PL217666B1

PL217666B1 - Zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFα lub jego części wiążącej antygen

Info

Publication number: PL217666B1
Application number: PL399491A
Authority: PL
Inventors: Joachim Kempeni; Roberta Weiss; Steven A. Fischkoff
Original assignee: Abbott Biotech Ltd
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2014-08-29
Also published as: US20130004507A1; PH12013500297A1; JP2012184242A; EP2359855A3; HUP0600688A3; EP3190124A1; US20150165023A1; JP2013100311A; BR0206289A; JP6074462B2; CA2385745A1; EP2359855A2; KR101715028B1; PL217702B1; AR034429A1; WO2002100330A9; PT1406656E; KR101497363B1; CN103495165A; LT2940044T

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen.

Czynnik martwicy nowotworu a (TNFa) jest cytokiną wytwarzaną przez liczne typy komórek, w tym monocyty i makrofagi, którą pierwotnie zidentyfikowano na podstawie jej zdolności do wywoływania martwicy pewnych nowotworów mysich (patrz np. Old, L. (1985) Science 230:630-632). Następnie wykazano, że czynnik określony jako kachektyna, związany z kacheksją, jest taką samą cząsteczką jak TNFa. TNFa jest jednym z czynników pośredniczących we wstrząsie (patrz np. Beutler, B. i Cerami, A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:505-518; Beutler, B. i Cerami, A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:625-655). Ponadto, TNFa jest zaangażowany w patofizjologię rozmaitych innych chorób i zaburzeń u człowieka, w tym posocznicy, infekcji, chorób autoimmunologicznych, odrzucenia przeszczepu i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi (patrz np. Vasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411-452; Tracey, K.J. i Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503).

Ze względu na szkodliwą rolę ludzkiego TNFa (hTNFa) w rozmaitych zaburzeniach u człowieka, stworzono strategie terapeutyczne mające na celu hamowanie lub przeciwdziałanie aktywności hTNFa. W szczególności poszukiwano przeciwciał, które wiążą i neutralizują hTNFa, jako środków hamowania aktywności hTNFa. Jednymi z pierwszych takich przeciwciał były przeciwciała monoklonalne myszy (mAb), wydzielane przez hybrydomy wytworzone z limfocytów myszy immunizowanych hTNFa (patrz np. Hahn T; i in., (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 3814-3818; Liang, C-M., i in. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137:847-854; Hirai, M., i in. (1987) J. Immunol. Methods 96:57-62; Fendly, B.M., i in. (1987) Hybridoma 6:359-370; Moller, A., i in. (1990) Cytokine 2:162-169; opis patentowy US nr 5231024, Moeller i in.; publikacja patentu europejskiego nr 186833 B1, Wallach, D.; publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr 218868 A1, Old i in.; publikacja patentu europejskiego nr 260610 B1, Moeller, A., i in.). Chociaż te mysie przeciwciała anty-hTNFa często wykazywały wysokie powinowactwo do hTNFa (np. Kd < 10'⁹ M) i miały zdolność neutralizowania aktywności hTNFa, ich zastosowanie in vivo mogą ograniczać problemy związane z podawaniem przeciwciał mysich ludziom, takie jak krótki okres półtrwania w surowicy, niezdolność do wyzwalania pewnych funkcji efektorowych u ludzi i wywoływanie niepożądanej odpowiedzi immunologicznej przeciw przeciwciału mysiemu u ludzi (reakcja „ludzkiego przeciwciała przeciwmysiego” (HAMA)).

Próbując przezwyciężyć problemy związane z zastosowaniem całkowicie mysich przeciwciał u ludzi, mysie przeciwciała anty-hTNFa zmieniono metodą inżynierii genetycznej tak, aby były bardziej „podobne do ludzkich”. Wytworzono np. przeciwciała chimeryczne, w których zmienne regiony łańcuchów przeciwciała pochodzą od myszy, a stałe regiony łańcuchów przeciwciała pochodzą od człowi eka (Knight, D.M, i in. (1993) Mol. Immunol. 30:1443-1453; publikacja PCT nr WO 92/16553, Daddona, P.E., i in.). Ponadto wytworzono także humanizowane przeciwciała, w których hiperzmienne domeny regionów zmiennych przeciwciał pochodzą od myszy, a reszta regionów zmiennych i regiony stałe przeciwciała pochodzą od człowieka (publikacja PCT nr WO 92/11383, Adair, J.R., i in.). Jednakże, ponieważ te chimeryczne i humanizowane przeciwciała wciąż zachowują pewne sekwencje mysie, nadal mogą wywoływać niepożądaną reakcję immunologiczną, reakcję ludzkiego przeciwciała przeciwchimerycznego (HACA), szczególnie podawane przez dłuższy czas, np. ze wskazań przewlekłych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów (patrz np. Elliott, M.J., i in. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M.J., i in. (1994) Lancet 344:1105-1110).

Korzystniejszym środkiem hamującym hTNFa w porównaniu z mysimi mAb lub ich pochodnymi (np. chimerycznymi lub humanizowanymi przeciwciałami) byłoby całkowicie ludzkie przeciwciało antyhTNFa, ponieważ taki środek nie powinien wywoływać reakcji HAMA, nawet stosowany przez dłuższy czas. Ludzkie monoklonalne autoprzeciwciała przeciw hTNFa wytworzono stosując techniki wytwarzania ludzkich hybrydom (Boyle, P., i in. (1993) Cell. Immunol. 152:556-568; Boyle, P., i in. (1993) Cell. Immunol. 152:569-581; publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego, nr 614984 A2, Boyle, i in.). Jednakże wykazano, że te pochodzące z hybrydom autoprzeciwciała monoklonalne wykazywały powinowactwo do hTNFa, które było za małe, aby obliczyć je typowymi metodami, były niezdolne do wiązania rozpuszczalnego hTNFa i były niezdolne do neutralizacji cytotoksyczności wywołanej przez hTNFa (patrz Boyle, i in.; powyżej). Ponadto powodzenie techniki wytwarzania Iudzkiej hybrydomy zależy od naturalnej obecności w obwodowej krwi człowieka limfocytów wytwarzających autoprzeciwciała specyficzne dla hTNFa. W pewnych badaniach wykryto autoprzeciwciała osoczowe przeciw hTNFa u ludzi jako pacjentów (Fomsgaard, A., i in. (1989) Scand. J. Immunol. 30:219-223; Bendtzen,

PL 217 666 B1

K., i in. (1990) Prog. Leukocyte Biol. 10B:447-452), natomiast w innych ich nie wykryto (Leusch, H-G., i in. (1991) J. Immunol. Methods 139:145-147).

Alternatywą dla naturalnie występujących ludzkich przeciwciał anty-hTNFa byłoby rekombinowane przeciwciało hTNFa. Opisano rekombinowane ludzkie przeciwciała, które wiążą hTNFa ze sto-7 -2 -1 sunkowo niskim powinowactwem (tj. Kd ~ 10^-7 M) i dużą szybkością dysocjacji dysocjacji (tj. Koff ~ 10^-2 s^-1) (Griffiths, A. D., i in. (1993) EMBO J. 12:725-734). Jednakże, ze względu na stosunkowo szybką kinetykę dysocjacji, te przeciwciała mogą być nieodpowiednie do zastosowania terapeutycznego. Ponadto, opisano rekombinowane ludzkie przeciwciało anty-hTNFa, które nie neutralizuje aktywności hTNFa, lecz raczej wzmacnia wiązanie hTNFa do powierzchni komórek i wzmacnia internalizację hTNFa (Lidbury, A., i in. (1994) Biotechnol. Ther. 5:27-45; publikacja PCT nr WO 92/03145, Aston, R. i in.).

Opisano także rekombinowane ludzkie przeciwciała, które wiążą rozpuszczalny hTNFa z wysokim powinowactwem i powolną kinetyką dysocjacji i które mają zdolność do neutralizowania aktywności hTNFa, w tym cytotoksyczności wywołanej przez hTNFa (in vitro i in vivo) i wywołanej przez hTNFa aktywacji komórek (patrz opis patentowy US nr 6090382). Zgodnie z typowymi protokołami, podawanie przeciwciał przeprowadza się dożylnie w odstępach tygodniowych. Cotygodniowe podawanie przeciwciał i/lub dowolnego leku może być kosztowne, niewygodne i powodować więcej działań ubocznych spowodowanych częstością podawania. Wadą podawania dożylnego jest zazwyczaj konieczność wykonywania zastrzyku przez osobę z przeszkoleniem medycznym.

Wynalazek dotyczy zastosowania izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, u człowieka, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie dla leczenia tego zaburzenia.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą Kd równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą i stałą

-3 -1 szybkości Koff równą 1 x 10^-3 S^-1 lub mniejszą, obie określone metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, i które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-7 M lub mniejszą.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą

-4 -1 antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 5 x 10^-4 s^-1 lub mniejszą.

-4 -1 antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff mniejszą 1 x 10^-4 s^-1 lub mniejszą.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się Iudzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-9 M lub mniejszą.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro -10 z wartością IC50 równą 1 x 10^-10 M lub mniejszą.

Wynalazek dotyczy również zastosowania izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają następujące właściwości:

-3 -1

a) odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 1 x 10^-3 s^-1 lub mniejszą, co określa się metodą powierzchniowego rezonansu plazmowego;

b) mają domenę CDR3 łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; i

c) mają domenę CDR3 łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12.

PL 217 666 B1

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą -4 -1 antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości K_off równą 5 x 10^- s^- lub mniejszą.

Wynalazek dotyczy także zastosowania izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie dla leczenia tego zaburzenia, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8, i mają region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11.

Korzystne jest zastosowanie, w którym podaje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, których LCVR obejmuje ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 5 i HCVR obejmuje ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 6.

Korzystne jest zastosowanie, w którym podaje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, których LCVR obejmuje ponadto domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 7 i HCVR obejmuje domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 i region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało, które ma region stały łańcucha ciężkiego IgG1.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało, które ma region stały łańcucha ciężkiego IgG4.

Korzystne jest zastosowanie, w którym jako ludzkie przeciwciało stosuje się fragment Fab.

Korzystne jest zastosowanie, w którym jako ludzkie przeciwciało stosuje się fragment Fv o pojedynczym łańcuchu.

Wynalazek dotyczy również zastosowania izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie dla leczenia tego zaburzenia, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 lub ma region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34.

Wynalazek dotyczy także zastosowania izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie, dla leczenia tego zaburzenia przy czym ludzkim przeciwciałem jest przeciwciało D2E7 lub jego część wiążąca antygen.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się posocznicę.

Korzystne jest zastosowanie, w którym przeciwciało podaje się człowiekowi razem z cytokiną, interleukiną-6 (IL-6), lub podaje się człowiekowi, u którego stężenie IL-6 w surowicy lub osoczu wynosi powyżej 500 pg/ml.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się chorobę autoimmunologiczną.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się chorobę autoimmunologiczną wybraną z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie kręgosłupa, zapalenie kości i stawów i dnawe zapalenie stawów.

PL 217 666 B1

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się chorobę autoimmunologiczną taką jak reumatoidalne zapalenie stawów.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się chorobę autoimmunologiczną wybraną z grupy obejmującej alergię, stwardnienie rozsiane, cukrzycę autoimmunologiczną, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka i zespół nerczycowy.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się chorobę zakaźną.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się odrzucenie przeszczepu lub reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się stan złośliwy.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się zaburzenie płucne.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się zaburzenie jelitowe.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się zaburzenie serca.

Korzystne jest zastosowanie, w którym leczy się zaburzenie wybrane z grupy obejmującej zapalne choroby kości, resorpcję kości, alkoholowe zapalenie wątroby, wirusowe zapalenie wątroby, zaburzenia krzepnięcia, oparzenia, uszkodzenie reperfuzyjne, powstawanie keloidu, powstawanie tkanki bliznowatej i gorączkę.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia, przy czym człowiekowi podaje się podskórnie kompozycję zawierającą przeciwciało anty-TNFa lub jego część wiążącą antygen i metotreksat tak, aby wyleczyć zaburzenie.

Korzystne jest zastosowanie, w którym metotreksat podaje się razem z przeciwciałem antyTNFa lub jego częścią wiążącą antygen.

Korzystne jest zastosowanie, w którym metotreksat podaje się przed podawaniem przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen.

Korzystne jest zastosowanie, w którym metotreksat podaje się po podaniu przeciwciała antyTNFa lub jego części wiążącej antygen.

Korzystne jest zastosowanie, w którym jako przeciwciało anty-TNFa stosuje się ludzkie przeciwciało anty-TNFa lub jego część wiążącą antygen.

Korzystne jest zastosowanie, w którym podaje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą Kd równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą i stałą -3 -1 szybkości Koff równą 1 x 10^-3 s^-1 lub mniejszą, obie określone metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, i które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-7 M lub mniejszą.

-4 -1 antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 1 x 10^-4 s^-1 lub mniejszą.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-9 M lub mniejszą.

Korzystne jest zastosowanie, w którym jako ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen stosuje się przeciwciało rekombinowane lub jego część wiążącą antygen.

Korzystne jest zastosowanie, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które hamują wywołaną przez ludzki TNFa ekspresję ELAM-1 na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej.

Wynalazek dotyczy również zastosowania ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym podaje się człowiekowi metotreksat i podskórnie, ludzkie przeciwciało anty-TNFa, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają następujące właściwości:

PL 217 666 B1

-3 -1

a) odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości K_off równą 1 x 10^- s^- lub mniejszą, co określa się metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego;

b) mają domenę CDR3 łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9;

Wynalazek dotyczy także zastosowania ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym człowiekowi podaje się metotreksat i podskórnie ludzkie przeciwciało anty-TNFa, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ED NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8, i mają region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym człowiekowi podaje się metotreksat i podskórnie ludzkie przeciwciało anty-TNFa, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 i region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ED NO: 2.

Korzystne jest zastosowanie, w którym podaje się ludzkie przeciwciało, które ma region stały łańcucha ciężkiego IgG1.

Korzystne jest zastosowanie, w którym podaje się ludzkie przeciwciało, które ma region stały łańcucha ciężkiego IgG4.

Korzystne jest zastosowanie, w którym jako ludzkie przeciwciało stosuje się jednołańcuchowy fragment Fv.

Wynalazek dotyczy również zastosowania ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym człowiekowi podaje się metotreksat i podskórnie ludzkie przeciwciało anty-TNFa, lub jego część wiążącą antygen, które mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 lub mają region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ED NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34.

PL 217 666 B1

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym człowiekowi podaje się metotreksat i podskórnie ludzkie przeciwciało anty-TNFa, a jako ludzkie przeciwciało stosuje się przeciwciało D2E7 lub jego część wiążącą antygen.

W niniejszym opisie omówiono sposoby dawkowania co dwa tygodnie w leczeniu zaburzeń związanych z TNFa, korzystnie drogą podskórną. Dawkowanie co dwa tygodnie ma wiele zalet w stosunku do dawkowania co tydzień, w tym, lecz nie ograniczając się do nich, mniejszą całkowitą liczbę iniekcji, mniejszą liczbę reakcji miejscowych na wstrzykiwanie (np. miejscowy ból i obrzęk), większe stosowanie się pacjenta do zaleceń (z uwagi na mniejszą częstość iniekcji) i mniejsze koszty dla pacjenta, jak również dla instytucji zapewniającej opiekę zdrowotną. Podawanie podskórne jest korzystne, ponieważ pacjent może sam podawać sobie substancję terapeutyczną, np. przeciwciało przeciw ludzkiemu TNFa, co jest dogodne zarówno dla pacjenta jak i dla instytucji zapewniającej opiekę zdrowotną.

Leczenie zaburzeń, w których aktywność TNFa jest szkodliwa, obejmuje podawanie co dwa tygodnie podskórnych iniekcji przeciwciał pacjentowi. Przeciwciała korzystnie obejmują rekombinowane ludzkie przeciwciała, które specyficznie wiążą ludzki TNFa. Ponadto leczenie zaburzeń, w których aktywność TNFa jest szkodliwa, obejmuje stosowanie leczenia skojarzonego, a ludzkie przeciwciała podaje się pacjentowi z innym środkiem terapeutycznym, takim jak jedno lub większa liczba dodatkowych przeciwciał, które wiążą inne cząsteczki docelowe (np. przeciwciała, które wiążą inne cytokiny lub które wiążą cząsteczki powierzchniowe komórki), jedna lub większa liczba cytokin, rozpuszczalny receptor TNFa (patrz np. publikacja PCT nr WO 94/06476) i/lub jeden lub większa liczba środków chemicznych, które hamują wytwarzanie lub aktywność hTNFa (takich jak pochodne cykloheksanoylidenu, ujawnione w publikacji PCT nr WO 93/19751), korzystnie metotreksat. Przeciwciała korzystnie obejmują rekombinowane ludzkie przeciwciała, które specyficznie wiążą ludzki TNFa. Przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem charakteryzują się wiązaniem z hTNFa z wysokim powinowactwem i powolną kinetyką dysocjacji, i neutralizacją aktywności hTNFa, w tym wywołanej przez hTNFa cytotoksyczności (in vitro i in vivo), i wywołanej przez hTNFa aktywacji komórki. Przeciwciała mogą być pełnej długości (np. przeciwciało IgG1 lub IgG4) lub mogą obejmować tylko część wiążącą antygen (np. fragment Fab, F(ab')2, scFv lub pojedynczą domenę). Domena CDR3 łańcucha lekkiego najkorzystniejszego rekombinowanego przeciwciała stosowanego zgodnie z wynalazkiem, określonego jako D2E7, zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, a domena CDR3 jego łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 (przedstawione w Wykazie sekwencji). Korzystnie, region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) przeciwciała D2E7 zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1, a region zmienny jego łańcucha ciężkiego (HCVR) zawiera sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2. Te przeciwciała ujawniono w opisie patentowym US nr 6090382.

W jednym rozwiązaniu, leczenie zaburzeń, w których aktywność TNFa jest szkodliwa obejmuje hamowanie aktywności ludzkiego TNFa przez podskórne podawanie co dwa tygodnie przeciwciała anty-TNFa tak, aby wyleczyć zaburzenie. Zaburzeniem może być np. posocznica, choroba autoimmunologiczną (np. reumatoidalne zapalenie stawów, alergia, stwardnienie rozsiane, cukrzyca autoimmunologiczną, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka i zespół nerczycowy), choroba zakaźna, proces złośliwy, odrzucenie przeszczepu lub reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi, zaburzenie płucne, zaburzenie kostne, zaburzenie jelitowe lub zaburzenie serca.

Można wytworzyć również zestawy obejmujące preparat zawierający kompozycję farmaceutyczną. Zestawy obejmują przeciwciało anty-TNFa i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Zestawy zawierają instrukcje podawania podskórnego kompozycji farmaceutycznej co dwa tygodnie w leczeniu zaburzenia, w którym korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa. Zgodnie z innym aspektem, można wytworzyć również zestawy obejmujące preparat zawierający kompozycję farmaceutyczną składającą się ponadto z przeciwciała anty-TNFa, metotreksatu i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Zestawy zawierają instrukcje dotyczące podskórnego podawania kompozycji farmaceutycznej w leczeniu zaburzenia, w którym korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa.

Można wytworzyć również gotową strzykawkę zawierającą kompozycję farmaceutyczną składającą się z przeciwciała anty-TNFa i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. W jeszcze innym aspekcie. Można wytworzyć również gotową strzykawkę zawierającą kompozycję farmaceutyczną składającą się z przeciwciała anty-TNFa, metotreksatu i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika.

PL 217 666 B1

Zgodnie z wynalazkiem możliwe są sposoby leczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa, obejmujące podawanie izolowanych ludzkich przeciwciał lub ich części wiążących antygen, które wiążą ludzki TNFa z wysokim powinowactwem, małą szybkością dysocjacji i dużą wydajnością neutralizacji tak, aby wyleczyć zaburzenie. Różne aspekty wynalazku odnoszą się do leczenia przeciwciałami i fragmentami przeciwciał, oraz ich kompozycjami farmaceutycznymi.

W celu łatwiejszego zrozumienia wynalazku poniżej podano definicje niektórych określeń.

Stosowane tu określenia „podawanie” i „dawkowanie” odnoszą się do podawania substancji (np. przeciwciała anty-TNFa) w celu osiągnięcia celu terapeutycznego (np. leczenia zaburzenia związanego z TNFa).

Stosowane tu określenia „tryb podawania co dwa tygodnie”, „dawkowanie co dwa tygodnie” i „podawanie co dwa tygodnie” odnoszą się do przebiegu w czasie podawania substancji (np. przeciwciała anty-TNFa) pacjentowi tak, aby osiągnąć cel terapeutyczny (np. leczenie zaburzenia związanego z TNFa). Tryb podawania co dwa tygodnie nie ma w zamierzeniu obejmować trybu podawania co tydzień. Korzystnie, substancję podaje się co 9-19 dni, korzystniej co 11-17 dni, jeszcze korzystniej co 13-15 dni, a najkorzystniej co 14 dni.

Stosowane tu określenie „leczenie skojarzone” odnosi się do podawania dwóch lub większej liczby substancji terapeutycznych, np. przeciwciała anty-TNFa i leku metotreksatu. Metotreksat można podawać wspólnie z, przed lub po podaniu przeciwciała anty-TNFa.

Stosowane tu określenie „ludzki TNFa” (w skrócie tu jako hTNFa, lub po prostu hTNF) ma w zamierzeniu odnosić się do ludzkiej cytokiny, która istnieje w postaci wydzielanej o masie 17 kD i postaci związanej z błoną o masie 26 kD, której biologicznie czynna postać składa się z trimeru niekowalencyjnie związanych cząsteczek o masie 17 kD. Budowę TNFa opisał ponadto np. Pennica, D., i in. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J.M., i in. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; i Jones, E.Y., i in. (1989) Nature 338:225-228. Określenie ludzki TNFa ma w zamierzeniu obejmować rekombinowany ludzki TNFa (rhTNFa), który można wytworzyć standardowymi metodami rekombinacyjnej ekspresji lub zakupić (R & D Systems, Numer katalogowy 210-TA, Minneapolis, MN).

Stosowane tu określenie „przeciwciało” ma w zamierzeniu odnosić się do cząsteczek immunoglobulin składających się z czterech łańcuchów polipeptydowych, dwóch łańcuchów ciężkich (H) i dwóch łańcuchów lekkich (L) połączonych ze sobą mostkami dwusiarczkowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (w skrócie tu jako HCVR lub VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen, CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (w skrócie tu jako LCVR lub VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony VH i VL można dalej podzielić na regiony hiperzmienności, określone jako regiony określające komplementarność (CDR), przeplatające się z regionami, które są bardziej zachowywane, określone jako regiony zrębowe (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech CDR i czterech FR, ułożonych od końca aminowego do końca karboksylowego w następującym porządku: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Stosowane tu określenie „część wiążąca antygen” przeciwciała (lub po prostu „część przeciwciała”) odnosi się do jednego lub większej liczby fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność do specyficznego wiązania antygenu (np. hTNFa). Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przez przeciwciało może być pełniona przez fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objętych określeniem „część wiążąca antygen” przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab')2, dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab związane mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (iv) fragment Fv składający się z domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, (v) fragment dAb (Ward i in., (1989) Nature 341:544-546), który składa się z domeny VH; i (vi) izolowany region określający komplementarność (CDR). Ponadto, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH, są kodowane przez oddzielne geny, można je połączyć, stosując metody rekombinacji, syntetyczną grupą łączącą, która umożliwia wytwarzanie ich w postaci pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH tworzą parę z wytworzeniem jednowartościowych cząsteczek (znanych jako jednołańcuchowe Fv (scFv); patrz np. Bird i in. (1988) Science 242:423-426; i Huston i in. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takie jednołańcuchowe przeciwciała także w zamierzeniu są objęte określeniem „część wiążąca antygen” przeciwciała. Inne postacie jednołańcuchowych przeciwciał, takie jak przeciwciała o podwójnej swoistości (ang. diabodies) także są objęte tym określeniem. Przeciwciała o podwójnej swoistości są

PL 217 666 B1 dwuwartościowymi, dwuspecyficznymi przeciwciałami, w których domeny VH i VL ulegają ekspresji w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, lecz z zastosowaniem grupy łączącej, która jest zbyt krótka, aby umożliwiać tworzenie pary pomiędzy tymi dwoma domenami na tym samym łańcuchu, tym samym wymuszając tworzenie par przez te domeny z uzupełniającymi domenami innych łańcuchów i tworząc dwa miejsca wiążące antygen (patrz np. Holliger, P., i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., i in. (1994) Structure 2:1121-1123).

Ponadto, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen może być częścią większych cząsteczek immunoadhezyjnych, utworzonych przez kowalencyjne lub niekowalencyjne połączenie przeciwciała lub części przeciwciała z jednym lub większą liczbą innych białek lub peptydów. Przykłady takich cząsteczek immunoadhezyjnych obejmują zastosowanie regionu rdzenia streptawidyny w celu wytworzenia tetramerycznej cząsteczki scFv (Kipriyanov, S.M., i in. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) i zastosowanie reszty cysteinowej, peptydu markerowego i C-końcowego znacznika polihistydynowego w celu wytworzenia dwuwartościowych i biotynylowanych cząsteczek scFv (Kipriyanov, S.M., i in. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Części przeciwciała, takie jak fragmenty Fab i F(ab')2, można wytworzyć z całych przeciwciał stosując typowe techniki, takie jak trawienie odpowiednio papainą lub pepsyną całych przeciwciał. Ponadto przeciwciała, części przeciwciał i cząsteczki immunoadhezyjne można otrzymać stosując opisane tu standardowe techniki rekombinacji DNA.

Stosowane tu określenie „ludzkie przeciwciało” ma w zamierzeniu obejmować przeciwciała mające regiony zmienne i stałe pochodzące od sekwencji immunoglobulin ludzkich linii zarodkowych. Ludzkie przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą obejmować reszty aminokwasowe niezakodowane przez sekwencje immunoglobulin ludzkich linii zarodkowych (np. mutacje wprowadzone przez przypadkową lub miejscowo-specyficzną mutagenezę in vitro lub przez somatyczną mutację in vivo), np. w CDR, a w szczególności CDR3. Jednakże, stosowane tu określenie „ludzkie przeciwciało” nie ma w zamierzeniu obejmować przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzące od linii zarodkowej innego gatunku ssaka, takiego jak mysz, przeszczepiono do ludzkich sekwencji zrębowych.

Stosowane tu określenie „rekombinowane ludzkie przeciwciało” ma w zamierzeniu obejmować wszystkie ludzkie przeciwciała, które są preparowane, ulegają ekspresji, są wytwarzane lub wyodrębniane technikami rekombinacji, takie jak przeciwciała ulegające ekspresji z zastosowaniem rekombinowanego wektora ekspresyjnego, którym stransfekowano komórkę gospodarza (opisane dokładniej poniżej w Sekcji II), przeciwciała wyodrębniane z rekombinowanej, kombinatorycznej biblioteki ludzkich przeciwciał (opisane dokładniej poniżej w Sekcji III), przeciwciała wyodrębniane od zwierzęcia (np. myszy) transgenicznego pod względem ludzkich genów immunoglobulin (patrz np. Taylor, L.D., i in. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) lub przeciwciała preparowane, ulegające ekspresji, wytwarzane lub wyodrębniane dowolnymi innymi sposobami, które obejmują składanie sekwencji genu ludzkiej immunoglobuIiny z innymi sekwencjami DNA. W takich rekombinowanych ludzkich przeciwciałach regiony zmienne i stałe pochodzą z sekwencji immunoglobulin ludzkiej linii zarodkowej. Jednakże w pewnych rozwiązaniach, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała poddaje się mutagenezie in vitro (lub gdy stosuje się zwierzę transgeniczne pod względem ludzkich sekwencji Ig, mutagenezie somatycznej in vivo), a więc sekwencje aminokwasów regionów VH i VL przeciwciał rekombinowanych są sekwencjami, które podczas gdy pochodzą z i są związane z sekwencjami VH i VL ludzkiej linii zarodkowej, mogą nie występować naturalnie w repertuarze linii zarodkowej ludzkich przeciwciał in vivo.

Stosowane tu określenie „izolowane przeciwciało” ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciała, które jest zasadniczo wolne od innych przeciwciał o innej swoistości antygenowej (np. izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże hTNFa jest zasadniczo wolne od przeciwciał, które specyficznie wiążą antygeny inne niż hTNFa). Jednakże, izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże hTNFa, może mieć reaktywność krzyżową w stosunku do innych antygenów, takich jak cząsteczki hTNFa od innych gatunków (omówione w dalszych szczegółach poniżej). Ponadto izolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innego materiału komórkowego i/lub środków chemicznych.

Stosowane tu określenie „przeciwciało neutralizujące” (lub „przeciwciało, które neutralizuje aktywność hTNFa) ma w zamierzeniu odnosić się do przeciwciała, którego wiązanie z hTNFa powoduje hamowanie biologicznej aktywności hTNFa. To hamowanie biologicznej aktywności hTNFa można oszacować przez pomiar jednego lub większej liczby wskaźników aktywności biologicznej hTNFa, takiej jak wywołana przez hTNFa cytotoksyczność (in vitro lub in vivo), wywołana przez hTNFa aktywacja komórek i wiązanie hTNFa z receptorami hTNFa. Te wskaźniki biologicznej aktywności hTNFa można oceniać przy pomocy jednego lub większej liczby spośród kilku standardowych testów in vitro

PL 217 666 B1 lub in vivo znanych w dziedzinie (patrz Przykład 4). Korzystnie, zdolność przeciwciała do neutralizacji aktywności hTNFa ocenia się przez hamowanie wywołanej przez hTNFa cytotoksyczności komórek

L929. Jako dodatkowy lub alternatywny parametr aktywności hTNFa, można oszacować zdolność przeciwciała do hamowania wywołanej przez hTNFa ekspresji ELAM-1 na HUVEC, jako miarę wywołanej przez hTNFa aktywacj i komórki.

Stosowane tu określenie „powierzchniowy rezonans plazmnowy” odnosi się do zjawiska optycznego, które umożliwia analizę w czasie rzeczywistym biospecyficznych oddziaływań przez wykrywanie zmian w stężeniach białka w obrębie macierzy będącej czujnikiem biologicznym, np. z zastosowaniem systemu BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja i Piscataway, NJ). Dokładniejszy opis podano w Przykładzie 1 i Jonsson, U., i in. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i in. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., i in. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; i Johnnson, B., i in. (1991) Anal Biochem. 198:268-277.

Stosowane tu określenie „Koff” ma w zamierzeniu odnosić się do stałej szybkości dysocjacji przeciwciała z kompleksu przeciwciało/antygen.

Stosowane tu określenie „Kd” ma w zamierzeniu odnosić się do stałej dysocjacji dla konkretnych oddziaływań przeciwciało-antygen.

Stosowane tu określenie „cząsteczka kwasu nukleinowego” ma w zamierzeniu obejmować cząsteczki DNA i cząsteczki RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jedno- lub dwuniciowa, lecz korzystnie obejmuje DNA o nici podwójnej.

Stosowane tu określenie „izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego”, w odniesieniu do kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała lub części przeciwciał (np. VH, VL, CDR3), które wiążą hTNFa, ma w zamierzeniu odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego, w której sekwencje nukleotydowe kodujące przeciwciało lub część przeciwciała nie zawierają innych sekwencji nukleotydowych kodujących przeciwciała lub części przeciwciał, które wiążą antygeny inne niż hTNFa, które to inne sekwencje mogą naturalnie otaczać kwas nukleinowy w DNA genomu ludzkiego. Zatem np. opisany tu izolowany kwas nukleinowy kodujący region VH przeciwciała anty-hTNFa nie zawiera żadnych innych sekwencji kodujących inne regiony VH, które łączą się z antygenami innymi niż hTNFa.

Stosowane tu określenie „wektor” ma w zamierzeniu odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do przenoszenia innego kwasu nukleinowego, niż do którego została przyłączona. Jednym z typów wektora jest „plazmid”, który jest kolistą pętlą dwuniciowego DNA, z którym można zligować dodatkowe segmenty DNA. Innym typem wektora jest wektor wirusowy, w którym dodatkowe segmenty DNA można zligować z genomem wirusa. Pewne wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarzu, do której są wprowadzone (np. wektory bakteryjne obejmujące bakteryjny początek replikacji i episomalne wektory ssacze). Inne wektory (np. nieepisomalne wektory ssacze) mogą się integrować z genomem komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i tym samym ulegają replikacji wraz z genomem gospodarza. Ponadto pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi zostały funkcjonalnie połączone. Takie wektory są tu opisywane jako „rekombinowane wektory ekspresyjne (lub po prostu „wektory ekspresyjne”). Na ogół wektory ekspresyjne przydatne w technikach rekombinacji DNA występują często w postaci plazmidów. W niniejszym opisie określenia „plazmid” i „wektor” można stosować zamiennie, ponieważ plazmid jest najpowszechniej stosowaną postacią wektora. Można jednakże stosować także inne postacie wektorów ekspresyjnych, takie jak wektory wirusowe (np. retrowirusy z defektem replikacji, adenowirusy i wirusy związane z adenowirusami), które spełniają równoważne funkcje.

Stosowane tu określenie „rekombinowana komórka gospodarz” (lub po prostu „komórka gospodarz”) ma w zamierzeniu odnosić się do komórki, do której wprowadzono rekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być zrozumiałe, że takie określenia mają w zamierzeniu odnosić się nie tylko do pojedynczej komórki gospodarza, lecz do potomstwa takiej komórki. Ponieważ w kolejnych pokoleniach mogą wystąpić pewne modyfikacje z powodu mutacji albo wpływów środowiskowych, takie potomstwo może właściwie nie być identyczne z macierzystą komórką, lecz wciąż mieści się w zakresie stosowanego tu określenia „komórka gospodarz”.

Różne aspekty według wynalazku opisano bardziej szczegółowo w kolejnych akapitach.

I. Ludzkie przeciwciała, które wiążą ludzki TNFa

Zgodnie z wynalazkiem możliwe są sposoby leczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa. Te sposoby obejmują podawanie podskórne co dwa tygodnie izolowanych ludzkich przeciwciał lub ich części wiążących antygen, które wiążą ludzki TNFa z wysokim powinowactwem, małą szybkością dysocjacji i dużą zdolnością neutralizacji. Korzystnie ludzkie przeciwciaPL 217 666 B1 ła stosowane zgodnie z wynalazkiem są rekombinowanymi, neutralizującymi ludzkimi przeciwciałami anty-hTNFa. Najkorzystniejsze rekombinowane, neutralizujące przeciwciało stosowane zgodnie z wynalazkiem jest tu opisywane jako D2E7 (sekwencję aminokwasów regionu VL D2E7 pokazano w SEQ ID NO: 1; sekwencję aminokwasów regionu VH D2E7 pokazano w SEQ ID NO: 2). Właściwości D2E7 opisał Salfeld i in., w opisie patentowym US nr 6090382.

W pewnym aspekcie, możliwe są sposoby leczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa. Te sposoby leczenia obejmują podawanie podskórne co dwa tygodnie przeciwciał D2E7 i części przeciwciał, przeciwciał i części przeciwciał spokrewnionych z D2E7, i innych ludzkich przeciwciał i części przeciwciał o właściwościach równoważnych z D2E7, takich jak wysokie powinowactwo wiązania do hTNFa ze słabą kinetyką dysocjacji i dużą zdolnością neutralizacji. W jednym rozwiązaniu, do leczenia stosuje się izolowane ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą Kd równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą i stałą -3 -1 szybkości Koff równą 1 x 10^-3 s^-1 Iub mniejszą, obie określone metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, i neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-7 M lub mniejszą. Korzystniej izolowane ludzkie przeciwciało lub jego -4 -1 część wiążąca antygen odłącza się od ludzkiego TNFa ze stałą Koff równą 5 x 10^-4 s^-1 lub mniejszą, -4 -1 lub jeszcze korzystniej, ze stałą Koff równą 1 x 10^-4 s^-1 lub mniejszą. Korzystniej izolowane ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą, jeszcze korzystniej z wartością IC50 równą 1 x 10^-9 M lub mniejszą i jeszcze korzystniej z wartością IC50 równą 1 x 10^-10 M lub mniejszą. W korzystnym rozwiązaniu przeciwciałem jest izolowane ludzkie przeciwciało rekombinowane lub jego część wiążąca antygen.

W dziedzinie dobrze wiadomo, że domeny CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała odgrywają ważną rolę w specyficzności/powinowactwie wiązania przeciwciała w stosunku do antygenu. Zgodnie z tym, według innego aspektu, możliwe są sposoby leczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa, przez podawanie podskórne ludzkich przeciwciał, które mają powolną kinetykę dysocjacji dla połączenia z hTNFa i które obejmują domeny CDR3 łańcucha lekkiego i ciężkiego, które strukturalnie są identyczne lub spokrewnione z domenami D2E7. Pozycję 9 domeny CDR3 VL D2E7 może zajmować Ala lub Thr bez zasadniczego wpływu na Koff. Zgodnie z tym, motyw konsensusowy dla domeny CDR3 VL D2E7 zawiera sekwencję aminokwasów: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO: 3). Ponadto pozycję 12 domeny CDR3 VH D2E7 może zajmować Tyr lub Asn, bez zasadniczego wpływu na Koff. Zgodnie z tym motyw konsensusowy dla CDR3 VH D2E7 zawiera sekwencję aminokwasów: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO: 4). Ponadto, jak pokazano w Przykładzie 2, domena CDR3 łańcucha ciężkiego i lekkiego D2E7 może podlegać podstawieniu pojedynczą resztą alaninową (w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 w obrębie CDR3 VL lub w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 w obrębie CDR3 VH) bez zasadniczego wpływu na Koff. Ponadto dla fachowca będzie oczywiste, że przy podatności domen CDR3 VL i VH D2E7 na podstawienia przez alaninę, podstawienie innych aminokwasów w obrębie domeny CDR3 może być możliwe przy zachowaniu nadal małej stałej szybkości dysocjacji przeciwciała, w szczególności podstawienia konserwatywnymi aminokwasami. Stosowane tu określenie „podstawienie konserwatywnym aminokwasem oznacza takie podstawienie, w którym jedną resztę aminokwasową zastępuje się inną resztą aminokwasową o podobnym łańcuchu bocznym. Rodziny reszt aminokwasowych o podobnych łańcuchach bocznych są znane w dziedzinie i obejmują zasadowe łańcuchy boczne (np. lizyna, arginina, histydyna), kwasowe łańcuchy boczne (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowane polarne łańcuchy boczne (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarne łańcuchy boczne (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), beta-rozgałęzione łańcuchy boczne (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatyczne łańcuchy boczne (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Korzystnie wprowadza się nie więcej niż jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w obrębie domen CDR3 VL i/lub VH D2E7. Korzystniej wprowadza się nie więcej niż jedno do trzech konserwatywnych podstawień aminokwasów w obrębie domen CDR3 VL i/lub VH D2E7. Ponadto konserwatywne podstawienia aminokwasów nie powinny być wprowadzane w pozycjach aminokwasów krytycznych dla wiązania z hTNFa. Pozycje 2 i 5 CDR3 VL D2E7 i pozycje 1 i 7 CDR3 VH D2E7 okazują się być krytyczne dla oddziaływania z hTNFa, a więc korzystnie nie wprowadza się konserwatywnych podstawień aminokwasów w tych pozycjach (chociaż podstawienie alaniny w pozycji 5 CDR3 VL D2E7 jest dopuszczalne, co opisano powyżej) (patrz opis patentowy US nr 6090382).

PL 217 666 B1

Zgodnie z tym, w innym rozwiązaniu, możliwe są sposoby leczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa przez podawanie podskórne co dwa tygodnie izolowanego ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen korzystnie ma następujące właściwości:

-3 -1

a) odłącza się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 1 x 10^-3 s^-1 lub mniejszą, co określa się metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego;

b) ma domenę CDR3 łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9;

c) ma domenę CDR3 łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12.

Korzystniej przeciwciało lub jego część wiążąca antygen odłącza się od ludzkiego TNFa ze sta-4 -1 łą Koff równą 5 x 10^-4 s^-1 lub mniejszą. Jeszcze korzystniej przeciwciało lub jego część wiążąca anty-4 -1 gen, odłącza się od ludzkiego TNFa ze stałą Koff równą 1 x 10^-4 s^-1 lub mniejszą.

W jeszcze innym rozwiązaniu, możliwe są sposoby leczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa przez podawanie podskórne co dwa tygodnie izolowanego ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen korzystnie ma region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8, i region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11. Korzystnie, LCVR obejmuje ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 5 (tj. CDR2 VL D2E7) i HCVR obejmuje ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 6 (tj. CDR2 VH D2E7). Jeszcze korzystniej LCVR obejmuje ponadto domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 7 (tj. CDR1 VL D2E7) i HCVR obejmuje domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8 (tj. CDR1 VH D2E7). Regiony zrębowe dla VL korzystnie pochodzą z rodziny ludzkiej linii zarodkowej V_KI, korzystniej z genu Vk ludzkiej linii zarodkowej A20 i najkorzystniej z sekwencji zrębowych VL D2E7 pokazanych na Figurach 1A i 1B opisu patentowego US nr 6090382. Regiony zrębowe dla VH korzystnie pochodzą z rodziny ludzkiej linii zarodkowej VH3, korzystniej z genu VH ludzkiej linii zarodkowej DP-31 i najkorzystniej z sekwencji zrębowych VH D2E7 pokazanych na Figurach 2A i 2B opisu patentowego US nr 6090382.

W jeszcze innym rozwiązaniu, możliwe są sposoby leczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa, przez podskórne podawanie co dwa tygodnie izolowanego ludzkiego przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen korzystnie ma region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 (tj. VL D2E7) i region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2 (tj. VH D2E7). W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało ma taki region stały łańcucha ciężkiego jak region stały IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD. Korzystnie region stały łańcucha ciężkiego stanowi region stały łańcucha ciężkiego IgG1 lub region stały łańcucha ciężkiego IgG4. Ponadto przeciwciało może obejmować region stały łańcucha lekkiego albo region stały łańcucha lekkiego kappa lub region stały łańcucha lekkiego lambda. Korzystnie przeciwciało ma region stały łańcucha lekkiego kappa. Alternatywnie część przeciwciała może obejmować np. fragment Fab lub jednołańcuchowy fragment Fv.

W jeszcze innych rozwiązaniach, możliwe są sposoby Ieczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa przez podawanie podskórne co dwa tygodnie izolowanego ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążących antygen. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen korzystnie zawiera domenę CDR3 VL i VH pokrewną D2E7, np. przeciwciała lub ich części wiążące antygen z regionem zmiennym łańcucha lekkiego (LCVR), który obejmuje domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID

NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID

NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID

NO: 24, SEQ ID NO: 25 i SEQ ID NO: 26 lub z regionem zmiennym łańcucha ciężkiego (HCVR), który obejmuje domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID

PL 217 666 B1

NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID

NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 i SEQ ID NO: 35.

Przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą być zmodyfikowane lub połączone z inną cząsteczką funkcyjną (np. innym peptydem lub białkiem). Zgodnie z tym, przeciwciała i części przeciwciał stosowane zgodnie z wynalazkiem mają w zamierzeniu obejmować przekształcone w pochodne i inaczej zmodyfikowane postacie ludzkich przeciwciał anty-hTNFa opisanych w tym opisie, obejmujących cząsteczki immunoadhezyjne. Przykładowo przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą być funkcjonalnie połączone (przez sprzęganie chemiczne, fuzję genetyczną, połączenie niekowalencyjne lub inaczej) z jedną lub większą liczbą jednostek cząsteczkowych, takich jak inne przeciwciało (np. dwuspecyficzne przeciwciało lub przeciwciało o podwójnej swoistości), środek wykrywalny, środek cytotoksyczny, środek farmaceutyczny i/lub białko lub peptyd, który może pośredniczyć w łączeniu przeciwciała lub części przeciwciała z inną cząsteczką (taką jak region rdzenia streptawidyny lub marker polihistydynowy).

Jeden typ przekształconego w pochodną przeciwciała wytwarza się przez sieciowanie dwóch lub większej liczby przeciwciał (takiego samego typu lub różnych typów, np. w celu stworzenia przeciwciał dwuspecyficznych). Odpowiednie środki sieciujące obejmują te, które są heterobifunkcyjne, mają dwie w odmienny sposób reaktywne grupy oddzielone odpowiednią grupą dystansującą (np. ester m-maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynimidowy) lub homobifunkcyjne (np. suberynian disukcynimidylu). Takie grupy łączące są dostępne z firmy Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Przydatne środki wykrywalne, z którymi można połączyć przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem obejmują związki fluorescencyjne. Przykładowe wykrywalne środki fluorescencyjne obejmują fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, chlorek 5-dimetyloamino-1-naftalenosulfonylu fikoerytrynę itp. Przeciwciało może także być zmodyfikowane przez związanie z wykrywalnymi enzymami, takimi jak zasadowa fosfataza, peroksydaza chrzanowa, oksydaza glukozowa itp. Gdy przeciwciało modyfikuje się przez związanie z wykrywalnym enzymem, wówczas wykrywa się je przez dodanie dodatkowych reagentów, które enzym wykorzystuje do wytworzenia wykrywalnego produktu reakcji. Przykładowo gdy jako środek wykrywalny stosuje się peroksydazę chrzanową, dodanie nadtlenku wodoru i diaminobenzydyny prowadzi do otrzymania barwnego produktu reakcji, który można wykrywać. Przeciwciało można także zmodyfikować przez połączenie z biotyną i wykrywać przez pośredni pomiar wiązania awidyny lub streptawidyny.

II. Ekspresja przeciwciał

Przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem można wytworzyć przez rekombinacyjną ekspresję genów łańcucha lekkiego i ciężkiego immunoglobuliny w komórce gospodarzu. Aby uzyskać rekombinacyjną ekspresję przeciwciała, komórkę gospodarza transfekuje się jednym lub większą liczbą rekombinowanych wektorów ekspresyjnych przenoszących fragmenty DNA kodujące łańcuchy lekkie i ciężkie przeciwciała tak, aby łańcuchy lekkie i ciężkie ulegały ekspresji w komórce gospodarzu i korzystnie były wydzielane do pożywki, w której hoduje się komórki gospodarzy, z której to pożywki przeciwciała można odzyskać. W celu uzyskania genów łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała, wbudowania tych genów do rekombinowanych wektorów ekspresyjnych i wprowadzenia wektorów do komórek gospodarzy stosuje się standardowe metodologie rekombinacji DNA, takie jak opisane przez Sambrook, Fritsch i Maniatis (red.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. i in. (red.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) i w opisie patentowym US nr 4816397 autorstwa Bossa i in.

W celu uzyskania ekspresji D2E7 lub przeciwciała spokrewnionego z D2E7, najpierw otrzymuje się fragmenty DNA kodujące regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego. Te fragmenty DNA można otrzymać przez amplifikację i modyfikację sekwencji zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego linii zarodkowej stosując łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Sekwencje DNA linii zarodkowej dla genów regionu zmiennego ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego są znane w dziedzinie (patrz np. baza danych sekwencji ludzkiej linii zarodkowej „Vbase”; patrz także Kabat, E.A., i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Service, publikacja NIH nr 91-3242; Tomlinson, I.M., i in. (1992) „The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; i Cox, J.P.L. i in. (1994) „A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage Eur. J. Immunol. 24:827-836). W celu uzyskania fragmentu DNA kodującego region zmienny łańcucha ciężkiego D2E7 lub przeciwciała spokrewnionego z D2E7 amplifikuje się gen należący do rodziny VH3 genów VH ludzkiej linii zarodkowej standardową PCR. Najkorzystniej

PL 217 666 B1 amplifikuje się sekwencję DP-31 VH linii zarodkowej. W celu uzyskania fragmentu DNA kodującego region zmienny łańcucha lekkiego D2E7 lub przeciwciała spokrewnionego z D2E7, amplifikuje się gen z rodziny V_KI genów VL ludzkiej linii zarodkowej standardową PCR. Najkorzystniej amplifikuje się sekwencję VL A20 linii zarodkowej. Startery do PCR odpowiednie do zastosowania w amplifikowaniu sekwencji VH DP-31 linii zarodkowej i VL A20 linii zarodkowej można zaprojektować na bazie sekwencji nukleotydowych ujawnionych w odsyłaczach literaturowych cytowanych powyżej, stosując standardowe metody.

Po uzyskaniu fragmentów VH i VL linii zarodkowej, te sekwencje można zmutować tak, aby kodowały sekwencje aminokwasów D2E7 lub spokrewnione z D2E7 ujawnione w tym opisie. Sekwencje aminokwasów zakodowane przez sekwencje DNA VH i VL linii zarodkowej porównuje się najpierw sekwencjami aminokwasów VH i VL D2E7 lub spokrewnionymi z D2E7, aby zidentyfikować reszty aminokwasowe w sekwencji D2E7 lub spokrewnionej z D2E7, które różnią się od linii zarodkowej. Następnie, odpowiednie nukleotydy sekwencji DNA linii zarodkowej poddaje się takiej mutacji, aby zmutowana sekwencja linii zarodkowej kodowała sekwencję aminokwasów D2E7 lub spokrewnioną z D2E7, stosując kod genetyczny w celu określenia, jakich zmian nukleotydowych należy dokonać. Mutagenezę sekwencji linii zarodkowej prowadzi się standardowymi metodami, takimi jak mutageneza z zastosowaniem PCR (w której zmutowane nukleotydy wprowadza się do starterów PCR tak, aby produkt PCR zawierał mutacje) lub mutageneza ukierunkowana.

Po otrzymaniu fragmentów DNA kodujących segmenty VH i VL D2E7 lub spokrewnione z D2E7 (przez amplifikację i mutagenezę genów VH i VL linii zarodkowej, jak opisano powyżej), można następnie manipulować tymi fragmentami DNA z zastosowaniem standardowych technik rekombinacji DNA, np. w celu przekształcenia genów regionu zmiennego w geny pełnej długości łańcucha przeciwciała, w geny fragmentu Fab lub w gen scFv. W tych manipulacjach VL- lub VH-kodujący fragment DNA jest czynnościowo związany z innym fragmentem DNA kodującym inne białko, takie jak region stały przeciwciała lub elastyczna grupa łącząca. Stosowane tu określenie „funkcjonalnie połączony” ma w tym kontekście w zamierzeniu oznaczać, że te dwa fragmenty DNA są tak połączone, aby sekwencje aminokwasów zakodowane przez te dwa fragmenty DNA pozostawały w ramce odczytu.

Izolowany DNA kodujący region VH można przekształcić w pełnej długości gen łańcucha ciężkiego przez funkcjonalne połączenie DNA kodującego VH z inną cząsteczką DNA kodującą regiony stałe łańcucha ciężkiego (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje ludzkich genów regionu stałego łańcucha ciężkiego są znane w dziedzinie (patrz np. Kabat, E.A., i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Service, publikacja NIH nr 91-3242) i fragmenty DNA obejmujące te regiony można otrzymać standardową amplifikacją PCR. Region stały łańcucha ciężkiego może obejmować region stały IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD, lecz najkorzystniej oznacza region stały IgG1 lub IgG4. Dla genu łańcucha ciężkiego fragmentu Fab, DNA kodujący VH może być funkcjonalnie połączony z inną cząsteczką DNA kodującą tylko region stały CH1 łańcucha ciężkiego.

Izolowany DNA kodujący region VL można przekształcić w pełnej długości gen łańcucha lekkiego (jak również gen łańcucha lekkiego Fab) przez funkcjonalne połączenie DNA kodującego VL z inną cząsteczką DNA kodującą region stały łańcucha lekkiego CL. Sekwencje regionu stałego łańcucha lekkiego ludzkich genów są znane w dziedzinie (patrz np. Kabat, E.A., i in. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie piąte, U.S. Department of Health and Human Service, publikacja NIH nr 91-3242) i fragmenty DNA obejmujące te regiony można otrzymać standardową amplifikacją PCR. Region stały łańcucha lekkiego może obejmować region stały kappa lub lambda, lecz najkorzystniej stanowi region stały kappa.

W celu stworzenia genu scFv, fragmenty DNA kodujące VH i VL funkcjonalnie łączy się z innym fragmentem kodującym elastyczną grupę łączącą, np. kodującym sekwencję aminokwasów (Gly4-Ser)3, tak aby sekwencje VH i VL mogły ulec ekspresji jako przylegające białko jednołańcuchowe, z regionami VL i VH połączonymi elastyczną grupą łączącą (patrz np. Bird i in. (1988) Science 242:423-426; Huston i in. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty i in., Nature (1990) 348:552-554).

W celu uzyskania ekspresji przeciwciał lub części przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem, DNA kodujące częściowe lub pełnej długości łańcuchy lekkie i ciężkie, otrzymane jak opisano powyżej, wprowadza się do wektorów ekspresyjnych tak, aby geny były funkcjonalnie połączone z sekwencjami kontrolującymi transkrypcję i translację. W tym kontekście, określenie „funkcjonalnie połączony ma w zamierzeniu oznaczać, że gen przeciwciała liguje się z wektorem tak, aby sekwencje

PL 217 666 B1 kontrolujące transkrypcję i translację w obrębie wektora spełniały swoją funkcję regulowania transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolujące ekspresję wybiera się tak, aby były zgodne ze stosowaną komórką gospodarzem, w której zachodzi ekspresja. Gen łańcucha lekkiego przeciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała można wprowadzić do oddzielnego wektora lub, bardziej typowo, oba geny wprowadza się do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciała wprowadza się do wektora ekspresyjnego standardowymi metodami (np. Iigacji komplementarnych miejsc restrykcyjnych na fragmencie genu przeciwciała i wektorze, lub ligacji tępych końców, jeśli nie występują miejsca restrykcyjne). Przed wprowadzeniem sekwencji łańcucha lekkiego lub ciężkiego D2E7 lub spokrewnionych z D2E7, wektor ekspresyjny może już zawierać sekwencje regionu stałego przeciwciała. Przykładowo jeden ze sposobów przekształcania sekwencji VH i VL D2E7 lub spokrewnionych z D2E7 w pełnej długości geny przeciwciała polega na wprowadzeniu ich do wektorów ekspresyjnych już kodujących odpowiednio regiony stałe łańcucha ciężkiego i regiony stałe łańcucha lekkiego, tak aby segment VH został funkcjonalnie połączony z segmentem(-ami) CH w obrębie wektora i segment VL został funkcjonalnie połączony z segmentem CL w obrębie wektora. Ponadto lub alternatywnie, rekombinowany wektor ekspresyjny może kodować peptyd sygnałowy, który ułatwia wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha przeciwciała można wklonować do wektora tak, aby peptyd sygnałowy został połączony w ramce odczytu do końca aminowego genu łańcucha przeciwciała. Peptyd sygnałowy może obejmować peptyd sygnałowy immunoglobuliny lub heterologiczny peptyd sygnałowy (tj. peptyd sygnałowy z białka nie będącego immunoglobuliną).

Oprócz genów łańcucha przeciwciała, opisane tu rekombinowane wektory ekspresyjne przenoszą sekwencje regulatorowe, które kontrolują ekspresję genów łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Stosowane tu określenie „sekwencja regulatorowa ma w zamierzeniu obejmować promotory, wzmacniacze i inne elementy kontrolujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji), które kontrolują transkrypcję lub translację genów łańcucha przeciwciała. Takie sekwencje regulatorowe opisał np. Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in EnzymoIogy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Dla fachowców w dziedzinie powinno być oczywiste, że projekt wektora ekspresyjnego, obejmujący wybór sekwencji regulatorowych może zależeć od takich czynników jak wybór komórki gospodarza, która ma być transformowana, pożądany poziom ekspresji białka itp. Korzystne sekwencje regulatorowe dla ekspresji komórki gospodarza pochodzącej od ssaka obejmują elementy wirusowe, które kierują wysokimi poziomami ekspresji białka w komórkach ssaka, takie jak promotory i/lub wzmacniacze pochodzące od cytomegalowirusa (CMV) (takie jak promotor/wzmacniacz CMV), wirusa Simian 40 (SV40) (takie jak promotor/wzmacniacz SV40), adenowirusa, (np. główny późny promotor adenowirusowy (Ad-MLP)) i wirusa poliomy. Szczegółowy opis wirusowych elementów regulatorowych i ich sekwencji zamieszczono np. w opisach patentowych US nr 5168062, Stinski, nr 4510245, Bell i in. i nr 4968615, Schaffner i in.

Oprócz genów łańcucha przeciwciała i sekwencji regulatorowych, opisane tu rekombinowane wektory ekspresyjne mogą przenosić dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora w komórkach gospodarzach (np. miejsca początku replikacji) i selekcyjne geny markerowe. Selekcyjny gen markerowy ułatwia selekcję komórek gospodarzy, do których wprowadzono wektor (patrz np. opisy patentowe US nr 4399216, 4634665 i 5179017, wszystkie Axel i in.). Przykładowo typowo selekcyjny gen marker nadaje komórce gospodarzowi, do której wprowadzono wektor, oporność na leki, takie jak G418, hygromycyna lub metotreksat. Korzystne selekcyjne geny markerowe obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do zastosowania w komórkach gospodarzach dhfr^- z selekcją/amplifikacją z użyciem metotreksatu) i gen neo (dla selekcji z użyciem G418).

Do ekspresji łańcuchów lekkich i ciężkich, wektorem(-ami) ekspresyjnym(-i) kodującym(-i) łańcuchy ciężkie i lekkie transfekuje się komórkę gospodarza standardowymi technikami. Różne formy określenia „transfekcja” mają w zamierzeniu obejmować rozmaite techniki powszechnie stosowane do wprowadzania egzogennego DNA do prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza, np. elektroporację, wytrącanie fosforanem wapnia, transfekcję DEAE-dekstranem itp. Chociaż jest teoretycznie możliwe uzyskanie ekspresji przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem w prokariotycznych lub eukariotycznych komórkach gospodarzach, najkorzystniejsza jest ekspresja przeciwciał w komórkach eukariotycznych, a najkorzystniej komórkach gospodarzach pochodzących od ssaka, ponieważ istnieje większe prawdopodobieństwo, że takie komórki eukariotyczne, a w szczególności komórki ssaka, a nie komórki prokariotyczne, złożą i wydzielą właściwie zwinięte i immunologicznie czynne przeciwciało. Opisano, że prokariotyczna ekspresja genów przeciwciał nie prowadzi do sku16

PL 217 666 B1 tecznego wytwarzania dużych ilości aktywnego przeciwciała (Boss, M. A. i Drewno, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Korzystne komórki gospodarze pochodzące od ssaka do ekspresji rekombinowanych przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem obejmują komórki jajnika chomika chińskiego (komórki CHO) (obejmujące komórki CHO dhfr^-, opisane przez Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, stosowane markerem selekcyjnym DHFR, np. opisanym przez R. J. Kaufman i P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), komórki szpiczaka NSO, komórki COS i komórki SP2. Gdy rekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny przeciwciał wprowadza się do komórek gospodarzy pochodzących od ssaka, przeciwciała wytwarza się, hodując komórki gospodarzy przez okres czasu wystarczający do ekspresji przeciwciał w komórkach gospodarzach lub korzystniej wydzielania przeciwciał do pożywki hodowlanej, w której hoduje się komórki gospodarzy. Przeciwciała można odzyskać z pożywki hodowlanej stosując standardowe metody oczyszczania białka.

Komórki gospodarzy można także stosować w celu wytworzenia części nienaruszonych przeciwciał, takich jak fragmenty Fab lub cząsteczki scFv. Zrozumiałe będzie, że możliwe są zmiany powyższej procedury. Przykładowo może być pożądane transfekowanie komórki gospodarza DNA kodującym albo łańcuch lekki albo łańcuch ciężki (lecz nie obydwa) przeciwciała stosowanego zgodnie z wynalazkiem. Można także stosować technikę rekombinacji DNA w celu usunięcia części lub całego DNA kodującego łańcuchy lekkie i/lub ciężkie, które nie jest konieczne dla wiązania hTNFa. Przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem obejmują także cząsteczki ulegające ekspresji z takich obciętych cząsteczek DNA. Ponadto, można wytwarzać przeciwciała bifunkcyjne, w których jeden łańcuch ciężki i jeden lekki stanowią przeciwciało stosowane zgodnie z wynalazkiem i drugi łańcuch ciężki i lekki są specyficzne dla antygenu innego niż hTNFa, przez sieciowanie przeciwciała stosowanego zgodnie z wynalazkiem z drugim przeciwciałem standardowymi metodami sieciowania chemicznego.

W korzystnym układzie rekombinacyjnej ekspresji przeciwciała lub jego części wiążącej antygen stosowanych zgodnie z wynalazkiem, rekombinowany wektor ekspresyjny kodujący zarówno łańcuch ciężki przeciwciała jak i łańcuch lekki przeciwciała wprowadza się do komórek dhfr-CHO metodą transfekcji, w której pośredniczy fosforan wapnia. W obrębie rekombinowanego wektora ekspresyjnego, wszystkie geny łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała są funkcjonalnie połączone z elementami regulatorowymi: wzmacniaczem CMV/promotorem AdMLP aby prowadzić do uzyskania wysokich poziomów transkrypcji genów. Rekombinowany wektor ekspresyjny przenosi także gen DHFR, który umożliwia selekcję komórek CHO, które zostały stransfekowane wektorem, z zastosowaniem selekcji/amplifikacji z użyciem metotreksatu. Wyselekcjonowane stransformowane komórki gospodarze hoduje się aby umożliwić ekspresję łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała i nienaruszone przeciwciało odzyskuje się z pożywki hodowlanej. W celu przygotowania rekombinowanego wektora ekspresyjnego, transfekowania komórek gospodarzy, selekcji transformantów, hodowli komórek gospodarzy i odzyskania przeciwciała z pożywki hodowlanej stosuje się standardowe techniki biologii molekularnej.

III. Wybór rekombinowanych ludzkich przeciwciał

Rekombinowane ludzkie przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem oprócz D2E7 lub jego części wiążącej antygen, lub przeciwciała spokrewnione z D2E7 ujawnione w tym opisie można wyodrębnić przez przeszukiwanie rekombinowanej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał, korzystnie biblioteki prezentacji fagowej scFv, wytworzonej z zastosowaniem ludzkiego cDNA dla VL i VH otrzymanego z mRNA pochodzącego z limfocytów ludzkich. Metodologie wytwarzania i przeszukiwania takich bibliotek są znane w dziedzinie. Oprócz dostępnych w handlu zestawów do wytwarzania bibliotek prezentacji fagowej (np. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, numer katalogowy 27-9400-01; i zestaw do prezentacji fagowej Stratagene Surf/ZAP™, nr katalogowy 240612), przykłady metod i reagentów szczególnie odpowiednie do stosowania w wytwarzaniu i przeszukiwaniu prezentacji bibliotek przeciwciał można znaleźć np. w opisie patentowym US nr 5223409, Ladner i in.; publikacji PCT nr WO 92/18619, Kang i in.; publikacji PCT nr WO 91/17271, Dower i in.; publikacji PCT nr WO 92/20791, Winter i in.; publikacji PCT nr WO 92/15679, Markland i in; publikacji PCT nr WO 93/01288, Breitling i in.; publikacji PCT nr WO 92/01047, McCafferty i in.; publikacji PCT nr WO 92/09690, Garrard i in.; Fuchs i in. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay i in. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse i in. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty i in., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths i in. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins i in. (1992) J. Mol. Biol. 226:889896; Clackson i in. (1991) Nature 352:624-628; Gram i in. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard i in. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom i in. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; oraz Barbas i in. (1991) PNAS 88:7978-7982.

PL 217 666 B1

W korzystnym rozwiązaniu, aby wyizolować ludzkie przeciwciała o wysokim powinowactwie i małej stałej szybkości dysocjacji dla hTNFa, najpierw stosuje się mysie przeciwciało anty-hTNFa o wysokim powinowactwie i małej stałej szybkości odłączania dla hTNFa (np. MAK 195, dla którego hybrydoma ma numer depozytu ECACC 87 050801), aby wyselekcjonować sekwencje ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego o podobnej aktywności wiązania wobec hTNFa, stosując metody imprintingu epitopowego opisane w publikacji PCT nr WO 93/06213, Hoogenboom i in.. Biblioteki przeciwciał stosowane w tej metodzie obejmują korzystnie biblioteki scFv wytworzone i przeszukiwane w sposób opisany w publikacji PCT nr WO 92/01047, McCafferty i in.; McCafferty i in., Nature (1990) 348:552554; i Griffiths i in., (1993) EMBO J 12:725-734. Biblioteki przeciwciał scFv korzystnie przeszukuje się stosując jako antygen rekombinowany ludzki TNFa.

Po wyselekcjonowaniu początkowych ludzkich segmentów VL i VH, przeprowadza się doświadczenia „mix and match”, w których różne pary początkowo wyselekcjonowanych segmentów VL i VH przeszukuje się pod względem wiązania hTNFa, aby wyselekcjonować korzystne połączenia par VL/VH. Ponadto, aby jeszcze bardziej zwiększyć powinowactwo i/lub zmniejszyć stałą szybkości dysocjacji dla wiązania hTNFa, segmenty VL i VH korzystnych(-ej) par(-y) VL/VH można losowo zmutować, korzystnie w obrębie regionu CDR3 VH i/lub VL, w procesie analogicznym do procesu mutacji somatycznej in vivo odpowiedzialnej za dojrzewanie powinowactwa przeciwciał podczas naturalnej odpowiedzi immunologicznej. To dojrzewanie powinowactwa in vitro można osiągnąć przez zamplifikowanie regionów VH i VL z zastosowaniem starterów PCR komplementarnych odpowiednio do CDR3 VH lub CDR3 VL, które to startery zostały „najeżone” przypadkową mieszaniną czterech zasad nukleotydowych w niektórych pozycjach tak, aby uzyskane produkty PCR kodowały segmenty VH i VL, do których wprowadzono przypadkowe mutacje do regionu VH i/lub VL CDR3. Te losowo zmutowane segmenty VH i VL można ponownie przeszukiwać pod względem wiązania z hTNFa i można wyselekcjonować sekwencje, które wykazują wysokie powinowactwo i małą szybkość dysocjacji dla wiązania hTNFa.

Po przeszukaniu i wyodrębnieniu przeciwciała anty-hTNFa stosowanego zgodnie z wynalazkiem z rekombinowanej biblioteki prezentacji immunoglobulin, kwas nukleinowy kodujący wyselekcjonowane przeciwciało można odzyskać z upakowania prezentacyjnego (np. z genomu faga) i subklonować do innych wektorów ekspresyjnych standardowymi technikami rekombinacji DNA. Jeśli to pożądane, kwas nukleinowy można poddawać dalszym manipulacjom w celu stworzenia innych postaci przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem (np. związanych z kwasem nukleinowym kodującym dodatkowe domeny immunoglobulin, takie jak dodatkowe regiony stałe). W celu uzyskania ekspresji rekombinowanego ludzkiego przeciwciała wyodrębnionego przez przeszukiwanie kombinatorycznej biblioteki, DNA kodujący przeciwciało klonuje się do rekombinowanego wektora ekspresyjnego i wprowadza do komórek gospodarzy pochodzących od ssaka, jak opisano bardziej szczegółowo w Sekcji II powyżej.

IV. Kompozycje farmaceutyczne i ich podawanie

Przeciwciała i części przeciwciał stosowane zgodnie z wynalazkiem można wprowadzać do kompozycji farmaceutycznych odpowiednich do podawania pacjentowi w sposobach ujawnionych w tym opisie, np. do podawania podskórnego co dwa tygodnie. Typowo, kompozycja farmaceutyczna zawiera przeciwciało (lub część przeciwciała) stosowane zgodnie z wynalazkiem i/lub metotreksat oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Stosowane tu określenie „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” obejmuje dowolne i wszystkie rozpuszczalniki, ośrodki dyspersyjne, otoczki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające wchłanianie itp., które są zgodne fizjologicznie i odpowiednie do podawania pacjentowi w sposobach ujawnionych w tym opisie. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych nośników obejmują jeden lub większa liczbę składników wybranych z grupy obejmującej wodę, sól fizjologiczną, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, dekstrozę, glicerol, etanol itp., jak również ich połączenia. W wielu przypadkach kompozycja korzystniej zawiera środki izotoniczne, np. cukry, polialkohole takie jak mannitol, sorbitol lub chlorek sodu. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą ponadto zawierać niewielkie ilości substancji pomocniczych takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki konserwujące lub bufory, które przedłużają dopuszczalny okres przechowywania lub zwiększają skuteczność przeciwciała lub części przeciwciała.

Opisane tu kompozycje mogą występować w rozmaitych postaciach. Obejmują one np. ciekłe, półstałe i stałe postacie dawkowania, takie jak ciekłe roztwory (np. roztwory do wstrzykiwania i do wlewów), dyspersje lub zawiesiny, tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna postać zależy od zamierzonego sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego. Typowe korzystne kompozy18

PL 217 666 B1 cje występują w postaci roztworów do wstrzykiwania lub do wlewów, takich jak kompozycje podobne do stosowanych w biernym uodparnianiu ludzi innymi przeciwciałami. Korzystny jest pozajelitowy sposób podawania (np. dożylnie, podskórnie, dootrzewnowo, domięśniowo). W korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało podaje się w dożylnym wlewie lub zastrzyku. W innym korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało podaje się w zastrzyku domięśniowym. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało podaje się w zastrzyku podskórnym (np. w zastrzyku podskórnym co dwa tygodnie).

Kompozycje terapeutyczne typowo muszą być sterylne i trwałe w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycję można formułować w postaci roztworu, mikroemulsji, dyspersji, liposomów lub innych uporządkowanych struktur odpowiednich do dużych stężeń substancji czynnej. Sterylne roztwory do wstrzykiwania można wytworzyć wprowadzając związek czynny (tj. przeciwciało lub część przeciwciała) w wymaganej ilości do odpowiedniego rozpuszczalnika z jednym lub z połączeniem składników wymienionych powyżej, jak jest to wymagane, a następnie poddając jałowieniu przez filtrację. Na ogół, dyspersje wytwarza się wprowadzając związek czynny do sterylnego rozczynnika, który zawiera podstawowy ośrodek dyspersyjny i inne wymagane składniki spośród wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do otrzymywania sterylnych roztworów do wstrzykiwania, korzystnymi metodami przygotowywania są suszenie próżniowe i liofilizacja, w wyniku których otrzymuje się proszek składnika czynnego z dowolnym dodatkowym pożądanym składnikiem z uprzednio wyjałowionego przez filtrację roztworu. Właściwą płynność roztworu można utrzymać np. przez zastosowanie otoczki, np. z lecytyny, przez utrzymanie wymaganego wymiaru cząstek w przypadku dyspersji i przez zastosowanie surfaktantów. Przedłużone wchłanianie kompozycji do wstrzykiwania można uzyskać przez włączanie do kompozycji środka, który opóźnia absorpcję, np. soli monostearynianowych i żelatyny.

Przeciwciała i części przeciwciał stosowane zgodnie z wynalazkiem można podawać rozmaitymi metodami znanymi w tej dziedzinie, chociaż dla wielu zastosowań terapeutycznych korzystną drogą/sposobem podawania jest zastrzyk podskórny. Jak wiadomo fachowcom w tej dziedzinie droga i/lub sposób podawania będą się zmieniać zależnie od pożądanych wyników. W pewnych rozwiązaniach, związek czynny można połączyć z nośnikiem, który będzie chronił związek przed gwałtownym uwalnianiem, tak jak w preparacie o kontrolowanym uwalnianiu, w tym implantach, układach transdermalnych i układach dostarczania w mikrokapsułkach. Można także stosować biodegradowalne, zgodne biologicznie polimery, takie jak octan etylenowinylu, glikol polietylenowy (PEG), polibezwodniki, poli(kwas glikolowy), kolagen, poliortoestry i poli(kwas mlekowy). Wiele metod otrzymywania takich preparatów zostało opatentowanych lub jest znanych fachowcom w tej dziedzinie. Patrz, np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, wyd. Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, 1978.

W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem można podawać doustnie, np. z obojętnym rozcieńczalnikiem lub przyswajalnym jadalnym nośnikiem. Związek (i inne składniki, jeśli to pożądane) może także być zamknięty w kapsułce żelatynowej o twardej lub miękkiej powłoce, sprasowany w tabletki lub wprowadzony bezpośrednio do diety pacjenta. W celu doustnego podawania terapeutycznego, związki można wprowadzać z rozczynnikami i stosować w postaci tabletek do połykania, tabletek podpoliczkowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków itp. Do podawania związku stosowanego zgodnie z wynalazkiem inaczej niż pozajelitowo, może być konieczne powleczenie związku lub stosowanie związku łącznie z materiałem zapobiegającym jego inaktywacji.

Do kompozycji można także wprowadzać dodatkowe związki czynne. W pewnych rozwiązaniach, przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem formułuje się wspólnie z i/lub podaje się wspólnie z jednym lub większą liczbą dodatkowych środków terapeutycznych. Przykładowo przeciwciało anty-hTNFa lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem można formułować wspólnie z i/lub podawać wspólnie z metotreksatem, jednym lub większą liczbą dodatkowych przeciwciał, które wiążą inne cząsteczki docelowe (np. przeciwciałami, które wiążą inne cytokiny lub które wiążą cząsteczki powierzchniowe komórek), jedną lub większą liczbą cytokin, rozpuszczalnym receptorem TNFa (patrz np. publikacja PCT nr WO 94/06476) i/lub jednym lub większą liczbą środków chemicznych, które hamują wytwarzanie lub aktywność hTNFa (takich jak pochodne cykloheksanoylidenu ujawnione w publikacji PCT nr 93/19751). Ponadto, jedno lub większą liczbę przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem można stosować w połączeniu z dwoma lub większą liczbą powyższych środków terapeutycznych. W takich terapiach skojarzonych można korzystnie stosować niższe dawki podawanych środków terapeutycznych, unikając w ten sposób możliwych efektów tokPL 217 666 B1 sycznych lub powikłań związanych z różnymi monoterapiami. Zastosowanie przeciwciał lub części przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem w połączeniu z innymi środkami terapeutycznymi omówiono dodatkowo w Sekcji IV.

Przykłady środków terapeutycznych stosowanych w reumatoidalnym zapaleniu stawów, z którymi można połączyć przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem, obejmują takie jak: niesteroidowy(-e) lek(-i) przeciwzapalny(-e) (NLPZ); przeciwzapalny(-e) lek(-i) hamujący (-e) cytokiny (CSAID); CDP-571/BAY-10-3356 (humanizowane przeciwciało anty-TNFa; Celltech/Bayer); cA2 (chimeryczne przeciwciało anty-TNFa; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (75 kD białko fuzyjne receptora IgG TNF; Immunex; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1994) tom 37, S295; J. Invest. Med. (1996) tom 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptora TNF-IgG, o masie 55 kD; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (przeciwciało anty-CD z małą wstawką białka naczelnych, nie powodujące spadku liczby komórek T; IDEC/SmithKline; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1995) tom 38, S185); DAB 486-IL-2 i/lub DAB 389-IL-2 (białka fuzyjne IL-2; Seragen; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1993) tom 36, 1223); Anty-Tac (humanizowane anty-IL-2Ra; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (cytokina przeciwzapalna; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; rekombinowana IL-10, cytokina przeciwzapalna; DNAX/Schering); IL-4; agoniści IL-10 i/lub IL-4 (np. przeciwciała agonistyczne); IL-IRA (antagonista receptora IL-1; Synergen/Amgen); TNF-bp/s-TNFR (rozpuszczalne białko wiążące TNF; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S284; Amer. J. Physiol; Heart and Circulatory Physiology (1995) tom 268, str. 37-42); R973401 (inhibitor fosfodiesterazy typu IV; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S282); MK966 (inhibitor COX-2; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S81); Iloprost (patrz np. Arthritis& Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S82); metotreksat; talidomid (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S282) i leki spokrewnione z talidomidem (np. Celgen); leflunomid (lek przeciwzapalny i inhibitor cytokiny; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S131; Inflammation Research (1996) tom 45, str. 103-107); kwas traneksamowy (inhibitor aktywacji plazminogenu; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S284); T-614 (inhibitor cytokiny; patrz np. Arthritis Sc Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S282); prostaglandyna E1 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39,nr 9 (suplement), S282); Tenidap (niesteroidowy lek przeciwzapalny; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S280); naproksen (niesteroidowy lek przeciwzapalny; patrz np. Neuro Report (1996) tom 7, str. 1209-1213); meloksykam (niesteroidowy lek przeciwzapalny); ibuprofen (niesteroidowy lek przeciwzapalny); piroksykam (niesteroidowy lek przeciwzapalny); diklofenak (niesteroidowy lek przeciwzapalny); indometacyna (niesteroidowy lek przeciwzapalny); sulfasalazyna (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S281); azatiopryna (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S281); inhibitor ICE (inhibitor enzymu konwertującego enzym interleukinę 1β); inhibitor zap-70 i/lub lek (inhibitor kinazy tyrozynowej zap-70 lub lek); inhibitor VEGF i/lub inhibitor VEGF-R (inhibitory czynnika wzrostu komórek nabłonka naczyń lub receptora czynnika wzrostu komórek nabłonka naczyń; inhibitory angiogenezy); kortykosterydowe leki przeciwzapalne (np. SB203580); inhibitory konwertazy TNF; przeciwciała anty-IL-12; interleukina-11 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S296); interleukina-13 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S308); inhibitory interleukiny-17 (patrz np. Arthritis & Rheumatism (1996) tom 39, nr 9 (suplement), S120); złoto; penicylamina; chlorochina; hydroksychlorochina; chlorambucyl; cyklofosfamid; cyklosporyna; radioterapia całkowita układu chłonnego; globulina antytymocytarna; przeciwciała anty-CD4; toksyny CD5; doustnie podawane peptydy i kolagen; sól disodowa lobenzaritu; środki regulujące cytokinę (CRA) HP228 i HP4 66 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); antysensowne dla ICAM-1 fosforotioniany oligodeoksynukleotydów (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); rozpuszczalny receptor 1 dopełniacza (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednizon; orgoteina; polisiarczan glikozaminoglikanu; minocyklina; przeciwciała anty-IL2R; lipidy ze zwierząt morskich i roślin (kwasy tłuszczowe z ryb i nasion roślin; patrz np. DeLuca i in. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); auranofina; fenylbutazon; kwas meklofenamowy; kwas flufenamowy; dożylna globulina odpornościowa; zileuton; kwas mykofenolowy (RS-61443); takrolimus (FK-506); syrolimus (rapamycyna); amipriloza (terafektyna); kladrybina (2-chlorodeoksyadenozyna); i azarybina.

Przykłady środków terapeutycznych stosowanych w chorobie zapalnej jelit, z którymi można połączyć przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem, obejmują takie jak: budezonid; czynnik wzrostu naskórka; kortykosteroidy; cyklosporyna, sulfasalazyna; aminosalicylany;

PL 217 666 B1

6-merkaptopuryna; azatiopryna; metronidazol; inhibitory lipooksygenazy; mesalazyna; olsalazyna; balsalazide; przeciwutleniacze; inhibitory tromboksanu; antagoniści receptora IL-1; przeciwciała monoklonalne anty-IL-13; przeciwciała monoklonalne anty-IL-6; czynniki wzrostu; inhibitory elastazy; związki pirydynyloimidazolowe; CDP-571/BAY-10-3356 (humanizowane przeciwciało anty-TNFa; Celltech/Bayer); cA2 (chimeryczne przeciwciało anty-TNFa; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptor TNF-IgG, o masie 75 kD; Immunex; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1994) tom 37, S295; J. Invest. Med. (1996) tom 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptor TNF-IgG, o masie 55 kD; Hoffmann-LaRoche); interleukina-10 (SCH 52000; Schering Plough); IL-4; agoniści IL-10 i/lub IL-4 (np. przeciwciała agonistyczne); interleukina-11; sprzężone z glukuronidem lub dekstranem proleki prednizolonu, deksametazonu lub budezonidu; antysensowne dla ICAM-1 tiofosforany oligodeoksynukleotydów (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); rozpuszczalny receptor 1 dopełniacza (ΤΡ10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazyna o powolnym uwalnianiu; metotreksat; antagoniści czynnika aktywującego płytki krwi (PAF); cyprofloksacyna; i lignokaina.

Przykłady środków terapeutycznych stosowanych w stwardnieniu rozsianym, z którymi można połączyć przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem, obejmują takie jak: kortykosteroidy; prednizolon; metyloprednizolon; azatiopryna; cyklofosfamid; cyklosporyna; metotreksat; 4-aminopirydyna; tyzanidyna; interferon-31a (Avonex™; Biogen); interferonów (Betaseron™; Chiron/Berlex); Kopolimer 1 (Cop-1; Copaxone™; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); tlen hyperbaryczny; immunoglobulina dożylna; kladrybina; CDP-571/BAY-10-3356 (humanizowane przeciwciało anty-TNFa; Celltech/Bayer); cA2 (chimeryczne przeciwciało anty-TNFa; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptor TNF-IgG, o masie 75 kD; Immunex; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1994) tom 37, S295; J. Invest. Med. (1996) tom 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptor TNF-IgG, o masie 55 kD; Hoffmann-LaRoche); IL-10; IL-4; i agoniści IL-10 i/lub IL-4 (np. przeciwciała agonistyczne).

Przykłady środków terapeutycznych stosowanych w posocznicy, z którymi można połączyć przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem, obejmują takie jak: hipertoniczne roztwory soli; antybiotyki; dożylna gamma globulina; ciągła hemofiltracja; karbapenemy (np. meropenem); antagoniści takich cytokin jak TNFa, IL-1 β, IL-6 i/lub IL-8; CDP-571/BAY-10-3356 (humanizowane przeciwciało anty-TNFa; Celltech/Bayer); cA2 (chimeryczne przeciwciało anty-TNFa; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptor TNF-IgG, o masie 75 kD; Immunex; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1994) tom 37, S295; J. Invest. Med. (1996) tom 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptor TNF-IgG, o masie 55 kD; Hoffmann-LaRoche); śodki regulujące cytokinę (CRA) HP228 i HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); SK&F 107647 (peptyd małocząsteczkowy; SmithKline Beecham); czterowartościowy guanylohydrazon CNI-1493 (Picower Institute); inhibitor szlaku czynnika tkankowego (TFPI; Chiron); PHP (chemicznie zmodyfikowana hemoglobina; APEX Bioscience); związki chelatujące i chelaty żelaza, obejmujące kompleks kwas dietylenotriaminopentaoctowy - żelazo (III) (DTPA - żelazo (III); Molichem Medicines); lizofilina (syntetyczna małocząsteczkowa metyloksantyna; Cel Therapeutics, Inc.); PGG-Glikan (wodny rozpuszczalny p1,3-glikan; AlfaBeta Technology); apolipoproteina A-1 roztworzona w lipidach; chiralne kwasy hydroksamowe (syntetyczne środki przeciwbakteryjne, które hamują biosyntezę lipidu A); przeciwciała anty-endotoksynowe; E5531 (syntetyczny antagonista lipidu A; Eisai America, Inc.); rBPl21 (rekombinowany N-końcowy fragment ludzkiego białka bakteriobójczego/zwiększającego przepuszczalność); i syntetyczne peptydy anty-endotoksynowe (SAEP; BiosYnth Research Laboratories).

Przykłady środków terapeutycznych stosowanych w zespole niewydolności oddechowej dorosłych (ARDS), z którymi można połączyć przeciwciało lub część przeciwciała według wynalazku, obejmują takie jak: przeciwciała anty-IL-8; terapia substytucyjna surfaktantu; CDP-571/BAY-10-3356 (humanizowane przeciwciało anty-TNFa; Celltech/Bayer); cA2 (chimeryczne przeciwciało anty-TNFa; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptor TNF-IgG, o masie 75 kD; Immunex; patrz np. Arthritis & Rheumatism (1994) tom 37, S295; J. Invest. Med. (1996) tom 44, 235A); i 55 kdTNFR-IgG (białko fuzyjne receptor TNF-IgG, o masie 55 kD; Hoffmann-LaRoche).

Opisane tu kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać „terapeutycznie skuteczną ilość” lub „profilaktycznie skuteczną ilość” przeciwciała lub części przeciwciała stosowanego zgodnie z wynalazkiem. Określenie „terapeutycznie skuteczna ilość” odnosi się do ilości skutecznej, w dawkach i przez wymagane okresy czasu, do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego. Terapeutycznie skuteczna ilość przeciwciała lub części przeciwciała może zmieniać się zależnie od czynników takich jak stan chorobowy, wiek, płeć i masa ciała osobnika oraz zdolność przeciwciała lub części przeciwciała

PL 217 666 B1 do wywoływania pożądanej odpowiedzi u tego osobnika. Terapeutycznie skuteczna ilość oznacza także taką, w której nad dowolnymi toksycznymi lub szkodliwymi działaniami przeciwciała lub części przeciwciała przeważają działania korzystne terapeutycznie. Określenie „profilaktycznie skuteczna ilość” odnosi się do ilości skutecznej, w dawkach i przez wymagane okresy czasu, do osiągania pożądanego efektu profilaktycznego. Typowo, ponieważ dawkę profilaktyczną stosuje się u pacjentów przed lub we wcześniejszym stadium choroby, profilaktycznie skuteczna ilość będzie mniejsza niż terapeutycznie skuteczna ilość.

Tryby dawkowania można tak dostosować, aby zapewnić optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną lub profilaktyczną). Przykładowo można podawać pojedynczy bolus, można podawać kilka podzielonych dawek w czasie lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszyć lub zwiększyć zgodnie ze wskazaniami terapeutycznymi. Szczególnie korzystne jest formułowanie kompozycji pozajelitowych w jednostkowe postacie dawkowania dla łatwości podawania i jednolitości dawkowania. Stosowana tu jednostkowa postać dawkowania obejmuje fizycznie oddzielne jednostki stosowane jako dawki jednostkowe dla leczonych ssaków jako pacjentów; przy czym każda jednostka zawiera wstępnie określoną ilość związku czynnego zapewniającą pożądany efekt terapeutyczny w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Rodzaj jednostkowych postaci dawkowania jest podyktowany przez i bezpośrednio zależny od (a) wyjątkowych właściwości związku czynnego i konkretnego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego, który ma być osiągnięty, i (b) ograniczeń właściwych dla komponowania takiego związku czynnego do leczenia związanych z wrażliwością pacjentów.

Przykładowy zakres terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości przeciwciała lub części przeciwciała stosowanego zgodnie z wynalazkiem wynosi 10-100 mg, korzystniej 20-80 mg i najkorzystniej około 40 mg. Należy zauważyć, że wartości dawkowania mogą się zmieniać zależnie od typu i stanu zaawansowania stanu chorobowego, który ma być złagodzony. Ponadto należy zrozumieć, że dla dowolnego poszczególnego pacjenta, specyficzne tryby podawania należy dostosowywać w czasie według indywidualnych potrzeb i profesjonalnego osądu osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji, oraz że zakresy dawkowania przedstawione w tym opisie są tylko przykładowe i nie mają w zamierzeniu ograniczać praktycznego stosowania opisanych tu kompozycji.

V. Zastosowania przeciwciał

Wiedząc o ich zdolności do wiązania hTNFa, przeciwciała anty-hTNFa lub ich części stosowanych zgodnie z wynalazkiem można stosować do wykrywania hTNFa (np. w próbce biologicznej, takiej jak surowica lub osocze), stosując typowy test immunologiczny, taki jak test immunoenzymatyczny (ELISA), test radioimmunologiczny (RIA) lub immunohistochemia tkankowa. Możliwy jest sposób wykrywania hTNFa w próbce biologicznej obejmujący kontaktowanie próbki biologicznej z przeciwciałem lub częścią przeciwciała stosowanymi zgodnie z wynalazkiem i wykrywanie albo przeciwciała (lub części przeciwciała) związanego z hTNFa albo niezwiązanego przeciwciała (lub części przeciwciała), aby tym samym wykryć hTNFa w próbce biologicznej. Przeciwciało jest bezpośrednio lub pośrednio znakowane wykrywalną substancją w celu ułatwienia wykrywania związanego lub niezwiązanego przeciwciała. Odpowiednie wykrywalne substancje obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne i substancje radioaktywne. Przykłady odpowiednich enzymów obejmują takie jak peroksydaza chrzanowa, fosfataza zasadowa, β-galaktozydaza lub acetylocholinesteraza; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują kompleksy streptawidyna/biotyna i awidyna/biotyna; przykłady, odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują takie jak umbeliferon, fluoresceina, izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina, dichlorotriazynyloaminofluoresceina, chlorek dansylu lub fikoerytryna; przykładem materiału luminescencyjnego jest Iuminol; a przykłady odpowiednich substancji radioaktywnych obejmują ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S lub ³H.

Alternatywnie do znakowania przeciwciała, hTNFa można oznaczać w płynach biologicznych metodą kompetycyjnego testu immunologicznego, w którym stosuje się wzorce rhTNFa znakowane wykrywalną substancją i nieznakowane przeciwciało anty-hTNFa. W tym teście, próbkę biologiczną, znakowane wzorce rhTNFa i przeciwciało anty-hTNFa łączy się i określa się ilość znakowanego wzorca rhTNFa związanego z nieznakowanym przeciwciałem. Ilość hTNFa w próbce biologicznej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości znakowanego wzorca hTNFa związanego z przeciwciałem anty-hTNFa.

Przeciwciało D2E7 stosowane zgodnie z wynalazkiem także można stosować do wykrywania TNFa od gatunków innych niż Iudzie, w szczególności TNFa od naczelnych (np. szympans, pawian, marmozeta, makak jawajski i rezus), świni i myszy, ponieważ D2E7 może wiązać każdy z tych TNFa.

Przeciwciała i części przeciwciał stosowane zgodnie z wynalazkiem są zdolne do neutralizacji aktywności hTNFa zarówno in vitro jak i in vivo (patrz opis patentowy US nr 6090382). Ponadto, przy22

PL 217 666 B1 najmniej niektóre przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem, takie jak D2E7, mogą neutralizować aktywność hTNFa od innych gatunków. Zgodnie z tym, przeciwciała i części przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem można stosować do hamowania aktywności hTNFa, np. w hodowli komórkowej zawierającej hTNFa, u osobników ludzkich lub u osobników innych ssaków mających TNFa, z którymi przeciwciało stosowane zgodnie z wynalazkiem reaguje krzyżowo (np. szympans, pawian, marmozeta, makak jawajski i rezus, świnia lub mysz). W jednym rozwiązaniu, możliwy jest sposób hamowania aktywności TNFa obejmujący kontaktowanie TNFa z przeciwciałem lub częścią przeciwciała stosowanymi zgodnie z wynalazkiem tak, aby hamowana była aktywność TNFa. Korzystnie, TNFa jest ludzkim TNFa. Przykładowo w hodowli komórkowej zawierającej lub prawdopodobnie zawierającej TNFa do pożywki hodowlanej można dodać przeciwciało lub część przeciwciała stosowanego zgodnie z wynalazkiem w celu hamowania aktywności hTNFa w hodowli.

W korzystnym rozwiązaniu, możliwe są sposoby leczenia zaburzeń, w których korzystne jest podawanie przeciwciała anty-TNFa, obejmujące podskórne podawanie pacjentowi co dwa tygodnie przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku tak, aby wyleczyć zaburzenie. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało podaje się podskórnie raz na dwa tygodnie. W innym szczególnie korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało podaje się podskórnie przed, podczas lub po podaniu metotreksatu. Zgodnie z wynalazkiem, osobnikiem jest człowiek. Alternatywnie, osobnikiem może być ssak, u którego ulega ekspresji TNFa, z którym przeciwciało stosowane zgodnie z wynalazkiem reaguje krzyżowo. Ponadto osobnikiem może być ssak, do którego organizmu wprowadzono hTNFa (np. przez podawanie hTNFa lub przez ekspresję transgenicznego genu hTNFa). Przeciwciało stosowane zgodnie z wynalazkiem można podawać człowiekowi dla celów terapeutycznych (omówionych dodatkowo poniżej). Ponadto, przeciwciało stosowane zgodnie z wynalazkiem można podawać ssakowi nie będącemu człowiekiem, u którego ulega ekspresji TNFa, z którym przeciwciało reaguje krzyżowo (np. ssak naczelny, świnia lub mysz) dla celów weterynaryjnych lub w ramach zwierzęcego modelu choroby ludzkiej. Biorąc pod uwagę ten drugi przypadek, takie modele zwierzęce mogą być przydatne do oceny terapeutycznej skuteczności przeciwciał stosowanych zgodnie z wynalazkiem (np. badanie dawek i przebiegów czasowych podawania).

Stosowane tu określenie „zaburzenie, w którym korzystne jest podawanie przeciwciała antyTNFa” ma w zamierzeniu obejmować choroby i inne zaburzenia, w których wykazano, że obecność TNFa u osobnika cierpiącego na zaburzenie jest lub jest podejrzewana jako odpowiedzialna za patofizjologię zaburzenia albo jest czynnikiem, który przyczynia się do zaostrzenia zaburzenia, lub gdzie wykazano, że inne przeciwciało anty-TNFa lub jego biologicznie czynna część jest z powodzeniem stosowana do leczenia choroby. Zgodnie z tym, zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa obejmuje zaburzenie, w którym oczekuje się, że hamowanie aktywności TNFa złagodzi objawy i/lub postęp zaburzenia. Takie zaburzenia można zidentyfikować np. przez zwiększenie stężenia TNFa w płynie biologicznym osobnika cierpiącego na zaburzenie (np. zwiększenie stężenia TNFa w surowicy, osoczu, płynie maziowym itp. osobnika), które można wykrywać stosując np. przeciwciało antyTNFa jak opisano powyżej. Istnieją liczne przykłady zaburzeń, w których aktywność TNFa jest szkodliwa. Zastosowanie przeciwciał i części przeciwciał według wynalazku w leczeniu specyficznych zaburzeń omówiono dodatkowo poniżej.

A. Posocznica

Czynnik martwicy nowotworu ma ustaloną rolę w patofizjologii posocznicy, z efektami biologicznymi, które obejmują niedociśnienie, supresję mięśnia sercowego, przecieki naczyniowe, martwicę narządów, stymulację uwalniania toksycznych drugorzędowych mediatorów i aktywację kaskady krzepnięcia (patrz np. Tracey, K.J. i Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russell, D i Thompson, R.C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721). Zgodnie z tym, ludzkie przeciwciała, i części przeciwciał, zgodnie z wynalazkiem można stosować do leczenia posocznicy w jej dowolnych okolicznościach klinicznych, obejmujących wstrząs septyczny, wstrząs endotoksynowy, posocznicę wywołaną przez bakterie Gram-ujemne i zespół wstrząsu toksycznego.

Ponadto, do leczenia posocznicy, przeciwciało anty-hTNFa lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem można podawać wspólnie z jednym lub większą liczbą dodatkowych środków terapeutycznych, które mogą dodatkowo złagodzić posocznicę, takich jak inhibitor interleukiny-1 (taki jak ujawniony w publikacjach PCT nr WO 92/16221 i WO 92/17583), cytokina interleukina-6 (patrz np. publikacje PCT nr WO 93/11793) lub antagonista czynnika aktywującego płytki krwi (patrz np. publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego EP 374510).

PL 217 666 B1

Ponadto, w korzystnym rozwiązaniu, przeciwciało anty-TNFa lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem podaje się człowiekowi należącemu do podgrupy pacjentów z posocznicą mających stężenie IL-6 w surowicy lub osoczu powyżej 500 pg/ml, a korzystniej 1000 pg/ml, w czasie leczenia (patrz publikacja PCT nr WO 95/20978, Daum, L., i in.).

B. Choroby autoimmunologiczne

Czynnik martwicy nowotworu jest zaangażowany w patofizjologię rozmaitych chorób autoimmunologicznych. Przykładowo TNFa jest zaangażowany w aktywowanie zapalenia tkanki i wywoływanie zniszczenia stawów w reumatoidalnym zapaleniu stawów (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej; Arend, W.P. i Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38:151-160; Fava, R.A., i in. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94:261-266). TNFa bierze także udział we wspomaganie śmierci komórek wysepek i pośredniczeniu w powstawaniu oporności na insulinę w cukrzycy (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej; publikacja PCT nr WO 94/08609). TNFa bierze także udział w pośredniczeniu w cytotoksyczności wobec oligodendrocytów i indukcji płytek zapalnych w stwardnieniu rozsianym (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Chimeryczne i humanizowane mysie przeciwciała anty-hTNFa poddano badaniom klinicznym pod względem leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów (patrz np. Elliott, M.J., i in. (1994) Lancet 344:11251127; Elliot, M.J., i in. (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin, E.C., i in. (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342).

Ludzkie przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można stosować do leczenia chorób autoimmunologicznych, w szczególności związanych z zapaleniem, obejmujących reumatoidalne zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie kręgosłupa, zapalenie kości i stawów i dnawe zapalenie stawów, alergię, stwardnienie rozsiane, cukrzycę autoimmunologiczną, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka i zespół nerczycowy. Typowo przeciwciało lub część przeciwciała podaje się ogólnoustrojowo, chociaż w pewnych zaburzeniach, miejscowe podawanie przeciwciała lub części przeciwciała do miejsca zapalenia może być korzystne (np. miejscowe podawanie do stawów w reumatoidalnym zapaleniu stawów lub miejscowe zastosowanie na wrzody w cukrzycy, pojedynczo lub w połączeniu z pochodną cykloheksanoylidenu, jak opisano w publikacji PCT nr WO 93/19751).

C. Choroby zakaźne

Czynnik martwicy nowotworu bierze udział w pośredniczeniu w efektach biologicznych obserwowanych w rozmaitych chorobach zakaźnych. Przykładowo TNFa bierze udział w pośredniczeniu w zapaleniu mózgu i zakrzepicy naczyń włosowatych i zawale w malarii (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). TNFa bierze także udział w pośredniczeniu w zapaleniu mózgu, indukowaniu przerwania bariery krew-mózg, wywoływaniu zespołu wstrząsu septycznego i aktywowaniu zawału żylnego w zapaleniu opon mózgowych (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). TNFa bierze także udział w indukowaniu kacheksji, stymulowaniu proliferacji wirusa i pośredniczeniu w uszkodzeniu układu ośrodkowego nerwowego w zespole nabytego niedoboru odporności (AIDS) (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Zgodnie z tym, przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można stosować w leczeniu chorób zakaźnych, obejmujących bakteryjne zapalenie opon mózgowych (patrz np. europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 585705), powikłania mózgowe w malarii, AIDS i kompleks związany z AIDS (ARC) (patrz np. publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP 230574), jak również infekcję cytomegalowirusem wtórną do transplantacji (patrz np. Fietze, E., i in. (1994) Transplantion 58:675-680). Przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można także stosować do złagodzenia objawów związanych z chorobami zakaźnymi, obejmującymi gorączkę i bóle mięśniowe spowodowane infekcją (taką jak grypa) i kacheksję wtórną do infekcji (np. wtórną do AIDS lub ARC).

D. Transplantacja

Czynnik martwicy nowotworu jest kluczowym mediatorem odrzucenia alloprzeszczepu i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD) i bierze udział w pośredniczeniu szkodliwej reakcji, którą obserwuje się gdy przeciwciało szczura OKT3, ukierunkowane przeciw kompleksowi receptora CD3 komórek T, stosuje się do hamowania odrzucenia przeszczepów nerek (patrz np., Tracey i Cerami, powyżej; Eason, J.D., i in. (1995) Transplantion 59:300-305; Suthanthiran, M. i Strom, T.B. (1994) New Engl. J. Med. 331:365-375). Zgodnie z tym, przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można stosować do hamowania odrzucenia przeszczepu, w tym odrzucenia przeszczepów alogenicznych i ksenogenicznych i do hamowania GVHD. Chociaż przeciwciało lub część przeciwciała można stosować pojedynczo, korzystniej stosuje się je w połączeniu z jednym lub większą liczbą innych środków, które hamują odpowiedź immunologiczną przeciw przeszczepowi alogenicznemu lub hamują GVHD. Przykładowo w jednym rozwiązaniu, przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem stosuje się w połączeniu z OKT3 do hamowania reakcji wywołanych przez

PL 217 666 B1

OKT3. W innym rozwiązaniu, przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem stosuje się w połączeniu z jednym lub większą liczbą przeciwciał ukierunkowanych na inne cząsteczki docelowe zaangażowane w regulowanie odpowiedzi immunologicznej, takie jak cząsteczki pomierzchniowe komórki CD25 (receptor-a interleukiny-2), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) i/lub CD86 (B7-2). W jeszcze innym rozwiązaniu, przeciwciało lub część przeciwciała stosowane zgodnie z wynalazkiem stosuje się w połączeniu z jednym lub większą liczbą ogólnych środków immunosupresyjnych, takich jak cyklosporyna A lub FK506.

E. Proces złośliwy

Czynnik martwicy nowotworu jest zaangażowany w indukowanie kacheksji, stymulowanie rozrostu guza, wzmaganie potencjału przerzutowego i pośredniczenie w cytotoksyczności w procesach złośliwych (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Zgodnie z tym, przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można stosować w leczeniu procesów złośliwych, do hamowania wzrostu nowotworu lub przerzutu i/lub do łagodzenia kacheksji wtórnej do procesu złośliwego. Przeciwciało lub część przeciwciała można podawać ogólnoustrojowo lub miejscowo w miejsce występowania guza.

F. Zaburzenia płucne

Czynnik martwicy nowotworu jest zaangażowany w patofizjologię zespołu zaburzeń oddechowych dorosłych, w tym stymulowanie aktywacji leukocytów śródbłonka, kierowanie cytotoksyczności na pneumocyty i indukowanie przecieków naczyniowych (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Zgodnie z tym, przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można stosować do leczenia różnych zaburzeń płuc, obejmujących zespół zaburzeń oddechowych dorosłych (patrz np. publikacja PCT nr WO 91/04054), płuco wstrząsowe, przewlekłą chorobę zapalną płuc, sarkoidozę płuc, zwłóknienie płuc i pylicę krzemową. Przeciwciało lub część przeciwciała można podawać ogólnoustrojowo lub miejscowo na powierzchnię płuc, np. jako aerozol.

G. Zaburzenia jelitowe

Czynnik martwicy nowotworu jest zaangażowany w patofizjologię zapalnych zaburzeń jelitowych (patrz np. Tracy, K.J., i in. (1986) Science 234: 470-474; Sun, X-M., i in. (1988) J. Clin. Invest. 81: 13281331; MacDonald, T.T., i in. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:301-305). Chimeryczne mysie przeciwciała anty-hTNFa poddano badaniom klinicznym pod względem leczenia choroby Crohna (van Dullemen, H. M., i in. (1995) Gastroenterology 109: 129-135). Ludzkie przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można także stosować do leczenia zaburzeń jelitowych, takich jak idiopatyczna choroba zapalna jelit, która obejmuje dwa zespoły, chorobę Crohna i zapalenie okrężnicy wrzodziejące.

H. Zaburzenia serca

Przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można także stosować do leczenia różnych zaburzeń serca, obejmujących niedokrwienie serca (patrz np. europejskie zgłoszenie patentowe nr EP 453898) i niewydolność serca (osłabienie mięśnia sercowego) (patrz np. publikacja PCT nr WO 94/20139).

I. Inne

Przeciwciała i części przeciwciał zgodnie z wynalazkiem można także stosować do leczenia różnych innych zaburzeń, w których aktywność TNFa jest szkodliwa. Przykłady innych chorób i zaburzeń, w których patofizjologię jest zaangażowana aktywność TNFa, a więc które można leczyć stosując zgodnie z wynalazkiem przeciwciało lub część przeciwciała, obejmują zapalne choroby kości i resorpcję kości (patrz np. Bertolini, D.R., i in. (1986) Nature 319:516-518; Konig, A., i in. (1988) J. Bone Miner. Res. 3:621-627; Lerner, U.H. i Ohlin, A. (1993) J. Bone Miner. Res. 8:147-155; i Shankar, G. i Stern, P.H. (1993) Bone 14:871-876), zapalenie wątroby, obejmujące alkoholowe zapalenie wątroby (patrz np. McClain, C.J. i Cohen, D. A. (1989) Hepatology 9:349-351; Felver, M.E., i in. (1990) Alcohol. Clin. Exp. Res. 14:255-259; i Hansen, J., i in. (1994) Hepatology 20:461-474) i wirusowe zapalenie wątroby (Sheron, N., i in. (1991) J. Hepatol. 12:241-245; i Hussain, M.J., i in. (1994) J. Clin. Pathol. 47:1112-1115), zaburzenia krzepnięcia (patrz np. van der Poll, T., i in. (1990) N. Engl. J. Med. 322:1622-1627; i van der Poll, T., i in. (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367:55-60), oparzenia (patrz np. Giroir, B.P., i in. (1994) Am. J. Physiol. 267:H118-124; i Liu, X.S., i in. (1994) Burns 20:40-44), uszkodzenie reperfuzyjne (patrz np. Scales, W.E., i in. (1994) Am. J. Physiol. 267:G1122-1127; Serrick, C., i in. (1994) Transplantion 58:1158-1162; i Yao, Y.M., i in. (1995) Resuscitation 29:157-168), powstawanie keloidu (patrz np. McCauley, R.L., i in. (1992) J. Clin. Immunol. 12:300-308), powstawanie tkanki bliznowatej i gorączkę.

PL 217 666 B1

Krótki opis rysunków

Fig. 1A i 1B obrazują odpowiedzi American College of Rheumatology 20 (ACR20) i ACR50 dotyczące pacjentów cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów (RA) po podaniu podskórnym przeciwciała D2E7 co tydzień przez ogółem dwanaście tygodni (1A), lub podawaniu podskórnym przeciwciała D2E7 i metotreksatu co drugi tydzień (1B) przez ogółem dwadzieścia cztery tygodnie. Te dane wskazują, że podawanie co drugi tydzień jest równie skuteczne jak podawanie co tydzień.

Fig. 2 przedstawia odpowiedzi ACR20, ACR50, i ACR70 dotyczące pacjentów cierpiących na RA po podskórnym podawaniu przeciwciała D2E7 i metotreksatu co drugi tydzień przez dwadzieścia cztery tygodnie.

Fig. 3A i 3B obrazują zmiany w czasie liczby tkliwych stawów (3A) i liczby obrzękniętych stawów (3B) w ciągu dwudziestu czterech tygodni u pacjentów cierpiących na RA po podawaniu podskórnym D2E7 i metotreksatu co drugi tydzień przez dwadzieścia cztery tygodnie.

Fig. 4 przedstawia wyniki uzyskane z krótkiej ankiety zdrowotnej (SF-36) pacjentów cierpiących na RA po podawaniu podskórnym przeciwciała D2E7 i metotreksatu co drugi tydzień przez dwadzieścia cztery tygodnie. RP, znaczenie fizyczne; PF, funkcja fizyczna; BP, ból cielesny; GH, ogólny stan zdrowia; V, witalność; SF, funkcjonowanie społeczne; RE, stan emocjonalny; i MH, zdrowie psychiczne.

Fig. 5 przedstawia odsetek osób dających odpowiedź ACR po pojedynczej dożylnej iniekcji przeciwciała D2E7 i metotreksatu u pacjentów cierpiących na RA.

Niniejszy wynalazek zilustrowano ponadto następującymi przykładami.

P r z y k ł a d 1

Leczenie przeciwciałem anty-TNFa

Skuteczność D2E7 po podaniu podskórnym (s.c.)

W tym badaniu, dwudziestu czterech pacjentów z aktywnym RA traktowano tygodniowymi dawkami 0,5 mg/kg D2E7 (n=18) lub placebo (n=6) metodą zastrzyku s.c. przez trzy miesiące. Średni czas trwania choroby u pacjentów biorących udział w tym badaniu mieli wynosił 10,1 lat, wynik punktacji aktywności choroby (DAS) wynosił 4,87 i otrzymywali średnio 3,4 DMARD (leki przeciwreumatyczne modyfikujące chorobę) przed włączeniem do badania; ponownie odzwierciedlające znaczną aktywność choroby. Pacjenci odpowiadający na leczenie kontynuowali leczenie otwarte przeciwciałem D2E7, podczas gdy pacjentom, którzy nie odpowiedzieli na leczenie dawką 0,5 mg/kg lub którzy utracili odpowiedź w zakresie DAS przy dawce 0,5 mg/kg, zwiększono dawkę do 1 mg/kg w iniekcji s.c. po dwunastym tygodniu badania.

Pierwsi włączeni pacjenci otrzymali do sześćdziesięciu iniekcji, a więc byli leczeni lekiem badanym przez sześćdziesiąt tygodni. Skuteczność dawkowania s.c. była podobna do iniekcji dożylnych. Aż do 78% pacjentów osiągnęło odpowiedź DAS i ACR20 w czasie pierwszych tygodni leczenia. Podskórne podawanie D2E7 w dawce 0,5 mg/kg/tydzień zmniejszyło liczbę obrzękniętych stawów (SWJ) o 54%, liczbę tkliwych stawów (TJC) o 61% i CRP o 39% w czasie dwunastu tygodni w porównaniu z wartościami wyjściowymi, podczas gdy w grupie placebo wszystkie parametry wzrosły. Po zakończeniu okresu tego badania kontrolowanego przez placebo, pacjenci kontynuowali leczenie przez aż do czternastu miesięcy z utrzymującą się skutecznością. Te wyniki wskazują zatem, że podskórne podawanie D2E7 w dawce 0,5 mg/kg/tydzień może być bezpiecznie stosowane przez samych pacjentów z dobrą tolerancją miejscową.

Podawanie D2E7 i metotreksatu

W tym badaniu, pacjenci otrzymali s.c. lub dożylnie (i.V.) placebo lub D2E7 w dawce 1 mg/kg, oprócz przyjmowanego przez nich leczenia (metotreksatem) MTX. Do badania włączono pięćdziesięciu czterech pacjentów i osiemnastu pacjentów otrzymało i.v. D2E7 i s.c. placebo, osiemnastu pacjentów otrzymało i.v. placebo i s.c. D2E7, a osiemnastu pacjentów otrzymało placebo i.v. i s.c. Pacjenci otrzymali drugą dawkę tuż po utracie statusu odpowiedzi w ramach ślepej próby, nie wcześniej niż cztery tygodnie po pierwszej dawce. Następnie, wszyscy pacjenci otrzymali w sposób otwarty iniekcje s.c. D2E7 co dwa tygodnie.

Demograficzna charakterystyka populacji badanej w tym badaniu obejmowała średni czas trwania RA równy 11,1 lat, wcześniejszą ekspozycję na średnio 3,6 DMARD (inne niż MTX), i średnią DAS w chwili rozpoczęcia badania równą 4,81. W dniu dwudziestym dziewiątym, 72% pacjentów leczonych i.v. D2E7 i 44% pacjentów leczonych s.c. D2E7 osiągnęło odpowiedź według kryteriów DAS, w porównaniu z tylko 28% pacjentów leczonych placebo (przedstawionych na Fig. 5). Spośród osób odpowiadających na leczenie w tym badaniu, 28% pacjentów leczonych placebo utrzymywało odpowiedź

PL 217 666 B1

ACR20 aż do dnia 29, w porównaniu z 72% pacjentów leczonych i.v. D2E7 i 67% pacjentów leczonych s.c. D2E7, którzy utrzymywali odpowiedzi przez od jednego do trzech miesięcy.

P r z y k ł a d 2

Dawka na całkowitą masę ciała podawanego podskórnie przeciwciała anty-TNFa

Podawanie podskórne D2E7 co tydzień

Do tego badania włączono dwieście osiemdziesięciu czterech pacjentów z RA i zaprojektowano je w celu określenia optymalnej dawki na całkowitą masę ciała podskórnie podawanego D2E7. Pacjentów zrandomizowano do otrzymywania 20, 40 lub 80 mg D2E7 lub placebo tygodniowo przez dwanaście tygodni, po którym to czasie pacjentów leczonych placebo przedstawiono w ramach ślepej próby na 40 mg D2E7/tydzień.

W przybliżeniu 49% pacjentów osiągnęło ACR20 przy dawce 20 mg, 55% pacjentów osiągnęło ACR20 przy dawce 40 mg, i 54% pacjentów osiągnęło ACR20 przy dawce 80 mg, podczas gdy tylko 10% pacjentów otrzymujących placebo osiągnęło ACR20 (przedstawiono na Fig. 1A). W przybliżeniu 23% pacjentów osiągnęło ACR50 przy dawce 20 mg, 27% pacjentów osiągnęło ACR50 przy dawce 40 mg i 20% pacjentów osiągnęło ACR50 przy dawce 80 mg, i tylko 2% pacjentów otrzymujący placebo osiągnęło ACR50. Te dane ilustrują, że podskórne podawanie D2E7, szczególnie w dawce 40 mg/tydzień wytwarza dobrą odpowiedź.

P r z y k ł a d 3

Podawanie podskórne co dwa tygodnie przeciwciała anty-TNFa, podawanie podskórne co dwa tygodnie D2E7

Badano efekty kliniczne, bezpieczeństwo, immunogenność i tolerancję u pacjentów RA z częściowymi odpowiedziami na MTX po podskórnych (s.c.) iniekcjach placebo lub D2E7 na kilku poziomach dawkowania co drugi tydzień przez aż do dwudziestu czterech tygodni w połączeniu z kontynuowanym leczeniem MTX.

Projekt badania

Przeprowadzono kontrolowane przez placebo, podwójnie ślepe, randomizowane, wieloośrodkowe badanie u pacjentów z RA, u których wystąpiła niewystarczająca skuteczność lub tolerancja na MTX. Podczas przebiegu próby, pacjenci kontynuowali leczenie na stałej dawce MTX z zakresem dawek wyspecyfikowanym w kryteriach włączenia opisanych poniżej.

To badanie składało się z dwóch części: 1) „okres pozbywania się z ustroju uprzednio stosowanego leku przed podaniem innego” równy cztery tygodnie przed podaniem pierwszej dawki leku, podczas którego wycofano DMARD (oprócz MTX); i 2) „okres kontrolowany przez placebo”, podczas którego pacjentów losowo przyporządkowano do jednej spośród czterech kohort obejmujących sześćdziesięciu siedmiu pacjentów, mających otrzymywać placebo, 20, 40 lub 80 mg D2E7 (jako dawka na całkowitą masę ciała) podawane co drugi tydzień s.c. przez do 24 tygodni. Każdą dawkę leku badanego podawano jako dwie iniekcje s.c. w ilości 1,6 ml każda. Pierwszą dawkę pacjent otrzymywał od personelu medycznego jako część szkolenia pacjenta. Kolejne dawki były stosowane przez samych pacjentów w ośrodku badawczym pod bezpośrednią obserwacją wyszkolonego personelu przez pierwsze cztery tygodnie. Następnie, dawki były podawane poza ośrodkiem badawczym przez pacjenta, wyszkoloną osobę wskazaną przez pacjenta lub przez personel medyczny. Lek przez cztery lub pięć tygodni wydawano po każdej ocenie klinicznej. Pacjentów badano seryjnie w tygodniu pierwszym, drugim, trzecim, czwartym, szóstym, ósmym, dwunastym, szesnastym, dwudziestym i dwudziestym czwartym badania, przy czym badanie stawów przeprowadzał nie znający przypisania grup lekarz oceniający, niezależny od lekarza prowadzącego.

Do tego badania włączono dwustu siedemdziesięciu jeden pacjentów z RA. Populacja badania była reprezentatywna dla populacji ze średnio ciężkim do ciężkiego RA w Ameryce Północnej: w przybliżeniu 70% pacjentów płci żeńskiej, i w przeważającej mierze w wieku powyżej czterdziestu lat. Populację dobrano stosując wstępnie określone kryteria włączenia i wykluczania, znane fachowcom w dziedzinie, np. pacjent musi mieć zdiagnozowane RA według kryteriów określonych przez American College of Rheumatology (ACR) poprawionych w 1987 roku (przedstawionych w Załączniku A).

Wyniki

Z Fig. 1B i 2-4 wynika, że podskórne leczenie D2E7 co dwa tygodnie połączone z metotreksatem znacznie lepiej niż placebo zmniejszało oznaki i objawy RA w ciągu dwudziestu czterech tygodni. Wszystkie trzy dawki D2E7 były w sposób statystycznie istotny bardziej skuteczne niż placebo podawane co tydzień. Ponadto, D2E7 w dawce 40 mg i 80 mg miało lepszą skuteczność niż w dawce 20 mg.

PL 217 666 B1

Załącznik A

Definicja RA według ACR

Kryteria i funkcje schematu klasyfikacji z roku 1987 dla reumatoidalnego zapalenia stawów (RA)

Kryterium	Definicja
1. Zapalenie 3 lub większej liczby obszarów stawów	Co najmniej 3 obszary stawów jednocześnie wykazywały obrzęk tkanek miękkich lub płyn (nie tylko przerost kostny) według obserwacji lekarza. 14 możliwych obszarów stawów oznacza prawy lub lewy PIP, MDP, nadgarstek, łokieć, kolano, kostkę i stawy MTP.
2. Zapalenie stawów ręki Nadgarstek MCP MCP lub nadgarstek MCP i nadgarstek	Obrzęk tkanek miękkich lub płyn (nie tylko przerost kostny) wyszczególnionego obszaru według obserwacji lekarza. Tam gdzie wyszczególniono 2 obszary, musiały one być objęte chorobą jednocześnie.
3. Symetryczny obrzęk (zapalenie stawów)	Jednoczesne objęcie chorobą tych samych obszarów stawów (jak zdefiniowano w 1 po obu stronach ciała (obustronne objęcie chorobą PIP, MCP lub MTP jest dopuszczalne mimo braku bezwzględnej symetrii)
4. Czynnik reumatoidalny w surowicy	Wykazanie nieprawidłowych ilości czynnika reumatoidalnego w surowicy dowolną metodą, dla której wynik jest dodatni u <5% zdrowych pacjentów kontrolnych
5. Zmiany radiograficzne w reumatoidalnym zapaleniu stawów	Zmiany radiograficzne typowe dla reumatoidalnego zapalenia stawów na tylnoprzednich radiogramach ręki i nadgarstka, które muszą obejmować nadżerki lub oczywiste odwapnienie kości zlokalizowane w lub najbardziej wyrażne sąsiadująco do objętych stawów (same zmiany jak w zapaleniu kości i stawów nie kwalifikują się)

Pacjenta określa się jako chorego na RA jeśli mieści się w 1 z 5 podzestawów RA wyszczególnionych w Tabeli 7 i ma kliniczną diagnozę RA postawioną przez swojego lekarza. Kryteria 1, 2 i 3 muszą być obecne przez co najmniej 6 tygodni. Arthritis and Rheumatism, tom 31, nr 3 (marzec 1988).

PL 217 666 B1

SEQ ID NO:1

Asp 1

Ile

Gin

Het

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Gly

Ile

Arg 30

Asn

Tyr

Leu

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Łys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Ile

Tyr

Ala 50

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin 55

Ser

Gly

Val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Leu

Gin

Pro eo

Glu

Asp

Val

Ala

Thr es

Tyr

Cys

Gin

Arg 90

Tyr

Asn

Arg

Ala

Pro 95

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Łys

Val

Glu

Ile

Lys

100 105

SEQ ID NO:2:

Glu val Gin Leu val	Glu	Ser	Gly Gly Gly Leu Vał Gin Pro Gly	Arg
1	5	10	15
Ser Leu Arg Leu	ser	cys	Ala	Ala Ser Gly Phe Thr Phe	Asp Asp	Tyr
20				25	30
Ala Het His Trp	Val	Arg	Gin	Ala Pro Gly Lys Gly Leu	Glu Trp	val
35				40 45
Ser Ala Ile-Thr	Trp	Asn	Ser	Gly His Ile Asp Tyr Ala	Asp Ser	Val
50			55	60
Glu Gly Arg Phe	Thr	Ile	Ser	Arg Asp Asn Ala Lys Asn	Ser Leu	Tyr
65		70		75		B0
Leu Gin Met Asn	Ser	Leu	Arg	Ala Glu Asp Thr Ala Val	Tyr Tyr	Cys
	85			90	95
Ala Lys val Ser	Tyr	Leu	Ser	Thr Ala Ser Ser Leu Asp	Tyr Trp	Gly
100				105	110
Gin Gly Thr Leu	val	Thr	val	Ser Ser
lis				120
ID NO: 3 :
Gin Arg Tyr Asn	Arg	Ala	Pro	Tyr Xaa

5

PL 217 666 B1 seq id ho : 4:

val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Aap Xaa 15 10

SEQ ID NO:5:

Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser 1 5

SSQ ID NO:6:

Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu i s xo is

Gly

SEQ ID NO:7:

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala 15 10

SEQ ID NO:8:

Asp Tyr Ala Met His 1 5

SEQ ID NO:9

Asp 1

Ile

Gin

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Ile 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Gly

ile

Arg 30

Asm

Leu

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Ile

Tyr

Ala 50

Ala

Ser

Thr

Leu

Gin 55

Ser

Gly

val

Pro

Ser 60

Arg

Phe

Ser

Gły

Ser es

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Leu

Gin

Pro 80

Glu

Asp

Val

Ala

Thr 85

Tyr

Cys

Gin

Lys 90

Tyr

Asn

Ser

Ala

Pro 95

Tyr

Ala

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

He

Lys

100 105

SEQ ID NO:10

PL 217 666 B1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

val

Gin

Pro

Gly 15

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp 30

Asp

Tyr

Ala

Met

His 35

Trp

val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Asp

Trp

Val

Ser

Ala 50

Ile

Thr

Trp

Asn

Ser 55

Gly

His

Ile

ASp

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Glu 65

Gly

Arg.

Phe

Ala

Val 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala 75

Lys

Asn

Ala

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Pro

Glu

Asp 90

Thr

Ala

val

Tyr

Tyr 95

Cys

Thr

Lys

Ala

Ser 100

Tyr

Leu

Ser

Thr

Ser 105

Ser

Leu

Asp

Asn 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

val

Ser

115 120

SEQ ID NO:II:

Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala 1 5

SEQ ID NO:12:

Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala 1 5

SEQ ID NO:13:

Gin Lys Tyr Gin Arg Ala Pro Tyr Thr 1 S

SEQ ID NO:14:

Gin Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5

SEQ ID NO:15:

Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5

SEQ ID NO:16 :

Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr

PL 217 666 B1

5

SEQ IB

Gla Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Tyr 1 5

SEQ IB NO:15:

Gin Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Asn i s

SSQ ID NO:19:

Gin Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5

SEO ID »0:20:

Gin Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Asn 1 5

SEQ ID N0:2I:

Gla Lys Tyr Asn Ser Ala Ala Tyr Ser l S

SEO ID NO:22:

Gin Gin Tyr Asn Ser Ala Pro Asp Thr 1 5

SEQ IB NO:23:

Gin Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr i s

SEO ID NO:24:

Gin. Lye Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5

SEO ID NO:2S:

Gin Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr 1 5

SEQ ID »0:26:

PL 217 666 B1

Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala 1 5

SEQ 10 NO:27;

Ala ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn 1 S 10

SEQ ID HO:28:

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys 15 10

SSQ ID NO:29:

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Tyr i s 10

SEQ ID NO:30:

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asp 15 10

SEQ ID NO:31:

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Phe Ser Leu Asp Tyr i s i(J

SEO ID NO:52:

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr i S 10

SEQ .ID NO:33:

Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr 1 5 10

SEQ ID N0:34t

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tyr 1 S 10

SEQ I» NO:35:

Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Asn 15 10

PL 217 666 B1

SEQ ID NO:36:

GACATCCAGA	TGACCCAGTC	TCCATCCTCC	CTGTCTGCAT	CTGTAGGGGA	CAGAGTCACC	60
ATCACTTGTC	GGGCAAGTCA	GGGCATCAGA	AATTACTTAG	CCTGGTATCA	GCAAAAACCA	120
GGGAAAGCCC	CTAAGCTCCT	GATCTATGCT	GCATCCACTT	TGCAATCAGG	GGTCCCATCT	ISO
CGGTTCAGTG	GCAGTGGATC	TGGGACAGAT	TTCACTCTCA	CCATCAGCAG	CCTACAGCCT	240
GAAGATGTTG	CAACTTATTA	CTGTCAAAGG	TATAACCGTG	CACCGTATAC	TTTTGGCCAG	300
GGGACCAAGG	TGGAAATCAA	A				321

SEQ ID NO:37:

GAGGTGCAGC	TGGTGGAGTC	TGGGGGAGGC	TTGGTACAGC	CCGGCAjGGTC	CCTGAGACTC	60
TCCTGTGCGG	CCTCTGGATT	CACCTTTGAT	GATTATGCCA	TGCACTGGGT	CCCGCAAGCT	120
CCAGGGAAGG	GCCTGGAATG	GGTCTCAGCT	ATCACTTGGA	ATAGTGGTCA	CATAGACTAT	180
GCGGACTCTG	TGGAGGGCCG	ATTCACCATC	TCCAGAGACA	ACGCCAAGAA	CTCCCTGTAT	240
CTGCAAATGA	ACAGTCTGAG	AGCTGAGGAT	ACGGCCGTAT	ATTACTGTGC	GAAAGTCTCG	300
TACCTTAGCA	CCGCGTCCTC	CCTTGACTAT	TGGGGCCAAG	GTACCCTGGT	CACCGTCTCG	360

AGT 363

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, u człowieka, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie dla leczenia tego zaburzenia.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą Kd równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą i stałą

-3 -1 szybkości Koff równą 1 x 10^-3 s^-1 lub mniejszą, obie określone metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego, i które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-7 M lub mniejszą.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wią-4 -1 żącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 5 x 10^-4 s^-1lub mniejszą.
4. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wią-4 1 żącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff mniejszą 1 x 10^-4 s-^{1 2 3 4 5}lub mniejszą.
5. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą.

PL 217 666 B1
6. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-9 M lub mniejszą.
7. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 -10 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-10 M lub mniejszą.
8. Zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają następujące właściwości:

-3 -1

a) odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 1 x 10^-3 s^-1 lub mniejszą, co określa się metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego;

b) mają domenę CDR3 łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; i

c) mają domenę CDR3 łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4,

5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12.
9. Zastosowanie według zastrz. 8, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część

-4 -1 wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 5 x 10^-4 s^-1lub mniejszą.
10. Zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie dla leczenia tego zaburzenia, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8, i mają region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym podaje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, których LCVR obejmuje ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 5 i HCVR obejmuje ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 6.
12. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym podaje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, których LCVR obejmuje ponadto domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 7 i HCVR obejmuje domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8.
13. Zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 i region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało, które ma region stały łańcucha ciężkiego IgG1.
15. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało, które ma region stały łańcucha ciężkiego IgG4.
16. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym jako ludzkie przeciwciało stosuje się fragment Fab.
17. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym jako ludzkie przeciwciało stosuje się fragment Fv o pojedynczym łańcuchu.

PL 217 666 B1
18. Zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie tygodnie dla leczenia tego zaburzenia, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11,

SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17,

SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23,

SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 lub ma region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34.
19. Zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym lek podaje się podskórnie w trybie podawania co dwa tygodnie, dla leczenia tego zaburzenia przy czym ludzkim przeciwciałem jest przeciwciało D2E7 lub jego część wiążąca antygen.
20. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się posocznicę.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym przeciwciało podaje się człowiekowi razem z cytokiną, interleukiną-6 (IL-6), lub podaje się człowiekowi, u którego stężenie IL-6 w surowicy lub osoczu wynosi powyżej 500 pg/ml.
22. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się chorobę autoimmunologiczną.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, w którym leczy się chorobę autoimmunologiczną wybraną z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie kręgosłupa, zapalenie kości i stawów i dnawe zapalenie stawów.
24. Zastosowanie według zastrz. 23, w którym leczy się chorobę autoimmunologiczną taką jak reumatoidalne zapalenie stawów.
25. Zastosowanie według zastrz. 22, w którym leczy się chorobę autoimmunologiczną wybraną z grupy obejmującej alergię, stwardnienie rozsiane, cukrzycę autoimmunologiczną, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka i zespół nerczycowy.
26. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się chorobę zakaźną.
27. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się odrzucenie przeszczepu lub reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi.
28. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się stan złośliwy.
29. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się zaburzenie płucne.
30. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się zaburzenie jelitowe.
31. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się zaburzenie serca.
32. Zastosowanie według zastrz. 1-19, w którym leczy się zaburzenie wybrane z grupy obejmującej zapalne choroby kości, resorpcję kości, alkoholowe zapalenie wątroby, wirusowe zapalenie wątroby, zaburzenia krzepnięcia, oparzenia, uszkodzenie reperfuzyjne, powstawanie keloidu, powstawanie tkanki bliznowatej i gorączkę.
33. Zastosowanie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia, przy czym człowiekowi podaje się podskórnie kompozycję zawierającą przeciwciało anty-TNFa lub jego część wiążącą antygen i metotreksat tak, aby wyleczyć zaburzenie.
34. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym metotreksat podaje się razem z przeciwciałem anty-TNFa lub jego częścią wiążącą antygen.
35. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym metotreksat podaje się przed podawaniem przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen.
36. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym metotreksat podaje się po podaniu przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen.
37. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym jako przeciwciało anty-TNFa stosuje się ludzkie przeciwciało anty-TNFa lub jego część wiążącą antygen.
38. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym podaje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą i stałą

-3 -1 szybkości Koff równą 1 x 10^-3 s^-1 lub mniejszą, obie określone metodą powierzchniowego rezonansu

PL 217 666 B1 plazmonowego, i które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-7 M lub mniejszą.
39. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część

-4 -1 wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 5 x 10^-4 s^-1lub mniejszą.
40. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część

-4 -1 wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 1 x 10^-4 s^-1lub mniejszą.
41. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-8 M lub mniejszą.
42. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-9 M lub mniejszą.
43. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które neutralizują cytotoksyczność ludzkiego TNFa w standardowym teście L929 -10 in vitro z wartością IC50 równą 1 x 10^-10 M lub mniejszą.
44. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym jako ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen stosuje się przeciwciało rekombinowane lub jego część wiążącą antygen.
45. Zastosowanie według zastrz. 33, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, które hamują wywołaną przez ludzki TNFa ekspresję ELAM-1 na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej.
46. Zastosowanie ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym podaje się człowiekowi metotreksat i podskórnie, ludzkie przeciwciało anty-TNFa, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają następujące właściwości:

-3 -1

a) odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 1 x 10^-3 s^-1 lub mniejszą, co określa się metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego;

b) mają domenę CDR3 łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9;

c) mają domenę CDR3 łańcucha ciężkiego zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych podstawień aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12.
47. Zastosowanie według zastrz. 46, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część

-4 -1 wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 5 x 10^-4 s^-1lub mniejszą.
48. Zastosowanie według zastrz. 46, w którym stosuje się ludzkie przeciwciało lub jego część

-4 -1 wiążącą antygen, które odłączają się od ludzkiego TNFa ze stałą szybkości Koff równą 1 x 10^-4 s^-1lub mniejszą.
49. Zastosowanie ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym człowiekowi podaje się metotreksat i podskórnie ludzkie przeciwciało anty-TNFa, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ED NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8, i mają region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11.
50. Zastosowanie według zastrz. 49, w którym podaje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, których LCVR obejmuje ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 5 i HCVR obejmuje ponadto domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 6.

PL 217 666 B1
51. Zastosowanie według zastrz. 49, w którym podaje się ludzkie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen, których LCVR obejmuje ponadto domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 7 i HCVR obejmuje domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8.
52. Zastosowanie ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym człowiekowi podaje się metotreksat i podskórnie ludzkie przeciwciało anty-TNFa, a ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 i region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ED NO: 2.
53. Zastosowanie według zastrz. 52, w którym podaje się ludzkie przeciwciało, które ma region stały łańcucha ciężkiego IgG1.
54. Zastosowanie według zastrz. 52, w którym podaje się ludzkie przeciwciało, które ma region stały łańcucha ciężkiego IgG4.
55. Zastosowanie według zastrz. 52, w którym jako ludzkie przeciwciało stosuje się fragment Fab.
56. Zastosowanie według zastrz. 52, w którym jako ludzkie przeciwciało stosuje się jednołańcuchowy fragment Fv.
57. Zastosowanie ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym człowiekowi podaje się metotreksat i podskórnie ludzkie przeciwciało anty-TNFa, lub jego część wiążącą antygen, które mają region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 lub mają region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) obejmujący domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ED NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34.
58. Zastosowanie ludzkiego przeciwciała anty-TNFa lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do hamowania aktywności ludzkiego TNFa u człowieka cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNFa jest szkodliwa, przy czym człowiekowi podaje się metotreksat i podskórnie ludzkie przeciwciało anty-TNFa, a jako ludzkie przeciwciało stosuje się przeciwciało D2E7 lub jego część wiążącą antygen.