ＨＣｌおよび尿素)を使用して、該抗体を再可溶性化できる。別の方法の例は、可溶性タンパク質の産生を導く、酸化環境ならびにシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供する細菌の細胞膜周辺腔における組み換えた抗体またはそのフラグメントの発現である。典型的に、リーダー配列を、発現させるタンパク質と誘導し、これはタンパク質を周辺質に指向させる。次いで、リーダーを周辺質内でシグナルペプチダーゼにより除去する。発現したタンパク質を周辺質に移動させる経路の例は、Ｓｅｃ経路、ＳＲＰ経路およびＴＡＴ経路である。周辺質ターゲティングリーダー配列の例は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子からのｐｅｌＢリーダー、ＳｔIIリーダー配列およびＤｓｂリーダー配列を含む。ある場合には、周辺質発現は、発現されたタンパク質の培養培地への漏出を可能にする。抗体の分泌は、培養上清からの迅速かつ単純な精製を可能にする。分泌されない抗体は、浸透圧性溶解により周辺質から得ることができる。細胞質発現に類似して、ある場合にはタンパク質は、不溶性となることがあり、変性剤および還元剤を使用して可溶化および再折りたたみを標準法を使用して促進できる。誘導および増殖の温度も発現レベルおよび溶解度に影響し得る。典型的に、２５℃〜３７℃の温度を使用する。発現したタンパク質の溶解度を上げるために、変異も使用できる。典型的に、細菌は無グリコシル化タンパク質を産生する。それゆえに、宿主細胞から精製後、インビトロでグリコシル化を追加できる。
ii. 酵母
酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウイア・リポリティカ、クルイベロミセス・ラクチスおよびピキア・パストリスは、組み換えた抗体またはその一部の有用な発現宿主である。酵母を、エピソーム複製型ベクターでまたは相同組換えによる安定な染色体組込みにより形質転換できる。典型的に、誘導性プロモーターを遺伝子発現の制御に使用する。このようなプロモーターの例は、ＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５およびメタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１を含む。発現ベクターは、しばしば、形質転換ＤＮＡの選択および維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３のような選択可能マーカーを含む。酵母で発現したタンパク質はしばしば可溶性である。シャペロニン、例えばＢｉＰおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現は、発現レベルおよび溶解度を改善し得る。さらに、酵母で発現したタンパク質は、分泌シグナルペプチド融合、例えばサッカロマイセス・セレビシエからの酵母接合タイプアルファ−因子分泌シグナルおよびＡｇａ２ｐ接合接着受容体またはアークスラ・アデニニボランス・グルコアミラーゼのような酵母細胞表面タンパク質との融合体を使用して、分泌を指示できる。Ｋｅｘ−２プロテアーゼのためのようなプロテアーゼ開裂部位を、分泌経路から出たら、発現されたポリペプチドから融合配列を除去するように操作できる。酵母はまたＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化できる。
iii. 昆虫
特にバキュロウイルス発現を使用する、昆虫細胞は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその一部の発現に有用である。昆虫細胞は高レベルのタンパク質を発現し、高級真核生物で使用される翻訳後修飾の大部分が可能である。バキュロウイルスは、真核発現の安全性を改善し、制御懸念を低減できる、拘束性の宿主範囲を有する。典型的発現ベクターは、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターおよびｐ１０プロモーターのような高レベル発現のためのプロモーターを使用する。一般的に使用されるバキュロウイルス系は、バキュロウイルス、例えばオートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)およびボンビクス・モリ核多核体病ウイルス(ＢｍＮＰＶ)およびスポドプテラ・フルギペルダに由来するＳｆ９およびトリコプルシア・ニに由来するＴＮのような昆虫細胞株を含む。高レベル発現のために、発現させる分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンの直ぐ下流に融合できる。ヒト抗体を発現できるバキュロウイルス組み換え体を産生するために、デュアル発現トランスファー、例えばｐＡｃＵＷ５１(PharMingen)を利用する。哺乳動物分泌シグナルは昆虫細胞で正確に処理され、培養培地に発現されたタンパク質を分泌するのに使用できる。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の発現のための昆虫細胞における別の発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。スポドプテラ・フルギペルダからのＳｆ９由来細胞およびトリコプルシア・ニからのＴＮ由来細胞のような細胞株を発現のために使用できる。バキュロウイルス最初期遺伝子プロモーターＩＥ１を使用して、一貫性のあるレベルの発現を誘発できる。典型的発現ベクターは、ｐＩＥ１−３およびｐＩ３１−４トランスファーベクター(Novagen)を含む。発現ベクターは、典型的にネオマイシンおよびハイグロマイシンのような選択可能マーカーの使用により維持される。
iv. 哺乳動物細胞
哺乳動物発現系を使用して、その抗原結合フラグメントを含む、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を発現できる。発現構築物を、アデノウイルスのようなウイルス感染によりまたはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランおよびエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような物理的手段の使用によるような直接ＤＮＡ導入により、哺乳動物細胞に導入できる。哺乳動物細胞のための発現ベクターは、典型的にｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列(コザックコンセンサス配列)およびポリアデニル化要素を含む。このようなベクターは、しばしば、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列(ＲＳＶ)のような、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサーを含む。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型で活性である。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域も発現に使用できる。プロモーター／エンハンサー領域の例は、遺伝子、例えばエラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳腫瘍ウイルス、アルブミン、アルファフェトタンパク質、アルファ１抗トリプシン、ベータグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２およびゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御を含むが、これらに限定されない。
選択可能マーカーを使用して、発現構築物を有する細胞を選択および維持できる。選択可能マーカー遺伝子の例は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、ＮＥＯＲ／Ｇ４１８系、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)系またはグルタミンシンテターゼ(ＧＳ)系を使用して産生できる。ＧＳ系は、重鎖および軽鎖の両者を発現するために、共同発現ベクター、例えばｐＥＥ１２／ｐＥＥ６を使用する。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γのような細胞表面シグナル伝達分子との融合は、細胞表面上への活性状態のタンパク質の発現を指示できる。
多くの細胞株が哺乳動物発現に利用可能であり、マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む。細胞株の例は、例えば、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０(非分泌型)および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞のような、当分野で知られるまたはここに記載するあらゆるものを含む。細胞培養培地から分泌タンパク質の精製を促進する無血清培地に適合させた細胞株も利用可能である。このような例は、無血清ＥＢＮＡ−１細胞株である(Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.)
ｖ. 植物
トランスジェニック植物細胞および植物を、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその一部の発現にしようできる。発現構築物を、典型的に微粒子銃およびプロトプラストへのＰＥＧ介在導入のような直接ＤＮＡ導入を使用しておよびアグロバクテリウム介在形質転換を用いて植物に導入する。発現ベクターはプロモーターおよびエンハンサー配列、転写停止要素および翻訳制御要素を含む。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常双子葉類宿主、例えばシロイヌナズナおよびタバコならびに単子葉類宿主、例えばトウモロコシおよび稲で違う。発現に使用する植物プロモーターの例は、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターおよびメイズユビキチン−１(ｕｂｉ−１)プロモーターを含む。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼのような選択可能マーカーをしばしば使用して、形質転換細胞の選択および維持を促進する。形質転換植物細胞は、細胞、凝集物(カルス組織)として培養で維持できるかまたは全植物に再生される。トランスジェニック植物細胞はまた、プロテアーゼまたは修飾プロテアーゼを産生するように操作された藻類を含む(例えば、Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442参照)。植物が哺乳動物細胞と異なるグリコシル化パターンを有するため、これがこれらの宿主で産生されたタンパク質の選択に影響し得る。
２. 精製
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗原結合その一部を、当業者に氏ら得るまたはここに記載するあらゆる方法で精製できる。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ・フラクションおよびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはカラムクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない当分野で知られる標準タンパク質精製技術を使用して、相当な純度まで精製できる。例えば、抗体をカラムクロマトグラフィーで精製できる。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を精製する方法例は、固体支持カラム材が、ストレプトコッカス属由来の細胞表面関連タンパク質であるプロテインＧに結合し、これが免疫グロブリンに高親和性で結合する、カラムクロマトグラフィーである。いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、固体支持カラム材が、スタフィロコッカス属由来の細胞表面関連タンパク質であるプロテインＡに結合し、これが免疫グロブリン、例えばＩｇＧ抗体に高親和性で結合する、カラムクロマトグラフィーにより精製できる(例えば、Liu et al. (2010)MAbs 2(5):480-499参照)。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の精製に使用できる他の免疫グロブリン結合細菌タンパク質は、プロテインＡおよびプロテインＧのＩｇＧ結合ドメインを組み合わせた組み換え融合タンパク質であるプロテインＡ／Ｇおよびペプトストレプトコッカス属由来の表面タンパク質であるプロテインＬである(Bjorck (1988) J. Immunol., 140(4):1194-1197; Kastern, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267(18):12820-12825; Eliasson et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:4323-4327)。
抗ＥＧＦＲ抗体は、６０％、７０％、８０％純度、典型的に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％純度まで精製できる。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色のような標準法で評価できる。
宿主細胞から抗体またはその一部を含む抗ＥＧＦＲ抗体を精製する方法は、選択した宿主細胞および発現系に依存する。分泌分子について、タンパク質は一般に細胞から除去後培養培地から精製される。細胞内発現について、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製できる。トランスジェニック植物および動物のようなトランスジェニック生物を発現に使用するとき、組織または臓器を出発物質として使用して、溶解細胞抽出物を製造できる。さらに、トランスジェニック動物産生は、乳または卵へのポリペプチドの産生を行い得て、これを回収し、必要であれば、当分野の標準法を使用してさらに該タンパク質を抽出し、精製できる。
タンパク質が形質転換細菌により大量に発現されたとき(典型的にプロモーター誘導後であるが、発現は構成的であってよい)、ポリペプチドは不溶性凝集物を形成し得る。当業者に知られるポリペプチド封入体の精製に適するいくつかのプロトコールがある。多くの変法が当業者には明らかである。
Ｅ. 抗ＥＧＦＲ抗体特性および活性の同定および評価のための方法
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体および変異体およびそのフラグメントを、ＥＧＦＲ抗原(例えば、ヒトＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントへの結合について評価できる。結合活性は、抗体の活性を低ｐＨ／高乳酸濃度および中性ｐＨ／生理学的乳酸濃度の条件下を比較する、条件下で評価できる。例えば、結合活性を酸性ｐＨ(例えば、ｐＨ５.８〜６.５、例えばｐＨ６.０〜６.５)および／または高乳酸濃度(例えば、１０〜２０mM、例えば１５〜２０mM)の条件下で評価し、中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.０〜７.６、例えばｐＨ７.０〜７.４)および／または生理学的乳酸濃度(例えば、０.５〜５mM、例えば約１mM)の条件下の結合活性と比較できる。このようなアッセイは、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、酸ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および／または１５mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下で結合活性が高いことを確認し得る。
アッセイはまた生理学的濃度のタンパク質または血清(例えば、１０mg／mL〜５０mg／mLタンパク質、例えば血清アルブミン；または２０〜５０％ヒト血清のような血清)の存在下で実施できる。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、典型的に２０〜５０％血清(vol/vol)または１０〜５０mg／mLタンパク質(例えば、血清アルブミン)および約５.８〜６.８の酸性ｐＨおよび／または１０mM〜２０mMの高乳酸レベルを含む第一セットの条件下、活性を評価する。例えば、第一セットの条件は、少なくとも２５％血清(vol/vol)または１２〜４０mg／mLタンパク質(例えば、血清アルブミン)および約６.０〜６.５の酸性ｐＨ、例えばｐＨ６.０および／または１５mM〜２０mMの高乳酸レベル、例えば約１６.７mMを含み得る。本抗ＥＧＦＲ抗体をまた、２０〜５０％血清(vol/vol)または１０〜５０mg／mLタンパク質(例えば、血清アルブミン)および約７.０〜７.４のほぼ中性ｐＨまたは中性ｐＨおよび／または０.５〜５mMの乳酸濃度を含む、第二セットの条件下で評価し得る。例えば、第二セットの条件は、少なくとも２５％血清(vol/vol)または１２〜４０mg／mLタンパク質(例えば、血清アルブミン)および約７.２〜７.４のｐＨ、例えば約ｐＨ７.４および／または０.５mM〜２mMの乳酸濃度、例えば１mMを含む。いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体はまた少なくとも２５％血清(vol/vol)または１２〜４０mg／mLタンパク質(例えば、血清アルブミン)および約６.０〜６.５の酸性ｐＨ、例えばｐＨ６.５および／または１５mM〜２０mMの高乳酸レベル、例えば約１６.７mMを含み得る第三セットの条件下、活性を評価し得る。このようなアッセイにおいて、生理的環境を模倣するために添加するタンパク質(例えば、血清タンパク質)の両は全ての試験条件セットで典型的に同じまたは実質的に同じであるが、互いに±２５％またはそれ未満の変動はあり得る。
それゆえに、結合活性は、生理的環境を模倣する条件または生理的環境である条件で決定できる。結合をインビトロ(例えば、免疫アッセイで)またはエクスビボまたはインビボで(例えば、腫瘍細胞または非腫瘍細胞、例えば真皮の細胞への結合)評価できる。ここに提供するアッセイは、異なるｐＨおよび／または乳酸濃度、および、所望により、生理学的濃度の総タンパク質の存在下で、検出可能なまたは他に測定可能な方法で、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を試験または評価できるあらゆるアッセイを含む。ここに提供するアッセイは、多数の抗ＥＧＦＲ抗体、例えばタンパク質変異体の活性を、一度にデュアル形式で測定するために、ハイスループット形式で開発できる。例えば、インビトロ結合アッセイを、固体支持結合アッセイまたは溶液結合アッセイを使用して実施でき、ここで、結合を上記条件下で行う。他の例において、結合アッセイをインビボで実施でき、ここで、結合を、腫瘍に存在する細胞と非腫瘍細胞に存在する細胞で比較する。特に、インビボ結合アッセイを、投与抗体の基底皮膚ケラチン生成細胞に対する腫瘍細胞への結合または局在化の評価のために実施できる。異種移植または皮膚移植モデルを使用して、これを本明細書で例示する。他のモデルも使用できる。アッセイ例を下に記載する。
結合活性に加えて、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を評価する他のアッセイを実施でき、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性および／または副作用を測定するための機能アッセイ、インビボアッセイ、動物モデルおよび臨床的アッセイを含むが、これらに限定されないインビトロまたはインビボアッセイを含む。評価した活性は、ＥＧＦＲへの結合、細胞増殖阻害(ＣＧＩ)活性または腫瘍増殖阻害活性のような抗ＥＧＦＲ抗体のあらゆる活性であり得る。ここに提供する抗体のいずれも、例えば、治療有効性、ＥＧＦＲへの親和性、毒性、副作用、薬物動態および薬力学のような、臨床的特性を評価するために当業者に知られる多種多様なアッセイによっても特徴付けできる。
１. 結合アッセイ
修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、当業者に知られるあらゆる方法によりＥＧＦＲに結合する能力をアッセイできる。アッセイの例を下に記載する。
結合アッセイを溶液、懸濁液または固体支持上で実施できる。例えば、ＥＧＦＲまたはその可溶性フラグメントを固体支持(例えば、炭素または可塑性表面、組織培養皿またはチップ)に固定化し、抗体と接触させる。未結合抗体または標的タンパク質を洗い流すことができ、その後結合複合体を検出できる。結合アッセイを、高イオン強度(例えば、０.３〜０.４Ｍ ＮａＣｌ)および／または非イオン性界面活性剤(例えば、０.１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｗｅｅｎ ２０)を含む緩衝液および／またはブロッキングタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミンまたはゼラチン)によるような、非特異的結合を低減させた条件下で実施できる。陰性対照も、バックグラウンド結合の測定値としてこのようなアッセイにおいて包含させ得る。結合親和性を、定量的ＥＬＩＳＡ、スキャッチャード解析(Munson et al., (1980) Anal. Biochem., 107:220)、表面プラズモン共鳴、等温熱量測定または当業者に知られる他の方法を使用して決定できる(例えば、Liliomet al. (1991) J. Immunol Methods. 143(1):119-25)。
このようなアッセイを、例えば、溶液中(例えば、Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421)、ビーズ上(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ上(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌上(米国特許５,２２３,４０９号)、胞子上(米国特許５,５７１,６９８号；５,４０３,４８４号および５,２２３,４０９号)、プラスミド上(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)またはファージ上(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; and Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310)で実施できる。
典型的に、ＥＧＦＲ結合を、活性レベルが評価できるような定量的であり得る方法で決定する。例えば、定量化の方法は、分光光度法、蛍光および放射性方法を含むが、これらに限定されない。このような方法は、例えば、比色シグナル、化学発光シグナル、化学蛍光シグナルまたは放射性シグナルを測定する。
いくつかの例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、ＥＧＦＲ結合活性の検出および決定を促進するために、検出可能部分またはタグで標識できる。当業者は、記載するまたは当分野で知られるアッセイにおいて使用するための適切な検出可能部分またはタグを選択できる。検出または同定され得るあらゆる検出可能部分(すなわち、当業者に知られるタグまたは他の部分)を、試験する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはフラグメントに直接的または間接的に、例えばリンカーを使用して結合できる。結合は治療用抗体のＮ末端またはＣ末端であり得る。タグおよび部分の例を表１３に示す。
ここに記載する治療用抗体に検出可能部分を結合できる、当業者に知られるあらゆるリンカーを使用できる。リンカーの例は、グリシン富可動性リンカー(−Ｇ４Ｓ−)ｎ(ここで、ｎは正の整数、例えば１(配列番号３４６)、２(配列番号３４７)、３(配列番号４６)、４(配列番号３４８)、５(配列番号３４９)またはそれ以上である)を含む。
結合アッセイを、溶液中、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を固体支持に結合してまたはＥＧＦＲを固体支持に結合して実施できる。表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、免疫アッセイ、免疫蛍光または免疫組織化学を使用する組織への結合、溶液結合アッセイおよび細胞ベースの結合アッセイ(例えば、下記ＥＧＦＲ発現細胞のいずれかを使用)を含むが、これらに限定されない当業者に知られるあらゆる固体支持結合アッセイが、ここに提供する抗体の活性の試験について意図される。
免疫アッセイは、ウェスタンブロットまたは免疫ブロット、例えば定量的ウェスタンブロット；放射免疫アッセイ；ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定法)；メソスケールディスカバリー(ＭＳＤ、Gaithersburg, Maryland)；“サンドイッチ”免疫アッセイ；免疫沈殿アッセイ；ＥＬＩＳＰＯＴ；沈降素反応；ゲル拡散沈降素反応；免疫拡散アッセイ；凝集アッセイ；補体固定化アッセイ；免疫放射測定アッセイ；蛍光免疫アッセイ；プロテインＡ免疫アッセイ；免疫組織化学；免疫電子顕微鏡法またはリポソーム免疫アッセイ(ＬＩＡ)を含むが、これらに限定されない技術を使用する、競合的および非競合的アッセイ系を含む。このようなアッセイは当分野で日常的であり、周知である(例えば、Ausubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York参照)。
いくつかの例において、免疫組織化学および／または免疫蛍光を使用して、エクスビボで、動物モデルでＥＧＦＲ結合を評価できる。例えば、齧歯類または他の動物モデルでの異種移植腫瘍への抗体結合を分析できる。他の例において、免疫組織化学を使用して、皮膚、例えば霊長類皮膚への修飾抗ＥＧＦＲ抗体結合を評価できる。他の例において、免疫組織化学を使用して、異種移植腫瘍および霊長類皮膚移植片への結合を、エクスビボで、例えば視覚的にまたは定量的的に抗体の結合優先度を比較し、試験抗体が選択的または条件付結合インビボを示すか否かを評価できる(例えば、実施例１１〜１３参照)。
他の例において、異種移植腫瘍または皮膚移植片を含む動物モデル、例えばここに記載する動物モデルに、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、例えば全身投与により投与し、インビボで修飾抗ＥＧＦＲ抗体の結合を評価できる。このような例において、組織を、特定の時点で採取し、上記のように免疫組織化学または免疫蛍光で結合をエクスビボで評価し得る。他の例において、投与する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、皮膚を通して蛍光を発光できるフルオロフォア、例えば赤外フルオロフォア(例えば、DyLight７５５)と接合する。このような例において、抗ＥＧＦＲ抗体結合を、IVIS Caliper造影系のような蛍光造影系を使用してインビボで視覚化でき、異種移植腫瘍および／または霊長類皮膚移植片への抗体結合を評価できる(例えば、実施例１３参照)。その後組織をエクスビボでの確認的免疫組織化学的解析のために採取できる。
当業者に知られるあらゆる溶液結合アッセイを含む溶液結合アッセイを、結合活性の評価に使用でき、平衡透析、競合的結合アッセイ(例えば、Myers et al., (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、放射標識結合アッセイ(例えば、Feau et al., (2009) J. Biomol. Screen. 14(1):43-48)、等温滴定熱量計(ＩＴＣ)および示差走査熱量測定を含む熱量測定(例えば、Alvarenga et al. (2012) Anal. Biochem 421(1):138-151, Perozzo et al., (2004) J. Recept Signal. Transduct Res. 24(1-2):1-52; Holdgate (2001) Biotechniques 31(1):164-166, 168, 170, Celej et al. (2006) Anal. Biochem. 350(2):277-284)および蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)アッセイを含むスペクトル蛍光アッセイ(Wu et al. (2007), J. Pharm. Biomed. Anal. 44(3):796-801)を含む。結合アッセイのための条件は、固体支持上で実施する結合アッセイについて上に記載した条件から応用できる。
抗体結合の測定のために選択した定量的アッセイによって、絶対的結合を、例えば濃度測定または分光光度測定からの、例えば、光学密度(ＯＤ)；例えば蛍光測定からの任意蛍光単位(ＡＦＵ)；または例えば化学発光測定からのルーメンの観点で表し得る。いくつかの例において、絶対的結合シグナルを抗体タンパク質濃度で除して比活性を計算する。いくつかの例において、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の特異的活性を対照抗体、例えば非修飾抗ＥＧＦＲ親抗体、例えば野生型セツキシマブの特異的活性で除すことにより比活性を標準化して、各修飾抗ＥＧＦＲ抗体について、標準化比活性(ＮＳＡ)を得る。
結合活性をまた、結合(ｋａまたはｋｏｎ)および／または解離(ｋｄまたはｋｏｆｆ)速度、半数効果濃度(ＥＣ５０)値および／または熱力学データ(例えば、ギブズ自由エネルギー(ΔＧ)、エンタルピー(ΔＨ)、エントロピー(−ＴΔＳ))を測定するおよび／または結合(ＫＡ)または解離(ＫＤ)定数を計算するような、結合反応速度の観点で決定できる結合親和性の点でも測定できる。典型的に、結合反応速度の決定のためは、抗体およびＥＧＦＲタンパク質濃度を知る必要がある。結合速度(ｋａ)および結合定数(ＫＡ)は結合親和性と正に相関する。対照的に、解離速度(ｋｄ)、解離定数(ＫＤ)およびＥＣ５０値は結合親和性と負に相関する。それゆえに、高い結合親和性は、低いｋｄ、ＫＤおよびＥＣ５０値により表される。
低ｐＨおよび／または高乳酸レベルの条件および中性ｐＨおよび／または正常乳酸レベルの条件下でここに提供する修飾抗体の結合活性を比較することには、同じ条件(例えば、異なるｐＨおよび／または乳酸条件以外、同一タンパク質希釈および結合条件)下での絶対的結合の比較によりまたは異なる条件下での結合親和性の比較により達成できる。
それゆえに、このようなアッセイを使用して、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較した、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および／または１０mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下の結合活性比を決定できる。用いるアッセイによって、結合活性は、絶対値(例えば、光学密度)、結合または効力の濃度則手い(例えば、ＥＣ５０)または動力学的測定(例えば、結合または解離定数)の数量化した値の比率である。ここでの目的のために、全例で、１を超える比率が、正確にまたは約７.４の中性ｐＨおよび／または正確にまたは約１mMの乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、ｐＨ６.０〜６.５(両端を含む)および／または１０mM〜２０mM(両端を含む)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下で、結合が大きい(例えば、密接な結合親和性または低ＥＣ５０)ことを示すように、比率を決定する。
例えば、絶対的結合を測定する例では、酸性ｐＨ(例えば、ｐＨ６.０または６.５)および／または高乳酸(例えば、１６.７mM)条件下の絶対的結合対中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.４)および／または正常乳酸(例えば、１mM)条件下の絶対的結合の比率を、例えば、ＯＤｐＨ６.０／ＯＤｐＨ７.４またはＯＤｐＨ６.５／ＯＤｐＨ７.４の商を求めることにより計算することにより、条件付結合を決定できる。結合活性を結合親和性と正に相関する動力学的測定値(例えば、ｋａおよびＫＡ)の観点で決定するとき、活性比を、酸性ｐＨ(例えば、ｐＨ６.０または６.５)および／または高乳酸(例えば、１６.７mM)条件下対中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.４)および／または正常乳酸(例えば、１mM)条件下の絶対的結合の正に相関する項の比率を、例えば、ＫＡ(ｐＨ６.０)／ＫＡ(ｐＨ７.４)またはＫＡ(ｐＨ６.５)／ＫＡ(ｐＨ７.４)の商を求めることにより計算することにより、評価できる。結合活性を結合親和性と負に相関する動力学的測定値(例えば、ＫＤまたはＥＣ５０)の観点で決定するとき、結合活性比を、酸性ｐＨ(例えば、ｐＨ６.０または６.５)および／または高乳酸(例えば、１６.７mM)条件対中性ｐＨ(例えば、ｐＨ７.４)および／または正常乳酸(例えば、１mM)条件下の絶対的結合下、例えば、(１／ＥＣ５０(ｐＨ６.０)／(１／ＥＣ５０(ｐＨ７.４))の商を求めることにより負に相関する項の逆関数または逆数の比率を計算することにより評価できる。
典型的に、ここに提供する抗体は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍またはそれ以上大きな結合であることを示す、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０である結合活性比を有する(例えば、密接な結合親和性または低ＥＣ５０)。
２. 他の細胞ベースの機能アッセイ
抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を測定するアッセイは細胞アッセイを含む。使用できる細胞株は、文献に記載されたあらゆる細胞株または貯蔵所、例えばAmerican Type Culture Collection(ATCC)から得ることができる細胞株を含む。当業者は、望まれる特性の細胞株を選択できる。一般に、ＥＧＦＲを発現することが知られる細胞株を使用して、アッセイを行う。このような細胞は当業者に知られる。例えば、ATCCカタログ(atcc.org)を参照して、細胞株を同定できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体のスクリーニングに使用する細胞アッセイに使用できる、ＥＧＦＲを発現する細胞株の例は、ＤｉＦｉヒト結腸直腸癌細胞、Ａ４３１細胞(ATCC CRL-1555)、Ｃａｃｏ−２結腸直腸腺癌細胞(ATCC HTB-37)、ＨＲＴ−１８結腸直腸腺癌細胞(ATCC CCL-244)、ＨＴ−２９結腸直腸腺癌細胞(ATCC HTB-38)、ヒト新生児ケラチン生成細胞およびＭＣＦ１０Ａ上皮性細胞(ATCC CRL-10317)を含む(例えば、Olive et al. (1993) In Vitro Cell Dev Biol. 29A(3 Pt 1):239-248; Wu et al. (1995) J. Clin. Invest. 95(4): 1897-1905参照)。ここに記載する細胞アッセイに使用できる細胞の例は、例えば、ここに記載する腫瘍または癌細胞を含む、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる細胞を含む。
いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を測定するためのアッセイ、例えばここに記載するアッセイを、抗ＥＧＦＲ抗体の副作用、例えばここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる副作用と関係する組織由来の細胞株を使用して実施する。例えば、アッセイを、皮膚細胞株を使用して実施できる。ＥＧＦＲは、ケラチン生成細胞、例えば基底ケラチン生成細胞および毛包の外毛根鞘およびエクリンおよび皮脂腺の細胞を含む、数細胞型で発現する(Albanell et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):110-124; Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5; Nanney et al. (1990) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748)。
いくつかの例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の活性を測定する細胞アッセイを、ケラチン生成細胞、例えば、例えば、ヒト新生児ケラチン生成細胞；毛包の外毛根鞘からの細胞およびエクリンおよび皮脂腺の細胞を使用して実施する。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の活性を測定する細胞アッセイに使用できる他の細胞は、例えば、メラニン形成細胞、例えば、例えば、新生児メラニン形成細胞；ランゲルハンス細胞；線維芽細胞；メルケル細胞；神経細胞；腺性細胞；皮脂腺細胞(脂腺細胞)および線維芽細胞、例えば、例えば皮膚線維芽細胞および創傷線維芽細胞を含む。このような細胞の培養法は、当業者の能力の範囲内である(例えば、Limat and Hunziker (1996) Methods Mol Med. 2:21-31; Abdel-Naser et al. (2005) Egypt. Dermatol. Online J. 1(2):1参照)。
ＥＧＦＲを発現する細胞株を、一過性または安定トランスフェクションにより産生できる。さらに、あらゆる一次細胞または細胞株を、例えば蛍光標識した抗ＥＧＦＲ抗体および蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)を使用して、ＥＧＦＲの発現について評価し得る。細胞株の例は、Ａ５４９(肺)、ＨｅＬａ、ジャーカット、ＢＪＡＢ、Ｃｏｌｏ２０５、Ｈ１２９９、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３、ＨＵＭＥＣ、ＨＵＶＥＣおよびＰｒＥＣを含む。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、例えば、細胞表面への結合を検出できるあらゆるアッセイを使用して評価できる。活性はまた抗ＥＧＦＲ抗体の機能的活性の評価によっても評価できる。いくつかの例において、アッセイは、抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲと結合し、ある生化学的事象、例えば、細胞溶解、ファゴサイトーシス、リガンド／受容体結合阻害、成長および／または増殖阻害およびアポトーシスのようなエフェクター機能に介在する能力の、生物学に基づく。
このようなアッセイは、しばしば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体に対する細胞の応答、例えば細胞生存、細胞死、細胞ファゴサイトーシス、細胞溶解、細胞形態学変化または転写活性化例えば、天然遺伝子またはレポーター遺伝子の細胞発現のモニタリングを含む。例えば、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、フローサイトメトリー、細胞分離技術、蛍光標示式細胞分取(ＦＡＣＳ)、相顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、受容体結合アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、免疫細胞化学、レポーター遺伝子アッセイ、細胞形態学(例えば、細胞体積、核体積、細胞周囲長および核周囲長)、リガンド結合、基質結合、ヌクレアーゼ活性、アポトーシス、走化性または細胞遊走、細胞表面マーカー発現、細胞増殖、ＧＦＰ陽性および色素希釈アッセイ(例えば、細胞膜に結合する色素での細胞追跡者アッセイ)、ＤＮＡ合成アッセイ(例えば、３Ｈ−チミジンおよび蛍光ＤＮＡ結合色素、例えばＢｒｄＵまたはヘキスト色素とＦＡＣＳ解析)および核内フォーカスアッセイは、全て、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性の測定に適当なアッセイである。測定できる他の機能的活性は、リガンド結合、基質結合、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性、既知または非特徴付け遺伝子マーカーの両者での転写変化(例えば、ノーザンブロット)、細胞代謝変化、細胞増殖、細胞表面マーカー発現、ＤＮＡ合成と関連する変化、マーカーおよび色素希釈アッセイ(例えば、ＧＦＰおよび細胞追跡者アッセイ)、接触阻害、ヌードマウスでの腫瘍増殖およびその他を含むが、これらに限定されない。
例えば、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、ＥＧＦＲを発現することが知られる細胞の１個以上の表現型の調節について評価できる。表現型アッセイ、その使用のためのキットおよび試薬は当業者に周知であり、ここでは修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性の測定に使用する。いくつかの商業的供給源の一つから購入できる代表的表現型アッセイは、細胞生存能、細胞毒性、増殖または細胞生存を測定するためのもの(Molecular Probes, Eugene, Oregon; PerkinElmer, Boston, Mass.)、酵素アッセイを含むタンパク質ベースのアッセイ(Panvera, LLC, Madison, Wis.; BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J.; Oncogene Research Products, San Diego, Calif.)、細胞制御、シグナル伝達、炎症、酸化的過程およびアポトーシス(Assay Designs Inc., Ann Arbor, Mich.)、血管形成アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイおよび代謝アッセイ(Chemicon International Inc., Temecula, Calif.; Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.)を含む。
特定の表現型アッセイに適すると決定された細胞(すなわち、ここに記載されたまたはＥＧＦＲを発現することが当分野で知られるあらゆる細胞)を、抗ＥＧＦＲ抗体ならびに対照抗体で処理できる。いくつかの例において、受容体の活性化が起こるように、ＥＧＦまたはそのフラグメントを包含させる。処理期間の最後に、処理および未処理細胞をここに記載するまたは当分野で知られる１個以上の方法で分析できる。いくつかの例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の活性を細胞形態学の変化の測定、ＥＧＦＲリン酸化または細胞増殖の測定により評価できる。
ＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦＲを発現する細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の影響を評価するために、アッセイを実施できる。いくつかの例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の存在下または非存在下にＥＧＦＲの活性をＥＧＦまたは他の刺激剤で刺激して、抗体がＥＧＦまたは他の刺激剤の作用を調節(例えば、阻害)するか否かを決定する。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦがＥＧＦＲと相互作用する能力を遮断することにより作用する。それゆえに、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体はまたた拮抗性特性についても試験できる。
例えば、ＥＧＦＲリン酸化アッセイを使用して、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲのリン酸化を阻害する能力を測定できる。ＥＧＦの、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合は受容体二量体化およびチロシンリン酸化を誘発し、未制御増殖に至り得る(Seshacharyulu et al. (2012) Expert. Opin. Ther. Targets. 16(1):15-31)。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体はＥＧＦＥＧＦＲへの結合を阻害でき、ＥＧＦＲリン酸化を減少できる(例えば、米国特許８,０７１,０９３号参照)。それゆえに、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、リン酸化ＥＧＦＲの検出により評価できる。いくつかの例において、リン酸化ＥＧＦＲを、当分野で知られるまたはここに記載する方法を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイにより細胞ライセートで検出できる(例えば、実施例８参照)。阻害効果に対する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の用量依存を、リン酸化ＥＧＦＲの濃度を修飾抗ＥＧＦＲ抗体の濃度に対してプロットすることにより決定できる。チロシンリン酸化形態のＥＧＦＲを、例えば、Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo.)、RAYBIO(Norcross, Ga)またはThermo Scientific(Rockford, IL)から入手可能なＥＧＦＲホスホＥＬＩＳＡキットを使用して検出できる。
増殖アッセイを使用して、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性を測定できる。アッセイは、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体によるＥＧＦＲを発現する細胞の増殖阻害を測定できる。細胞を、細胞が増殖するのに十分な時間インキュベートする(例えば、１２時間または１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日またはそれ以上)。細胞増殖を当分野で知られるあらゆる方法で測定でき、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、５−ブロモ−２−デオキシウリジン(ＢｒｄＵ)ＥＬＩＳＡ、テトラゾリウムマイクロプレートアッセイおよび酸ホスファターゼアッセイを含む(例えば、Maghni et al. (1999) J. Immunol. Method. 223(2):185-194)。細胞増殖を、Invitrogen(Cyquant NF cell proliferation assay kit)、Cambrex(ViaLight HS(high sensitivity) BioAssay)、Promega(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay, Guava Technologies(CellGrowth assay)、Stratagene(Quantos cell proliferation assay)から入手可能なキットを使用しても測定できる(例えば、Assays for Cell Proliferation Studies, Genetic Eng. Biotechnol. News. 26(6))。いくつかの例において、細胞増殖を、抗体非存在下の細胞の増殖で標準化できる。増殖アッセイの例において、細胞を、アッセイする抗ＥＧＦＲ抗体を含む正常増殖培地中で、９６ウェルプレートプレートに添加する。細胞増殖アッセイ例を実施例９に記載する。
３. 動物モデル
動物モデルを使用するインビボも、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の治療活性を評価するために使用できる。抗ＥＧＦＲ抗体を、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を使用する治療が考慮される疾患および状態の動物モデルに投与する。このような動物モデルは当分野で知られ、ヒト癌外植片または継代異種移植組織を易感染性動物、例えばヌードまたはＳＣＩＤマウスに導入する異種間癌モデルを含むが、これに限定されない(例えば、Klein. et al. (1997) Nature Medicine 3:402-408参照)。腫瘍形成阻害、腫瘍退縮または転移を測定するアッセイを使用して、有効性を予測できる。動物モデルを、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の副作用の評価にも使用できる。
種々の腫瘍細胞株または腫瘍動物モデルは当業者に知られ、ここに記載する。抗ＥＧＦＲ抗体の活性を、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる疾患または状態の処置の指標であるパラメータのモニタリングにより評価できる。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を、腫瘍担持動物に投与し、その後体重および腫瘍体積をモニタリングできる。例えば、抗腫瘍原性の指標であるパラメータは、腫瘍サイズの縮小および／または腫瘍進行遅延である。それゆえに、例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を、腫瘍増殖またはサイズを減少させるものの同定のために評価できる。腫瘍サイズを、抗ＥＧＦＲ抗体で処置した腫瘍担持ヒトまたは動物モデルでインビボで評価できる。腫瘍縮小または腫瘍サイズを、当分野で知られる種々のアッセイ、例えば、体重、体積または物理的測定により評価できる。抗ＥＧＦＲ抗体をまた正常動物に投与し、抗ＥＧＦＲ抗体投与と関連する有害副作用を評価するために体重をモニタリングもてきる。
インビボ腫瘍を、免疫欠損齧歯類への腫瘍細胞の接種またはインプラント(例えば、皮下注射による)により産生された異種移植腫瘍、マウスまたはラット腫瘍細胞株を対応する免疫適格性マウスまたはラット種に接種(例えば、皮下注射による)することにより産生された同系腫瘍モデル、動物モデルにインプラントした原発腫瘍の転移により産生された転移腫瘍、腫瘍細胞の機嫌と同じ種への腫瘍細胞のインプラントにより産生された同種移植片腫瘍および動物の遺伝子操作により産生された自然発症腫瘍を含む、あらゆる既知法により動物に産生できる。腫瘍モデルを、その起源の組織または臓器への腫瘍細胞の注射により同所性に、例えば、乳腫瘍細胞のマウス乳房脂肪体へのインプラントにより産生できる。いくつかの例において、異種移植モデルまたは同質遺伝子的モデルを使用する。例えば、腫瘍を、免疫適格性宿主(同一遺伝子)または免疫欠損宿主(例えば、ヌードまたはＳＣＩＤマウス；異種移植)に腫瘍細胞懸濁液(例えば、１×１０６〜５×１０６細胞／動物)を右腋窩に皮下注射して確立できる。動物モデルは、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる生物、例えば、例えば、サルおよびマウスを含む哺乳動物のモデルを含む。
腫瘍は同一遺伝子、異質遺伝子型または異種であり得る。腫瘍は内在性または外来ＥＧＦＲを発現できる。外来ＥＧＦＲ発現は、当分野で知られるまたはここに記載する組み換え発現法を使用して、適切な核酸を用いる細胞のトランスフェクションまたは形質導入により達成できる。細胞株の例は、ＥＧＦＲ形質移入ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＣＦ７(ヒト乳房)、ヒト類表皮扁平上皮癌Ａ４３１、口腔扁平上皮細胞癌(ＯＳＣＣ)細胞株ＢｃａＣＤ８８５、ＣＯＬＯ ３５６／ＦＧ膵臓細胞株、結腸直腸癌細胞株、ＨＴ２９またはＬＳ１７４ＴおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１三種陰性乳癌細胞株を含む(例えば、Santon et al., (1986) Cancer Res. 46:4701-05 and Ozawa et al., (1987) Int. J. Cancer 40:706-10; U.S. Pat. Pub. No. 20110111059; Reusch et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(1):183-190; and Yang et al. (2011) Int. J. Nanomedicine 6:1739-1745参照)。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、多様な同所性腫瘍モデルで試験できる。これらの動物モデルは、例えば、膵臓癌、前立腺癌および乳癌のような高悪性度癌の病態生理および治療の研究のために当業者により使用されている。無胸腺ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスを含むが、これらに限定されない免疫欠損マウスを、ヒト腫瘍細胞またはドナー患者の断片の臓器内(例えば、膵臓、前立腺または乳腺)注射部位から拡散した局所および全身腫瘍のスコアリングに使用できる。
いくつかの例において、抗ＥＧＦＲターゲティングタンパク質の試験は、ＥＧＦＲ抗原含有特異的標的細胞の枯渇の評価を促進するための、霊長類(例えば、カニクイザルモデル)における有効性試験を含み得る。さらなる霊長類モデルは、アカゲザルを含むが、これに限定されない。
例えば、腫瘍のレシピエントは、任意の適当なマウス株であり得る。レシピエントは、ｎｕ／ｎｕマウス、ＳＣＩＤマウスおよびベージュマウスを含むが、これらに限定されない１種以上の免疫関連機能について免疫適格性または易感染性であり得る。腫瘍細胞を移植できる動物の例は、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、重症複合型免疫欠損／ベージュマウス(ＳＣＩＤ−ベージュ)を含む(例えば、米国特許公開２０１１０１１１０５９号；Reusch et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(1):183-190; Yang et al. (2011) Int. J. Nanomedicine 6:1739-1745参照)。他の例は、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウスおよびトランスジェニックマウス(ノックインおよびノックアウトを含む)を含む。例えば、抗ＥＧＦＲここに提供する抗体を、マウス癌モデル、例えば異種移植マウスで試験できる。この方法で、腫瘍または腫瘍細胞株をマウスに移植するか注入し、続いて該マウスを抗ＥＧＦＲ抗体で処置して、癌増殖および転移を低減または阻止する抗ＥＧＦＲ抗体の能力を測定する。また意図されるのは、免疫欠損マウスがヒト末梢血リンパ球(ＰＢＬｓ)を注射されたＳＣＩＤマウスモデルの使用である。
マウス、例えばヌードまたはＳＣＩＤマウスにおけるヒト腫瘍異種移植モデルの例は、ヒト肺癌(Ａ５４９細胞、ATCC No. CCL-185)；ヒト乳腫瘍(GI-101A細胞、Rathinavelu et al., (1999)Cancer Biochem. Biophys., 17:133-146またはMDA-MB-231三種陰性乳癌細胞)；ヒト卵巣癌(OVCAR-3細胞、ATCC No. HTB-161)；ヒト膵臓癌(PANC-1細胞、ATCC No. CRL-1469およびMIA PaCa-2細胞、ATCC No. CRL-1420)；ＤＵ１４５細胞(ヒト前立腺癌細胞、ATCC No. HTB-81)；ヒト前立腺癌(PC-3細胞、ATCC# CRL-1435)；結腸癌(HT-29細胞)；ヒト黒色腫(888-MEL細胞、1858-MEL細胞または1936-MEL細胞；例えば、Wang et al., (2006) J. Invest. Dermatol. 126:1372-1377参照)およびヒト線維肉腫(HT-1080細胞、ATCC No. CCL-121)およびヒト中皮腫(MSTO-211H細胞)を含むが、これらに限定されない。マウスにおけるラット腫瘍異種移植モデルの例は、神経膠腫腫瘍(Ｃ６細胞；ATCC No. CCL-107)を含むが、これに限定されない。マウス腫瘍同種移植モデルは、マウス黒色腫(B16-F10細胞；ATCC No. CRL-6475)を含むが、これに限定されない。マウスにおけるネコ腫瘍異種移植モデルの例は、ネコ線維肉腫(FC77.T細胞；ATCC No. CRL-6105)を含むが、これに限定されない。マウスにおけるイヌ腫瘍異種移植モデルの例は、イヌ骨肉腫(Ｄ１７細胞；ATCC No. CCL-183)を含むが、これに限定されない。ヒト異種移植モデルおよび同系腫瘍モデルの非限定的例を下の表１４および１５に示す。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与経路は、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる投与経路、例えば腹腔内、腫瘍内または静脈内投与であり得る。抗ＥＧＦＲ抗体はここに記載するまたは当分野で知られる種々の投与量で投与できる。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍担持動物に、例えば、約０.１mg／kg、０.１５mg／kg、０.２mg／kg、０.２５mg／kg、０.３０mg／kg、０.３５mg／kg、０.４０mg／kg、０.４５mg／kg、０.５mg／kg、０.５５mg.kg、０.６mg／kg、０.７mg／kg、０.８mg／kg、０.９mg／kg、１.０mg／kg、１.１mg／kg、１.２mg／kg、１.３mg／kg、１.４mg／kg、１.５mg／kg、１.６mg／kg、１.７mg／kg、１.８mg／kg、１.９mg／kg、２mg／kg、２.５mg／kg、３mg／kg、３.５mg／kg、４mg／kg、４.５mg／kg、５mg／kg、５.５mg／kg、６mg／kg、６.５mg／kg、７mg／kg、７.５mg／kg、８mg／kg、８.５mg／kg、９mg／kg、９.５mg／kg、１０mg／kg、１１mg／kg、１２mg／kg、１３mg／kg、１４mg／kg、１５mg／kg、１６mg／kg、１７mg／kg、１８mg／kg、１９mg／kg、２０mg／kg、２１mg／kg、２２mg／kg、２３mg／kg、２４mg／kg、２５mg／kg、３０mg／kg、４０mg／kg、５０mg／kg、６０mg／kg、７０mg／kg、８０mg／kg、９０mg／kg、１００mg／kgまたはそれ以上で投与できる。
いくつかの例において、投与量の例は、凡そまたは正確に０.０１mg／ｍ２〜凡そまたは正確に８００mg／ｍ２、例えば、凡そまたは正確に０.０１mg／ｍ２、凡そまたは正確に０.１mg／ｍ２、凡そまたは正確に０.５mg／ｍ２、凡そまたは正確に１mg／ｍ２、凡そまたは正確に５mg／ｍ２、凡そまたは正確に１０mg／ｍ２、凡そまたは正確に１５mg／ｍ２、凡そまたは正確に２０mg／ｍ２、凡そまたは正確に２５mg／ｍ２、凡そまたは正確に３０mg／ｍ２、凡そまたは正確に３５mg／ｍ２、凡そまたは正確に４０mg／ｍ２、凡そまたは正確に４５mg／ｍ２、凡そまたは正確に５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に１００mg／ｍ２、凡そまたは正確に１５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に２００mg／ｍ２、凡そまたは正確に２５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に３００mg／ｍ２、凡そまたは正確に４００mg／ｍ２、凡そまたは正確に５００mg／ｍ２、凡そまたは正確に６００mg／ｍ２および凡そまたは正確に７００mg／ｍ２を含むが、これらに限定されない。当業者は、mg／kg単位およびmg／ｍ２単位の投与量を認識し、変換できることは理解される(例えば、Michael J. Derelanko, TOXICOLOGIST'S POCKET HANDBOOK, CRC Press, p.16 (2000)参照)。
腫瘍サイズおよび体積は、当業者に知られる技術に基づきモニターできる。例えば、腫瘍サイズおよび体積は、放射線写真術、超音波造影、剖検、カリパスの使用、マイクロＣＴまたは１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴによりモニターできる。腫瘍サイズはまた目視により評価できる。具体例では、腫瘍サイズ(直径)をカリパスを使用して直接測定する。他の例において、腫瘍体積を、カリパスまたは超音波評価により得た腫瘍直径(Ｄ)の測定値の平均を使用して測定できる。
体積は、式Ｖ＝Ｄ３×π／６(カリパスを使用して測定した直径について)；式Ｖ＝[長さ×(幅)２]／２(ここで、長さは最長直径および幅は長さに対して垂直の最短直径である)；またはＶ＝Ｄ２×ｄ×π／６(超音波を使用して測定した直径について、ここで、ｄは深さまたは厚みである)。例えば、カリパス測定は腫瘍長(ｌ)および幅(ｗ)からなり、腫瘍体積を長さ×幅２×０.５２として計算できる。
他の例において、マイクロＣＴ走査を使用して、腫瘍体積を測定できる(例えば、Huang et al. (2009) PNAS, 106:3426-3430参照)。このような例において、マウスにOptiray Pharmacyイオベルソール注射７４％造影剤(例えば、イオベルソール７４１mg／mL)を注射し、マウスを麻酔し、ＣＴ走査をMicroCat 1Aスキャナーまたは他の類似スキャナー(例えば、IMTek)を使用して行うことができる(４０kV、６００μA、１９６回転ステップ、全角度または回転＝１９６)。画像をソフトウェア(例えば、ＲＶＡ３ソフトウェアプログラム；ImTek)を使用して再構築できる。腫瘍体積を、利用可能なソフトウェア(例えば、Amira 3.1ソフトウェア；Mercury Computer Systems)を使用して、決定できる。いくつかの例において、腫瘍を０日目に皮下に注射し、原発腫瘍の体積を指定した時点で測定できる。
インプラントした腫瘍が予定したサイズまたは体積に到達したら、修飾抗ＥＧＦＲ抗体を投与できる。進行している腫瘍を可視化でき、腫瘍サイズおよび腫瘍体積を当業者に知られる任意の技術を使用して測定できる。例えば、腫瘍体積または腫瘍サイズをここに記載する技術のいずれかを使用して測定できる。腫瘍体積およびサイズを、感染後、例えば、毎時、６時間毎、１２時間毎、２４時間毎、３６時間毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、毎週、３週毎、毎月またはそれ以上のような、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与後長期間にわたり一定間隔で評価または測定できる。経時的な腫瘍体積の中央値変化のグラフを作成できる。これは実施例１０に例示する。曲線下全面積(ＡＵＣ)を計算できる。治療指数も、式ＡＵＣ未処置動物−ＡＵＣ処置動物／ＡＵＣ未処置×１００を使用して計算できる。
一般に、同一方法で、同時に同一タイプの腫瘍細胞を用いて作製された腫瘍担持動物を対照として使用する。このような対照腫瘍担持動物は未処置の(修飾抗ＥＧＦＲ抗体を投与しない)ままのものを含む。さらなる対照動物は、当分野で知られる抗ＥＧＦＲ抗体を投与するものを含む。このような抗ＥＧＦＲ抗体の例はセツキシマブである。腫瘍担持動物に対照として既知抗ＥＧＦＲ抗体を投与する例において、投与する対照抗体の量は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の量と同じであり得る。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体の活性評価は、対照処置または未処置腫瘍担持動物と比較して、腫瘍サイズ(例えば、直径)、体積または重量の減少に介在する抗体の同定を含む。対照処置または未処置腫瘍担持動物と比較した腫瘍サイズ、体積または重量の減少は、抗ＥＧＦＲ抗体自体が腫瘍退縮または縮小を媒介するかまたは抗ＥＧＦＲ抗体が対照処置または未処置腫瘍担持動物と比較して腫瘍進行の遅延に介在することを意味すると理解される。腫瘍縮小または腫瘍進行遅延は、抗腫瘍原性を示すパラメータである。
例えば、抗ＥＧＦＲ抗体は、対照処置または未処置腫瘍担持動物と比較した、動物における腫瘍サイズの視覚的評価に基づき、腫瘍サイズまたは体積の減少に介在すると同定され得る。他の例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、未処置腫瘍担持動物と比較してまたは対照抗ＥＧＦＲ抗体で処置した腫瘍担持動物と比較して、腫瘍サイズが当分野で知られる任意の測定により評価した直径(例えば、カリパスの使用)で減少しているならば、腫瘍サイズまたは体積の減少に介在すると同定される。腫瘍サイズまたは体積の比較は、感染後任意の予定した時点で実施でき、かつ当業者により経験的に決定できることは理解される。いくつかの例において、比較は、未処置対照を屠殺する日に行い得る。他の例において、総ＡＵＣの解析を行うことができ、ＡＵＣ値を一定期間の腫瘍サイズおよび体積の指標として比較する。
腫瘍サイズまたは体積に対する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の効果を、抗ＥＧＦＲ抗体処置動物と比較した、投与後の指定時間の対照処置動物の腫瘍サイズまたは体積の比として表し得る(対照処置動物の腫瘍サイズまたは体積／修飾抗ＥＧＦＲ抗体処置動物の腫瘍サイズまたは体積)。評価は、動物において、１.０を超える、例えば、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上である腫瘍縮小の比率を示す結果となる抗ＥＧＦＲ抗体の同定を含み得る。具体例では、結果を、処置経過中の総ＡＵＣ面積の比率として表す(対照処置動物の腫瘍サイズまたは体積のＡＵＣ／修飾抗ＥＧＦＲ抗体処置動物の腫瘍サイズまたは体積のＡＵＣ)。ＡＵＣで測定して、対象で１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上の腫瘍縮小の比率をもたらす抗ＥＧＦＲ抗体を選択できる。１.２または５の比率は、修飾抗ＥＧＦＲ抗体が腫瘍サイズまたは体積を低減させ、、参照または対照と比較して１２０％または５００％抗腫瘍原性活性をもたらすことを意味することは理解される。
具体例では、治療指数を、腫瘍サイズまたは体積に対する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体の効果の指標として決定する。抗ＥＧＦＲ抗体は、対照抗ＥＧＦＲ抗体の治療指数と比較して、少なくとも正確にまたは少なくとも凡そまたは１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％以上である治療指数を有し得る。
さらなる例において、腫瘍を動物から摘出し、秤量し得る。抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、対照腫瘍担持動物から摘出した腫瘍と比較して、腫瘍重量を減少できる。投与後同時に対照処置動物から摘出した腫瘍とも重量を比較できる。重量変化は、腫瘍重量の比率として表し得る(対照処置動物腫瘍重量／抗ＥＧＦＲ処置動物腫瘍重量)。抗ＥＧＦＲ抗体は、対象において、１.０を超える、例えば、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上である腫瘍重量の比率をもたらし得る。１.２または５である腫瘍重量の比率は、抗ＥＧＦＲ抗体が腫瘍重量を減少させ、参照または対照と比較して１２０％または５００％抗腫瘍原性活性をもたらすことを意味すると理解される。
具体例では、動物における他の臓器または組織に対する抗ＥＧＦＲ抗体の影響を評価できる。例えば、他の臓器を動物から摘出し、秤量および／または試験できる。
動物試験を使用して、標準薬理学プロファイルでは評価できないまたは修飾抗ＥＧＦＲ抗体の反復投与後にしか生じない副作用のような有害副作用も評価できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体の評価する副作用は、皮膚毒性および低マグネシウム血症を含む、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体の副作用を含む。例えば、セツキシマブの既知副作用は、症候性低マグネシウム血症、爪囲炎、発熱、皮膚科学的毒性、顔面および躯幹上部の丘疹小水疱性皮疹、発毛異常、頭毛喪失、顔の毛および睫毛の成長増加、皮膚の乾燥および痒みおよび圧痛を伴う爪周囲炎を含み、ここに記載するおよび／または当業者に知られるあらゆるものを含む(Eng (2009) Nat. Rev. 6:207-218; Schrag et al. J. Natl. Cancer Inst. 97(16):1221-1224; Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5)。副作用を評価するために測定できる他のパラメータは、摂食量、体重、抗体形成、臨床化学および標準臓器／組織の巨視的および顕微鏡的試験(例えば、心毒性)の標準測定を含む。さらなる測定パラメータは、注射部位外傷および何らかの中和抗体の測定を含む。
例えば、本明細書に記載するとおり、低マグネシウム血症は、血清マグネシウムレベルの測定により診断および／または評価できる。丘疹小水疱性皮疹およびざ瘡様発疹は、丘疹(小さな盛り上がった面皰)および膿疱(小さな膿汁で満たされた疱疹)からなる発疹の観察により、動物モデル、例えばマウスモデルおよびカニクイザルモデルで特徴付けできる。乾燥皮膚は、鱗状で色のくすんだ皮膚、細孔があり紙のように薄い皮膚肌目により特徴付けできる。皮膚色素増加症は、過剰のメラニン沈着による皮膚の暗色化により特徴付けできる。掻痒は、動物の引っかき行動観察により評価できる。爪囲炎は試験により評価できる。
いくつかの例において、皮膚毒性の存在は、ヒト皮膚がマウスに移植されている、マウスモデルで評価できる(例えば、Nanney et al.(1996) J. Invest. Dermatol. 106(6):1169-1174参照)。さらに、皮膚科学的副作用を他の動物モデルで評価できる。例えば、カニクイザルにおいて、セツキシマブ投与後の注射部位の炎症および外側外皮の落屑を評価できる。同様の影響が、鼻道、食道および舌の上皮性粘膜で観察でき、腎尿細管上皮の退行性変化で観察できる。評価できる他の上皮性毒性は、結膜炎、目の赤みおよび腫れおよび消化器系障害の徴候を含む(例えば、Lutterbuese et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. 107(28):12605-12610; European Medicines Agency (2009) Summary of product characteristics (Erbitux)参照)。
副作用を、健常動物モデルまたは疾患または状態の動物モデル、例えばここに記載する動物モデルで評価できる。いくつかの例において、このようなアッセイは２種(例えば、齧歯類および非齧歯類)で実施して、あらゆる予想外の有害作用が看過されないことを確実にする。一般に、これらのモデルは、遺伝毒性、慢性毒性、免疫原性、生殖／発達毒性、発癌性を含む多様な毒性を測定できる。
４. 薬物動態および薬力学アッセイ
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の薬物動態(ＰＫ)および薬力学(ＰＤ)アッセイを、ここに記載するまたは当分野で知られる方法を使用して実施できる(例えば、Klutchko, et al., (1998) J. Med. Chem. 41:3276-3292参照)。測定パラメータの例は、一般に投与後の最大(ピーク)血漿濃度(Ｃｍａｘ)、ピーク時間(すなわち、最大血漿濃度が生じるとき；Ｔｍａｘ)、最小血漿濃度(すなわち、投薬間の最小血漿濃度；Ｃｍｉｎ)、排出半減期(Ｔ１／２)および曲線下面積(すなわち、時間対血漿濃度のプロットにより作成した曲線下面積；ＡＵＣ)を含む。投与した修飾抗ＥＧＦＲ抗体の絶対的バイオアベイラビリティは、皮下送達後の曲線下面積(ＡＵＣｓｃ)と静脈内送達後のＡＵＣ(ＡＵＣiv)の比較により決定できる。絶対的バイオアベイラビリティ(Ｆ)は、式Ｆ＝([ＡＵＣ]ｓｃ×投与量ｓｃ)／([ＡＵＣ]iv×投与量iv)を使用して計算できる。投与後の血漿中の抗ＥＧＦＲ抗体濃度を、血液サンプル中の抗体の評価濃度に適する当分野で知られる任意の方法を使用して測定できる。方法の例は、ＥＬＩＳＡおよび比濁分析を含むが、これらに限定されない。さらなる測定パラメータは、静脈内投与後に得られた濃度−時間データのコンパートメント解析およびバイオアベイラビリティを含み得る。体内分布、線量測定(放射標識抗体またはＦｃ融合体について)およびＰＫ試験も、齧歯類モデルを含む、ここに記載するまたは当分野で知られる動物モデルを含む動物モデルで実施できる。このような試験は、投与したしたいくつかのまたは全投与量での耐容性、局所組織に対する毒性、齧歯類異種移植動物モデルへの優先的局在化および標的細胞(例えば、ＣＤ２０陽性細胞)枯渇を評価できる。薬力学試験は、特異的腫瘍細胞へのターゲティングまたはシグナル伝達機構遮断、ＥＧＦＲ発現細胞またはシグナルの枯渇の測定を含むが、これらに限定されない。
ＰＫおよびＰＤアッセイを、健常動物モデル、罹患動物モデルおよびヒトを含む、ここに記載するまたは当分野で知られる任意の動物モデルで実施できる。ＰＤおよび／またはＰＫ特性についての修飾抗ＥＧＦＲ抗体のスクリーニングは、該修飾抗ＥＧＦＲ抗体により寄与されるＰＤ、ＰＫおよび治療有効性の最適バランスの規定に有用であり得る。例えば、Ｆｃ受容体のアレイは、種々の免疫細胞型ならびに種々の組織上に差示的に発現していることは当分野で知られる。Ｆｃ受容体の異なる組織分布は、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の薬力学(ＰＤ)および薬物動態(ＰＫ)特性に影響し得る。
薬物動態において一定範囲の投与量でかつ種々の投薬頻度で投与し、投与量における修飾抗ＥＧＦＲ抗体の濃度の増加または減少の影響を評価できる。投与した修飾抗ＥＧＦＲ抗体の薬物動態特性、例えばバイオアベイラビリティを、ここに記載する治療剤またはレジメンの共投与有りまたは無しで評価できる。例えば、イヌ、例えばビーグル犬に修飾抗ＥＧＦＲ抗体を単独でまたはここに記載する１種以上の治療剤もしくはレジメンと共に投与できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、治療剤またはレジメンの投与前、投与中または投与後に投与できる。次いで、血液サンプルを種々の時点で採り、血漿中の修飾抗ＥＧＦＲ抗体の量を、例えば比濁分析により決定する。次いでＡＵＣを測定し、付加的治療剤またはレジメンの共投与を伴うまたは伴わない投与した修飾抗ＥＧＦＲ抗体のバイオアベイラビリティを決定できる。このような試験を実施して、投与した抗ＥＧＦＲ抗体の薬物動態特性、例えばバイオアベイラビリティに対する共投与の影響を評価できる。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体の単回または反復投与を、約６０００倍(約０.０５〜３００mg／kg)の投与量範囲で行い、血漿濃度およびクリアランスを使用して半減期を評価でき、ならびに定常状態での分布体積および全身吸光度レベルを測定できる。
Ｆ. 医薬組成物、製剤、キット、製品および組み合わせ剤
１. 医薬組成物および製剤
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかを含む医薬組成物が投与用に提供される。薬学的に許容される組成物は、規制当局または動物およびヒトにおいて使用する一般に認識される薬局方に従い調製された他の当局での承認の観点で製造する。典型的に、化合物を、当分野で周知の技術および方法を使用して医薬組成物に製剤する(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126参照)。
医薬組成物は、治療、予防および／または診断適用に使用できる。ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を薬学的に許容される担体または希釈剤とともに製剤できる。一般に、このような医薬組成物は、抗体の生物学的特性、例えばその特異的エピトープへの結合(例えば、ＥＧＦＲへの結合)を顕著に障害しない成分を利用する。各成分は、他の成分と適合性であり、患者に傷害性ではないとの意味で薬学的におよび生理学的に許容される。製剤は、簡便には単位投与形態で示され、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液剤または懸濁液剤(例えば、注射可能、摂取可能および局所製剤(例えば、点眼剤、ゲル剤、ペースト剤、クリーム剤または軟膏剤))、エアロゾル(例えば、経鼻スプレー)、リポソーム、坐薬、腟坐薬、注射可能および点滴可能溶液および徐放性形態を含むが、これらに限定されない、薬学分野で周知の方法により製造される。例えば、Gilman, et al.(eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; and Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY参照。全身性に投与するとき、治療組成物は無菌であり、発熱性物質除去されており、一般に粒子状物質がなく、ｐＨ、等張性および安定性に関してそれ応分の非経腸的許容される溶液中にある。これらの条件は当業者に知られる。非経腸投与可能組成物の製造方法は周知であるか、当業者には明白であり、例えば、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy (以前はRemington's Pharmaceutical Sciences)”, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)に詳述されている。
ここに提供する医薬組成物は、種々の形態、例えば、固体、半固体、液体、粉末、水性または凍結乾燥形態であり得る。適当な医薬担体の例は当分野で知られ、とりわけ水、緩衝剤、食塩水溶液、リン酸緩衝化食塩水溶液、種々のタイプの湿潤剤、無菌溶液、アルコール類、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール類、ゼラチン、グリセリン、炭水化物、例えばラクトース、スクロース、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル類、ヒドロキシメチルセルロース、粉末を含むが、これらに限定されない。ここに提供する医薬組成物は、例えば、抗酸化剤、防腐剤、抗菌剤、鎮痛剤、結合剤、崩壊剤、着色剤、希釈剤、添加物、増量剤、流動促進剤、可溶化剤、安定化剤、等張化剤、媒体、粘性剤、風味剤、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、乳化剤および懸濁化剤、例えばアカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ベントナイト、カルボマー、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、セルロース、コレステロール、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、オクトキシノール−９、オレイルアルコール、ポビドン、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル類、ステアリルアルコール、トラガカント、キサンタンゴムおよびその誘導体、溶媒を含む他の添加剤およびとりわけ結晶セルロース、微結晶セルロース、クエン酸、デキストリン、デキストロース、液体グルコース、乳酸、ラクトース、塩化マグネシウム、メタリン酸カリウム、デンプンのような種々成分を含み得る(一般に、Alfonso R. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins参照)。このような担体および／または添加剤を慣用法で製剤でき、適当な投与量で対象に投与できる。安定化剤、例えば脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマーおよびキレート剤は、体内で組成物を分解から保存し得る。
抗体の投与経路は既知方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、髄腔内注射または点滴、吸入または病巣内経路、局所または下記徐放性系に従う。本抗体は、典型的に点滴によりまたはボーラス注射により連続的に投与する。抗体を局所または全身様式で投与できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗体は、薬学的に許容される担体との混合物として製造できる。化合物の製剤および投与のための技術は当業者に知られる(例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, Pa.参照)。この治療組成物を、好ましくは液体または粉末エアロゾル(凍結乾燥)として、静脈内または鼻もしくは肺経由で投与できる。組成物はまた望むならば非経腸的にまたは皮下に投与できる。全身性に投与するとき、治療組成物は無菌であり、発熱性物質除去され、ｐＨ、等張性および安定性に関してそれ応分の非経腸的許容される溶液中でなければならない。これらの条件は当業者に知られる。
使用に適する医薬組成物は、１個以上抗ＥＧＦＲ抗体が意図される目的を達成するのに有効なで含まれている組成物である。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。治療的有効な投与量は、ここに記載するインビトロおよびインビボ法を使用して決定できる。したがって、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、医薬製剤中のとき、投与のための単位用量形態で提供され得る。
治療製剤を多くの慣用の投与剤形で投与できる。簡単にいうと、ここに提供される抗体の投与量製剤は、生理学的に許容される担体、所望の程度の純度を有する該化合物と添加物または安定化剤の混合により、保存または投与用に製剤される。このような物質は、用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝液、例えば、ＴＲＩＳ ＨＣｌ、リン酸、クエン酸、酢酸および他の有機酸塩；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量(約１０残基未満)ペプチド、例えば、ポリアルギニン、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリジノン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；単糖、二糖およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール類、例えば、マンニトールまたはソルビトール；対イオン、例えばナトリウムおよび／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ、プルロニックまたはポリエチレングリコールを含み得る。
ここでの具体例において、ここに提供されるのは、安定化剤を含む医薬組成物である。安定化剤はアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミン、糖、ポリオール類、塩または界面活性剤であり得る。いくつかの例において、安定な共製剤は、単一安定化剤を含む。他の例において、安定な共製剤は２種、３種、４種、５種または６種の異なる安定化剤を含む。
例えば、安定化剤は糖またはポリオール、例えばグリセロール、ソルビトール、マンニトール、イノシトール、スクロースまたはトレハロースであり得る。具体例では、安定化剤はスクロースである。他の例において、安定化剤はトレハロースである。糖またはポリオールの濃度は、正確にまたは凡そ１００mM〜５００mM、１００mM〜４００mM、１００mM〜３００mM、１００mM〜２００mM、２００mM〜５００mM、２００mM〜４００mM、２００mM〜３００mM、２５０mM〜５００mM、２５０mM〜４００mM、２５０mM〜３００mM、３００mM〜５００mM、３００mM〜４００mMまたは４００mM〜５００mM(それぞれ両端を含む)である。
実施例において、安定化剤は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベートである界面活性剤である。例えば、界面活性剤はポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポロクサマーおよびポリソルベート、例えばポロクサマー１８８、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０であり得る。具体例では、安定化剤はポリソルベート８０である。界面活性剤の濃度は、製剤中の質量濃度％(ｗ／ｖ)として、正確にまたは凡そ０.００５％〜１.０％、０.０１％〜０.５％、０.０１％〜０.１％、０.０１％〜０.０５％または０.０１％〜０.０２％(それぞれ両端を含む)である。
インビボ投与に使用するとき、修飾抗ＥＧＦＲ抗体製剤は無菌でなければならず、慣用の製薬実務に従い製剤され得る。これは、凍結乾燥および再構成前または後の無菌濾過膜での濾過により容易に達成される。本抗体は、通常凍結乾燥形態でまたは溶液中に保存される。他の媒体、例えばゴマ油、ピーナツ油または綿実油のような天然に存在する植物油またはオレイン酸エチルなどのような合成脂肪媒体が望まれ得る。緩衝液、防腐剤、抗酸化剤などを、認められた製薬実務に従い取り込み得る。
抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、組成物中、正確にまたは凡そ０.１〜１０mg／mLの濃度で、例えば、例えば少なくとも正確にまたは少なくとも凡そ０.１mg／mL、０.２mg／mL、０.３mg／mL、０.４mg／mL、０.５mg／mL、０.６mg／mL、０.７mg／mL、０.８mg／mL、０.９mg／mL、１.０mg／mL、１.５mg／mL、２.０mg／mL、２.５mg／mL、３.０mg／mL、３.５mg／mL、４.０mg／mL、４.５mg／mL、５.０mg／mL、５.５mg／mL、６.０mg／mL、６.５mg／mL、７.０mg／mL、７.５mg／mL、８.０mg／mL、８.５mg／mL、９.０mg／mL、９.５mg／mL、１０mg／mLまたはそれ以上の濃度で提供できる。溶液の体積は、正確にまたは凡そ１〜１００mL、例えば、例えば、少なくとも正確にまたは少なくとも凡そまたは０.５mL、１mL、２mL、３mL、４mL、５mL、１０mL、１５mL、２０mL、２５mL、３０mL、３５mL、４０mL、４５mL、５０mL、５５mL、６０mL、６５mL、７０mL、７５mL、８０mL、８５mL、９０mL、９５mL、１００mLまたはそれ以上であり得る。いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体はリン酸緩衝化食塩水中に提供する。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体を、１００mgの抗ＥＧＦＲ抗体をリン酸緩衝化食塩水中２mg／mLの濃度で含む、５０mL単回用バイアルとして提供できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、保存し、使用前に適当な担体で再構成するために凍結乾燥され得る。この技術は、慣用の免疫グロブリンおよびタンパク質調製物で有効であることが示されており、当分野で知られる(art-known)凍結乾燥および再構成技術を使用できる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は、放出制御または徐放性組成物として提供され得る。ここに提供する抗体の制御されたまたは徐放性の放出を達成できる錠剤およびカプセル剤の製剤用の重合体物質は、当分野で知られる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Langer and Peppas (1983) J. Macromol. Sci. 23:61; see also Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105；米国特許５,６７９,３７７号、５,９１６,５９７号、５,９１２,０１５号、５,９８９,４６３号、５,１２８,３２６号およびＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４号およびＷＯ９９／２０２５３号参照)。徐放性製剤に使用されるポリマーの例は、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン−コ−酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(ＰＬＧ)、ポリ酸無水物、ポリ(Ｎ−ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(ＰＬＡ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧＡ)およびポリオルトエステル類を含むが、これらに限定されない。一般に、徐放性製剤に使用するポリマーは不活性であり、浸出可能不純物を含まず、保存に安定であり、無菌かつ生分解性である。徐放性製剤の製造のための当分野で知られる任意の技術を使用して、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の１種以上を含む徐放性製剤を産生できる。
いくつかの例において、医薬組成物はここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体および１個以上の付加的抗体を含む。いくつかの例において、１個以上の付加的抗体は例えば、ＡＢＸ−ＥＧＦまたはセツキシマブのような、ここに記載するまたは当分野で知られる抗ＥＧＦＲ抗体を含むが、これらに限定されない。
２. 製品／キット
修飾抗ＥＧＦＲ抗体または修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその誘導体もしくは生物学的活性部分をコードする核酸の医薬組成物を、包装材、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる疾患または状態、例えばここに記載するまたは当分野で知られる疾患および状態の処置に有効な医薬組成物および該抗体または核酸分子が感染、疾患または障害の処置に使用されるものであることを示すラベルを含む、製品として包装できる。医薬組成物を、単回投与量または複数回投与量のための医薬組成物の一定量を含む単位投与形態に包装できる。包装組成物は、投与前に再構成(例えば、水または食塩水で)できる、提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を含む医薬組成物の凍結乾燥粉末を含み得る。
ここに提供する製品は包装材を含む。医薬品の包装に使用される包装材は当業者に周知である(例えば、米国特許５,３２３,９０７号、５,０５２,５５８号および５,０３３,２５２号参照)。医薬包装材の例は、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器(例えば、加圧定量吸入器(ＭＤＩ)、乾燥粉末吸入器(ＤＰＩ)、ネブライザー(例えば、ジェットまたは超音波ネブライザー)および他の１回呼吸液体系)、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、および選択した製剤ならびに意図する投与方式および処置に適する任意の包装材を含むが、これらに限定されない。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体、該抗体をコードする核酸分子、医薬組成物または組み合わせ剤は、キットとしても提供できる。キットは、所望により使用指示書、デバイスおよびさらなる薬剤(例えば、組成物の希釈および／または凍結乾燥タンパク質の再構成のための滅菌水または食塩水溶液)のような１個以上の要素および本方法を実施するためのチューブ、容器およびシリンジのような要素を含み得る。キットの例は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を含み、所望により使用指示書、対象に該抗ＥＧＦＲ抗体を投与するためのデバイス、対象の抗ＥＧＦＲ抗体を検出するためのデバイス、対象から得たサンプルの抗ＥＧＦＲ抗体を検出するためのデバイスおよび対象に付加的治療剤を投与するためのデバイスを含み得る。
キットは、所望により、指示を含み得る。指示は、典型的に修飾抗ＥＧＦＲ抗体および、所望により、キットに含まれる他の成分、ならびに対象の適切な状態を決定するための方法、適切な投与量、投薬レジメンおよび該抗ＥＧＦＲ抗体を投与する適切な投与法を含む投与法を記載する有形の表現を含む。指示はまた処置期間中の対象のモニタリングについてのガイダンスも含み得る。
キットはまたここに記載する医薬組成物および診断用アイテムも含み得る。例えば、このようなキットは、対象内の抗ＥＧＦＲ抗体の濃度、量または活性を測定するためのアイテムを含み得る。
いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、採取した生物学的サンプル(例えば、対象から得た腫瘍細胞、例えば循環腫瘍細胞または対象から切除した腫瘍細胞)中のＥＧＦＲを検出ための診断キットにおいて提供され得る。いくつかの例において、診断キットは、一団の１個以上の抗ＥＧＦＲ抗体および／または１個以上の対照抗体(すなわち、当分野で知られる非ＥＧＦＲ結合抗体またはＥＧＦＲ抗体、例えばセツキシマブ)を含み、ここで、該パネルの１個以上の抗体はここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体である。
ここに提供するキットは、対象に該抗ＥＧＦＲ抗体を投与するためのデバイスも含み得る。対象に医薬を投与するための当分野で知られる多様なデバイスのいずれかを、ここに提供するキットに包含できる。デバイスの例は、皮下針、静脈内針およびカテーテルを含むが、これらに限定されない。典型的にキットの修飾抗ＥＧＦＲ抗体を投与するためのデバイスは、該修飾抗ＥＧＦＲ抗体の所望の投与法と適合性である。
３. 組み合わせ剤
提供されるのは、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体および第二剤、例えば第二の抗ＥＧＦＲ抗体または他の治療剤もしくは診断剤の組み合わせ剤である。組み合わせ剤は、ここに使用する方法に従い、治療を実施するためのあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体または試薬を含み得る。例えば、組み合わせ剤は、任意の抗ＥＧＦＲ抗体および化学療法剤を含み得る。組み合わせ剤はまたここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体と１個以上のさらなる治療用抗体を含み得る。例えば、付加的治療剤は、例えば、セクションＧに記載するような、抗癌剤、例えば化学療法剤である。提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせ剤はまた、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を含む医薬組成物または抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞も含み得る。ここに提供する組み合わせ剤は、単一組成物としてまたは別々の組成物に製剤できる。
Ｇ. 治療用途
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントは、抗ＥＧＦＲ抗体の使用について当業者に知られるあらゆる目的のために使用できる。例えば、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を、治療目的、診断目的、産業目的および／または研究目的の一つ以上のために使用できる。特に、ここに提供する方法は、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の治療使用のための方法を含む。いくつかの例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を、ＥＧＦＲを含む標的細胞、例えば、例えば癌細胞の死滅のために使用できる。いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲを阻止、拮抗または刺激できる。このような活性のおかげで、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体またはそのフラグメントを、腫瘍、癌または転移を含むが、これらに限定されないあらゆる抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態の処置のために、患者または対象に投与できる。治療用途は、治療有効量の抗ＥＧＦＲ抗体の、単独でのまたは他の処置または処置剤と組み合わせての投与を含む。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントを、現存するセツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体を使用するあらゆる疾患または状態の処置のための治療剤として使用できる。抗ＥＧＦＲ抗体は、投与したとき、対象において、他の抗ＥＧＦＲ抗体の投与後に見られる副作用と比較して、副作用が軽減するかまたは少ない。抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体での疾患および状態の処置は、点滴、皮下注射、筋肉内、皮内、経口および局所および経皮投与を含むが、これらに限定されない、ここに記載する適当な製剤を使用して、任意の適当な投与経路により行い得る。
本明細書に記載するとおり、現存するセツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体は、投与したとき、対象において局所および全身副作用、特に、皮膚副作用を誘発し得る。これらの副作用は治療使用を制限する。多くの場合、これらの副作用は、中性生理的ｐＨ環境、例えば真皮でのＥＧＦＲへの結合と関係する。中性ｐＨ(例えば、凡そまたは正確に７.０〜７.４(両端を含む)のｐＨ)および／または０.５mM〜５mM(例えば、１mM)の正常乳酸濃度の一方または両方を含む条件下と比較して、約５.６〜約６.８、特に６.０〜６.５(両端を含む)の範囲の低ｐＨおよび／または１５mM〜２０mM(例えば、１６.６mMまたは１６.７mM)の乳酸濃度の一方または両方を含む条件下で高活性であるここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、ここに記載するあらゆる疾患または状態の処置のために投与できる。この活性のおかげで、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体の１個以上の副作用と関係する中性生理的環境、例えば皮膚基底層よりも、腫瘍環境(低ｐＨおよび／または高乳酸濃度を有し得る)で大きな活性を有し得る。これは、局所および全身副作用を含む副作用の軽減または予防のために、罹患組織、例えば腫瘍組織へのターゲティング治療により有利であり得る。
それゆえに、軽減した副作用を伴うここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、高用量レジメンで使用でき、有効性および安全性を改善できる。現存する抗ＥＧＦＲ抗体治療剤、例えばセツキシマブで見られるのと比較して軽減し得る副作用は、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる望ましくない非治療的作用、例えば悪心、嘔吐、胸部絞扼感、頭痛および関連心血管効果、例えば、血圧不安定および動脈狭窄、皮膚毒性、骨髄抑制、心毒性、脱毛、腎機能不全、口内炎、貧血、発作、免疫反応、例えば急性アナフィラキシー、血清病、抗体産生、感染、癌、自己免疫疾患および心毒性を含む。いくつかの例において、現存する抗ＥＧＦＲ抗体治療剤、例えばセツキシマブの投与が原因の副作用と比較して、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、非修飾ＥＧＦＲ抗体の１種以上の副作用の重症度と比較して、１種以上の副作用の重症度を、少なくともまたは約９９％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約６５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約５５％、少なくともまたは約５０％、少なくともまたは約４５％、少なくともまたは約４０％、少なくともまたは約３５％、少なくともまたは約３０％、少なくともまたは約２５％、少なくともまたは約２０％、少なくともまたは約１５％または少なくともまたは約１０％軽減させる。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体、例えば修飾抗ＥＧＦＲ抗体および抗体フラグメントは、投与したとき、投与によりある副作用が生じ得る他のセツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体と比較して、対象で副作用が少ないかまたは軽減し得ることは理解される。耐容性副作用の数および程度は、化合物が投与される状態によることは理解される。例えば、軽度の結果となる障害の処置のときには容認されない、ある種の毒性および望ましくない副作用が、命を脅かす病気の処置に際しては容認される。治療使用に有効な量は、疾患の重症度および対象の体重および一般的状態ならびに投与経路による。治療剤の局所投与は、典型的に全身投与のあらゆる様式より少ない投与量を必要とするが、治療剤の局所濃度は、ある場合には、全身投与により安全性を伴い達成し得るものより局所投与後には高いことがある。
このセクションは、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の使用および投与法の例を記載する。これらの記載する使用は例であり、ここに記載する抗体の適用を制限しない。抗ＥＧＦＲ抗体を使用して処置可能な疾患または状態の同定は処置医の技術の範囲内である。
１. 疾患および状態の例
ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、抗ＥＧＦＲ抗体が使用できるあらゆる治療目的のために使用できる(例えば、Reeves et al. (2011) Otolaryngol Head Neck Surg. 144(5):676-84; Adams et al. (2008) Expert Rev Anticancer Ther. 8(8):1237-45; Belda-Iniesta et al. (2006) Cancer Biol Ther. 5(8):912-4; Liu et al. (2010) Cancer Chemother Pharmacol. 65(5):849-61参照)。いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体を、抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる疾患または障害の処置のために患者に投与する。いくつかの例において、疾患の処置は、ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、疾患の症状と闘うために、疾患の臨床的顕在化後である。いくつかの例において、ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、疾患の根絶のために投与する。ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる疾患または障害の例は、自己免疫性および炎症性疾患、感染症および癌を含む。
ａ. 癌
ＥＧＦＲは、多様なヒト悪性腫瘍、例えば肺癌、頭頸部癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌および神経膠腫において癌発症および進行と関係する。ＥＧＦＲ関連分子因子、例えばコピー数および遺伝子変異が、癌の予後診断的および予測的因子として同定されている(例えば、Bronte et al. (2011) Front Biosci. 3:879-887; Harding and Burtness (2005) Drugs Today 41(2):107-127参照)。例えば、高ＥＧＦＲ発現は、頭頸部扁平上皮細胞癌(ＨＮＳＣＣ)を有する患者の予後不良と関係する(Szabo et al. (2011) Oral Oncol. 47(6):487-496)。
ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦ受容体と結合し、刺激を阻止できる。ｐＨ選択的結合により、結合活性は、酸性ｐＨおよび高乳酸濃度の一方または両方を示す腫瘍微小環境に選択的である。例えば、改変されたｐＨ微小環境は、疾患状態で見られる最も一般的微小環境、例えば腫瘍微小環境であり、低酸素症のような他の特性と比較して、疾患微小環境内で最も均一性である(例えば、Fogh Andersen et al. (1995) Clin. Chem., 41:1522-1525; Bhujwalla et al. (2002) NMR Biomed., 15:114-119; Helmlinger et al. (1997) Nature Med., 3:177; Gerweck and Seetharaman (1996), Cancer Res. 56(6):1194-1198参照)。例えば、多くの腫瘍で、‘ワールブルグ効果’が約５.６〜約６.８、例えば正確にまたは凡そまたは正確にｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８未満の範囲のｐＨを有する微小環境を作る。それゆえに、中性ｐＨよりも酸性ｐＨで高活性である抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を使用して、非標的疾患細胞または組織での活性を最小にしながら、ＥＧＦＲ発現腫瘍を処置できる。
さらに、多くの腫瘍において、‘ワールブルグ効果’は、１０〜２０mMの乳酸濃度の微小環境を作る。高乳酸レベルは、頭頸部、転移結腸直腸癌、頸部癌および扁平上皮細胞癌を含むが、これらに限定されない多様な腫瘍と関係することが判明している(例えば、Walenta et al., (1997) American Journal of Pathology 150(2): 409-415; Schwickert et al., (1995) Cancer Research 55: 4757-4759; Walenta et al., (2000) Cancer Research 60: 916-921; Guo et al., (2004) J Nucl Med 45: 1334-1339; Mathupala et al., (2007) J Bioenerg Biomembr 39: 73-77; Holroyde et al., (1979) Cancer Research 39: 4900-4904; Schurr and Payne. (2007) Neuroscience 147: 613-619; and Quennet et al., (2006) Radiotherapy and Oncology 81: 130-135参照)。それゆえに、正常生理的乳酸濃度よりも高乳酸濃度で高活性である抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、非標的疾患細胞または組織での活性を最小化しながら、ＥＧＦＲ発現腫瘍の処置に使用できる。
修飾抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲへの結合は、受容体の機能的活性により阻害できる。例えば、修飾抗ＥＧＦＲ抗体の受容体への結合は、上皮成長因子(ＥＧＦ)の結合を阻害できおよび／または抗体−受容体複合体の内部移行をもたらし得る(Harding and Burtness, Drugs Today (Barc))。それゆえに、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、受容体リン酸化および受容体関連キナーゼ活性の活性化を阻止し、最終的に受容体介在細胞シグナル伝達を遮断できる。
ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントを、ＥＧＦＲを発現する、固形腫瘍を含む腫瘍の処置に使用できる。ＥＧＦＲ発現腫瘍は、その局所微小環境に存在するＥＧＦに感受性であり得て、腫瘍が産生するＥＧＦまたはトランスフォーミング増殖因子−アルファ(ＴＧＦ−α)によりさらに刺激され得る。提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置または予防できる疾患および状態は、例えば、腫瘍増殖がＥＧＦＲ傍分泌および／または自己分泌ループにより刺激されるものを含む。ここに記載する処置は、それゆえに、血管が新生されていないかまたはまだ実質的に血管が新生されていない腫瘍の処置に有用であり得る。
さらに、ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、腫瘍関連血管形成を阻止できる。血管内皮のＥＧＦＲ刺激は、腫瘍の血管新生と関係する。典型的に、血管内皮は、ＥＧＦおよび／または他の源由来のＴＧＦ−α(例えば、腫瘍細胞)により傍分泌形態で刺激される。したがって、抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、血管が新生された腫瘍または新生物を有する対象の処置に有用であり得る。
処置できる腫は、原発腫瘍および転移腫瘍、ならびに難治性腫瘍を含む。難治性腫瘍は、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独またはこれらの組み合わせでの処置に応答しなかったまたは抵抗性である腫瘍である。難治性腫瘍はまた、このようなものでの処置で阻止されたように見えるが、処置中止後５年以内に再発する、ある場合、最大１０年またはそれ以上で再発する腫瘍も含む。腫瘍は正常レベルでＥＧＦＲを発現しても、例えば、正常レベルの少なくとも１０倍、１００倍または１０００倍であるレベルでＥＧＦＲを発現してもよい。
ＥＧＦＲを発現し、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントで処置できる腫瘍の例は、癌、神経膠腫、肉腫(脂肪肉腫を含む)、腺癌、腺肉腫および腺腫を含む。このような腫瘍は、例えば、乳、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸または肝臓を含む、実質的に体の全ての部分で生じ得る。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびそのフラグメントで処置できる腫瘍の例は、ＥＧＦＲを過発現するものを含む。ＥＧＦＲ過発現が観察され、処置できるいくつかの腫瘍は、結腸直腸および頭頸部腫瘍、特に頭頸部の扁平上皮細胞癌、脳腫瘍、例えば神経膠芽腫および肺、乳、膵臓、食道、膀胱、腎臓、卵巣、子宮頸および前立腺の腫瘍を含むが、これらに限定されない。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗体フラグメントで処置できる腫瘍の他の例は、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽腫、毛細血管芽腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、消化器癌および腎癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫(例えば多形神経膠芽腫)および平滑筋肉腫を含む。ＥＧＦＲを発現し得る癌の例は、リンパ腫、芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫および白血病またはリンパ系悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。このような癌の例は、血液系腫瘍、例えばホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫(バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉症、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病)、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆体細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病を含む成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大型顆粒リンパ性白血病、ランゲルハンス細胞組織球症、成熟を伴うＡＭＬ、分化なしのＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球白血病を含む急性骨髄性白血病のような骨髄球性腫瘍、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性障害；中枢神経系の腫瘍、例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫および網膜芽細胞腫；頭頸部(例えば、鼻咽頭癌、唾液腺癌および食道癌)、肺(例えば、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌)、消化器系(例えば、消化器癌を含む胃部または胃癌、胆道または胆管の癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌および肛門癌)、生殖器系(例えば、精巣癌、陰茎癌または前立腺癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、子宮頸部、卵巣癌および子宮内膜癌)、皮膚(例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、光線性角化症)、肝臓(例えば、肝臓の癌、肝癌、肝細胞癌および肝細胞腫)、骨(例えば、骨巨細胞腫および溶骨性骨癌)、付加的組織および臓器(例えば、膵癌、膀胱癌、腎臓のまたは腎性の癌、甲状腺癌、乳癌、腹膜の癌およびカポジ肉腫)の固形腫瘍および血管系の腫瘍(例えば、血管肉腫および血管外皮腫)を含むが、これらに限定されない。
ｂ. 非癌過増殖性疾患
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗体フラグメントは、対象における非癌過増殖性疾患の処置に使用できる。ＥＧＦＲは、Ｇタンパク質共役型受容体(ＧＰＣＲｓ)、サイトカイン、受容体チロシンキナーゼおよびインテグリンから多様な細胞性応答、例えばマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化、遺伝子転写および増殖へのシグナル伝達における重要な経路要素である。ＥＧＦＲへのリガンド結合は細胞質チロシン残基の自己リン酸化を誘発でき、これが、細胞増殖における細胞経路を開始できる。過発現および／または過刺激が過増殖を起こし得る。例えば、ＥＧＦＲ ｖIII変異は、ＥＧＦＲ受容体に構成的に活性キナーゼ機能を持たせ、細胞増殖を刺激する。抗ＥＧＦＲ抗体が非癌過増殖性障害を処置できることは当分野で知られる。例えば、胃の稀な前悪性、非癌性、過増殖性障害であるメネトリエ病をセツキシマブで処置できる(Fiske et al. (2009) Sci Trasl. Med. 1(8): 8ra18; Myers et al.(2012) Mol. Cell. Proteomics 11:10.1074/mcp.M111.015222, 1-15)。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる過増殖性疾患の疾患は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できるあらゆる過増殖性疾患を含み、例えば、乾癬、日光角化症および脂漏性角化症、疣贅、ケロイド瘢痕および湿疹を含む。またウイルス感染、例えばパピローマウイルス感染が原因の過増殖性疾患も含む。異なるタイプの乾癬は、例えば膿様疱疹(膿疱性乾癬)、皮膚の重度脱落(紅皮症乾癬)、液滴様点(滴状乾癬)および滑らかな炎症病変(逆性乾癬)のような特徴を示し得る。乾癬の処置は、全てのタイプの乾癬の処置を含むと理解される(例えば、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、紅皮症乾癬、関節症性乾癬、類乾癬、掌蹠膿疱症)。
ｃ. 自己免疫疾患または障害
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗体フラグメントを使用して、自己免疫疾患または障害を処置できる。ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる自己免疫疾患または障害の例は、同種異系間島移植片拒絶反応、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、抗好中球細胞質自己抗体(ＡＮＣＡ)、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性蕁麻疹、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン症候群、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素疾患、クローン病、皮膚筋炎、円板状狼瘡、必須混合型クリオグロブリン血症、第VIII因子欠損、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主疾患(ＧＶＨＤ)、橋本甲状腺炎、血友病Ａ、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、ＩｇＡニューロパチー、ＩｇＭ多発神経障害、免疫介在血小板減少症、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合型結合組織疾患、多発性硬化症、１型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、固形臓器移植片拒絶、スティッフマン症候群、全身エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血栓性血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、例えば、疱疹状皮膚炎脈管炎、白斑症およびウェゲナー肉芽腫を含むが、これらに限定されない。
ｄ. 炎症性障害
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗体フラグメントを、炎症性疾患または障害の処置に使用できる。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる炎症性障害は、急性呼吸促迫症候群(ＡＲＤＳ)、急性敗血症性関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性脈管炎、アレルギー、喘息、アテローム性動脈硬化症、慢性細菌感染またはウイルス感染による慢性炎症、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、冠動脈疾患、脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解、急性および遅延型過敏反応と関係する炎症、腫瘍、末梢神経傷害または脱髄性疾患と関係する炎症、組織外傷、例えば、熱傷および虚血と関係する炎症、髄膜炎による炎症、多臓器傷害症候群、肺線維症、敗血症および敗血症性ショック、スティーブンス・ジョンソン症候群、未分化関節症および未分化脊椎関節症を含むが、これらに限定されない。
ｅ. 感染症
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗体フラグメントを使用して、感染症を処置できる。ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる感染症は、ウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫のような病原体が原因の疾患を含むが、これに限定されない。感染症は、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、デング、エプスタイン・バー、ハンタ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスII型、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、インフルエンザ、麻疹、ムンプス、パポーバウイルス、ポリオ、呼吸器多核体ウイルス、牛疫、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹、ＳＡＲＳウイルス、天然痘およびウイルス性髄膜炎を含むウイルスが原因であり得る。感染症はまた、バチルス・アントラシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・トラコマチス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・テタニ、ジフテリア、大腸菌、レジオネラ、ヘリコバクター・ピロリ、マイコバクテリウム・リケッチア、マイコプラズマ・ナイセリア、百日咳、シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、ビブリオ・コレラエおよびエルシニア・ペスチスを含む細菌が原因であり得る。感染症はまた、真菌、例えば、アスペルギルス・フミガーツス、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ・アルビカンス、コクシジオイデス・イミチス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツムおよびペニシリウム・マルネッフェイが原因であり得る。感染症はまた原虫および寄生虫、例えばクラミジア、コクシジウム、リーシュマニア、マラリア、リケッチアおよびトリパノソーマが原因であり得る。
ｆ. 他の疾患および状態
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体およびその抗体フラグメントを使用して、ＥＧＦＲの発現が関係しているおよび／または既存のセツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体での処置が知られる他の疾患および状態を処置できる。ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体で処置できる他の疾患および状態は、心臓状態、例えば、うっ血性心不全(ＣＨＦ)、心筋炎および心筋の他の状態；皮膚状態、例えば、酒さ、アクネおよび湿疹；骨および歯状態、例えば、骨量減少、骨粗鬆症、ページェット病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、歯周病、廃用性骨減少、骨軟化症、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、骨転移、骨疼痛管理、液性悪性高カルシウム血症、歯周再建、脊髄傷害および骨折；代謝状態、例えば、ゴーシェ病；内分泌条件、例えば、クッシング症候群および神経学状態を含むが、これらに限定されない。
２. 治療の対象
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体での治療の対象または候補は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与により処置できる疾患または状態、例えばここに記載するまたは当分野で知られる疾患または状態を有するヒト患者のような対象を含むが、これに限定されない。
ａ. ＥＧＦＲを過発現する対象の選択
いくつかの例において、治療の対象または候補で、例えば膜結合タンパク質および／または全ホモジネートのウェスタンブロッティング(ＷＢ)および組織マイクロアレイ上の免疫組織化学(ＩＨＣ)のような、当分野で知られる方法を使用して陽性ＥＧＦＲ発現の証拠を試験する。さらに、リン酸化ＥＧＦＲ(ｐＥＧＦＲ)をウェスタンブロットで試験できる(例えば、Thariat et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1313参照)。ＥＧＦＲ評価を、例えば、ＥＧＦＲ ＰＨＡＲＭＤＸ点数化ガイドラインを使用して評価できる(Dako, Glostrup, Denmark)。ＥＧＦＲ発現を、最大密度のＥＧＦＲ陽性細胞を含み得る腫瘍侵襲の最深領域で評価でききる。このような方法は、当業者の能力の範囲内である(例えば、Ervin-Haynes et al. (2006) J. Clin. Oncol. ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol. 24, No. 18S (June 20 Supplement)13000; Goldstein and Armin (2001) Cancer 92(5):1331-1346; Bibeau et al. (2006) Virchows Arch. 449(3):281-287参照)。
ｂ. ＥＧＦＲ関連多型を示す対象の選択
いくつかの例において、治療の対象または候補を、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の有効性を予測するために、１個以上の多型についてスクリーニングし得る。多くの抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾ＥＧＦＲ抗体と相互作用できる受容体がヒト集団で多型である。ある患者または患者集団について、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の有効性は、タンパク質における特異的多型の存在または不在により影響を受け得る。
例えば、ＦｃγＲIIIａは１５８位では多型であり、通常Ｖ(高親和性)またはＦ(低親和性)である。Ｖ／Ｖホモ接合遺伝子型を有する患者は強いナチュラルキラー(ＮＫ)応答を開始し、抗ＣＤ２０抗体リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)での処置に対する臨床的応答が良好であることが観察されている(Dall’Ozzo et. al. (2004) Cancer Res. 64:4664-4669)。さらなる多型は、ＦｃγＲIIａ Ｒ１３１またはＨ１３１を含むが、これらに限定されず、このような多型は、多型によってＦｃ結合および続く生物活性を増加または減少することが知られる。
いくつかの例において、治療の対象または候補を、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の有効性を予測するために、１個以上の多型についてスクリーニングし得る。このような方法は、当業者の能力の範囲内である。この情報を使用して、例えば、適切な投与量および処置選択肢について医師および患者に指針を提供するために、臨床試験、または、承認後に含ませるまたは除外する患者の選択ができる。例えば、ＦｃγＲIIIａ １５８Ｆについてホモ接合またはヘテロ接合である患者において、抗体薬物、例えば抗ＣＤ２０ ｍＡｂリツキシマブの有効性は低減し得て(Cartron 2002 Blood 99: 754-758; Weng 2003 J. Clin. Oncol. 21:3940-3947)、このような患者はここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体に対する良好な臨床的応答を示し得る。
ｃ. 抗ＥＧＦＲ関連副作用を示す対象の同定
いくつかの例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体での治療の対象または候補は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば当分野で知られる抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかの投与により１個以上の副作用を経験している対象、例えばヒト患者を含むが、これに限定されない。副作用の原因となった抗ＥＧＦＲ抗体治療に代えて、対象へのここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、副作用を軽減または減少させながら、同等なまたは改善された治療有効性をもたらし得る。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の投与量および投与頻度を含む投与レジメンは、先の抗ＥＧＦＲ抗体治療と同一でも異なってもよい。ある場合には、投与量を増加しても減少してもよい。処置する特定の対象、疾患または状態の性質、存在する症状または副作用の性質および投与する特定のここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体のような因子に基づき、投与レジメンを決定するのは開業医の技術の範囲内である。
本明細書に記載するとおり、ＥＧＦＲは多くの正常ヒト組織で発現する(Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5)。それゆえに、多くのセツキシマブのような治療用抗ＥＧＦＲ抗体の投与は望ましくない反応をもたらし得る。このような副作用は当業者に周知であり、評価または同定できる。抗ＥＧＦＲ抗体治療が原因の副作用を同定する方法は、ここに記載するあらゆる方法、例えば患者臨床的面接、患者診察および血液検査を含む。評価できる副作用は、例えば、セツキシマブの投与と関係する副作用のような、ここに記載するあらゆる副作用を含む、抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関係することが当業者に知られるあらゆる副作用を含む。
例えば、セツキシマブの副作用は、症候性低マグネシウム血症、爪囲炎、発熱、皮膚科学的毒性、顔面および躯幹上部の丘疹小水疱性皮疹、発毛異常、頭毛喪失、顔の毛および睫毛の成長増加、皮膚の乾燥および痒みおよび圧痛を伴う爪周囲炎を含む、ここに記載するおよび／または当業者に知られるあらゆるものを含む(Eng (2009) Nat. Rev. 6:207-218; Schrag et al. (2005) J. Natl. Cancer Inst. 97(16):1221-1224; Lacouture and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5)。いくつかの例において、セツキシマブの副作用は、丘疹膿疱性皮疹、乾燥皮膚、掻痒、眼および爪変化、ざ瘡様皮膚反応、ざ瘡様発疹、ざ瘡様濾胞性発疹、アクネ様発疹、斑点状丘疹皮膚発疹、単形性膿疱性病変、丘疹膿疱性反応を含む、皮膚科毒性を含む(Lacouture and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5)。
副作用は外部事象により誘発され得るおよび／または経時的に進行し得る。例えば、皮膚発疹は日光暴露により誘発され得て、感覚障害、紅斑および浮腫(例えば、１週目)；丘疹膿疱性皮疹(例えば、２週目)および痂皮(例えば、４週目)のように段階的に進行し得る。発疹の処置が成功すれば、紅斑および乾燥皮膚は、丘疹膿疱性皮疹に先に罹患していた領域に見られ得る(例えば、４〜６週目)。セツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関係し得る他の皮膚科毒性は、掻痒、紅斑および爪囲炎を含む(Lacouture, and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12, 1-5)。例えば、セツキシマブは、患者の約５％で免疫応答を誘発する。このような免疫応答は、循環からの抗体またはフラグメントの免疫複合体が介在するクリアランスをもたらし得て、治療に不適な反復投与を行い、それにより患者の治療利益を減少し、抗体の再投与を制限する。
いくつかの例において、副作用の重症度を、国立癌研究所有害事象共通用語規準(ＣＴＣＡＥ)ｖ４.０に従い評価でき、これは、副作用重症度の等級付けの基準を示す。ＣＴＣＡＥは、各有害作用の重症度の特有の臨床記述を示す、グレード１〜５を含む。ＣＴＣＡＥの一般的ガイドライン下では、グレード１有害事象は軽度、無症候性または軽度症候性であり、臨床的または診断的観察のみであり、介入は示されない。グレード２有害事象は中程度であり、年相応の手段的日常生活動作(ＡＤＬ)を制限する、最小限の、局所または非浸潤性介入が指示される。グレード３有害事象は、セルフケアＡＤＬを無能にし、制限する、重度であるかまたは医学的に顕著であるが、直ぐに命を脅かすものではなく、入院または入院の延長が指示される。グレード４有害事象は命を脅かす結果となり、緊急介入が指示される。グレード５有害事象は、有害事象に関連する死と分類される。それゆえに、例えば、特定のグレードの副作用を有する対象へのここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の投与は、ＣＴＣＡＥ ｖ４.０の下に分類される副作用グレードの低減により特徴付けられる、副作用の減少をもたらし得る。いくつかの例において、副作用の減少は、ここに記載するまたは当業者に知られるあらゆる症状を含む、副作用と関連する症状の軽減により特徴付けられる。
抗ＥＧＦＲ抗体の副作用を示す患者を同定するための他の方法は当業者に知られ、クオリティ・オブ・ライフ質問表を含む(例えば、Jonker et al. (2007) N. Engl. J. Med. 357:2040-2048)。抗ＥＧＦＲ抗体の副作用および副作用の重症度を決定することが当業者に知られる方法の例を次に記載する。これらの副作用は例であり、限定することを意図しない。セツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体と関連する当分野で知られるまたはここに記載するあらゆる副作用を対象で同定でき、それにより、そのような副作用がさらに悪化しないおよび／または軽減するように、その後対象をここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体で処置できることは理解される。
ｉ. 皮膚毒性
ヒト皮膚において、ＥＧＦＲは基底ケラチン生成細胞で発現し、上皮増殖を刺激し、分化を阻害し、創傷治癒を加速できる(Lacouture and Melosky (2007) Skin Therapy Lett. 12:1-5；Nanney et al. (1996) J. Invest. Dermatol 94(6):742-748)。それゆえに、基底ケラチン生成細胞で発現したＥＧＦＲと相互作用し、阻害する抗ＥＧＦＲ抗体は、ケラチン生成細胞の増殖および遊走を障害し、炎症性ケモカイン発現に至り得る。これらの作用は炎症性細胞動員および続く皮膚傷害に至り得、これは、副作用、例えばここに記載する副作用を生じ得る。皮膚基底層環境のｐＨは中性である(例えば、正確にまたは凡そｐＨ７.０〜７.４)。それゆえに、中性ｐＨよりも低ｐＨで活性が増加する修飾抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体は皮膚毒性を減少させ、副作用を減少させ得る。皮膚のＥＧＦＲ阻害が原因の副作用ならびにその同定および分類法の例を次に記載する。
丘疹小水疱性皮疹およびざ瘡様発疹は、典型的に顔面、頭皮および胸および背中の上部に出現する、丘疹(小さな盛り上がった面皰)および膿疱(小さな膿汁で満たされた疱疹)からなる皮疹である。アクネと異なり、丘疹小水疱性皮疹には白色頭部または黒色面皰は存在せず、症候性であり、痒いまたは圧痛のある病変を伴い得る(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010)。丘疹小水疱性皮疹およびざ瘡様発疹は、患者の診察および／または臨床的面接により同定および分類できる。グレード１丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、＜１０％体表面(ＢＳＡ)を覆う丘疹および／または膿疱と分類され、これは掻痒または圧痛の症状と関連し得る。グレード２丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、１０〜３０％ＢＳＡを覆う丘疹および／または膿疱と分類され、これは掻痒または圧痛の症状と関連し得る；心理社会的影響と関係し、手段的日常生活動作(ＡＤＬ)を制限する。グレード３丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、＞３０％ＢＳＡを覆う丘疹および／または膿疱と分類され、これは掻痒または圧痛の症状と関連し得る；セルフケアＡＤＬを制限し、局所重複感染と関連し得て、経口抗生物質が指示される。グレード４丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、あらゆるパーセントのＢＳＡを覆う丘疹および／または膿疱と分類され、これは掻痒または圧痛の症状と関連し得て、大規模重複感染と関連し、ＩＶ抗生物質が支持され、命を脅かす結果となる。グレード５丘疹小水疱性皮疹またはざ瘡様発疹は、死亡に至ると分類される(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010；Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
セツキシマブのような抗ＥＧＦＲ抗体の副作用の例は乾燥皮膚であり、これは、鱗状で色のくすんだ皮膚；細孔があり紙のように薄い皮膚肌目により特徴付けられる障害である。乾燥皮膚患者の診察および／または臨床的面接により同定および分類できる。グレード１乾燥皮膚は、＜１０％ＢＳＡを覆い、紅斑または掻痒を伴わないとして分類される。グレード２乾燥皮膚は、１０％〜３０％ＢＳＡを覆い、紅斑または掻痒を伴い、手段的ＡＤＬを制限するとして分類される。グレード３乾燥皮膚は＞３０％ＢＳＡを覆うと分類され、掻痒と関係し、セルフケアＡＤＬを制限する(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010；Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
皮膚色素増加症は、過剰のメラニン沈着による皮膚の暗色化により特徴付けられる副作用である。皮膚色素増加症は、患者の診察および／または臨床的面接により同定および分類できる。グレード１皮膚色素増加症は、＜１０％ＢＳＡを覆う色素増加症と分類され、心理社会的影響はない。グレード２皮膚色素増加症は、＞１０％ＢＳＡを覆う色素増加症と分類され、心理社会的影響と関係する(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010；Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
掻痒は、激しい掻痒感により特徴付けられる副作用である。掻痒は、患者の診察および／または臨床的面接により評価できる。グレード１掻痒は、軽度または局所の掻痒感により特徴付けられ、局所介入が指示される。グレード２掻痒の症状は、激しいまたは広範な掻痒感、間欠性掻痒感、ひっかき行動による皮膚変化(例えば、浮腫、丘疹形成、表皮剥離、苔癬化、滲出／痂皮)を含み、手段的ＡＤＬを制限し、経口介入が指示され得る。グレード３掻痒の症状は、激しい、広範なおよび／または定常性の掻痒感を含み、セルフケアＡＤＬまたは睡眠を制限し、経口コルチコステロイドまたは免疫抑制性治療が指示され得る(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010；Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
爪囲炎は、爪周囲の軟組織が関与する感染過程により特徴付けられる副作用である。爪囲炎は、患者診察および／または臨床的面接により評価できる。グレード１爪囲炎は、爪郭浮腫または紅斑および甘皮の破壊の症状を含むと分類される。グレード２爪囲炎の症状は、局在化介入指示、経口介入指示(例えば、抗生物質、抗真菌、抗ウイルス)、疼痛を伴う爪郭浮腫または紅斑、分泌または爪甲分離を含み得て、手段的ＡＤＬを制限する。グレード３爪囲炎の症状はセルフケアＡＤＬの制限を含み、外科的介入またはＩＶ抗生物質指示を伴う。
ii. 低マグネシウム血症
ＥＧＦＲは腎臓、特にヘンレ係蹄の上行性肢で高度に発現され、そこで濾過マグネシウムの７０％が再吸収される。それゆえに、ＥＧＦＲと相互作用する抗体はマグネシウム輸送を妨害し得る。血液中のマグネシウムが低濃度である低マグネシウム血症は、抗ＥＧＦＲ抗体投与の副作用であり得る。一つの研究で、セツキシマブ治療を受けている患者の５％がグレード３または４低マグネシウム血症を示す。
ヘンレ係蹄は中性ｐＨ(例えば、ｐＨ６.９〜７.４)を有する(Dieleman et al.(2001) J. Acquir Immune Defic Syndr. 28(1):9-13; Dantzler et al. (2000) Pflugers Arch. 440(1):140-148)。それゆえに、中性ｐＨより低ｐＨで高活性を有する修飾抗ＥＧＦＲ抗体、例えばここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、低マグネシウム血症を低減し得る。
低マグネシウム血症は、血清マグネシウムレベルの測定により診断および／または評価できる。例えば、ＣＴＣＡＥは、グレード１低マグネシウム血症を、＜正常下限(ＬＬＮ)〜１.２mg／dLの血清マグネシウム濃度；グレード２低マグネシウム血症を１.２〜０.９mg／dL血清マグネシウム；グレード３低マグネシウム血症を＜０.９〜０.７mg／dL血清マグネシウム、グレード４低マグネシウム血症を＜０.７mg／dL血清マグネシウムであり、かつ命を脅かす結果を伴い得る、そしてグレード５低マグネシウム血症は死をもたらすとして分類する。さらに、低マグネシウム血症の症状は当業者に知られ、疲労、錯感覚および低カルシウム血症を含む(CTCAE v. 4.03, U.S. Department of Health and Human Services, published June 14, 2010；Schrag J. Natl. Cancer. Inst. 97(16):1221-1224)。
ｄ. 処置対象を選択または同定する他の方法
当分野で知られる治療のために候補をスクリーニングする他の方法が意図される。例えば、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子相同体(ＫＲＡＳ)変異状態が、結腸直腸癌におけるセツキシマブ治療に対する応答に予測的であることが最近示された(Van Cutsem et al. (2008) J. Clin. Oncol 26 (May 20 suppl): Abstract 2)。ＫＲＡＳは、多くのシグナル伝達経路に役割を有するＧＴＰａｓｅである。結腸直腸癌の２５％超に存在するＫＲＡＳをコードする遺伝子の変異は、ＥＧＦＲ阻害薬物の成功に予測的である。変異ＫＲＡＳ遺伝子の発現は、ＥＧＦＲ阻害剤治療に対する応答を減少させる。ＫＲＡＳ変異は、市販の検査診断薬により検出できる。
３. 投与量
治療有効量の抗ＥＧＦＲ抗体または抗体フラグメントを、ここに提供するまたは当業者に知られるあらゆる疾患または状態の処置に投与できる。このような投与量は、当業者、例えば処置医により経験的に決定できる。いくつかの例において、投与する投与量は、特定の疾患または状態に対するセツキシマブのような既知抗ＥＧＦＲ抗体の投与量を参照し得る。ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の治療有効濃度は、既知インビトロおよびインビボ系で抗ＥＧＦＲ抗体を試験することにより、例えばここに提供するまたは当分野で知られるアッセイを使用して試験することにより、経験的に決定できる。
治療的に投与する抗ＥＧＦＲ抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路および患者の状態による。さらに、処置医は、疾患の重症度およびタイプ、患者の健康状態、体重、性別、食習慣、投与の時間および経路、他の投薬および他の関連する臨床因子を含む、薬物の作用を修飾することが知られる種々の因子を考慮し得る。さらに、治療者は、副作用、例えばここに記載するまたは当分野で知られる副作用の発生率および重症度を考慮し得る。したがって、治療者は抗体またはその抗原結合フラグメントの投与量をタイトレーションし、必要に応じて投与経路を修飾して、最適な治療効果と最小の望ましくない副作用を得ることができる。臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで抗体を投与し得る。この治療の進行を、ここに記載するまたは当分野で知られる慣用のアッセイによりモニターできる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与量は、副作用を軽減または排除しながら、活性を達成するのに必要な最適または最小投与量を同定するために変えてよい。
一般に、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の投与のための投与量範囲は、抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態の症状が軽減される所望の治療効果を生じるのに十分に多い。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度により変わり、当業者により決定され得る。いくつかの例において、投与量は、有害副作用の原因となるほど大量ではない。何らかの有害副作用が出現した際には、個々の医師は投与量を調節できる。
投与量の例は、凡そまたは正確に０.１mg／kg〜１００mg／kg、例えば少なくとも凡そまたは正確に約０.１mg／kg、凡そまたは正確に０.１５mg／kg、凡そまたは正確に０.２mg／kg、凡そまたは正確に０.２５mg／kg、凡そまたは正確に０.３０mg／kg、凡そまたは正確に０.３５mg／kg、凡そまたは正確に０.４０mg／kg、凡そまたは正確に０.４５mg／kg、凡そまたは正確に０.５mg／kg、凡そまたは正確に０.５５mg.kg、凡そまたは正確に０.６mg／kg、凡そまたは正確に０.７mg／kg、凡そまたは正確に０.８mg／kg、凡そまたは正確に０.９mg／kg、凡そまたは正確に１.０mg／kg、凡そまたは正確に１.１mg／kg、凡そまたは正確に１.２mg／kg、凡そまたは正確に１.３mg／kg、凡そまたは正確に１.４mg／kg、凡そまたは正確に１.５mg／kg、凡そまたは正確に１.６mg／kg、凡そまたは正確に１.７mg／kg、凡そまたは正確に１.８mg／kg、凡そまたは正確に１.９mg／kg、凡そまたは正確に２mg／kg、凡そまたは正確に２.５mg／kg、凡そまたは正確に３mg／kg、凡そまたは正確に３.５mg／kg、凡そまたは正確に４mg／kg、凡そまたは正確に４.５mg／kg、凡そまたは正確に５mg／kg、凡そまたは正確に５.５mg／kg、凡そまたは正確に６mg／kg、凡そまたは正確に６.５mg／kg、凡そまたは正確に７mg／kg、凡そまたは正確に７.５mg／kg、凡そまたは正確に８mg／kg、凡そまたは正確に８.５mg／kg、凡そまたは正確に９mg／kg、凡そまたは正確に９.５mg／kg、凡そまたは正確に１０mg／kg、凡そまたは正確に１１mg／kg、凡そまたは正確に１２mg／kg、凡そまたは正確に１３mg／kg、凡そまたは正確に１４mg／kg、凡そまたは正確に１５mg／kg、凡そまたは正確に１６mg／kg、凡そまたは正確に１７mg／kg、凡そまたは正確に１８mg／kg、凡そまたは正確に１９mg／kg、凡そまたは正確に２０mg／kg、凡そまたは正確に２１mg／kg、凡そまたは正確に２２mg／kg、凡そまたは正確に２３mg／kg、凡そまたは正確に２４mg／kg、凡そまたは正確に２５mg／kg、凡そまたは正確に３０mg／kg、凡そまたは正確に４０mg／kg、凡そまたは正確に５０mg／kg、凡そまたは正確に６０mg／kg、凡そまたは正確に７０mg／kg、凡そまたは正確に８０mg／kg、凡そまたは正確に９０mg／kg、凡そまたは正確に１００mg／kgまたはそれ以上を含むが、これらに限定されない。
いくつかの例において、投与量の例は、凡そまたは正確に０.０１mg／ｍ２〜凡そまたは正確に８００mg／ｍ２、例えば例えば、少なくとも凡そまたは正確に凡そまたは正確に０.０１mg／ｍ２、凡そまたは正確に０.１mg／ｍ２、凡そまたは正確に０.５mg／ｍ２、凡そまたは正確に１mg／ｍ２、凡そまたは正確に５mg／ｍ２、凡そまたは正確に１０mg／ｍ２、凡そまたは正確に１５mg／ｍ２、凡そまたは正確に２０mg／ｍ２、凡そまたは正確に２５mg／ｍ２、凡そまたは正確に３０mg／ｍ２、凡そまたは正確に３５mg／ｍ２、凡そまたは正確に４０mg／ｍ２、凡そまたは正確に４５mg／ｍ２、凡そまたは正確に５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に１００mg／ｍ２、凡そまたは正確に１５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に２００mg／ｍ２、凡そまたは正確に２５０mg／ｍ２、凡そまたは正確に３００mg／ｍ２、凡そまたは正確に４００mg／ｍ２、凡そまたは正確に５００mg／ｍ２、凡そまたは正確に６００mg／ｍ２および凡そまたは正確に７００mg／ｍ２を含むが、これらに限定されない。当業者は、mg／kg単位とmg／ｍ２単位の投与量を認識し、変換できることは理解される(例えば、Michael J. Derelanko, TOXICOLOGIST’S POCKET HANDBOOK, CRC Press, p.16 (2000)参照)。
疾患または状態の処置のために、抗ＥＧＦＲ抗体の投与量は、疾患のタイプおよび重症度により変わり得る。本抗ＥＧＦＲ抗体を一投与量で、複数の別々の投与でまたは連続点滴で投与し得る。状態によって数日またはそれより長い期間の反復投与について、処置を、疾患症状の所望の抑制が生じるまでまたは患者の状態の所望の改善が達成されるまで反復し得る。反復投与は、処置の進行によって、抗ＥＧＦＲ抗体の量の増加または減少を含み得る。例えば、初期負荷投与量は維持投与量より多くてよい。いくつかの例において、初期負荷投与量は４００mg／ｍ２であり、維持投与量は２５０mg／ｍ２である。
他の投与レジメンも意図される。例えば、投与レジメンは変わり得る。副作用減少と関係する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、高い投薬レジメンで使用できる。さらに、罹患組織で活性が増加した抗ＥＧＦＲ抗体は低い投薬レジメンで使用できる。ここに記載する投与する修飾抗ＥＧＦＲ抗体の有効性を決定する方法は当業者に知られ、例示的方法をここに記載し、経験的に適切な投与レジメンを決定するために使用できる。ここに開示する抗ＥＧＦＲ抗体の個々の投与量の最適量および間隔は、処置する状態の性質および程度、投与形態、経路および部位および処置する特定の対象の年齢および状態により決定され、医師は使用すべき適切な投与量を決定できる。この投与量は、適切である頻度で、反復できる。副作用が発生したら、通常の診療に従い、投与量および／または頻度を変更または減少し得る。このような試験および実施は当業者のレベルの範囲内である。
いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体を１日あたりまたは数日に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上投与する。いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体を２回以上の一連の投与により投与し、ここで、これらの投与は選択した期間離れている。いくつかの例において、選択した期間は少なくともまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月である。
特定の投与量または投与レジメンの副作用も、抗ＥＧＦＲ抗体の１回以上の投与量の投与後に例えば、ここに記載するまたは当分野で知られるあらゆる方法により、評価できる。投与量および／または投与頻度を、副作用のタイプおよび重症度によって修飾し得る。
当業者には当然であるが、最適処置レジメンは変わり、最適治療投与量および投与頻度を決定するために、１回以上の治療サイクルの前および後に、処置下の疾患の状態および患者の一般的健康状態を評価することは、処置方法の範囲内である。ある特定の対象に対して、特異的投与レジメンを、個々の必要性および医薬製剤を投与するまたは投与を監視する者の専門的判断により経時的に調節でき、ここに示す投与量は単なる例であり、その範囲に限定することは意図されないこともさらに理解されるべきである。疾患または状態、例えばここに記載する疾患または状態の処置のために投与すべき抗ＥＧＦＲ抗体の量は、ここに記載するまたは当分野で知られる標準臨床的技術により決定できる。さらに、インビトロアッセイおよび動物モデルを、最適投与量範囲の同定の助けとして用い得る。このようなアッセイは、ヒトのような対象への投与を推定できる、投与量範囲を提供できる。動物モデルに基づき最適投与量範囲を同定する方法は当業者に周知であり、例をここに記載する。
４. 投与経路
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を、例えば全身または局所投与を含む、ポリペプチドの投与について当分野で知られる任意の方法により対象に投与できる。抗ＥＧＦＲ抗体は、非経腸(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下または腔内)、局所、硬膜外または粘膜(例えば、鼻腔内、経口、膣、外陰腟、食道、口腔食道、気管支または肺)のような経路により投与できる。抗ＥＧＦＲ抗体を、対象に、局所または経皮作用の発揮のために、疾患部位に外的に投与できる。抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物を、任意の慣用の経路で、例えば点滴またはボラス注射または上皮性または皮膚粘膜裏層(例えば、口腔粘膜、膣、直腸および腸管粘膜)を介する吸収により投与できる。抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物を、他の生物活性剤と組み合わせて投与できる。具体例では、抗ＥＧＦＲ抗体を点滴送達、例えば点滴ポンプまたはシリンジポンプにより投与し、他の治療剤と組み合わせてまたは単剤療法として投与してよい。
投与の方法および／または経路は、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関連する有害副作用を軽減するために変えてよい。例えば、患者が軽度または中程度(すなわち、グレード１または２)急性輸液反応を経験したら、点滴速度を落としてよい(例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減速)。患者が重度(すなわち、グレード３または４)急性輸液反応を経験したら、点滴を一時的にまたは永久的に中断してよい。
いくつかの例において、対象が有害副作用、例えば重度皮膚毒性、例えば重度ざ瘡様発疹を経験したら、処置を調節できる。例えば、有害副作用発生後、投与を、１〜２週または有害副作用が改善するまでのように遅らせ得る。いくつかの例において、さらに有害副作用が発生した後、投与量を減らし得る。例えば、投与量が２５０mg／ｍ２であるとき、有害副作用の２回目の発生後、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を１〜２週遅らせ得る。副作用が改善したら、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を、投与量を２５０mg／ｍ２まで減らして続け得る。副作用の３回目の発生後、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を１〜２週遅らせ得る。副作用が改善したら、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を、投与路油を１５０mg／ｍ２まで減らして続け得る。副作用の数回の発生後、抗ＥＧＦＲ抗体の投与を中止できる。軽度または中程度皮膚毒性を有する患者において、当業者は投与量を修飾することなく投与を続けてよい。このような決定は、当業者の能力の範囲内である。
送達のための適切な方法は、抗ＥＧＦＲ抗体または抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の投与量の特性に基づき、当業者が選択できる。このような特性は、溶解度、吸湿性、結晶化特性、融点、密度、粘性、流れ、安定性および分解プロファイルを含むが、これらに限定されない。
５. 組み合わせ治療
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体は、１種以上の他の治療レジメンまたは薬剤の前に、後にまたは一緒に投与できる。熟練した開業医は経験的にまたは薬剤の薬物動態および作用機序を考慮して、各治療レジメンまたは薬剤の適切な１投与量または複数投与量ならびに適切な投与時期および方法を決定できる。付加的治療レジメンまたは薬剤は、抗ＥＧＦＲ抗体の有効性または安全性を改善し得る。いくつかの例において、付加的治療レジメンまたは薬剤は、抗ＥＧＦＲ抗体の作用を変えるよりも、同じ疾患または併存症を処置できる。いくつかの例において、付加的治療レジメンまたは薬剤は、抗ＥＧＦＲ抗体の投与と関係する当分野で知られるまたはここに記載する１個以上の副作用を寛解、軽減または排除できる。
例えば、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を化学療法剤、放射線治療または化学療法剤と放射線治療の両者とともに投与できる。修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、抗体、細胞毒性剤、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管形成剤、心保護剤、免疫刺激剤、免疫抑制性剤、血液学的細胞の増殖を促進する薬剤、血管形成阻害剤、タンパク質チロシンキナーゼ(ＰＴＫ)阻害剤、さらなる抗ＥＧＦＲ抗体、ＦｃγＲIIｂまたは他のＦｃ受容体阻害剤または他の治療剤を含むが、これらに限定されない１種以上の他の予防または治療剤と組み合わせて投与できる。
１種以上のさらなる薬剤を、抗ＥＧＦＲ抗体と同時に、逐次的にまたは間欠的に投与できる。薬剤は、例えば、同じ医薬組成物または同じ送達法の一部として、抗ＥＧＦＲ抗体と共投与できる。いくつかの例において、薬剤を、修飾抗ＥＧＦＲ抗体と同時ではあるが、異なる送達手段により、抗ＥＧＦＲ抗体と共投与できる。薬剤はまた抗ＥＧＦＲ抗体の投与と異なる時点であるが、抗ＥＧＦＲ抗体の投与と、組み合わせ予防または治療効果を有するように十分に近い時点で投与できる。いくつかの例において、１個以上のさらなる薬剤を、選択した期間離して、抗ＥＧＦＲ抗体の投与と逐次的にまたは前に投与する。いくつかの例において、該期間は１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月である。いくつかの例において、１個以上のさらなる薬剤を複数開投与しおよび／またはここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体を複数回投与する。
いくつかの例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上の抗体または抗体フラグメントと投与する。抗ＥＧＦＲ抗体を、同一疾患または付加的併存症の処置に有効性を有する１個以上の他の抗体と投与できる。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体と投与する１個以上の抗体を、抗癌抗体、自己免疫性または炎症性疾患を処置するための抗体、移植拒絶反応を処置するための抗体、移植片対宿主−疾患(ＧＶＨＤ)を処置するための抗体および感染症を処置するための抗体の中から選択できる。いくつかの例において、ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体の２個以上を、組み合わせて投与する。
ここに提供する抗ＥＧＦＲ抗体と共投与できる抗癌抗体の例は、抗１７−ＩＡ細胞表面抗原抗体、例えばPanorex(登録商標)(エドレコロマブ)；抗４−１ＢＢ抗体；抗４Ｄｃ抗体；抗Ａ３３抗体、例えばＡ３３およびＣＤＰ−８３３；抗α１インテグリン抗体、例えばナタリズマブ；抗α４β７インテグリン抗体、例えばＬＤＰ−０２；抗αＶβ１インテグリン抗体、例えばＦ−２００、Ｍ−２００およびＳＪ−７４９；抗αＶβ３インテグリン抗体、例えばアブシキシマブ、ＣＮＴＯ−９５、Ｍａｂ−１７Ｅ６およびVitaxin(登録商標)；抗補体因子５(Ｃ５)抗体、例えば５Ｇ１.１；抗ＣＡ１２５抗体、例えばOvaRex(登録商標)(オレゴボマブ)；抗ＣＤ３抗体、例えばNuvion(登録商標)(ビジリズマブ)およびRexomab；抗ＣＤ４抗体、例えばＩＤＥＣ−１５１、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａ；抗ＣＤ６抗体、例えばOncolysin BおよびOncolysin CD6；抗CD7抗体、例えばＨＢ２；抗ＣＤ１９抗体、例えばＢ４３、ＭＴ−１０３およびOncolysin B；抗ＣＤ２０抗体、例えば２Ｈ７、２Ｈ７.ｖ１６、２Ｈ７.ｖ１１４、２Ｈ７.ｖ１１５、Bexxar(登録商標)(トシツモマブ)、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)およびZevalin(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン)；抗ＣＤ２２抗体、例えばLymphocide(登録商標)(エピラツズマブ)；抗ＣＤ２３抗体、例えばＩＤＥＣ−１５２；抗ＣＤ２５抗体、例えばバシリキシマブおよびZenapax(登録商標)(ダクリズマブ)；抗ＣＤ３０抗体、例えばＡＣ１０、ＭＤＸ−０６０およびＳＧＮ−３０；抗ＣＤ３３抗体、例えばMylotarg(登録商標)(ゲムツズマブオゾガマイシン)、Oncolysin MおよびSmart Ml 95；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ４０抗体、例えばＳＧＮ−４０およびトラリズマブ；抗ＣＤ４０Ｌ抗体、例えば５ｃ８、Antova(登録商標)およびＩＤＥＣ−１３１；抗ＣＤ４４抗体、例えばビヴァツヅマブ；抗ＣＤ４６抗体；抗ＣＤ５２抗体、例えばCampath(登録商標)(アレムツズマブ)；抗ＣＤ５５抗体、例えばＳＣ−１；抗ＣＤ５６抗体、例えばｈｕＮ９０１−ＤＭ１；抗ＣＤ６４抗体、例えばＭＤＸ−３３；抗ＣＤ６６ｅ抗体、例えばＸＲ−３０３；抗ＣＤ７４抗体、例えばＩＭＭＵ−１１０；抗ＣＤ８０抗体、例えばガリキシマブおよびＩＤＥＣ−１１４；抗ＣＤ８９抗体、例えばＭＤＸ−２１４；抗ＣＤ１２３抗体；抗ＣＤ１３８抗体、例えばＢ−Ｂ４−ＤＭ１；抗ＣＤ１４６抗体、例えばＡＡ−９８；抗ＣＤ１４８抗体；抗ＣＥＡ抗体、例えばｃＴ８４.６６、ラベツズマブおよびPentacea(登録商標)；抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えばＭＤＸ−１０１；抗ＣＸＣＲ４抗体；抗ＥＧＦＲ抗体、例えばＡＢＸ−ＥＧＦ、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ)、ＩＭＣ−Ｃ２２５およびMerck Mab 425；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えばCrucellの抗ＥｐＣＡＭ、ＩＮＧ−１およびＩＳ−ＩＬ−２；抗エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４抗体；抗Ｈｅｒ２抗体、例えばハーセプチン(登録商標))、ＭＤＸ−２１０；抗ＦＡＰ(線維芽細胞活性化タンパク質)抗体、例えばシブロツヅマブ；抗フェリチン抗体、例えばＮＸＴ−２１１；抗ＦＧＦ−１抗体；抗ＦＧＦ−３抗体；抗ＦＧＦ−８抗体；抗ＦＧＦＲ抗体、抗フィブリン抗体；抗Ｇ２５０抗体、例えばＷＸ−Ｇ２５０およびRencarex(登録商標)；抗ＧＤ２ガングリオシド抗体、例えばＥＭＤ−２７３０６３およびＴｒｉＧｅｍ；抗ＧＤ３ガングリオシド抗体、例えばＢＥＣ２、ＫＷ−２８７１およびミツモマブ；抗ｇｐIIｂ／IIIａ抗体、例えばReoPro；抗ヘパリナーゼ抗体；抗Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２抗体、例えばハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ＭＤＸ−２１０およびペルツズマブ；抗ＨＬＡ抗体、例えばOncolym(登録商標)、Smart 1D10；抗ＨＭ１.２４抗体；抗ＩＣＡＭ抗体、例えばＩＣＭ３；抗ＩｇＡ受容体抗体；抗ＩＧＦ−１抗体、例えばＣＰ−７５１８７１およびＥＭ−１６４；抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えばＩＭＣ−Ａ１２；抗ＩＬ−６抗体、例えばＣＮＴＯ−３２８およびエルシリモマブ；抗ＩＬ−１５抗体、例えばHuMax(登録商標)-IL15；抗ＫＤＲ抗体；抗ラミニン５抗体；抗ルイスＹ抗原抗体、例えばＨｕ３Ｓ１９３およびＩＧＮ−３１１；抗ＭＣＡＭ抗体；抗Ｍｕｃ１抗体、例えばBravaRexおよびTriAb；抗ＮＣＡＭ抗体、例えばＥＲＩＣ−１およびＩＣＲＴ；抗ＰＥＭ抗原抗体、例えばTheragynおよびTherex；抗ＰＳＡ抗体；抗ＰＳＣＡ抗体、例えばＩＧ８；抗Ｐｔｋ抗体；抗ＰＴＮ抗体；抗ＲＡＮＫＬ抗体、例えばＡＭＧ−１６２；抗ＲＬＩＰ７６抗体；抗ＳＫ−１抗原抗体、例えばMonopharm C；抗ＳＴＥＡＰ抗体；抗タグ７２抗体、例えばＣＣ４９−ＳＣＡおよびＭＤＸ−２２０；抗ＴＧＦ−β抗体、例えばＣＡＴ−１５２；抗ＴＮＦ−α抗体、例えばＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、ヒュミラ(登録商標)(アダリムマブ)およびレミケード(登録商標)(インフリキシマブ)；抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体；抗ＶＥ−カドヘリン−２抗体および抗ＶＬＡ−４抗体、例えばアンテグレン(登録商標)を含むが、これらに限定されない。さらに、ＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２およびｇｐ７２エピトープ抗体１０５ＡＤ７を含むが、これらに限定されない抗イディオタイプ抗体を使用できる。さらに、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体Ｂｉ２０を含むが、これに限定されない二重特異性抗体を使用できる。
自己免疫性または炎症性疾患、移植片拒絶、ＧＶＨＤを処置でき、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体と共投与できる抗体の例は、抗α４β７インテグリン抗体、例えばＬＤＰ−０２、抗ベータ２インテグリン抗体、例えばＬＤＰ−０１、抗補体(Ｃ５)抗体、例えば５Ｇ１.１、抗ＣＤ２抗体、例えばＢＴＩ−３２２、ＭＥＤＩ−５０７、抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３、ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３、抗ＣＤ４抗体、例えばＩＤＥＣ−１５１、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａ、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１４抗体、例えばＩＣ１４、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ２３抗体、例えばＩＤＥＣ１５２、抗ＣＤ２５抗体、例えばZenapax、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、例えば５ｃ８、Antova、ＩＤＥＣ−１３１、抗ＣＤ６４抗体、例えばＭＤＸ−３３、抗ＣＤ８０抗体、例えばＩＤＥＣ−１１４、抗ＣＤ１４７抗体、例えばＡＢＸ−ＣＢＬ、抗Ｅ−セレクチン抗体、例えばＣＤＰ８５０、抗ｇｐIIｂ／IIIａ抗体、例えばReoPro(登録商標)／アブシキシマブ、抗ＩＣＡＭ−３抗体、例えばＩＣＭ３、抗ＩＣＥ抗体、例えばＶＸ−７４０、抗ＦｃγＲ１抗体、例えばＭＤＸ−３３、抗ＩｇＥ抗体、例えばｒｈｕＭＡｂ−Ｅ２５、抗ＩＬ−４抗体、例えばＳＢ−２４０６８３、抗ＩＬ−５抗体、例えばＳＢ−２４０５６３、ＳＣＨ５５７００、抗ＩＬ−８抗体、例えばＡＢＸ−ＩＬ８、抗インターフェロンガンマ抗体および抗ＴＮＦａ抗体、例えばＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、インフリキシマブ、ＭＡＫ−１９５Ｆ、抗ＶＬＡ−４抗体、例えばAntegrenを含むが、これらに限定されない。自己免疫性または炎症性疾患、移植片拒絶およびＧＶＨＤの処置のために共投与できる他のＦｃ含有分子の例は、ｐ７５ ＴＮＦ受容体／Ｆｃ融合エンブレル(登録商標)(エタネルセプト)およびRegeneron's IL-1 trapを含むが、これらに限定されない。
感染症の処置のために共投与できる抗体の例は、抗炭疽抗体、例えばABthrax、抗ＣＭＶ抗体、例えばCytoGamおよびセヴィルマブ、抗クリプトスポリジウム抗体、例えばCryptoGAM、Sporidin-G、抗ヘリコバクター抗体、例えばPyloran、抗Ｂ型肝炎抗体、例えばＨｅｐｅＸ−Ｂ、Ｎａｂｉ−ＨＢ、抗ＨＩＶ抗体、例えばＨＲＧ−２１４、抗ＲＳＶ抗体、例えばフェルビズマブ、ＨＮＫ−２０、パリビズマブ、RespiGamおよび抗スタフィロコッカス属抗体、例えばAurexis、Aurograb、ＢＳＹＸ−Ａ１１０およびＳＥ−Ｍａｂを含むが、これらに限定されない。
いくつかの例において、ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、１個以上のＦｃ受容体への結合について競合する１個以上の分子と投与する。例えば、阻害性受容体ＦｃγＲIIｂの阻害剤共投与は、エフェクター機能を増加させ得る。同様に、活性化受容体、例えばＦｃγＲIIIａの阻害剤共投与は望まないエフェクター機能を最小化し得る。Ｆｃ受容体阻害剤は、ＦｃγＲIIｂ、ＦｃγＲIIIａまたは他のＦｃ受容体との結合について競合的阻害剤として作用するように操作されたＦｃ分子ならびに他の免疫グロブリン、特にＩＶＩｇ(静脈内免疫グロブリン)と呼ばれる処置を含むが、これらに限定されない。一つの具現化において、阻害剤を投与し、抗ＥＧＦＲ抗体の投与前に作用させる。逐次投薬の効果を達成する別の方法は、即時放型投与量形態のＦｃ受容体阻害剤、続く抗ＥＧＦＲ抗体の徐放性製剤の提供である。即時放出型および放出制御製剤を別々にまたは一単位投与形態に組み合わせて投与してよい。
いくつかの例において、ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上の化学療法剤と投与する。化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４(５)−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY 117018、オナプリストンおよびトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン剤；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；アジリジン、例えばベンゾデパ、カルボコン、メツレデパおよびウレデパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン類およびメチルメラミン類；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸；窒素マスタード類、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロライド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；白金アナログ、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；タンパク質、例えばアルギニンデイミナーゼおよびアスパラギナーゼ；プリンアナログ、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；タキサン類、例えば、パクリタキセル(タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)およびドセタキセル(タキソテール(登録商標))、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；チミジル酸シンターゼ阻害剤(例えばTomudex)；アセグラトンを含む付加的化学療法剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デホスファミド；デメコルチン；ジアジクオン；ジフルオロメチルオルニチン(ＤＭＦＯ)；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２,２’,２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド(“Ａｒａ−Ｃ”)；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；エトポシド(ＶＰ−１６)；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；Novantrone；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ−１１；レチノイン酸；エスペラミシン類；カペシタビンおよびトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカンを含むが、これらに限定されない。上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も使用できる。いくつかの例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体をイリノテカンと投与する(例えば、Pfeiffer et al. (2007) Acta. Oncol. 46(5):697-701参照)。
化学療法剤をプロドラッグとして投与できる。ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できるプロドラッグの例は、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸−修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベータ−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されていてよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合により置換されていてよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび高活性細胞毒性遊離薬物に変換され得る他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含むが、これらに限定されない。
いくつかの例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上の抗血管形成剤と投与する。例えば、抗血管形成因子は、血管形成促進に関与する増殖因子または増殖因子受容体と結合する小分子またはタンパク質(例えば、抗体、Ｆｃ融合またはサイトカイン)であり得る。抗血管形成剤の例は、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合するまたはＶＥＧＦ−Ｒに結合する抗体、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ−Ｒ発現レベルを減少させるＲＮＡベースの治療剤、ＶＥＧＦ−毒素融合体、Regeneron's VEGF-trap、アンジオスタチン(プラスミノーゲンフラグメント)、抗トロンビンIII、アンジオザイム、ABT-627、Bay 12-9566、BeneFin、ベバシズマブ、ビスホスホネート、BMS-275291、軟骨由来阻害剤(ＣＤＩ)、ＣＡＩ、ＣＤ５９補体フラグメント、CEP-7055、Col 3、コンブレタスタチンＡ−４、エンドスタチン(コラーゲンXVIIIフラグメント)、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、フィブロネクチンフラグメント、ＧＲＯ−ベータ、ハロフジノン、ヘパリナーゼ類、ヘパリンヘキササッカライドフラグメント、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)、IM-862、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン誘導性タンパク質１０(IP-10)、インターロイキン−１２、クリングル５(プラスミノーゲンフラグメント)、マリマスタット、メタロプロテイナーゼ阻害剤(例えば、ＴＩＭＰｓ)、２−メトキシエストラジオール、MMI 270(CGS 27023A)、プラスミノーゲンアクティベーター阻害剤(ＰＡＩ)、血小板因子−４(ＰＦ４)、プリノマスタット、プロラクチン１６kDaフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質(ＰＲＰ)、PTK 787/ZK 222594、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、SS3304、SU5416、SU6668、SU11248、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、テトラチオモリブデン酸、サリドマイド、トロンボスポンジン−１(ＴＳＰ−１)、ＴＮＰ４７０、トランスフォーミング増殖因子ベータ(ＴＧＦ−β)、バスクロスタチン、バソスタチン(カルレティキュリンフラグメント)、ZS6126およびZD6474を含むが、これらに限定されない。
いくつかの例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上のチロシンキナーゼ阻害剤と投与する。チロシンキナーゼ阻害剤の例は、キナゾリン類、例えばPD 153035、４−(３−クロロアニリノ)キナゾリン；ピリドピリミジン類；ピリミドピリミジン類；ピロロピリミジン類、例えばCGP 59326、CGP 60261およびCGP 62706；ピラゾロピリミジン類、４−(フェニルアミノ)−７Ｈ−ピロロ(２,３−ｄ)ピリミジン類；クルクミン(ジフェルロイルメタン、４,５−ビス(４−フルオロアニリノ)フタルイミド)；ニトロチオフェン部分含有チロホスチン類；PD-0183805(Warner-Lambert)；アンチセンス分子(例えば、ＥｒｂＢコード核酸と結合するもの)；キノキサリン類(米国特許５,８０４,３９６)；チロホスチン類(米国特許５,８０４,３９６)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis／Schering AG)；汎ＥｒｂＢ阻害剤、例えば、C1-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521;Isis/Lilly)；イマチニブメシレート(STI571、Gleevec(登録商標)；Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；C1-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1 C11(ImClone)；または次の特許公報に記載されているいずれか：米国特許５,８０４,３９６；ＰＣＴ ＷＯ９９／０９０１６(American Cyanamid)；ＰＣＴ ＷＯ９８／４３９６０(American Cyanamid)；ＰＣＴ ＷＯ９７／３８９８３(Warner-Lambert)；ＰＣＴ ＷＯ９９／０６３７８(Warner-Lambert)；ＰＣＴ ＷＯ９９／０６３９６(Warner-Lambert)；ＰＣＴ ＷＯ９６／３０３４７(Pfizer, Inc.)；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９７８(AstraZeneca)；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９７９(AstraZeneca)；ＰＣＴ ＷＯ９６／３３９８０(AstraZeneca)、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標)、ZD1839、AstraZeneca)およびOSI-774(Tarceva(登録商標), OSI Pharmaceuticals/Genentech)を含むが、これらに限定されない。
いくつかの例において、ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上の免疫調節剤と投与する。このような薬剤は、１個以上のサイトカインの産生を増加または減少でき、自己抗原提示を上方または下方制御でき、ＭＨＣ抗原をマスクできまたは免疫細胞の増殖、分化、遊走または活性化状態の１種以上を促進できる。免疫調節剤の例は、非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤｓ)、例えば、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、オキサプロジン、ナブメトン、スリンダク、トルメチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェンおよびナブメトン；ステロイド類(例えば、グルココルチコイド類、デキサメサゾン、コルチゾン、ヒドロキシコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、エイコサノイド、例えばプロスタグランジン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類；ならびに局所ステロイド類、例えばアントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾールおよびタザロテン)；サイトカイン、例えばＴＧＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ４、ＩＬ−１０；サイトカイン、ケモカインまたはＢＡＦＦ、Ｂ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、補体因子(Ｃ５、Ｄ) ＣＴＬＡ４、エオタキシン、Ｆａｓ、ＩＣＡＭ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮＡＲ、ＩｇＥ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒ１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インテグリン類、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣ、セレクチン類、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦ−Ｒ１に対する抗体、可溶性受容体および受容体−Ｆｃ融合体を含む受容体アンタゴニスト、エンブレル(登録商標)(エタネルセプト)、ヒュミラ(登録商標)(アダリムマブ)およびレミケード(登録商標)(インフリキシマブ)を含むＴ細胞受容体；異種抗リンパ球グロブリン；他の免疫調節分子、例えば２−アミノ−６−アリール−５置換ピリミジン類、ＭＨＣ結合ペプチドおよびＭＨＣフラグメントに対する抗イディオタイプ抗体、アザチオプリン、ブレキナール(brequinar)、ブロモクリプチン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、Ｄ−ペニシラミン、デオキシスペルグアリン、ＦＫ５０６、グルタラルデヒド、金、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、マロノニトロアミド類(例えば、レフルノミド)、メトトレキサート、ミノサイクリン、ミゾルビン、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシンおよびスルファサラジンを含むが、これらに限定されない。
いくつかの例において、ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上のサイトカインと投与する。サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン類および従来型ポリペプチドホルモン類を含むが、これらに限定されない。サイトカインに含まれるのは、増殖ホルモン、例えばヒト増殖ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト増殖ホルモンおよびウシ増殖ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)および黄体ホルモン(ＬＨ)；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子アルファおよびベータ；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経増殖因子、例えばＮＧＦ−ベータ；血小板−増殖因子；トランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦｓ)、例えば、ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータ；インシュリン様増殖因子ＩおよびII；エリスロポエチン(ＥＰＯ)；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマ；コロニー刺激因子(ＣＳＦｓ)、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ(Ｍ−ＣＳＦ)；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)および顆粒球−ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)；インターロイキン類(ＩＬｓ)、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータおよびＬＩＦおよびkitリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子を含むが、これらに限定されない。
いくつかの例において、ここに記載する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上のサイトカインまたは細胞の免疫系を刺激し、望まれるエフェクター機能を増強する他の薬剤と投与する。例えば、ＩＬ−２を含むが、これに限定されないＮＫ細胞を刺激する薬剤をここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できる。他の具現化において、Ｃ５ａ、ホルミルペプチド、例えば、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン(Beigier-Bompadre et. al. (2003) Scand. J. Immunol. 57: 221-8)を含むが、これらに限定されないマクロファージを刺激する薬剤をここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できる。また、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含むが、これらに限定されない好中球を刺激する薬剤をここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できる。さらに、免疫刺激性サイトカインの遊走を刺激する薬剤をここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体と投与できる。またインターフェロンガンマ、ＩＬ−３およびＩＬ−７を含むが、これらに限定されないさらなる薬剤が１個以上のエフェクター機能を増強できる。いくつかの例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を１個以上のサイトカインまたはエフェクター細胞機能を阻害する他の薬剤と投与する。
いくつかの例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を、アミノグリコシド抗生物質(例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン類、ブチロシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン)、アミノシクリトール類(例えば、スペクチノマイシン)、アンフェニコール抗生物質(例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコールおよびチアンフェニコール)、アンサマイシン抗生物質(例えば、リファミドおよびリファンピン)、カルバペネム類(例えば、イミペネム、メロペネム、パニペネム)；セファロスポリン類(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セファレキシン、セフラジン)、セファマイシン類(セフブペラゾン、セフォキシチン、セフミノクス、セフメタゾールおよびセフォテタン)；リンコサミド類(例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン)；マクロライド(例えば、アジスロマイシン、ブレフェルジンＡ、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トブラマイシン)、モノバクタム類(例えば、アズトレオナム、カルモナムおよびチゲモナム)；ムピロシン；オキサセフェム類(例えば、フロモキセフ、ラタモキセフおよびモキサラクタム)；ペニシリン類(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナメシリン、ペネタマートヨウ化水素酸塩、ペニシリンｏ−ベネタミン、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンゾエート、ペニシリンＶヒドラバミン、ペニメピサイクリンおよびフェネチシリンカリウム)；ポリペプチド(例えば、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、テイコプラニン、バンコマイシン)；キノロン類(アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリニン酸、ペフロキサシン、ピペミド酸、ロソクサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシンおよびトロバフロキサシン)；リファンピン；ストレプトグラミン類(例えば、キヌプリスチン、ダルホプリスチン)；スルホンアミド類(スルファニルアミド、スルファメトキサゾール)；テトラサイクリン類(クロルテトラサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、デメチルクロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ズラマイシン、ミノサイクリン、ネオマイシン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリンおよびバンコマイシン)を含むが、これらに限定されない１個以上の抗生物質と投与する。
いくつかの例において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、アンホテリシンＢ、シクロピロクス、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ニスタチン、テルビナフィン、テルコナゾールおよびチオコナゾールを含むが、これらに限定されない１個以上の抗真菌剤と投与する。いくつかの例において、ここに記載する抗ＥＧＦＲ抗体を、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤およびＩ型インターフェロン類、ウイルス融合阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、クレブジン、エンフュービルタイド、エンテカビル、フォスカーネット、ガンシクロビル、イドクスウリジン、インジナビル、ロピナビル、プレコナリル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、トリフルリジン、ビダラビンおよびジドブジンを含むが、これらに限定されない１個以上の抗ウイルス剤と投与する。
ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を他の治療レジメンと組み合わせ得る。例えば、一つの具現化において、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体で処置する患者は放射線治療を受け得る。放射線治療を、当分野で一般的に用いられ、当業者に知られるプロトコールに従い適用できる。このような治療は、セシウム、イリジウム、ヨウ素またはコバルト放射線を含むが、これらに限定されない。放射線治療は全身照射でも、肺、膀胱または前立腺のような体内または体の特定部位または組織に対して局所的であってもよい。
典型的に、放射線治療を約１〜２週の期間にわたりパルス投与する。放射線治療は、しかしながら、長期間にわたり適用できる。例えば、頭頸部癌を有する患者に放射線治療を約６〜約７週適用できる。所望により、放射線治療を一適用でまたは複数の、逐次的適用で適用できる。熟練した開業医は、ここで有用な放射線治療の適切な１回または複数回線量を経験的に決定できる。いくつかの例において、抗ＥＧＦＲ抗体および所望により１個以上の他の抗癌治療を、エクスビボでの癌細胞処置に用い得る。このようなエクスビボ処置は、骨髄移植、特に自己骨髄移植に有用であり得ることが意図される。例えば、ここに記載するような癌細胞を含む細胞または組織の抗ＥＧＦＲ抗体および１個以上抗癌治療での処置は、レシピエント患者への移植前に癌細胞を枯渇または実質的に枯渇させるために使用できる。
放射線治療はまた同位体標識された分子、例えば抗体での処置も含み得る。放射免疫治療剤の例は、ゼヴァリン(登録商標)(Ｙ−９０標識抗ＣＤ２０)、LymphoCide(登録商標)(Ｙ−９０標識抗ＣＤ２２)およびベキサール(登録商標)(１−１３１標識抗ＣＤ２０)を含む。
さらに、ここに提供する修飾抗ＥＧＦＲ抗体を、さらに他の治療技術、例えば手術または光線療法と組み合わせで患者または対象に投与できることも意図される。
Ｈ. 実施例
次の実施例は説明のみを目的として包含させ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１
ＨＣ−Ｙ１０４変異体抗ＥＧＦＲ抗体の産生および発現
内部リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)により分離したセツキシマブの軽鎖(ＬＣ)および修飾重鎖(ＨＣ)をコードする４個の発現ベクターを、pcDNA3.1-アービタックス-LC-IRES-HC主鎖構築物(配列番号３０６)で産生した。プラスミド構築物中の対照セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号５０に示すヌクレオチドの軽鎖配列(配列番号８に示す軽鎖をコード)に直接結合したＩｇκシグナルペプチド(配列番号４２)をコードするヌクレオチド配列を含む。プラスミド構築物中の対照セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体はまた、配列番号４８に示すヌクレオチドの重鎖配列(配列番号６に示す重鎖コード)に直接結合したＩｇシグナルペプチド(配列番号４１)をコードするヌクレオチド配列も含む。プラスミドはまた、重鎖定常ドメインのＣ末端で結合するFLAGタグ(配列番号４５)もコードする。
修飾重鎖を、重鎖アミノ酸配列の１０４位のＴｙｒ(Ｙ)をコードするヌクレオチドを、Ａｓｐ(Ｄ)またはＧｌｕ(Ｅ)をコードするものに置き換えるコドン置換により対照プラスミド構築物のコード配列の変異導入により産生した。表１６は、産生された変異体の変異体コドン、各修飾抗ＥＧＦＲ抗体をコードする発現ベクターおよび各産生された変異体の重鎖および軽鎖の対応する配列番号を示す。
FreeStyle CHO-S細胞(Invitrogen)を、１Ｌシェーカーフラスコで３００mL中６×１０５細胞／mLの密度まで増殖させ、製造者の指示に従い、DNA FreeStyle MAX(Invitrogen)を使用して上で産生した構築物でトランスフェクトした。上清をトランスフェクション１６８時間後に採取し、発現された抗体(ｍＡｂ)を２mLプロテインＡ／Ｇカラム(Bio-Rad)を使用して精製した。溶出したｍＡｂをリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)に対して透析し、０.５〜１mLの体積まで濃縮した。精製ｍＡｂのタンパク質濃度をNanoDrop分光光度計および消衰係数を使用して、ベール・ランベルト式：Ａ＝εｃｌ(ここで、Ａは吸光度であり、εは消衰係数であり、ｃはタンパク質濃度であり、ｌは経路長である)を使用して、決定した。表１７は発現された抗体のタンパク質濃度を示す。
実施例２
ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体を発現する安定な細胞株の産生
ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体を発現する安定な細胞株を確立するために、約１.０×１０６細胞／mL密度の３０mLのＣＨＯ−Ｓ細胞を、３７.５μgのプラスミドＤＮＡ(配列番号３０８、上記パート１で産生)と３７.５μLのFreeStyleTMMAX Reagent(Invitrogen)を製造者のプロトコールに従い使用して、形質移入した。
トランスフェクション７２時間後、９６ウェル丸底プレート(Nunc)中１５ウェルのGlutaMAX(８mM)および１mg／mL Ｇ４１８添加ＣＤ−ＣＨＯ培地で１次元連続希釈ストラテジーを細胞のクローン取得のために使用した。４週間後、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体を発現するクローンを、検知抗体としてペルオキシダーゼ接合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ(Jackson Immunolab)を使用して、ウェスタンブロット解析(ＷＢ)によりスクリーニングした。陽性クローンを段階的に１２ウェルプレート、続いて６ウェルプレート、その後Ｔ−２５フラスコおよびＴ−７５フラスコ、最後にシェーカーフラスコに拡張した。５mg／ＬのＨＣ−Ｙ１０４Ｄを発現する２クローンを、さらにwavebagバイオリアクター産生のために拡張した。抗体を３０mLプロテインＡカラムを使用して、実施例１に記載のとおり親和性クロマトグラフィーで精製した。
実施例３
ＨＣ−Ｙ１０４変異体抗ＥＧＦＲ抗体のｐＨ依存性結合評価
実施例１で産生したflagタグ付けＹ１０４Ｄ−ＧＡＴ、Ｙ１０４Ｄ−ＧＡＣ、Ｙ１０４Ｅ−ＧＡＡおよびＹ１０４Ｅ−ＧＡＧの上清を、ｐＨ７.４、６.５および６.０の３ｐＨ条件下、平行、ハイスループットｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用して、Ｈｉｓタグ付け可溶性ＥＧＦＲの細胞外ドメイン(ｓＥＧＦＲ−Ｈ６；Sino Biologics, Cat #10001-H08H)への結合についてアッセイした。Flagタグ付け非修飾、野生型セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体(配列番号１８に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖)およびflagタグ付けヒト化Ｔ０３０Ｆ／Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ変異体抗ＥＧＦＲ変異体抗体(ＦＤＰ−ｈ３と命名、米国公開２０１３／０２６６５７９号の実施例１５参照)を対照抗体として使用した。ＦＤＰ−ｈ３は、配列番号２５７に示すヌクレオチド配列(軽鎖、配列番号２５８に示す軽鎖をコード)および配列番号６４に示すヌクレオチド配列(重鎖、配列番号６５に示す重鎖をコード)を含み、ここで、重鎖は、配列番号４５に示すFLAGタグにＣ末端で直接結合している。
簡単にいうと、ｓＥＧＦＲ−Ｈ６を、プレートを一夜、４℃または２時間、室温(ＲＴ)で、緩衝液Ａクレブス・リンゲル緩衝液、ｐＨ７.４、無血清(ＫＲＢ、Sigma Aldrich、# K4002)中１２nM(１.３２μg／mL)で１００μL ｓＥＧＦＲ−Ｈ６抗原をコーティングすることにより、９６ウェルＨｉ結合プレート(Costar #2592)に固定化した。プレートを２５０μL／ウェルのＫＲＢで３回洗浄した。プレートを３群に分け、１)２５０μL ｐＨ７.４緩衝液Ｂ(２５％ヒト血清および１mM乳酸)、２)２５０μL ｐＨ６.５緩衝液Ｃ(２５％ヒト血清および１６.７mM乳酸)または３)２５０μL ｐＨ６.０緩衝液Ｃ(２５％ヒト血清および１６.７mM乳酸)のいずれかで、１時間、ＲＴでカバーしながらブロックした。
flagタグ付けＹ１０４Ｄ−ＧＡＴ、Ｙ１０４Ｄ−ＧＡＣ、Ｙ１０４Ｅ−ＧＡＡおよびＹ１０４Ｅ−ＧＡＧ抗体および対照野生型およびＦＤＰ−ｈ３抗体を３倍連続希釈により希釈し、各ｐＨ条件下、各抗体の７個の作業濃度を作製した。ｐＨ７.４での結合試験のために、Ｙ１０４Ｄ−ＧＡＴ、Ｙ１０４Ｄ−ＧＡＣ、Ｙ１０４Ｅ−ＧＡＡおよびＹ１０４Ｅ−ＧＡＧ変異体および対照ＦＤＰ−ｈ３を各々１０００ng／mL、３３３ng／mL、１１１ng／mL、３７ng／mL、１２.３ng／mL、４.１ng／mLおよび１.４ng／mLに緩衝液Ｂ、ｐＨ７.４で希釈した。ｐＨ６.５および６.０での試験のために、Ｙ１０４Ｄ−ＧＡＴ、Ｙ１０４Ｄ−ＧＡＣ、Ｙ１０４Ｅ−ＧＡＡおよびＹ１０４Ｅ−ＧＡＧ変異体および対照ＦＤＰ−ｈ３を各々３００ng／mL、１００ng／mL、３３.３ng／mL、１１.１ng／mL、３.７ng／mL、１.２ng／mLおよび０.４ng／mLにそれぞれ緩衝液Ｃ、ｐＨ６.５または６.０で希釈した。野生型セツキシマブは、１００ng／mL、３３.３ng／mL、１１.１ng／ml、３.７ng／ml、１.２ng／ml、０.４ng／mLおよび０.１４ng／mLにｐＨ７.４、６.５および６.０の３緩衝液の各々で希釈した。１００μLの各抗体希釈を、結合ｓＥＧＦＲ−Ｈ６抗原を含む９６ウェルプレートの別々のウェルに添加し、それをカバーし、ＲＴで１時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートを対応するｐＨの２５０μL／ウェルの緩衝液Ｂまたは緩衝液Ｃで３回洗浄した。対応するｐＨの緩衝液Ｂまたは緩衝液Ｃ中５００ng／mLの、１００μLヤギ抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ検出抗体(Abcam、#ab 1238)を各ウェルに添加した。プレートをカバーし、１時間、ＲＴでインキュベートした。プレートのウェルを対応するｐＨの２５０μLの緩衝液Ｂまたは緩衝液Ｃで３回洗浄した。最後に、１００μL SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate 1-component(ＫＰＬ、#52-00-0３)溶液を各ウェルに添加し、プレートを１５〜２０分、ＲＴで発色させた(遮光)。各ウェルに１００μL ＴＭＢ停止溶液(ＫＰＬ、#50-85-06)を添加することにより反応を停止させ、ウェルの光学密度を、４５０nM(ＯＤ４５０)で３０分以内に、マイクロプレート分光光度計(Molecular Devices, Spectra Max M3)で測定した。
ＥＬＩＳＡを３連で行い、反応の平均ＯＤ値を各サンプルについて計算し、抗体濃度に対してプロットした。４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを、次の式を使用する結果の曲線あてはめ解析のために使用した：ｙ＝((Ａ−Ｄ)／(１＋((ｘ／Ｃ)＾Ｂ)))＋Ｄ(ここで、Ａは最小漸近線であり、Ｂは傾斜因子であり、Ｃは屈曲点／ＥＣ５０値であり、Ｄは最大漸近線である)。結果を下記表１８〜２０に示す。
各試験した変異体および対照の異なるｐＨ条件でのＥＣ５０値をさらに表２１に要約し、ここで高いＥＣ５０は弱い結合を示す。本表はまた、ｐＨ６.０または６.５対７.４での各変異体の結合活性比(すなわち、ｐＨ６.０または６.５対ｐＨ７.４でのＥＣ５０の逆数の商)を示し、ここで、比率＞１は、結合が中性ｐＨ条件下より酸性ｐＨ条件下で大きいことを示す。
結果は、ｐＨ７.４で、野生型セツキシマブ抗体はｐＨ６.５またはｐＨ６.０よりわずかに高いＥＣ５０を示すことを示す。対照的に、Ｙ１０４変異体およびＦＤＰ−ｈ３対照について、酸性ｐＨ試験条件より中性ｐＨ試験条件でＥＣ５０が高いことにより証明されるとおり、ｐＨ７.４での結合は実質的にｐＨ６.５またはｐＨ６.０より弱い。それゆえに、変異体の各々は、ｐＨ７.４より酸性ｐＨ６.０または６.５で大きな結合比を示す。
ｐＨ７.４で、Ｙ１０４Ｅ変異体は、Ｙ１０４Ｄ変異体のＥＣ５０値より約３倍高いＥＣ５０値を示し、Ｙ１０４Ｅ変異体がＹ１０４Ｄ変異体よりｐＨ７.４での結合が弱いことが示される。６.０および６.５の酸性ｐＨ条件で、Ｙ１０４ＥおよびＹ１０４Ｄ変異体のＥＧＦＲへの結合は、ＥＣ５０値が類似することにより証明されるとおり実質的に同じであった。具体的に、Ｙ１０４Ｅ変異体、Ｙ１０４Ｅ−ＧＡＡおよびＹ１０４Ｅ−ＧＡＧはｐＨ７.４で１８.６および１６.９のＥＣ５０値を示し、これは、中性ｐＨ(ＥＣ５０＝３.３)での野生型抗体より５倍以上高く、より酸性のｐＨでの対応するＥＣ５０値より約６倍高かった。これらの結果は、１０４位のＴｙｒ(Ｙ)のＧｌｕ(Ｅ)での置換が、野生型および１０４位にＡｓｐ(Ｄ)を有する抗体と中性ｐＨではＥＧＦＲ結合が減少しているが、酸性条件下では同等レベルのＥＧＦＲ結合を保持する抗体をもたらすことを示す。
実施例４
ヒト化Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４ＥおよびＹ１０４Ｅ／Ｑ１１１Ｐ抗体の産生
１. ヒト化およびｐＨ依存性についてのスクリーニング
ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐの完全長軽鎖および重鎖配列(クローン２−２；別称ＤＰ；米国特許出願１３／８１５,５５３号参照)と配列番号５３に示す重鎖(配列番号５２に示す核酸配列によりコード化)および配列番号８に示す軽鎖(配列番号５０に示す核酸配列によりコード化)をコードする二本鎖ＤＮＡフラグメントを、ヒト化クローンのライブラリーの産生のために使用し、次いで発現させ、ｐＨ依存性ＥＧＦＲ結合およびタンパク質発現レベルについてスクリーニングした(米国公開２０１３／０２６６５７９号の実施例１５参照)。ＣＨＯ−Ｓ細胞を９６ウェルプレートに播種し、ヒト化クローンでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に上清を回収した。ＩｇＧ濃度を測定し、上清を２ng／mLに調節し、実施例３に記載したｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用して、ｐＨ６.０およびｐＨ７.４でのＥＧＦＲ結合のｐＨ依存性結合を試験した。
親陽性対照(ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ)と比較して、同等なまたは良好なｐＨ６.０での結合活性対ｐＨ７.４での結合活性の比率を示す１次ヒットを選択し、低発現レベルのクローンを除外した。１次ヒットを二次的構築および確認スクリーニングに付した。スクリーニングのために、トランスフェクトした上清を４ng／mL、２ng／mLおよび１ng／mLの濃度に調節し、実施例３に記載したｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用して、ｐＨ６.０およびｐＨ７.４でのＥＧＦＲ結合のｐＨ依存性結合を試験した。親陽性対照と比較して、同等なまたは良好なｐＨ６.０での結合活性対ｐＨ７.４での結合活性の比率を示すヒットを同定し、同定されたヒットの配列を決定した。
２. ヒト化主鎖からの変異体の産生
ヒト化Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐセツキシマブ変異体抗体(ＤＰ−ｈ７と命名；配列番号５５(重鎖)および１８１(軽鎖))を上記のとおりヒト化ヒットとして産生し、選択した。確認スクリーニングにおいて、ＤＰ−ｈ７ヒト化クローンは、試験濃度で次のとおりのｐＨ６.０／ｐＨ７.４ ＯＤ比を示した。４ng／mL、比率１１.３０；２ng／mL、比率７.２１；１ng／mL、比率１７.３５。
配列番号５４(重鎖)および１８０(軽鎖)に示すヌクレオチド配列を含む、配列番号３１１に示すＤＰ−ｈ７をコードするプラスミドを、ヒト化Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４ＥおよびＹ１０４Ｅ／Ｑ１１１Ｐ変異体ＥＧＦＲ抗体を産生するための出発主鎖として使用した。簡単にいうと、ヒト化主鎖を使用して、１０４位のＡｓｐ(Ｄ)をＧｌｕ(Ｅ)におよび／または１１１位のＰｒｏ(Ｐ)をＧｌｎ(Ｑ)に変異させた。表２２は変異導入コドン類、産生された発現ベクターならびに産生されたヒト化抗体得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を要約する。
３. ヒト化Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４ＥおよびＹ１０４Ｅ／Ｑ１１１Ｐ抗体の発現評価
ヒト化Ｙ１０４Ｄ(Ｄ−ｈ)、Ｙ１０４Ｅ(Ｅ−ｈ)およびＹ１０４Ｅ／Ｑ１１１Ｐ(ＥＰ−ｈ)クローンをコードするプラスミドを、上清をトランスフェクション６時間後に採取し、４.５mLの最終体積に濃縮した以外、実施例１に記載のとおり、FreeStyle CHO-S細胞で発現させ、精製し、濃縮した。発現された抗体のタンパク質濃度を、実施例１に記載のとおり、NanoDrop分光光度計および消衰係数を使用して決定した。表２３は発現された抗体のタンパク質濃度を示す。
４. ヒト化Ｙ１０４Ｄ(Ｄ−ｈ)、Ｙ１０４Ｅ(Ｅ−ｈ)およびＹ１０４Ｅ／Ｑ１１１Ｐ(ＥＰ−ｈ)抗体のｐＨ依存性活性の評価
ａ.
ヒト化Ｙ１０４Ｄ(Ｄ−ｈ)、Ｙ１０４Ｅ(Ｅ−ｈ)およびＹ１０４Ｅ／Ｑ１１１Ｐ(ＥＰ−ｈ)を、サブセクション３に記載のとおり精製し、実施例３に記載のとおり、ｐＨ７.４、６.５および６.０の３ｐＨ条件下、平行、ハイスループットｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用してＨｉｓタグ付け可溶性ＥＧＦＲの細胞外ドメイン(ｓＥＧＦＲ−Ｈ６；Sino Biologics, Cat #10001-H08H)への結合についてアッセイした。非ヒト化flagタグ付けＹ１０４Ｄ(配列番号６７に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖)および非ヒト化flagタグ付けＹ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(配列番号５３に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖)の結合活性を参照／対照抗体として使用した。
ＥＬＩＳＡを３連で行い、反応の平均ＯＤ値を各サンプルについて計算し、実施例３に記載した４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを使用して、抗体濃度に対してプロットした。結果を下記表２４〜２６に示す。
各試験した変異体および対照について異なるｐＨ条件でのＥＣ５０値をさらに表２７に要約し、ここで、高いＥＣ５０は弱い結合を示す。本表はまた、ｐＨ６.０または６.５対７.４での各変異体の結合活性比(すなわち、ｐＨ６.０または６.５対ｐＨ７.４でのＥＣ５０の逆数の商)を示し、ここで、比率＞１は、結合が中性ｐＨ条件下より酸性ｐＨ条件下で大きいことを示す。
結果は、試験した全変異体が、ｐＨ６.５またはｐＨ６.０よりもｐＨ７.４で高いＥＣ５０、すなわち弱い結合を示すことを示した。試験変異体のＥＣ５０により証明される結合活性は、ｐＨ６.０およびｐＨ６.５で全て実質的に同じであったが、変異体Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐは、他の試験変異体と比較して、ｐＨ６.０および６.５で結合活性のわずかな減少を示した。具体的に、非ヒト化Ｙ１０４Ｄ、ＤＰ−ｈ０７、Ｄ−ｈ、Ｅ−ｈおよびＥＰ−ｈ抗体のＥＣ５０値はｐＨ６.０で、約３〜４の範囲の値で類似した。非ヒト化Ｙ１０４Ｄ／Ｑ１１１ＰのＥＣ５０はｐＨ６.０でわずかに高かった(ＥＣ５０＝７.２)。変異体はまたｐＨ６.５で類似するＥＣ５０値を示した。それゆえに、酸性ｐＨで、試験した構築物は全て類似するＥＧＦＲ結合親和性を有する。
変異体の各々は、ｐＨ７.４よりも酸性ｐＨで６.０または６.５で大きな結合活性比を示した。ヒト化Ｙ１０４Ｅ(Ｅ−ｈ)およびＹ１０４Ｄ／Ｑ１１１Ｐ(ＥＰ−ｈ)は、試験した構築物のｐＨ７.４より、酸性ｐＨ６.０または６.５で最高結合活性比を示した。Ｅ−ｈおよびＥＰ−ｈ変異体変異体もまたｐＨ７.４で最高ＥＣ５０値、したがって最弱結合活性を示し、これは、それぞれｐＨ７.４で４６.１および６９.８であった。それゆえに、ｐＨ６.０または６.５対ｐＨ７.４でＥＣ５０の逆数の比率で測定して、高い結合活性比は、中性ｐＨでの低い結合親和性(高いＥＣ５０値)によるものである。
ｂ.
さらなる実験において、精製、ヒト化Ｙ１０４Ｄ(Ｄ−ｈ)、Ｙ１０４Ｅ(Ｅ−ｈ)およびＹ１０４Ｅ／Ｑ１１１Ｐ(ＥＰ−ｈ)を、上記のとおり、ｐＨ７.４、６.５および６.０の３ｐＨ条件下、平行、ハイスループットｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用してＨｉｓタグ付け可溶性ＥＧＦＲの細胞外ドメイン(ｓＥＧＦＲ−Ｈ６；Sino Biologics, Cat #10001-H08H)への結合についてアッセイした。比較のために、非ヒト化flagタグ付けＹ１０４Ｄ(配列番号６７に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖)、非ヒト化flagタグ付けＹ１０４Ｅ(配列番号７１に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖)および配列番号６７に示す重鎖および配列番号８に示す軽鎖を発現する確立された安定なＣＨＯ細胞株から精製した非ヒト化flagタグ付けＹ１０４Ｄ(Ｙ１０４Ｄ−Ｓと命名)の結合活性を試験した。
ＥＬＩＳＡを３連で行い、反応の平均ＯＤ値を各サンプルについて計算し、上記のとおり４パラメータロジスティック非線形回帰モデルを使用して抗体濃度に対してプロットした。結果を下記表２８〜３０に示す。
各試験した変異体および対照について異なるｐＨ条件でのＥＣ５０値を表３１にさらに要約し、ｐＨ６.０または６.５対７.４での各変異体の結合活性比(すなわち、ｐＨ６.０または６.５対ｐＨ７.４でのＥＣ５０の逆数の商)を記載する。
結果は、Ｙ１０４Ｅ変異体が、Ｙ１０４Ｄ変異体よりも酸性ｐＨで大きなｐＨ選択的結合を示したことを示す。例えば、非ヒト化Ｙ１０４Ｅ変異体は、ｐＨ６.０(ＥＣ５０＝３.２１)またはｐＨ６.５(ＥＣ５０＝４.３１)よりも低いｐＨ７.４での結合を示し、ｐＨ７.４のＥＣ５０は３８.９であった。ヒト化Ｙ１０４Ｅ(Ｅ−ｈ)抗体は、対応する非ヒト化Ｙ１０４Ｅ抗体よりもｐＨ７.４でわずかに結合活性の低下を示したが、ｐＨ６.０または６.５対７.４での結合活性比は、非ヒト化Ｙ１０４Ｅ抗体のものと実質的に同じであった。ヒト化Ｙ１０４Ｅ／Ｑ１１１Ｐ変異体(ＥＰ−ｈ)は、試験した構築物の酸性条件下で、ＥＧＦＲ結合について最高の選択性を示した。具体的に、ＥＰ−ｈ変異体は、ｐＨ７.４でＥＣ５０ ２０９を示し、これは、ｐＨ６.０での対応するＥＣ５０値より約４９倍高く、ｐＨ６.５での対応するＥＣ５０値より約１７倍高く、ＥＰ−ｈヒト化変異体が他の試験した変異体よりもｐＨ７.４で実質的に弱い結合を示すことが示される。ＥＣ５０値により示される酸性ｐＨ６.０または６.５でのＥＰ−ｈ変異体の結合活性は、他の試験した変異体と類似した。
Ｙ１０４Ｄ変異体はまた酸性ｐＨ選択的結合活性を示したが、Ｙ１０４Ｅ変異体で示されるより低い程度であった。ヒト化Ｙ１０４Ｄ(Ｄ−ｈ)変異体は、ｐＨ７.４で５６.４のＥＣ５０を示し、これはｐＨ６.０でのＥＣ５０より約８倍高く、ｐＨ６.５のＥＣ５０より約４倍高い。
実施例５
ｐＨ依存性ＥＧＦＲ結合を有する抗ＥＧＦＲ変異体の産生およびスクリーニング
１. 抗ＥＧＦＲ変異体抗体のライブラリーの産生
セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体の単一点変異体のライブラリーを、pcDNA3.1-アービタックス-LC-IRES-HC主鎖構築物(配列番号３０６)の部位特異的突然変異誘発により構築し、産生した。構築物は、配列番号５０に示すヌクレオチドの軽鎖配列(配列番号８に示す軽鎖をコード)に直接結合したＩｇκシグナルペプチド(配列番号４２)をコードするヌクレオチド配列を含む対照セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体プラスミド構築物を含む。プラスミド構築物における対照セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号４８に示すヌクレオチドの重鎖配列(配列番号６に示す重鎖コード)に直接結合したＩｇシグナルペプチド(配列番号４１)をコードするヌクレオチド配列も含む。プラスミドはまた重鎖定常ドメインのＣ末端に結合したFLAGタグ(配列番号４５)も含んだ。
ライブラリーを、セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体の変異体を含むように産生し、それにより各メンバーは、セツキシマブの重鎖(配列番号６と配列番号７に示す可変重鎖)または軽鎖(配列番号８と配列番号９に示す可変軽鎖)いずれかの可変領域内の１００アミノ酸位置の一箇所に、対照抗体と比較して一アミノ酸変異を含んだ。変えた位置は、セツキシマブ抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域内であり、大部分が軽鎖または重鎖のＣＤＲ内の位置であった。少なくとも１５アミノ酸変異を各位置で行った。ライブラリーの各メンバーを配列決定し、ライブラリーメンバーのグリセロール・ストックを調製し、−８０℃で保存した。
２. スクリーニング抗ＥＧＦＲ変異体
プラスミドＤＮＡを、製造者のプロトコールに従い、リポフェクタミン２０００(Invitrogen、Cat. No. 11668-027)を使用して単層ＣＨＯ−Ｓ細胞(Invitrogen、Cat. No. 11619-012)に形質移入した。簡単にいうと、ＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクション前夜に播種し、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)含有ＤＭＥＭで増殖させた。翌日、細胞が８０％コンフルエントになった後、ＣＨＯ−Ｓ細胞の培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ(Invitrogen)に変えた。プラスミドＤＮＡとリポフェクタミンの混合物(０.２μg ＤＮＡおよび０.５μL リポフェクタミン)をＣＨＯ−Ｓ細胞に添加し、一夜インキュベートした。翌日、細胞にＣＤ−ＣＨＯ無血清培地(Invitrogen、Cat. No. 10743-029)を添加した。トランスフェクトした細胞からの上清をトランスフェクション後に回収した(一般にトランスフェクション７２時間後)。
上清を、抗体を２希釈(希釈１および希釈２)で添加し、結合をｐＨ７.４およびｐＨ６.０の２ｐＨ条件下で測定した以外、実施例３に記載したとおり、平行、ハイスループットｐＨ感受性ＥＬＩＳＡを使用するＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメイン(ＥＧＦＲ ｓＥＣＤ)への結合についてアッセイした。
ａ. 抗体結合結果
ＥＬＩＳＡを２連で実施し、２連の反応の平均ＯＤ値を計算した。ＯＤ値に基づき、ｐＨ７.０と比較してｐＨ６.０でｓＥＧＦＲ−Ｈ６に対して高結合活性を示す変異体抗ＥＧＦＲ抗体を同定し、表３２に示す。本表は、変異体抗体の希釈１および希釈２でのｐＨ６.０(ＯＤｐＨ６.０)での平均ＯＤ、ｐＨ７.４(ＯＤｐＨ７.４)での平均ＯＤおよびｐＨ６.０および７.４(ＯＤｐＨ６.０／ＯＤｐＨ７.４)での平均ＯＤ値比率を示す。
ａ ＨＣ＝重鎖；ＬＣ＝軽鎖
ｂ Ｖ＝可変
ｂ. 抗体濃度決定
抗体濃度を抗ＥＧＦＲ抗体定量化ＥＬＩＳＡにより決定した。簡単にいうと、プレートを１００μL ｓＥＧＦＲ−Ｈ６(Sino Biologicals Inc、Cat# 10001-H08H)抗原で、ＰＢＳ中１２nM(１.３２μg／mL)で被覆し、２５０μl／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、５mg／mL ＢＳＡを含む２５０μlのＰＢＳで１時間、室温でブロックした。抗ＥＧＦＲ−ＦＬＡＧ抗体標準の連続希釈(プロテインＡカラム精製)を５mg／mL ＢＳＡ含有ＰＢＳで調製した。出発抗体濃度は１００ng／mLであり、その後定めるとおり１：３希釈した。試験サンプル希釈を調製し(１：３希釈)、１００μl／ウェルの標準および試験サンプルをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを５mg／mL ＢＳＡ含有２５０μl／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。１００μL／ウェルウサギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰを、ＰＢＳ／５mg／mL ＢＳＡ中１：５０００(最終濃度０.２μL／mL)希釈で添加した。プレートを１時間、ＲＴでインキュベートし、２５０μl／ウェルのＰＢＳ／５mg／mL ＢＳＡで３回洗浄した。ＴＭＢ基質を添加し、プレートを上記のとおり読んだ。
ｃ. 比活性計算
比活性(ＳＡ)を、平均ＯＤ値を抗体濃度で除すことにより計算した。変異体抗ＥＧＦＲ抗体の比活性を対照ＦＬＡＧタグ付け抗ＥＧＦＲ親抗体の比活性で除すことにより比活性を標準化して、各変異体について標準化比活性(ＮＳＡ)を得た。表３３は、希釈１および希釈２で上に示した各同定した変異体の標準化比活性を示す。ｐＨ６.０でＮＳＡ＞０.４およびｐＨ７.４でＮＳＡ＜０.４を有する変異体抗ＥＧＦＲ抗体を同定し、さらなる解析のために選択した。これらの同定した抗体の変異は、Ｌ００４Ｃ、Ｌ００４Ｖ、Ｓ０５６ＨまたはＮ０９１Ｖの軽鎖(ＬＣ)変異を含む抗体およびＶ０２４Ｉ、Ｖ０２４Ｌ、Ｓ０２５Ｃ、Ｓ０２５Ｇ、Ｓ０２５Ｉ、Ｓ０２５Ｑ、Ｓ０２５Ｔ、Ｓ０２５Ｌ、Ｎ０３１Ｉ、Ｎ０３１Ｔ、Ｎ０３１Ｖ、Ｙ０３２ｓｅＴ、Ｖ０５０Ｌ、Ｇ０５４Ｒ、Ｇ０５４Ｃ、Ｇ０５４Ｐ、Ｄ０５８Ｍ、Ｙ０５９Ｅ、Ｆ０６３Ｒ、Ｆ０６３Ｃ、Ｆ０６３Ｇ、Ｆ０６３Ｍ、Ｆ０６３Ｖ、Ｔ０６４Ｎ、Ｔ０６４Ｖ、Ｓ０６８Ｆ、Ｓ０６８Ｑ、Ｄ０７２Ｋ、Ｄ０７２Ｌ、Ｄ０７２Ｍ、Ｄ０７２Ｗ、Ｎ０７３Ｑ、Ｓ０７４Ｈ、Ｓ０７４Ｒ、Ｓ０７４Ｄ、Ｓ０７４Ｇ、Ｓ０７４Ｙ、Ｋ０７５Ｈ、Ｋ０７５Ｗ、Ｑ０７７Ｒ、Ｑ０７７Ｅ、Ｔ１００Ｉ、Ｔ１００Ｐ、Ｙ１０１Ｗ、Ｙ１０４Ｄ、Ｙ１０４Ｆ、Ｙ１０４ＳまたはＡ１０７Ｎの重鎖(ＨＣ)変異を含む抗体である。
ａ ＨＣ＝重鎖、ＬＣ＝軽鎖
３. 確認スクリーニング
確認スクリーニングを、５％血清を両ｐＨ値で使用した以外、パート２に記載したとおり実施した。表３４は、希釈１および希釈２での例示した試験修飾抗体の各希釈のｐＨ６.０でのＯＤ(ＯＤ６.０)、各希釈のｐＨ７.４でのＯＤ(ＯＤ７.４)およびｐＨ６.０と７.４の平均ＯＤ値比(ＯＤ６.０／ＯＤ７.４)を示す。
ａ ＨＣ＝重鎖、ＬＣ＝軽鎖
実施例６
組み合わせライブラリーの産生およびスクリーニング
ＨＣ−Ｙ１０４Ｅと共に、ＬＣ−Ｉ２９Ｓ、ＨＣ−Ｖ２４Ｅ、ＨＣ−Ｓ２５Ｃ、ＨＣ−Ｆ２７Ｒ、ＨＣ−Ｒ９７Ｈおよび／またはＨＣ−Ｑ１１１Ｐの変異の全組み合わせを有する抗体メンバーを含む抗ＥＧＦＲ変異体メンバーのコンビナトリアルライブラリーを産生する。複数の点変異体を、実施例１に記載したＨＣ−Ｙ１０４Ｅセツキシマブ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域(配列番号７４に示す可変重鎖または可変配列番号８に示す軽鎖含有)または部位特異的突然変異誘発により実施例４で産生したヒト化形態のＨＣ−Ｙ１０４Ｅの重鎖可変領域(配列番号６１に示す可変重鎖および配列番号１８３に示す可変軽鎖含有)で産生する。ライブラリーの各メンバーの配列決定し、−８０℃でグリセロール・ストックとして保存する。産生された組み合わせ変異体中、変異体を表３５に示す。
スクリーニングのために、ライブラリーのメンバーをコードする発現ベクターを、ＣＨＯ細胞にＩｇＧ抗体として別々に発現させ、上清を回収する。ライブラリーを、実施例３に記載のとおり、ｐＨ感受性ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。ｐＨ７.４と比較してｐＨ６.０で高結合活性を示す例示的抗体を選択する。
実施例７
同定したヒットの結合親和性
バイオレイヤー干渉法を実施して、ｐＨ６.５およびｐＨ７.４での変異体抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲへの結合を測定する。ｓＥＧＦＲに対するセツキシマブおよびＹ１０４Ｅ含有変異体抗ＥＧＦＲ抗体の解離定数(ＫＤ)を、Octet QKe装置(ForteBio, Menlo Park, CA)を使用して、９６ウェル形式でバイオレイヤー干渉法で測定する。データ取得ソフトウェアを、ビオチニル化ｓＥＣＤ ＥＧＦＲリガンド負荷ならびに抗体結合および解離工程を含む全操作工程で使用する。リガンド負荷ならびに抗体結合および解離工程を一方はｐＨ６.５、他方はｐＨ７.４の２群で行う。
ビオチニル化ｓＥＣＤ ＥＧＦＲを、１５μLのＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン溶液(超純水中２０mM)(PIERCE, Cat# 21329)を溶液中１mgのｓＥＧＦＲに添加し、反応混合物を室温で３０分インキュベートすることにより調製する。未反応ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンを透析により除去し、ビオチニル化ｓＥＧＦＲのタンパク質濃度を、製造者の指示に従いＢＣＡタンパク質アッセイ(PIERCE, Cat# 23225)により測定する。
１. ｐＨ６.５およびｐＨ７.４での抗ＥＧＦＲ変異体の結合親和性
異なるｐＨでの結合を評価するために、ビオチニル化ｓＥＣＤ ＥＧＦＲを、ｐＨ６.５またはｐＨ７.４(リガンド負荷過程)でＰＢＳ中ストレプトアビジンバイオレイヤーに結合させる。ストレプトアビジンセンサーを、ＰＢＳ(ｐＨ６.５またはｐＨ７.４)含有ウェルに１分浸す。次いでセンサーを、ＰＢＳ(ｐＨ６.５またはｐＨ７.４)中ビオチニル化ｓＥＧＦＲ(５０μg／mL)含有ウェルに２分浸す。センサーをＰＢＳ(ｐＨ６.５またはｐＨ７.４)含有ウェルで濯ぐ。全工程中、プレートを１０００rpmで撹拌する。
結合速度を測定するために、固定化ｓＥＣＤ−ＥＧＦＲセンサーを、ｐＨ６.５または７.４のＰＢＳ中２２nMまたは６６.７nMの抗体(セツキシマブまたはＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体)を含むウェルに２分浸す。解離速度を測定するために、抗体結合センサーを、ｐＨ６.５または７.４のＰＢＳウェルに４分浸す。ｓＥＧＦＲと抗体(セツキシマブまたはＹ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体)の結合と解離を、光学層およびバイオレイヤーから反射される光により産生された干渉パターンの変化の測定により定量する。結合速度、解離速度およびＫＤ値グローバル曲線あてはめを使用して、ソフトウェアData Analysis(v. 6.4)で計算する。
実施例８
ＥＧＦＲリン酸化
対照セツキシマブ抗体またはＹ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体変異体で処置したヒト新生児ケラチン生成細胞およびＡ４３１細胞からのリン酸化ＥＧＦＲの濃度をＥＬＩＳＡで測定する(RnD systems reagents, #DYC3570-2)。
１. サンプル調製
約１０,０００細胞のヒト新生児ケラチン生成細胞(Invitrogen C-001-5C)またはＡ４３１細胞(ATCC CRL 1555)を、９６ウェルプレート(BD Falcon #35-3072)のウェルに播種する。加湿雰囲気の５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で一夜インキュベーション後、細胞を洗浄し、無血清ダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)に再懸濁し、同じ条件下で一夜インキュベートする。細胞を冷リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ；１３７mM ＮａＣｌ、２.７mM ＫＣｌ、８.１mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１.５mM ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７.２〜７.４)で洗浄する。プレートを２群に分ける。第一群では、１０μg／mL 精製セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体または緩衝液対照をｐＨ７.４に調節したリン酸緩衝液中で添加する。第二群では、精製セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体または緩衝液対照をｐＨ６.５に調節したリン酸緩衝液で添加する。
Ａ４３１細胞について、投与量−応答試験も実施し、それによりセツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体を、３０μg／mL、１０μg／mL、３.３３μg／mL、１.１１μg／mL、０.３７μg／mL、０.１２３μg／mLおよび０.００１μg／mLの濃度でサンプルに添加する。細胞を１５〜３０分、３７℃でインキュベートする。
抗体との最初のインキュベーション後、ＥＧＦ(RnD Systems, catalog no. 236-E)(１００μg／mL)を、抗体と同じ緩衝液中の細胞に別々に添加する。対照細胞も試験し、ここで、抗体を添加しない(ＥＧＦのみ)または抗体もしくはＥＧＦを添加しない(Ｒｘなし)。細胞を１５〜３０分、３７℃でインキュベートする。抗原とのインキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、冷溶解緩衝液(１％NP-40 Alternative、２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１３７mM ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２mM ＥＤＴＡ、１mM活性化オルトバナジン酸ナトリウム、１０μg／mL アプロチニン、１０μg／mL ロイペプチン)を添加する。ライセートを回収し、直ぐに圧制するか、その後の解析まで≦−７０℃で保存する。
２. ＥＬＩＳＡ
９６ウェルマイクロプレート(Costar #2592)をラット抗ヒト抗ホスホＥＧＦＲ捕獲抗体(ＰＢＳ中８.０μg／mL、１００μL／ウェル)(R&D Systems # 842428)で一夜、室温で被覆する。各ウェルを吸引し、洗浄緩衝液(ＰＢＳ中０.０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０、ｐＨ７.２〜７.４(R&D Systems # WA126)で計５回の洗浄で洗浄する。プレートを、３００μLのブロック緩衝液(ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０.０５％ＮａＮ３、ｐＨ７.２〜７.４)で１〜２時間、室温でブロックする。ウェルを吸引し、洗浄緩衝液で計５回の洗浄で洗浄する。細胞ライセート(セツキシマブ、抗ＥＧＦＲ抗体Ｙ１０４Ｅ変異体抗体、ＥＧＦのみまたはＲｘなし)をＩＣ希釈剤(１％NP-40 Alternative、２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１３７mM ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２mM ＥＤＴＡ、１mM活性化オルトバナジン酸ナトリウム)で希釈し、１００μLを添加する。吸引および洗浄工程を繰り返し、１００μLの、ＨＲＰに接合したマウス抗ヒトホスホ−ＥＧＦＲ(Ｙ１０６８)抗体(２０mM Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、１３７mM ＮａＣｌ、０.０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)２０、０.１％ＢＳＡ)を添加する。プレートを密閉し、２時間、室温でインキュベートする。吸引および洗浄工程を繰り返す。基質(Ｈ２Ｏ２およびテトラメチルベンジジン１：１混合物(R&D Systems, Catalog # DY999))(１００μL)を各ウェルに添加し、プレートを、２０分、室温でインキュベートする。停止溶液(２Ｎ Ｈ２ＳＯ４(R&D Systems, Catalog # DY994)(５０μL)を添加し、ウェルの光学密度(ＯＤ)を、５４０nmおよび５７０nmの波長補正した、４５０nmに設定したマイクロプレートリーダーで直ぐに測定する。
実施例９
セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体存在下でのヒトおよび新生児ケラチン生成細胞の増殖
ヒト新生児ケラチン生成細胞(Invitrogen C-001-5C)およびヒト成人ケラチン生成細胞(Invitrogen C-005-5C)の増殖を、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体とのインキュベーション後に測定する。試験する抗体を通常の増殖培地(１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ(ｐＨ７.４))に、１０μg／mL、３.３３μg／mL、１.１１μg／mL、０.３７μg／mL、０.１２３μg／mL、０.０４１１μg／mL、０.０１３７μg／mLおよび０.００４５７μg／mLの濃度で添加する。
ヒト新生児ケラチン生成細胞およびヒト成人ケラチン生成細胞(１０００細胞／ウェル)を９６ウェルプレート(BD Falcon 35-3072)に、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む通常の増殖培地の存在下で添加する。各条件を５個のウェルでアッセイする(すなわち、ｎ＝５／条件)。細胞を、加湿雰囲気の５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で５日インキュベートする。細胞増殖を、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega Cat# G-7571)で測定し、抗体不在下で増殖させた対照細胞と比較した細胞の生存パーセントとして表す。
実施例１０
異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対するセツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体の効果
Ａ４３１類表皮癌細胞、ＦａＤｕ下咽頭癌細胞ならびにＡ４３１細胞に由来する操作細胞株Ａ４３１ＬＤＨＡおよびＡ４３１ＣＡ９を異種移植腫瘍モデルの産生に使用し、これを使用して、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性を評価する。
１. 皮下Ａ４３１腫瘍
雄無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスに、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した３.３×１０６ Ａ４３１類表皮癌細胞(ATCC CRL1555)を、０.１mL皮下(ＳＣ)注射で右側腹部に接種する。腫瘍が〜１００mm３のサイズに達したら、動物を５試験群に無作為化する(ｎ＝４／群)：(１)群１ − 媒体(セツキシマブ緩衝液)、(２)群２ − ０.１mg／マウス(４mg／kg体重)セツキシマブ、(３)群３ − １.０mg／マウス(４０mg／kg体重)セツキシマブ、(４)群４ − ０.１mg／マウス(４mg／kg体重ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体または(５)群５ − １.０mg／マウス(４０mg／kg体重ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体。マウスに、０.１mgまたは１.０mgのセツキシマブ対照またはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体変異体または媒体対照を週に２回、０日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目に腹腔内(ＩＰ)投与する。腫瘍増殖を、媒体のみでの処置動物を１４日目に屠殺した以外、上記のとおり０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目および１８日目に測定する。
セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体処置群の腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)を式：％ＴＧＩ＝[１−(ＴＢ−ＴＡ)／(ＣＢ−ＣＡ)]×１００(ここで、ＴＢは処置開始１４日後の処置群の平均腫瘍体積(mm３)であり、ＴＡは処置前０日目の処置群の平均腫瘍体積(mm３)であり、ＣＢは対照群の処置開始１４日後の平均腫瘍体積であり、ＣＡは対照群の処置開始前０目の平均腫瘍体積である)を使用して計算する(例えば、Teicher BA and Andrews PA: Anticancer Drug Development, Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials and Approval, 2nd edition. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 134, 2004 and T. Friess et al., (2006) Anticancer Research 26:3505-3512参照)。ＴＧＩを、野生型セツキシマブとＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体で比較する。
２. 皮下ＦａＤｕ腫瘍：
雄無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスに、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した５.０×１０６ ＦａＤｕ下咽頭癌細胞(ATCC)の０.１mL皮下(ＳＣ)注射を右側腹部に摂取する。腫瘍が〜１００mm３のサイズに達したら、動物を５試験群に無作為化する(ｎ＝４／群)：(１)群１ − 媒体(セツキシマブ緩衝液)、(２)群２ − ４mg／kgセツキシマブ、(３)群３ − ４０mg／kgセツキシマブ、(４)群４ − ４mg／kg ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体または(５)群５ − ４０mg／kg ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体。本抗体または媒体のみを週に２回、０日目、３日目、７日目および１０日目に腹腔内(ＩＰ)投与する。腫瘍増殖を、抗体投与直前−１日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目に上記のとおりカリパスを使用して測定する。腫瘍増殖阻害を評価抗体で比較する。。
実施例１１
皮下腫瘍および霊長類皮膚でのＥＧＦＲ発現
皮下異種移植腫瘍および収集した霊長類皮膚でのＥＧＦＲの検出を、免疫組織化学(ＩＨＣ)により確認および評価する。
ａ. 皮下腫瘍でのＥＧＦＲ発現
免疫組織化学(ＩＨＣ)を使用して、実施例１０.１に記載したように、ヌードマウスで異種移植として増殖させたＡ４３１ヒト腫瘍のＥＧＦＲ発現レベルを評価した。Ａ４３１皮下腫瘍を採取し、０％中性緩衝化ホルマリン(ＮＢＦ)に固定し、パラフィン包埋した。５μm切片をスライドに載せ、乾燥させた。染色前に、スライドを脱パラフィン処理し、再水和した。切片を、EGFR IHCキット(DAKO, Carpinteria, CA)を使用して免疫標識した。製造者の指示に従い３,３’−ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)を用いて染色を可視化した。核をヘマトキシリンで対比染色した。顕微鏡写真を、Insight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)と連結したNikon Eclipse TE2000U顕微鏡で撮った。腫瘍細胞でのＥＧＦＲに対する激しい細胞膜陽性により、Ａ４３１細胞に由来する異種移植腫瘍が高ＥＧＦＲ発現レベルを維持することが確認された。
ｂ. 霊長類皮膚におけるＥＧＦＲ発現
免疫組織化学(ＩＨＣ)を使用して、ヒトおよび非ヒト霊長類皮膚サンプルにおけるＥＧＦＲ発現レベルを評価した。ヒト皮膚サンプルを、地元の外科診療所から得て、カニクイザル、マーモセットおよびリスザル皮膚をWorldwide Primates Inc.(Miami, FL)から得た。ヒト、カニクイザル、マーモセットおよびリスザルのホルムアルデヒド固定サンプルを、上記のとおり薄切し、ＥＧＦＲ ＩＨＣキット(DAKO)でＩＨＣ用に処理した。核をヘマトキシリンで対比染色した。顕微鏡写真を２０倍および４０倍対物レンズで上記のとおり捕らえた。
予想どおり、基底ケラチン生成細胞の膜は、ＥＧＦＲに対する激しい染色を示した。カニクイザルおよびリスザル皮膚組織の基底ケラチン生成細胞も染色され、カニクイザル皮膚染色は、ヒトおよびリスザル組織で観察されたものよりわずかに低強度であった。マーモセット皮膚は、４０倍対物レンズを使用したときでさえ、検出可能ば染色をなんら示さなかった。これらの結果は、マーモセットＥＧＦＲではなく、カニクイザルおよびリスザルＥＧＦＲが、抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体により認識されるために十分にヒトＥＧＦＲと似ていることを示す。
実施例１２
ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体のＡ４３１皮下腫瘍または皮膚移植片へのエクスビボでの結合
先の実施例に記載したように、皮下腫瘍および霊長類皮膚でＥＧＦＲが発現されるため、エクスビボでの皮下腫瘍および霊長類皮膚移植片へのＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗体結合を評価する。
１. 皮下腫瘍に対するエクスビボ結合試験
免疫蛍光(ＩＦ)を使用して、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体がヒトＥＧＦＲと結合する能力を評価かつ比較する。セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体を、製造者の指示に従い、ＰＢＳ中、DyLight 594抗体標識キット(Thermo Scientific; Rockford, IL)を１０μg／mL、５μg／mL、１μg／mL、０.３μg／mL、０.１μg／mLでDyLight５９４に接合させる。薄切にした後、Ａ４３１腫瘍の凍結切片を冷アセトンで１０分固定し、１時間、５μg／mLまたは１μg／mLのDyLight５９４接合セツキシマブまたはDyLight５９４接合ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ抗体とインキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、切片を、ＤＡＰＩ(４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロライド)(Molecular Probes, Eugene)で対比染色する。顕微鏡写真を、実験条件下での比較を可能とするために、各画像について同じ設定を使用して、Insight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)に接続したNikon Eclipse TE2000U顕微鏡を使用して、２０倍および４０倍対物レンズで撮る。ＥＧＦＲ結合を抗体間で比較する。
２. 霊長類皮膚に対するエクスビボ結合試験
免疫蛍光(ＩＦ)を使用して、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗体が種々の霊長類皮膚サンプルにおけるヒトＥＧＦＲと結合する能力を比較する。ヒト、カニクイザル、マーモセットおよびリスザル(ヒト皮膚は地元の外科診療所から受領；カニクイザル、マーモセットおよびリスザル皮膚はWorldwide Primate, Floridaから受領)の凍結切片を、Alexafluor 594(Thermo Scientific DyLight 594抗体標識キット; Rockford, IL)に接合した１.０μg／mLセツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体接合を使用して、中性ｐＨで直接免疫標識する。核をＤＡＰＩで対比染色する。顕微鏡写真を、２０倍および４０倍対物レンズを使用して、上記のとおり撮る。ケラチノサイトおよび基底細胞の免疫標識を目視評価し、抗体間で比較する。
実施例１３
インビボでの腫瘍対皮膚に対する蛍光標識ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の選択的結合
セツキシマブ、ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体および対照ヒトＩｇＧを、近ＩＲ蛍光である、DyLight755 Sulfydryl-Reactive Dye(DL755)(Thermo Scientific, Rockford, IL)で、室温で、６０分標識する。ＤＬ７５５標識ＩｇＧ、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗体の異種移植腫瘍またはヒトまたはサル皮膚移植片への結合を、励起波長７４５nmおよび放出波長８００nmのIVIS Caliper蛍光造影系を使用して評価する。画像を、抗体投与前ならびに抗体投与１分後、２分後、１０分後、６０分後、１２０分後、２４０分後、３６０分後、１日後および連日撮る。ヒト皮膚移植モデルにおいて、画像を抗体投与後１０日目にも撮る。
１. 皮下Ａ４３１腫瘍へのセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅの結合
ａ. 全動物造影
Ａ４３１異種移植腫瘍を、上の実施例１０に記載したように、ヌードマウスの右側腹部へのＡ４３１細胞の注射により産生する。インプラント２１日後、マウスに１０μg／マウス(０.５mg／kg)ヒトＩｇＧＤＬ７５５、ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体ＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５を投与する。ＤＬ７５５標識を、励起波長７４５nmおよび放出波長８００nmを用いるIVIS Caliper蛍光造影系を使用して、２〜４動物／群で検出する。画像を抗体投与前、抗体投与４時間後および７日目まで連日撮る。ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗体により示される結合をセツキシマブＤＬ７５５および陰性対照抗体、ヒトＩｇＧＤＬ７５５と比較する。
ｂ. 全動物造影および免疫組織化学
上記のとおり、ヌードマウスにＡ４３１細胞を右側腹部に注射して、Ａ４３１腫瘍を産生する。Ａ４３１細胞インプラント２１日後、マウスに、１mg／マウスのＩｇＧＤＬ７５５、ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体ＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５の１回ｉ.ｖ.投与を、少なくとも２匹のマウス／群で投与する。抗体投与４８時間後、腫瘍を上記のとおりIVIS Caliper蛍光造影系を使用して可視化する。
腫瘍造影後、Ｆｃ検出によるヒトＩｇＧＤＬ７５５、ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体ＤＬ７５５およびセツキシマブＤＬ７５５注射マウスの免疫組織化学的染色を実施して、抗体結合の局在化のより詳細な評価を実施する。造影後、マウスを灌流し、腫瘍を採取し、腫瘍の凍結切片を、可視化を可能とするためにＨＲＰ基質としてＤＡＢを使用して、標準免疫組織化学的染色法を使用して、注射抗体のＦｃ領域を検出するために、ＨＲＰ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体とインキュベートする。２０倍対物レンズを備えたInsight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)に接続したNikon Eclipse TE2000U顕微鏡を使用して染色組織を試験する。
２. 皮下ＰＣ−３腫瘍へのセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅの結合
ＰＣ−３細胞に由来する異種移植腫瘍を、１００μl無血清Opti-MEM(登録商標)中の２×１０６ ＰＣ−３細胞(Caliper Life Sciences)を、雄ヌードマウスの右前脛骨筋に注射することにより産生する。インプラント３５日後、ＰＣ−３腫瘍担持マウスに１０μg／マウス(０.５mg／kg)ヒトＩｇＧＤＬ７５５、ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体ＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５(ｎ＝少なくとも２／群)を投与し、ＤＬ７５５標識を上記のようにIVIS Caliper蛍光造影系を使用して検出する。抗体投与前およびその後連日５日目まで画像を撮る。上記のとおりＦｃ検出によりヒトＩｇＧ(対照)、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄまたはセツキシマブ(１mg／マウス)のｉ.ｖ.投与４８時間後、ＰＣ−３異種移植腫瘍に対して平行免疫組織化学的研究も実施する。
３. ヒト皮膚移植片へのセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体の結合
皮膚毒性を評価するモデルとして、マウスにインプラントしたヒトおよびサル皮膚移植片へのＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の結合をインビボで評価する。ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体、セツキシマブおよびヒトＩｇＧ(それぞれ陽性および陰性対照として)を、近ＩＲ蛍光であるDyLight755 Sulfydryl-Reactive Dye(DL755)(Thermo Scientific, Rockford, IL)で、室温で、６０分標識する。ヒト分層植皮片(ＳＴＳＧ)(ヒト皮膚は地元の外科診療所から受領)およびヒト包皮片NDRI(1628 JFK Blvd, 8 Penn Center, Philadelphia, PA)から購入)を、Ｎｃｒ ｎｕ／ｎｕマウスの左背側側腹部に外科的に移植する。ＥＧＦＲ発現を、抗ＥＧＦＲ ＩＨＣキット(Dako)で、インプラント７０日目および３２日目にヒト皮膚移植片でそれぞれ確認する。インプラント後３２日目および３６日目に、標識抗体を、３００μg／マウスの投与量で、ヒト皮膚移植片を有するマウスにｉ.ｖ.投与する。ＤＬ７５５シグナルの画像を、投与後１〜１０目の各日に撮り、視覚的評価を使用して、循環全身シグナル皮膚移植片位置へのシグナルの局在化を評価かつ比較する。
他の試験において、インプラント後２１日目に、ヒト包皮片を受領したマウスを、１０μg／マウス(０.５mg／kg)ヒトＩｇＧＤＬ７５５、ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体ＤＬ７５５またはセツキシマブＤＬ７５５の静脈内投与前および４時間後、そしてその後連日計６日間、同じ方法(ｎ＝３／群)を使用して抗体結合を評価する。
インプラント後２８日目に、ヒト包皮皮膚移植片への抗体の結合を、標準法を使用して免疫組織化学により評価する。ヒト包皮片を受領したマウスに、１mg／マウスで、ＩｇＧ、Ｙ１０４Ｅ変異体またはセツキシマブを１回ｉ.ｖ.投与により投与する。抗体投与４８時間後、マウスを灌流し、凍結切片をＨＲＰ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体とインキュベートする。ＤＡＢをＨＲＰ基質として使用する。染色組織を、４０倍対物レンズを備えた、Insight FireWireデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Michigan)に接続したNikon Eclipse TE2000U顕微鏡を使用して試験する。
４. サル皮膚移植片へのセツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体の結合
サルＳＴＳＧ(BioToxから受領したカニクイザル皮膚)を、７匹のＮｃｒ ｎｕ／ｎｕマウスの左背側側腹部に怪我的に移植する。ＥＧＦＲ発現を、抗ＥＧＦＲ ＩＨＣキット(Dako)により、それぞれインプラント後７０日目および３２日目にサル皮膚移植片で確認する。インプラント後３２日目および３６日目、上記ＤＬ７５５標識抗体を、サル皮膚移植モデルのマウスに、３０μg／マウスの投与量でｉ.ｖ.投与する。抗体投与後の１〜９日の各日に、上記のとおり循環および局在化蛍光シグナルを検出し、画像を撮る。
５. Ａ４３１腫瘍対皮膚結合
数量化蛍光シグナル強度を使用して、本実施例のパート１で測定した腫瘍結合のＤＬ７５５シグナル強度を、本実施例のパート２で測定した同じ抗体のヒト皮膚移植片結合の対応するＤＬ７５５シグナル強度で除すことにより、セツキシマブおよびＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗体の腫瘍：皮膚結合比を決定する(ｎ＝少なくとも２／群)。対照ＩｇＧ投与動物で計算した腫瘍：皮膚結合比に対して、これらの比率を標準化する。
実施例１４
皮膚移植モデルにおける皮膚毒性に対するセツキシマブの影響
患者の瞼裂からのドナー皮膚を採取し、分層植皮を、４匹のＮｃｒ ｎｕ／ｎｕマウスに移植する。皮膚移植後１５日目から出発して、マウスのうち２匹に、各々２mg ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ抗体変異体またはセツキシマブ(１００mg／kg、ＨＥＤ ６０mg／kg)を週に２回、４週間静脈内投与する。抗体投与後３５日目(すなわち、抗体最終投与７日後)、例えば、移植片の収縮および／または局所刺激(例えば、発赤、乾き)について、皮膚移植片の状態を目視評価する。宿主マウスのヒトドナー皮膚移植片および隣接皮膚の両者を含む、ドナー皮膚および移植皮膚のサンプルを採取し、抗ＥＧＦＲ ＩＨＣキット(Dako)を使用して、免疫組織化学により分析する。ヒト皮膚移植片のケラチノサイトおよび基底細胞の染色を、宿主マウスの隣接する本来の皮膚のケラチノサイトおよび基底細胞の染色と比較する。
実施例１５
セツキシマブおよび化学療法剤組み合わせ処置
化学療法剤、シスプラチンと組み合わせたセツキシマブの有効性を、Ａ４３１異種移植腫瘍増殖の阻害について評価する。
皮下Ａ４３１異種移植腫瘍を、上の実施例１０に記載したように、雄ヌードマウスで確立した。腫瘍が約１００〜２００mm３サイズに達したとき、表３６に示すように動物を８試験群(ｎ＝５／群)に無作為化し、セツキシマブを腹腔内投与により週に２回および／またはシスプラチンを静脈内投与により週に２回投与した。具体的に、試験品を０日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目に投与した。
＊＝ｐ＜０.０５対媒体のみ
腫瘍体積(mm３)で測定した腫瘍増殖を、０日目、１日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目にデジタルカリパスを使用して、測定し、実施例１０に記載のとおり計算した。処置群の腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)は、式：％ＴＧＩ＝[１−(ＴＢ−ＴＡ)／(ＣＢ−ＣＡ)]×１００(ここで、ＴＢは処置群の１４目の平均腫瘍体積(mm３)であり、ＴＡは処置群の最初の処置１日前(−１日目)の平均腫瘍体積(mm３)であり、ＣＢは媒体のみ対照群の１４日目の平均腫瘍体積であり、ＣＡは媒体のみ対照群の置１日前(−１日目)の平均腫瘍体積である)を使用して、計算した(例えば、Teicher BA and Andrews PA: Anticancer Drug Development, Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials and Approval, 2nd edition. Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 134, 2004 and T. Friess et al., (2006) Anticancer Research 26:3505-3512参照)。結果を上の表３６に示す。
１.５mg／kgシスプラチンは、それ自体では腫瘍増殖を有意に阻害しなかったが、セツキシマブと４mg／kg(セツキシマブ単独の４１.８％ＴＧＩ対組み合わせの５３.２％ＴＧＩ)および１２mg／kg(セツキシマブ単独の６５.９％ＴＧＩ対組み合わせの７４.１％ＴＧＩ)で組み合わせたとき、付加的腫瘍増殖阻害に貢献した。５mg／kgシスプラチン単独での処置は３４.２％ＴＧＩとなり、４mg／kg(セツキシマブ単独の４１.８％ＴＧＩ対組み合わせの５０.２％ＴＧＩ)および１２mg／kg(セツキシマブ単独の６５.９％ＴＧＩ対８組み合わせの５.２％ＴＧＩ)でセツキシマブと組み合わせたとき、ＴＧＩにさらに貢献した。最大腫瘍増殖阻害は、１２mg／kgセツキシマブ＋５mg／kgシスプラチンで観察された。
実施例１６
セツキシマブ対ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体および化学療法剤組み合わせ処置
化学療法剤シスプラチンとの組み合わせでのセツキシマブ対ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ変異体の有効性を、Ａ４３１異種移植腫瘍増殖の阻害について評価する。
皮下Ａ４３１異種移植腫瘍を上記のように雄ヌードマウスで確立する。腫瘍が約１００mm３のサイズに達したら、動物を試験群(ｎ＝５／群)に無作為化し、セツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ含有変異体(Ｙ１０４Ｅ)をＩＰ投与によりおよび／またはシスプラチンをＩＶ投与により週に２回、下記表３７に示すとおり投与する。具体的に、試験品を、０日目、４日目、７日目および１１日目に投与する。腫瘍体積(mm３)を、先に記載したとおり−１日目、４日目、７日目、１１日目および１４日目に測定する。
実施例１７
腫瘍細胞およびケラチン生成細胞の細胞増殖阻害に対する抗ＥＧＦＲ抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)の効果
抗ＥＧＦＲ抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)を、免疫毒素サポリンをセツキシマブまたはＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体抗ＥＧＦＲ抗体に、ビオチニル化抗体およびストレプトアビジン−サポリン(Advanced Targeting Systems Bio, Cat# IT-27)と混合してまたは薬物を標的細胞内で放出させることを可能とするために切断可能タンパク質クロスリンカー(Advanced Targeting Systems Bioにより提供されるサービス)を使用して融合することにより産生した。
ビオチン−ストレプトアビジンベースのＡＤＣ形成のために、５mg／mlの最終濃度で過ヨウ素酸ナトリウム(ＮａＩＯ４)を４℃で３０分使用して、０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.２中１〜２mg／ml濃度の抗体を酸化し、抗体糖鎖の隣接するヒドロキシル基をアルデヒド基に変換する。酸化抗体を０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７.２に対して透析し、透析した抗体を、反応中５mMヒドラジド−ビオチンとなるように、ＤＭＳＯ中９対１体積比で調製した５０mMヒドラジド−ビオチンと混合する。混合物を室温で、２時間インキュベートして、抗体のアルデヒド基とヒドラジド基の間でヒドラゾン結合を形成させる。ビオチニル化抗体を１×ＰＢＳで透析し、等モル濃度比でストレプトアビジン−サポリンと混合して、抗体−サポリン複合体を形成させる。次いで、ＡＤＣをヒト腫瘍細胞株、Ａ４３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびヒトケラチン生成細胞細胞株、ＨＥＫ−Ｎの細胞増殖を阻害する能力について試験する。
１. Ａ４３１細胞増殖のサポリンＡＤＣ阻害
Ａ４３１細胞を、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ；Mediatech)添加ＲＰＭＩ １６４０培地で培養する。ＡＤＣ処置前日、Ａ４３１細胞を透明底白色９６ウェルプレートに、２００μL体積で１,０００細胞／ウェルで播種する。細胞を未処置のままとするかまたは１μg／mLの濃度から出発して濃度を増加させながらサポリン接合セツキシマブ(Ｗｔ−Ｓａｐ)、サポリン接合ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体(Ｙ１０４Ｅ−Ｓａｐ)またはサポリン接合ヒトＩｇＧで処置する。細胞を５日間ＡＤＣ処置する。生存細胞を、５日目に製造者の指示に従いCell Titer-glo Luminescentキット(Promega)を使用して測定する。未処置細胞に対する生存細胞パーセンテージを計算し、ＥＣ５０値をGraphPad Prismを使用して計算する
２. 新生児ケラチン生成細胞(ＨＥＫ−Ｎ)細胞のサポリンＡＤＣ阻害
新生児ケラチン生成細胞(ＨＥＫ−Ｎ)細胞を、増殖因子添加Epilife培地(Gibco)で培養する。サポリンＡＤＣ処置前日に、ＨＥＫ−Ｎ細胞を透明底白色９６ウェルプレートに、２００μL体積で１,０００細胞／ウェルで播種する。細胞を未処置のままとするかまたは１μg／mLの濃度から出発して濃度を増加させながらサポリン接合セツキシマブ(Ｗｔ−Ｓａｐ)、サポリン接合ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ変異体(Ｙ１０４Ｅ−Ｓａｐ)またはサポリン接合ヒトＩｇＧで処置する。細胞を５日間ＡＤＣ処置する。生存細胞を、５日目に製造者の指示に従いCell Titer-glo Luminescentキット(Promega)を使用して測定する。未処置細胞に対する生存細胞パーセンテージを計算し、ＥＣ５０値をGraphPad Prismを使用して計算した。
実施例１８
インビボでのＡ４３１皮下腫瘍増殖に対するＹ１０４Ｄ−ＤＭ１、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥおよびＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)の効果
ＥＧＦＲ＋腫瘍のモデルであるＡ４３１腫瘍異種移植モデルを使用して、ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体の抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)の腫瘍増殖阻害活性を評価した。特に、細胞毒性薬物マイタンシノイドＤＭ１、モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)またはモノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)を含むＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体接合体を産生し、各々このモデルで評価した。ＤＭ１およびＭＭＡＥは、１０pM〜１nMの同等な効力を有し、ＭＭＡＦは１０nM〜１００nMの効力を有する(“Second-Generation ADCs.” Biological Drug Products: Development and Strategies. Ed. Wei Wang, Ed. Manmohan Singh. ISBN: 978-1-118-14889-1, 2013. Section 9.4.2.3)。
１. マイタンシノイドＤＭ１に接合したＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体(Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１)
ａ. Ｙ１０４Ｄ−ＭＣＣ−ＤＭ１(Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１)の産生
ＨＣ−Ｙ１０４Ｄ抗体を、非切断可能スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(ＳＭＣＣ)リンカーを介してマイタンシノイドＤＭ１に接合した。Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１ ＡＤＣを産生するために、実施例２に記載のように産生した２.５mLのＹ１０４Ｄを、接合緩衝液１(５０mMリン酸カリウム／５０mM塩化ナトリウム、ｐＨ６.５、２mM ＥＤＴＡ)で前平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム(GE Health)に載せた。０.５mL接合緩衝液１に続き、脱塩抗体を回収した。抗体の濃度を測定し、２０mg／mLに調節した。
Ｙ１０４Ｄ−ＭＣＣ接合体を、ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)中１０mM ＳＭＣＣを、抗体溶液に７：１モル濃度比(０.９３３mLの１０mM ＳＭＣＣ対１０mLの２０mg／mL抗体溶液)で添加することにより最初に産生した。ＤＭＡを該混合物に添加して、１０％ｖ／ｖ ＤＭＡを達成した。混合物を室温で、２時間インキュベートした。Ｙ１０４Ｄ−ＭＣＣ接合体を前平衡化ＰＤ−１０脱塩カラムに載せた。０.５mL接合緩衝液１に続き、脱塩抗体を回収した。接合体の濃度を溶離液のＡ２８０を使用して計算した(ε＝１.４５mg−１cm−１または２１７５００Ｍ−１cm−１)。
抗体あたりのＳＭＣＣ分子の平均数を、溶液中の遊離チオール基の還元の測定により、間接的に測定することにより決定した。マイクロ遠心チューブ中、５μL緩衝液またはＹ１０４Ｄ−ＭＣＣを、５μL １mMシステインに添加し、続いてＰＢＳ中１mM エルマン試薬(５,５’−ジチオビス−(２−ニトロ安息香酸)またはＤＴＮＢ)(ＤＭＳＯ原液中０.ｌＭから希釈)を添加した。ボルテックス処理後、混合物を室温で、５分インキュベートした。吸光度を２８０nmおよび４１２nmで測定し、濃度をＡ２８０および消衰係数、ε＝２１０,８６３cm−１Ｍ−１を使用して計算した。緩衝液のみサンプル中のシステイン濃度を、発色団、５−メルカプト−２−ニトロ安息香酸の消衰係数(ε＝１３,６００cm−１Ｍ−１)を使用して計算した。リンカー濃度は、緩衝液とＹ１０４Ｄ−ＭＣＣサンプル間で異なることが測定され、これは、抗体あたり凡そ平均４.５個ＳＭＣＣ分子であった。
Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１と命名したＹ１０４Ｄ−ＭＣＣ−ＤＭ１接合体を、ＤＭＡ中１.７当量の１０mM ＤＭ１−ＳＨをＹ１０４Ｄ−ＭＣＣと混合し、１０mg／mL接合体緩衝液１に希釈することにより産生した。ＤＭＡを添加して、最終ＤＭＡ濃度を１０％ｖ／ｖとし、反応混合物を一夜、室温(２５℃)でインキュベートした。Ｙ１０４Ｄ−ＭＣＣ−ＤＭ１の薬物抗体比(ＤＡＲ)を、２５２nmと２８０nmの吸光度およびε＝１.４８mg−１cm−１の消衰係数を使用して計算した。抗体あたりのＤＭ１分子の平均数は４.６であった。
凝集も、各接合過程後ＳＥＣ−ＨＰＬＣでモニターした。接合前、Ｙ１０４Ｄ抗体は約１％高ＭＷタンパク質を含んだ。Ｙ１０４Ｄ−ＭＣＣ−ＤＭ１接合体は、典型的に約１〜１５％高ＭＷタンパク質を含んだ。最終Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１接合体は、典型的に約１〜１５％高ＭＷタンパク質を含んだ。
ｂ. Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１の腫瘍増殖阻害活性
雄無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスに、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した３.３×１０６ Ａ４３１類表皮癌細胞(ATCC CRL1555)を、０.１mL皮下(ＳＣ)注射で右側腹部に接種した。腫瘍が〜１００mm３のサイズに到達したら、動物を５実験群に無作為化した：(１)群１ − 媒体(無菌水中８.４８mg／mL 塩化ナトリウム、１.８８mg／mL リン酸ナトリウム二塩基性七水和物、０.４２mg／mL リン酸ナトリウム一塩基性一水和物)(ｎ＝８)、(２)群２ − 週に２回、０日目、３日目、７日目および１０日目に腹腔内注射により５mg／kg体重で投与する未接合Ｙ１０４Ｄ(ｎ＝８)、(３)群３ − ０日目に単回静脈内投与により１.０mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＤＭ１(ｎ＝６)、(４)群４ − ０日目に単回静脈内投与により５.０mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＤＭ１(ｎ＝６)または(５)群５ − ０日目に単回静脈内投与により１０.０mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＤＭ１(ｎ＝６)。腫瘍増殖を、実施例１０に記載のとおり、０日目、３日目、７日目、１０日目および１３日目に測定した。腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)を、１３日目の測定に基づき、上記のように計算した。
結果を下記表３８に示す。結果は、媒体単独と比較して、Ｙ１０４ＤまたはＹ１０４Ｄ−ＤＭ１で処置した動物で腫瘍増殖率が減少したことを示す。週に２回投与したＹ１０４Ｄ単独処置は、１３日目に２６.５％ＴＧＩを生じた。単回静脈内注射より１回だけ投与したＹ１０４Ｄ−ＤＭ１接合体は、１３日目に１.０mg／kg、５.０mg／kgおよび１０.０mg／kgでそれぞれ３２.６％、１０.０％および２０.４％であるＴＧＩをもたらした。２要因の分散分析とダネット後検定に基づき、Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１処置群の観察されたＴＧＩは、お互い有意差はなかった。
２. モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)に接合したＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体(Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ)
ａ. Ｙ１０４Ｄ−Ｍｃ−ＶｃＰＡＢ−ＭＭＡＥ(Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ)の産生
実施例２に記載のように産生したＹ１０４Ｄ抗体を、Francisco et al. Blood 102:1458-1465 (2003)に記載のように、切断可能リンカーマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルリンカーを介してＭＭＡＥに接合した(マレイミドカプロイル−ｖｃＰＡＢ−ＭＭＡＥ)。抗体内の内在性ジスルフィドを簡単に還元し、マレイミドカプロイル部分に接合して、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥと名づけた抗体−薬物接合体を作った。最終接合生成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーで評価して約４の薬物：抗体(ＤＡＲ)比を有した。典型的に、高分子量物質は、全調製物の約１〜２％に対応した。さらに、未接合タンパク質は、無傷のＩｇＧの約１〜２％に対応した。
ｂ. Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥの腫瘍増殖阻害活性
Ａ４３１異種移植腫瘍を有するマウスを、腫瘍を処置前に〜３５０mm３のサイズに到達させる以外、上記のように産生した。腫瘍が〜３５０mm３に到達したら、動物を４試験群に無作為化した：(１)群１ − 媒体(無菌水中８.４８mg／mL 塩化ナトリウム、１.８８mg／mL リン酸ナトリウム二塩基性七水和物、０.４２mg／mL リン酸ナトリウム一塩基性一水和物)(ｎ＝６)、(２)群２ − １.５mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ(ｎ＝６)、(３)群３ − ５mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ(ｎ＝６)および(４)群４ − １５mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ(ｎ＝６)。腫瘍の出発サイズが大きいため、全処を静脈内注射で、０日目、３日目、７日目および１０日目に週に２回投与した。腫瘍増殖を、−１日目、２日目、６日目、１０日目、１４日目および１７日目に上記のように測定した。
結果を下記表３９に示す。媒体のみを投与したマウスは、試験の間に腫瘍増殖が進行した。１.５mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥを投与されたマウスは、媒体対照と比較して、腫瘍増殖率が低下した。高投与量のＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥで、媒体対照と比較して、腫瘍増殖が実質的に減少した。例えば、５mg／kgまたは１５mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥを投与したマウスの腫瘍は、ベースライン体積まで腫瘍サイズが戻る退縮を伴う腫瘍増殖減少を示した。１７日目の腫瘍増殖阻害(ＴＧＩ)は、媒体に対して、１.５mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥで３４.２％、５mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥで９６.３％および１５mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥで１００.９％であった。
これらの結果は、ＤＭ１弾頭とＭＭＡＥ弾頭の効力が類似しているにも関わらず、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ接合体が介在する腫瘍増殖阻害が、Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１接合体(上記)より実質的に大きいことを示す。
３. モノメチルアウリスタチンＦ(ＭＭＡＦ)に接合したＨＣ−Ｙ１０４Ｄ変異体抗ＥＧＦＲ抗体(Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ)
ａ. Ｙ１０４Ｄ−Ｍｃ−ＭＭＡＦ(Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ)の産生
実施例２に記載のように産生したＹ１０４Ｄ抗体を、非切断可能リンカー、マレイミドカプロイル(すなわち、ＭＣ−ＭＭＡＦ)へのＭＭＡＦ接合を使用した以外、実質的に上のパート２に記載したように、ＭＭＡＦと接合した。最終接合生成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(ＨＩＣ−ＨＰＬＣ)で評価して、約４の薬物：抗体比(ＤＡＲ)を有した。典型的に、高分子量物質は、総生成物の約６.３８％に対応した。さらに、未接合タンパク質は、無傷のＩｇＧの約４.５８％に対応した。
ｂ. Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦの腫瘍増殖阻害活性
Ａ４３１異種移植腫瘍を有するマウスを、上のパート２に記載のように産生した。腫瘍が〜３５０mm３のサイズに達したら、動物を４試験群に無作為化した：(１)群１ − 媒体(無菌水中８.４８mg／mL 塩化ナトリウム、１.８８mg／mL リン酸ナトリウム二塩基性七水和物、０.４２mg／mL リン酸ナトリウム一塩基性一水和物)(ｎ＝６)、(２)群２ − １.５mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ(ｎ＝６)、(３)群３ − ５mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ(ｎ＝６)および(４)群４ − １５mg／kg体重で投与するＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ(ｎ＝６)。腫瘍の出発サイズが大きいため、全処を静脈内注射で、０日目、３日目、７日目、１１日目および１６日目に週に２回投与した。腫瘍増殖を、−１日目、２日目、６日目、１０日目、１４日目および１７日目に上記のように測定した。
結果を下記表４０に示す。媒体のみを投与したマウスは、試験の間に腫瘍増殖が進行した。１.５mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦを投与されたマウスは、媒体対照と比較して、腫瘍増殖率が低下した。高投与量のＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＦで、媒体対照と比較して、腫瘍増殖が実質的に減少した。例えば、５mg／kgまたは１５mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦを投与されたマウスの腫瘍は、腫瘍増殖の減少を示し、続いて腫瘍サイズがほぼベースライン体積まで退縮して戻った。
これらの結果は、ＭＭＡＥ弾頭およびＤＭ１弾頭と比較してＭＭＡＦの効力が低いにも関わらず、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ接合体が介在する腫瘍増殖阻害はＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥで観察されるものに類似し、Ｙ１０４Ｄ−ＤＭ１接合体より実質的に大きい(上記参照)。
実施例１９
インビボでのＫＲＡＳ変異型ＥＧＦＲ＋ＭＤＡＭＢ ２３１三種陰性乳癌(ＴＮＢＣ)腫瘍の腫瘍増殖に対するＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)の効果
ＫＲＡＳ変異型ＥＧＦＲ＋腫瘍のモデルであるＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｍヒト乳腫瘍異種移植モデルを使用して、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)の腫瘍増殖阻害活性を評価した。Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ ＡＤＣを実施例１８に記載のように産生した。Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦの腫瘍増殖阻害活性を未接合セツキシマブと比較した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ２Ｈ２ＬＮ三種陰性乳癌(ＴＮＢＣ)細胞(Caliper Life Sciences)を、８０％〜９０％密集度のサブコンフルエント増殖段階まで標準条件下で増殖させた。細胞を回収し、無菌ＨＢＳＳで２回洗浄し、計数し、ＨＢＳＳで５.０×１０７細胞／mLまで希釈した。０.１mLの細胞懸濁液(５.０×１０６細胞)を、４〜６週齢、雌無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスの乳房脂肪体にインプラントした。腫瘍が〜４５０mm３のサイズに達したら、動物を次のとおり３試験群に無作為化した：ＨＢＳＳ(媒体対照)；３０mg／kgセツキシマブ対照および３０mg／kg ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＦ。マウスは、処置品の静脈内注射を０日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目および１７日目に受けた。腫瘍増殖を、上記のように処置日に測定した。
結果を表４１に示す。媒体のみを投与したマウスは、試験の間に腫瘍増殖が進行した。セツキシマブ処置は、媒体処置対照動物と比較して腫瘍増殖に対して効果がなく、該抗体がこのモデルで腫瘍増殖阻害を支持するのに十分ではなかったことを示す。対照的に、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＦを投与したマウスでは、媒体対照と比較して、試験の間に実質的に腫瘍増殖が減少し、全試験時点でほぼベースラインレベルの腫瘍体積が維持された。
実施例２０
インビボでのＫＲＡＳ変異型ＥＧＦＲ＋腫瘍の腫瘍増殖に対するヒト化Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥおよびＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥ抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)の効果
いずれもＫＲＡＳ変異型ＥＧＦＲ＋腫瘍のモデルであるＨＴ２９腫瘍異種移植モデルおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｍヒト乳腫瘍異種移植モデルを使用して、変異体Ｙ１０４ＤまたはＹ１０４Ｅ抗ＥＧＦＲ抗体の抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)の腫瘍増殖阻害活性を評価した。ヒト化Ｙ１０４Ｄおよびヒト化Ｙ１０４Ｅ抗体を実施例４.３に記載のように調製し、実施例１８に記載のようにＭＭＡＥと接合させて、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥおよびｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥと命名したＡＤＣを産生した。各ＡＤＣの腫瘍増殖阻害活性を実施例１８で産生したキメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ接合体と比較した。
１. ＨＴ２９腫瘍異種移植モデル
ＨＴ２９腫瘍異種移植を産生するために、雄４〜６週齢、無胸腺ＮＣｒ−ｎｕ／ｎｕマウスに、ＨＢＳＳに懸濁した５.０×１０６ ＨＴ２９結腸直腸癌細胞(ATCC HTB-38)の０.１mL皮下(ＳＣ)注射を、右側腹部に接種した。腫瘍が〜３００mm３のサイズに達したら、動物を次の１０試験群に無作為化した。ＨＢＳＳ(媒体対照)；１０mg／kgキメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ；または３mg／kg、６mg／kg、１０mg／kgまたは３０mg／kg ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ；または３mg／kg、６mg／kg、１０mg／kgまたは３０mg／kg ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥ。マウスは、各試験品を週に２回、０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２１日目および２５日目に静脈内注射された。腫瘍増殖を、上記のように処置日に測定した。腫瘍体積が約２０００mm３までまたはそれを超えて増加したら、動物を屠殺した。
結果を下記表４２(ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ)および表４３(ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥ)に示す。結果の表の各々について、これらの表はまた各時点の媒体対照またはキメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥの投与後の腫瘍体積も示す。媒体のみを投与したマウスは、試験の間に腫瘍増殖が進行した。腫瘍増殖の範囲により、媒体対照を投与されたマウスは１４日後に屠殺した。
表４２および４３の結果は、１０mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥのマウスへの投与が、媒体対照と比較して腫瘍増殖を阻害し、１１日目までに低ベースライン腫瘍体積を下回る腫瘍退縮をもたらし、これが試験の間中持続したことを示す。結果はまた、ＡＤＣ接合体のヒト化形態、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥまたはｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥを投与されたマウスもまた腫瘍退縮を伴う強い抗腫瘍応答を示したことも示す。
例えば、表４２に示すとおり、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥを投与されたマウスは投与量依存性腫瘍増殖阻害を示すが、腫瘍阻害活性の程度は、１０mg／kgの等価な投与量で非ヒト化キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥがわずかに低いが、実質的に３０mg／kg投与量では実質的に同じまたはそれ以上であった。例えば、６mg／kgまたは１０mg／kgの投与量で、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥで処置されたマウスは媒体対照で処置されたマウスと比較して腫瘍増殖の減少を示し、これはほぼベースライン腫瘍体積までの腫瘍退縮をもたらした。３０mg／kgの高投与量で、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥの存在は腫瘍増殖を阻害し、ベースラインレベル未満までへの腫瘍退縮をもたらし、２５日目で、出発(ベースライン)腫瘍体積の半分未満の腫瘍体積となった。
ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥでの結果と類似して、表４３の結果は、ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥを投与されたマウスも投与量依存性腫瘍阻害を示したことを示す。本実験において、ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥの抗腫瘍応答の程度も、試験した全投与量で非ヒト化キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥより小さかった。例えば、 １０mg／kgまたは３０mg／kgを投与されたマウスは媒体処置動物と比較して腫瘍増殖の減少を示し、これはほぼベースラインへの腫瘍退縮をもたらした。
２. ＭＤＡＭＢ ２３１三種陰性乳癌(ＴＮＢＣ)
上記のものに類似する試験も、上の実施例１９に記載したＭＤＡＭＢ ２３１Ｍ異種移植モデルを使用して産生した乳癌異種移植モデルで実施した。腫瘍が〜４００mm３のサイズに達したら、動物を、各６匹のマウスを含む、次の１０試験群に無作為化した：ＨＢＳＳ(媒体対照)；１０mg／kgキメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ対照；３mg／kg、６mg／kg、１０mg／kgまたは３０mg／kg ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ；または３mg／kg、６mg／kg、１０mg／kgまたは３０mg／kg ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥ。マウスは、処置品の静脈内注射を０日目、３日目、６日目、９日目、１３日目、１６日目、２０日目および２３日目に受けた。腫瘍増殖を、上記のように処置日に測定した。
結果を下記表４４(ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ)および表４５(ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥ)に示す。結果の表の各々について、本表はまた、各時点での媒体対照またはキメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥの投与後の腫瘍体積を示す。媒体のみを投与したマウスは、試験の間に腫瘍増殖が進行した。腫瘍増殖の範囲により、媒体対照を投与したマウスを１３日後に屠殺した。
表４４および４５に示す結果は、１０mg／kg Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥのマウスへの投与が媒体対照と比較して腫瘍増殖を阻害し、９日目までにベースライン腫瘍体積未満への腫瘍退縮をもたらし、これが試験の間中持続したことを示す。
ＨＴ２９異種移植腫瘍モデルでの上記結果に類似して、本結果はまたＡＤＣ接合体のヒト化形態、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥまたはｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥを投与されたマウスもまた腫瘍退縮を伴う強い抗腫瘍応答を示したことを示す。３mg／kgおよび６mg／kgの試験したｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥおよびｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥの各々の低投与量で、媒体対照と比較した腫瘍増殖の減少が観察されたが、腫瘍退縮は生じなかった。対照的に、キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥと同様、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥおよびｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥのいずれも、１０mg／kgおよび３０mg／kgの試験投与量の投与により腫瘍退縮が生じた。
例えば、表４４に示すとおり、１０mg／kgまたは３０mg／kg ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥで処置したマウスは対照と比較して腫瘍増殖の減少を示し、試験６日目から始まり持続する腫瘍退縮を生じた。試験完了時、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ処置マウスにおける残存腫瘍体積は、最初の腫瘍体積のわずか約１４％(１０mg／kg)または７％(３０mg／kg)であった(表４４参照)。表４５に示すとおり、ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥの１０mg／kgおよび３０mg／kg投与量を投与したマウスで類似の結果が観察された。試験完了時、ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥ処置マウスにおける残存腫瘍体積は、最初の腫瘍体積の約５０％(１０mg／kg)または１３％(３０mg／kg)であった(表４５)。
３. 結論
これらの結果は、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ接合体およびヒト化形態ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥおよびｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥが、ＫＲＡＳ変異型ＥＧＦＲ＋腫瘍モデルで強い抗腫瘍応答を示すことを確認する。各試験抗体の抗腫瘍応答は、腫瘍増殖退縮を達成する。
実施例２１
セツキシマブ−ＭＭＡＥまたはＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)存在下のケラチン生成細胞と比較した腫瘍細胞のｐＨ依存性増殖の評価
ＥＧＦＲ発現細胞の増殖に対する抗ＥＧＦＲ ＡＤＣ接合体のｐＨ依存性効果を評価した。具体的に、各々セツキシマブ−ＭＭＡＥまたはＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ存在下での、ｐＨ６.８でのＡ４３１腫瘍細胞の細胞増殖またはｐＨ７.４でのケラチン生成細胞細胞の細胞増殖を評価し、比較した。Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥを実施例１８に記載のように産生した。セツキシマブ−ＭＭＡＥを類似法を使用して産生した。
１. 方法
処置前日、Ａ４３１細胞(ATCC CRL 1555)またはヒト新生児ケラチン生成細胞細胞株(Invitrogen C-001-5C)を、適切なｐＨに調節されている１００μL完全培地に、約２,０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート(BD Falcon #35-3072)のウェルに播種した。ケラチン生成細胞を、ｐＨ７.４でEpilife Defined Growth Supplement(Life Technologies)を補ったEpilifeで試験し、Ａ４３１細胞を、ＭＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ(ｐＨ６.８)で試験した。ＭＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳのｐＨは最初にｐＨ７.４に設定し、培地は、ＣＯ２インキュベーターで２時間後ｐＨ６.８に達した。それゆえに、Ａ４３１細胞の細胞増殖はｐＨ６.８で評価し、ケラチン生成細胞細胞の細胞増殖はｐＨ７.４で評価した。細胞は未処置であるか、またはＡ４３１細胞に対して０.９μg／mL〜０.００００１μg／mLの濃度を達成するように添加したＡＤＣの各々の１：３連続希釈で処置した。ＡＤＣの各々をケラチン生成細胞で９０μg／mL〜０.００１μg／mLの濃度で試験した。各条件を、３個のウェルでアッセイした(すなわち、ｎ＝３／条件)。細胞を、５日間、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターの加湿雰囲気下でインキュベートした。細胞増殖を、製造者の指示に従い、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay (Promega Cat# G-7571)で測定した。細胞増殖阻害(ＣＧＩ)パーセントを、未処置細胞に対する生存細胞の減少のパーセンテージとして決定した。ＩＣ５０値を、未処置対照細胞の増殖と比較して、細胞増殖を５０％阻害するのに必要な薬物濃度と定義した。
２. 結果
結果は、セツキシマブ−ＭＭＡＥおよびＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥがＡ４３１細胞の細胞増殖の阻害を示し、これは、試験薬剤で実質的に同一であったことを示す。濃度をｘ軸(LOG(mg／mL))、細胞増殖阻害％をｙ軸にプロットしたとき、セツキシマブ−ＭＭＡＥおよびＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥでの処置は、重複する、シグモイド形濃度依存性細胞増殖阻害を示した。約５０％ＣＧＩは、両ＡＤＣで約０.００１μg／mLであり、最大約８０％ＣＧＩが試験した高濃度で、両ＡＤＣで観察された。
対照的に、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥは、セツキシマブ−ＭＭＡＥと比較して、低ケラチン生成細胞増殖阻害を示した。濃度をｘ軸(LOG(mg／mL))、細胞増殖阻害％をｙ軸にプロットしたとき、セツキシマブ−ＭＭＡＥおよびＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥでの処置はシグモイド形濃度依存性細胞増殖阻害を示したが、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ処置の曲線は、増殖阻害が有意に減少していることを示すシフトをしていた。例えば、セツキシマブ−ＭＭＡＥは約５０％ＣＧＩを約０.１μg／mL濃度で示すのに対し、５０％ＣＧＩを達成するために、１μg／mL Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥが必要であった。最大投与量で、セツキシマブは約８０％ＣＧＩを達成し、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥは約７０％ＣＧＩを示した。
それゆえに、これらの結果は、Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲのＭＭＡＥ ＡＤＣ接合体が、Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥがＡ４３１腫瘍細胞よりも低い細胞増殖阻害活性を皮膚ケラチン生成細胞で示すように、Ｙ１０４Ｄ抗ＥＧＦＲのｐＨ依存性活性を保持することを確認する。
実施例２２
キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥまたはヒト化Ｙ１０４変異体抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)存在下のケラチン生成細胞と比較した腫瘍細胞のｐＨ依存性増殖の評価
ヒト化抗ＥＧＦＲ変異体ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥおよびｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥのＡＤＣ接合体の活性を確認するために、実施例２０に記載したのと実質的に同じ方法を使用して、ＥＧＦＲ発現細胞の増殖に対する各々のｐＨ依存性効果を評価し、キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥと比較した。具体的に、ｐＨ６.８でのＨＴ２９腫瘍細胞(ATCC HTB-38)、ｐＨ６.８でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞(ATCC HTB-26)またはｐＨ７.４でのケラチン生成細胞細胞の細胞増殖を、各々Ｙ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥまたはｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥの存在下で評価した。試験した接合体の各々は、実施例１８に記載する方法を使用して産生した。さらに、ケラチン生成細胞の細胞増殖を評価する試験のために、非アドセトリス(ブレンツキシマブ・ベドチン、非標的抗体接合ＭＭＡＥ；Commercial Pharmacyから得た)も、陰性対照として細胞増殖阻害のために試験した。
１. 方法
細胞増殖アッセイを、ＡＤＣを連続的に１：３希釈して、２００〜０.０３nMの濃度を達成した以外、実施例２１に記載するのと実質的に同じ方法を使用して実施した。ＨＴ２９細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＭＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ(ｐＨ６.８)の存在下培養およびアッセイし、一方ケラチン生成細胞をEpilife(ｐＨ７.４)中培養およびアッセイした。
２. 結果
キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥまたはｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥの各々での処置は、ＨＴ２９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の両者で類似レベルの投与量依存性細胞増殖阻害をもたらした。ＨＴ２９細胞に関して、ＡＤＣ処置は、約２２nM濃度で約５０％細胞増殖阻害をもたらし、試験した最大濃度で約８０％細胞増殖阻害をもたらした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞について、ＡＤＣ処置は、試験した最大濃度で最大約３５〜４０％細胞増殖阻害をもたらした。
キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥは、ケラチン生成細胞の細胞増殖阻害を示し、３.７nMキメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥで５０％増殖阻害が達成された。対照的に、ヒト化変異体ＡＤＣ、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥおよびｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥの各々は、キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥと比較して低いケラチン生成細胞増殖阻害を示した。例えば、ｈｕＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥの細胞増殖阻害ＩＣ５０は約１７nMであり、ｈｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥの細胞増殖阻害ＩＣ５０は約５.４nMであった。比較として、非標的抗体対照、アドセトリスの細胞増殖阻害ＩＣ５０は５０nMであった。
それゆえに、これらの結果は、ヒト化形態のＹ１０４Ｄ−およびＹ１０４Ｅ−抗ＥＧＦＲ変異体のＡＤＣ接合体が、キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥ接合体よりも大きなｐＨ依存性活性を示したことを示す。例えば、各々は、ｐＨ６.８での腫瘍細胞増殖の阻害についてキメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥと同程度有効であるが、各々ｐＨ７.４で、キメラＹ１０４Ｄ−ＭＭＡＥと比較して低い非腫瘍ケラチン生成細胞の増殖阻害を示す。
実施例２３
Ｙ１０４Ｅ抗体−薬物接合体(ＡＤＣ)製剤の安定性
実施例２０に記載のように産生したＨｕＹ１０４Ｅ−ＭＭＡＥ ＡＤＣを、表４６に示す種々の安定化剤との組成物で製剤した。各抗体製剤は、３.７５mg／mlのタンパク質濃度で、１.５mLエッペンドルフチューブに入れ、チューブをドライアイス／エタノールで３０分凍結させ、室温の棚で１０分融解する、２回の凍結融解サイクルに付した。サンプルを、製剤後および各凍結融解サイクル後に、２８０nmでの吸光度の測定によるタンパク質含量、３４０nmでの吸光度測定による濁度(凝集)および５８０nmでの透過率(Ｔ％)測定によるタンパク光(凝集)の分析を行い、製剤安定性を評価した。
初期値と比較した各融解後の増加パーセントを表す結果を、下記表４６に提供する。本結果は、全ての試験した安定化剤が、ＰＢＳ単独よりも安定な製剤をもたらすことを示す。特に、本結果は、０.０２％Ｔｗｅｅｎ ８０または２８０mMトレハロース安定化剤を含むＰＢＳ製剤が、他の安定化剤を含む製剤より安定であることを示す。
当業者にとって修飾が明らかであるため、本発明は添付する特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。

Claims (32)

  1. 非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの可変重鎖(ＶＨ)に、配列番号２または７において１０４位に対応する位置に、グルタミン酸(Ｅ)なるアミノ酸置換（Ｙ１０４Ｅ）を含む修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    対応するアミノ酸位置は本抗体の可変重鎖と配列番号２または７に示す可変重鎖のアライメントにより決定され；
    該修飾抗ＥＧＦＲ抗体、またはその抗原結合フラグメントが上皮成長因子受容体(ＥＧＦＲ)またはその可溶性フラグメントに特異的に結合し、非修飾抗体またはその抗原結合フラグメント中にＹ１０４Ｅ置換単独を含むか、またはＹ１０４Ｅに加えて最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸置換を含み；
    修飾抗ＥＧＦＲ抗体、またはその抗原結合フラグメントが、ｐＨ７．４の条件下で、他は同じ条件で結合活性を測定したときと比較して、ｐＨ６．５の条件下で２．０以上のＥＧＦＲに対する結合活性比を示し、
    該非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントは、
    ｉ)配列番号２または７に示す可変重鎖と配列番号４、９または１１に示す可変軽鎖を含む、セツキシマブまたはその変異体、またはその抗原結合フラグメント；
    ｉｉ)配列番号１に示す重鎖と配列番号３に示す軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント；
    ｉｉｉ）配列番号５に示す重鎖と配列番号３に示す軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント；
    ｉｖ）配列番号１２に示す重鎖と配列番号１３に示す軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント；
    ｖ）配列番号６に示す重鎖と配列番号８に示す軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント；
    ｖｉ）配列番号６に示す重鎖と配列番号１０に示す軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント；
    ｖｉｉ）ヒト化形態のｉ)〜ｖｉ）のいずれか
    から選択されるものである、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 非修飾抗ＥＧＦＲ抗体が
    配列番号２に示す可変重鎖と配列番号４に示す可変軽鎖；または
    配列番号７に示す可変重鎖と配列番号９または１１に示す可変軽鎖を含む、
    請求項１に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 非修飾抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されており、ヒト化形態の配列番号２に示す可変重鎖と配列番号４に示す可変軽鎖、またはヒト化形態の配列番号７に示す可変重鎖と配列番号９または１１に示す可変軽鎖を含む、請求項１または２に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. ヒト化非修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントが
    配列番号１４に示す可変重鎖と配列番号１５に示す可変軽鎖；または
    配列番号１６に示す可変重鎖と配列番号１７に示す可変軽鎖を含む、
    請求項３に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 完全長抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  6. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、および二重特異性抗体フラグメントから選択される抗原結合フラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  7. ａ)配列番号７４もしくは７５に示すアミノ酸配列、または重鎖における１０４位に対応する位置でのＥでの置換以外に、配列番号７４もしくは７５に示す可変重鎖中に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸置換を含む可変重(ＶＨ)鎖；および
    ｂ)配列番号４、９もしくは１１に示すアミノ酸配列、または配列番号４、９もしくは１１に示す可変軽鎖中に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸置換を含む可変軽(ＶＬ)鎖を含むか、または、
    ａ)配列番号７２に示すアミノ酸配列、または重鎖における１０４位に対応する位置でのＥでの置換以外に、配列番号７２に示す重鎖中に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸置換を含む重鎖；および
    ｂ)配列番号３、８、１０もしくは１３のいずれかに示すアミノ酸配列、または配列番号３、８、１０もしくは１３のいずれかに示す軽鎖中に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸置換を含む軽鎖、を含む、
    請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  8. ａ)配列番号７４、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３に示すアミノ酸配列を含む可変重(ＶＨ)鎖；および
    ｂ)配列番号４、９もしくは１１に示すアミノ酸配列を含む可変軽(ＶＬ)鎖；または
    ａ)配列番号７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかに示す重鎖；および
    ｂ）配列番号３、８、１０もしくは１３のいずれかに示す軽鎖；または
    ａ）配列番号７４、７５、７７、７８、８０、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０、９２、９３、９５、９６、９８、９９、１０１、１０２、１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１６、１１７、１１９、１２０、１２２もしくは１２３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む可変重(ＶＨ)鎖；および
    ｂ)配列番号１２５、１２６もしくは１２７に示すアミノ酸配列を含む可変軽(ＶＬ)鎖；または
    ａ）配列番号７２、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８もしくは１２１のいずれかに示すアミノ酸配列を含む重鎖；および
    ｂ）配列番号１２４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、
    請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  9. 修飾抗体またはその抗原結合フラグメント中の唯一の修飾が、前記１０４位に対応する位置のグルタミン酸(Ｅ)でのアミノ酸置換である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  10. 修飾抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  11. （ａ）配列番号６１または６３に示す、または配列番号６１または６３に示す可変重鎖において１０４位のＥ以外の位置に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸置換を含む、可変重鎖および配列番号１８３、１８４または１８６に示す、または配列番号１８３、１８４または１８６に示す可変軽鎖に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸置換を含む、可変軽鎖；または
    （ｂ）配列番号５９に示す、または配列番号５９に示す重鎖において１０４位のＥ以外の位置に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸置換を含む、重鎖および配列番号１８１に示す、または配列番号１８１に示す軽鎖に最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸置換を含む、軽鎖、
    を含む、請求項１０に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  12. Ｖ２４Ｅ、Ｓ２５Ｃ、Ｓ２５Ｖ、Ｆ２７Ｒ、Ｔ３０Ｆ、Ｓ５３Ｇ、Ｄ７２Ｌ、Ｒ９７ＨおよびＱ１１１Ｐから選択されるアミノ酸置換を非修飾抗体の可変重鎖に含む、請求項１〜７、１０および１１のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  13. アミノ酸置換がＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｃ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ／ＬＣ−Ｉ２９Ｓ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｓ２５Ｖ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｔ３０Ｆ／ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐ；ＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ；またはＨＣ−Ｓ５３Ｇ／ＨＣ−Ｄ７２Ｌ／ＨＣ−Ｙ１０４Ｅ／ＨＣ−Ｑ１１１Ｐである、請求項１２に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  14. 次のものから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体もしくはその抗原結合フラグメント：
    ａ)配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖および配列番号１５５、１５６もしくは１５８に示す可変軽鎖；
    ｂ)配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖および配列番号１６２、１６３もしくは１６５に示す可変軽鎖；
    ｃ)配列番号１３７もしくは１３９に示す可変重鎖および配列番号１５５、１５６もしくは１５８に示す可変軽鎖；
    ｄ)配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖および配列番号１６９、１７０もしくは１７２に示す可変軽鎖；
    ｅ)配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖および配列番号１７６、１７７もしくは１７９に示す可変軽鎖；
    ｆ)配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示す可変軽鎖；
    ｇ)配列番号１３７もしくは１３９に示す可変重鎖および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示す可変軽鎖；
    ｈ)配列番号１３１もしくは１３３に示す可変重鎖および配列番号１９０、１９１もしくは１９３に示す可変軽鎖；
    ｉ)配列番号１４３もしくは１４５に示す可変重鎖および配列番号１８３、１８４もしくは１８６に示す可変軽鎖；
    ｊ)配列番号１４９もしくは１５１に示す可変重鎖および配列番号１９７、１９８もしくは２００に示す可変軽鎖；
    ｋ)配列番号１４３もしくは１４５に示す可変重鎖および配列番号１９７、１９８もしくは２００に示す可変軽鎖；
    ｌ)配列番号１４９もしくは１５１に示す可変重鎖および配列番号２０４、２０５もしくは２０７に示す可変軽鎖；
    ｍ)配列番号１４３もしくは１４５に示す可変重鎖および配列番号２０４、２０５もしくは２０７に示す可変軽鎖；
    ｎ)配列番号２１１もしくは２１３に示す可変重鎖および配列番号２５３、２５４もしくは２５６に示す可変軽鎖；
    ｏ)配列番号２１７もしくは２１９に示す可変重鎖および配列番号２５３、２５４もしくは２５６に示す可変軽鎖；
    ｐ)配列番号２２３もしくは２２５に示す可変重鎖および配列番号２６０、２６１もしくは２６３に示す可変軽鎖；
    ｑ)配列番号２２９もしくは２３１に示す可変重鎖および配列番号２６０、２６１もしくは２６３に示す可変軽鎖；
    ｒ)配列番号２３５もしくは２３７に示す可変重鎖および配列番号２６７、２６８もしくは２７０に示す可変軽鎖；
    ｓ)配列番号２４１もしくは２４３に示す可変重鎖および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示す可変軽鎖；
    ｔ)配列番号２２３もしくは２２５に示す可変重鎖および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示す可変軽鎖；
    ｕ)配列番号２２９もしくは２３１に示す可変重鎖および配列番号２７４、２７５もしくは２７７に示す可変軽鎖；
    ｖ)配列番号２３５もしくは２３７に示す可変重鎖および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖；
    ｗ)配列番号２４７もしくは２４９に示す可変重鎖および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖；
    ｘ)配列番号２２３もしくは２２５に示す可変重鎖および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖；
    ｙ)配列番号２２９もしくは２３１に示す可変重鎖および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖；
    ｚ)配列番号２３５もしくは２３７に示す可変重鎖および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖；
    ａａ)配列番号２４７もしくは２４９に示す可変重鎖および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖；
    ｂｂ)配列番号２２３もしくは２２５に示す可変重鎖および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖；
    ｃｃ)配列番号２２９もしくは２３１に示す可変重鎖および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖；
    ｄｄ)配列番号２３５もしくは２３７に示す可変重鎖および配列番号２９５、２９６もしくは２９８に示す可変軽鎖；
    ｅｅ)配列番号２４７もしくは２４９に示す可変重鎖および配列番号３０２、３０３もしくは３０５に示す可変軽鎖；
    ｆｆ)配列番号２１１もしくは２１３に示す可変重鎖および配列番号３０２、３０３もしくは３０５に示す可変軽鎖；
    ｇｇ)配列番号２１１もしくは２１３に示す可変重鎖および配列番号２８１、２８２もしくは２８４に示す可変軽鎖；
    ｈｈ)配列番号２１１もしくは２１３に示す可変重鎖および配列番号２８８、２８９もしくは２９１に示す可変軽鎖。
  15. 完全長抗体であり、該抗体が次のものから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１４のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント：
    ａ)配列番号１２９に示す重鎖および配列番号１５３に示す軽鎖；
    ｂ)配列番号１２９に示す重鎖および配列番号１６０に示す軽鎖；
    ｃ)配列番号１３５に示す重鎖および配列番号１５３に示す軽鎖；
    ｄ)配列番号１２９に示す重鎖および配列番号１６７に示す軽鎖；
    ｅ)配列番号１２９に示す重鎖および配列番号１７４に示す軽鎖；
    ｆ)配列番号１２９に示す重鎖および配列番号１８１に示す軽鎖；
    ｇ)配列番号１３５に示す重鎖および配列番号１８１に示す軽鎖；
    ｈ)配列番号１２９に示す重鎖および配列番号１８８に示す軽鎖；
    ｉ)配列番号１４１に示す重鎖および配列番号１８１に示す軽鎖；
    ｊ)配列番号１４７に示す重鎖および配列番号１９５を示す軽鎖；
    ｋ)配列番号１４１に示す重鎖および配列番号１９５を示す軽鎖；
    ｌ)配列番号１４７に示す重鎖および配列番号２０２に示す軽鎖；
    ｍ)配列番号１４１に示す重鎖および配列番号２０２に示す軽鎖；
    ｎ)配列番号２０９に示す重鎖および配列番号２５１に示す軽鎖；
    ｏ)配列番号２１５に示す重鎖および配列番号２５１に示す軽鎖；
    ｐ)配列番号２２１に示す重鎖および配列番号２５８に示す軽鎖；
    ｑ)配列番号２２７に示す重鎖および配列番号２５８に示す軽鎖；
    ｒ)配列番号２３３に示す重鎖および配列番号２６５に示す軽鎖；
    ｓ)配列番号２３９に示す重鎖および配列番号２７２に示す軽鎖；
    ｔ)配列番号２２１に示す重鎖および配列番号２７２に示す軽鎖；
    ｕ)配列番号２２７に示す重鎖および配列番号２７２に示す軽鎖；
    ｖ)配列番号２３３に示す重鎖および配列番号２７９に示す軽鎖；
    ｗ)配列番号２４５に示す重鎖および配列番号２７９に示す軽鎖；
    ｘ)配列番号２２１に示す重鎖および配列番号２７９に示す軽鎖；
    ｙ)配列番号２２７に示す重鎖および配列番号２７９に示す軽鎖；
    ｚ)配列番号２３３に示す重鎖および配列番号２８６に示す軽鎖；
    ａａ)配列番号２４５に示す重鎖および配列番号２８６に示す軽鎖；
    ｂｂ)配列番号２２１に示す重鎖および配列番号２８６に示す軽鎖；
    ｃｃ)配列番号２２７に示す重鎖および配列番号２８６に示す軽鎖；
    ｄｄ)配列番号２３３に示す重鎖および配列番号２９３に示す軽鎖；
    ｅｅ)配列番号２４５に示す重鎖および配列番号３００に示す軽鎖；
    ｆｆ)配列番号２０９に示す重鎖および配列番号３００に示す軽鎖；
    ｇｇ)配列番号２０９に示す重鎖および配列番号２７９に示す軽鎖；および
    ｈｈ)配列番号２０９に示す重鎖および配列番号２８６に示す軽鎖。
  16. 配列番号６１に示す可変重鎖および配列番号１８３に示す可変軽鎖を含むアミノ酸配列または配列番号５９に示す重鎖および配列番号１８１に示す軽鎖を含むアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  17. 前記結合活性比が少なくとも３.０である、請求項１に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメント。
  18. 標的剤に直接的または間接的に結合した請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、接合体。
  19. 次の成分：
    (Ａｂ)、(Ｌ)ｑおよび(標的剤)ｍ
    を含み、ここで、
    接合体が次の式Ａｂ−[(Ｌ)ｑ−(標的剤)ｍ]を有し；
    ＡｂはＥＧＦＲに結合する修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
    ＬはＡｂを標的剤に結合するためのリンカーであり；
    ｍが１〜８であり；
    ｑが０〜８であり；かつ
    得られた接合体がＥＧＦＲに結合する、請求項１８に記載の接合体。
  20. 標的剤がタンパク質、ペプチド、核酸、細胞毒性部分、放射性同位体、化学療法剤、溶解性ペプチド、サイトカインまたは小分子である、請求項１８または１９に記載の接合体。
  21. 接合体がリンカーＬを含み、リンカーＬがＮ−スクシンイミジル−４(２−ピリジルチオ)プロパノエート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(ＳＭＣＣ)およびＮ−スクシンイミジル−４−(２−ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ)から選択される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の接合体。
  22. 標的剤がアウリスタチンまたはその機能的ペプチド類似体またはモノメチルアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)もしくはＦ(ＭＭＡＦ)である誘導体である、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の接合体。
  23. 標的剤がＭＭＡＥであり；
    ＭＭＡＥが構造
    を有するかまたはその薬学的に許容される塩形態である、請求項２２に記載の接合体。
  24. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  25. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  26. 請求項２４または２５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  27. 請求項２６に記載のベクターを１個または複数個含む、細胞。
  28. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖もコードするベクターを含む、請求項２７に記載の細胞を培養することを含む、修飾抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗原結合フラグメントの製造方法。
  29. 請求項１〜１７のいずれかに記載の修飾抗ＥＧＦＲ抗体または抗原結合フラグメントまたは請求項１８〜２３のいずれかに記載の接合体および
    薬学的に許容される担体または添加物
    を含む、医薬組成物。
  30. 対象における抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態の処置のための、請求項１〜１７のいずれかに記載の修飾抗体もしくは抗原結合フラグメント、請求項１８〜２３のいずれかに記載の接合体、または請求項２９に記載の医薬組成物であって、抗ＥＧＦＲ抗体での処置に応答性である状態が腫瘍、癌または転移である、抗体もしくは抗原結合フラグメント、接合体または医薬組成物。
  31. 腫瘍が固形腫瘍である、請求項３０に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメント、接合体または医薬組成物。
  32. 産生した抗体または抗原結合フラグメントを回収することをさらに含む、請求項２８に記載の製造方法。
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