JP6180408B2 - 抗ｐｓｇｌ−１抗体およびその使用 - Google Patents

Description

１．関連出願
本出願は、２０１１年６月１３日に出願された米国仮特許出願第61/496,249号、名称「抗ＰＳＧＬ−１抗体およびその使用（ANTI-PSGL-1 ANTIBODIES AND USES THEREOF）」の出願日の利益を主張する。参照された仮出願の全体の教示および内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
２．分野

本明細書で提供されるのは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）に特異的に結合する抗体、かかる抗体をコードするポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、かかる発現ベクターを含む宿主細胞、および関連する組成物である。本明細書でさらに提供されるのは、活性化Ｔ細胞の増殖および／または数の増加に起因するかまたはこれに関連する障害または障害、例えば乾癬などを、抗ＰＳＧＬ−１抗体を用いて処置するための方法である。
３．背景技術

感染症または外傷に対する炎症反応は、白血球の血管壁への付着によって開始される（McEver et al., 1997, J. Clin. Invest., 100 (3): 485-492）。セレクチンは、炎症の間の最初の白血球−内皮細胞および白血球−血小板の相互作用を媒介する糖タンパク質のファミリーを表わす。Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＰ−セレクチンから構成されるセレクチンファミリーは、ＮＨ_２末端レクチンドメイン、続くＥＧＦ様ドメイン、一連のコンセンサスリピート、膜貫通ドメイン、および短い細胞質の尾を含む。セレクチンのレクチンドメインは、細胞接着を促進するために、特定の複合糖質リガンドと相互作用する。ほとんどの白血球上で発現されるＬ−セレクチンは、いくつかの内皮細胞および他の白血球上でリガンドに結合する。サイトカイン活性化内皮細胞上で発現されるＥ−セレクチンは、大部分の白血球上でリガンドに結合する。活性化血小板および内皮細胞上で発現されるＰ−セレクチンもまた、ほとんどの白血球上でリガンドに結合する。

Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）は、ＳＥＬＰＬＧまたはＣＤ１６２（分化１６２のクラスタ）としても知られており、これは、全３種のセレクチンについてのヒトムチン型糖タンパク質リガンドである（Constantin, Gabriela, 2004, Drugs News Perspect, 17(9): 579-585；McEver et al., 1997, J. Clin. Invest., 100 (3): 485-492）。ＰＳＧＬ−１は、２つの１２０ｋＤのサブユニットを持つジスルフィド結合ホモ二量体であり、単球、リンパ球、顆粒球の表面およびいくつかのＣＤ３４^＋幹細胞中で発現される。ＰＳＧＬ−１は、セレクチンの接着相互作用を促進するため、多くの炎症性疾患における病理学的白血球動員に貢献する可能性が高く、ＰＳＧＬ−１に対する抗体等のＰＳＧＬ−１の阻害剤が、潜在的に有用な抗炎症薬であることを示唆している。

いくつかの抗ＰＳＧＬ−１抗体が開発されている（例えば、２００５年１１月２４日に公開された国際出願公開第WO 2005/110475号、２００３年２月２０日に公開された国際出願公開第WO 2003/013603号；Constantin, Gabriela, 2004, Drugs News Perspect, 17(9): 579-585を参照）。
４．概要

一側面において、本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体および、抗体由来の抗原結合断片である。一態様において本明細書で提供されるのは、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変軽（「ＶＬ」）鎖領域；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変重（「ＶＨ」）鎖領域を含む重鎖；および（ｉｉｉ）ＥＵ（γ−Ｇ１免疫グロブリン）インデックス（Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1): 78-85参照）の番号付けによる重鎖のアミノ酸２２８においてセリンからプロリンへの置換を含む、ヒトＩｇＧ４定常領域、を含む、前記モノクローナル抗体である。特定の態様において本明細書で提供されるのは、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖；および（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖、を含む、前記モノクローナル抗体である。別の特定の態様において本明細書で提供されるのは、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、（ｉ）配列番号２からなる重鎖；および（ｉｉ）配列番号１からなる軽鎖を含む、モノクローナル抗体である。別の特定の態様において本明細書で提供されるのは、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖および相補的な軽鎖を含む、モノクローナル抗体である。特定の態様において、前述のモノクローナル抗体のいずれかは精製されている。

別の側面において、本明細書で提供されるのは、前述のモノクローナル抗体のいずれか１つおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物である。特定の態様において、医薬組成物は、精製されたモノクローナル抗体を含む。

一態様において本明細書で提供されるのは、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびクエン酸一水和物を含有する水溶液中に前述のモノクローナル抗体のいずれか１つを含む医薬製剤である。特定の態様において、医薬製剤は、９．１ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および０．９ｍＭのクエン酸を含む水溶液である。別の特定の態様において、モノクローナル抗体は、医薬製剤中に０．２６７ｍＭの濃度で存在する。特定の態様において、医薬製剤は、２．６７６ｇ／Ｌのナトリウム、８．７６６ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２ｇ／Ｌのポリソルベート８０、および０．１８９ｇ／Ｌのクエン酸を含む水溶液である。別の特定の態様において、モノクローナル抗体は、医薬製剤中に４０ｇ／Ｌの濃度で存在する。特定の態様において、前述の全ての水性溶液はｐＨ６．０である。

別の側面において本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、ポリヌクレオチドである。特定の態様において本明細書で提供されるのは、配列番号２を含む抗体重鎖をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。ある態様において、発現ベクターは、前述の単離されたポリヌクレオチドを含む。一定の態様において、発現ベクターは、配列番号１を含む抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。特定の態様において、発現ベクターは哺乳動物発現ベクターである。別の態様において本明細書で提供されるのは、前述の発現ベクターを含む宿主細胞である。特定の態様において、宿主細胞は、（ａ）配列番号２をコードし、前記宿主細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結されている第１の核酸；および（ｂ）配列番号１をコードし、前記宿主細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結されている第２の核酸、を含む。別の特定の態様において、宿主細胞の第１および第２の核酸は、同一の発現ベクター内または異なる発現ベクター内にある。

別の側面において本明細書で提供されるのは、前述のモノクローナル抗体のいずれかを産生する方法であって、任意の前述の宿主細胞を、前記第１および第２の核酸が前記細胞によって発現されるように、および前記重鎖および軽鎖が一緒になって前記抗体を形成するように、培養することを含む、前記方法である。

別の側面において本明細書で提供されるのは、配列番号２を含む抗体重鎖、または配列番号２のアミノ酸１〜２２８を含む抗体重鎖断片である。特定の態様において本明細書で提供されるのは、配列番号２を含む抗体重鎖である。別の特定の態様において本明細書で提供されるのは、配列番号２のアミノ酸１〜２２８を含む抗体重鎖断片である。本明細書でさらに提供されるのは、前述の重鎖を産生する方法であって、任意の前述の宿主細胞を、前記重鎖が前記細胞によって発現されるように培養すること、および前記重鎖を単離することを含む、前記方法である。特定の態様において、前述の抗体のいずれかを産生する方法は、重鎖を産生する前述の方法に従って重鎖を産生すること、前記重鎖を単離すること、および前記重鎖を配列番号１を含む抗体軽鎖に複合化することを含む。

別の特定の態様において本明細書で提供されるのは、前述のモノクローナル抗体のいずれかを含む第１の容器を含むキットである。特定の態様において、第１の容器は、真空下で凍結乾燥された無菌粉末としての前記モノクローナル抗体を含むバイアルであり、キットはさらに、薬学的に許容し得る流体を含む第２の容器を含む。本明細書でさらに提供されるのは、前述のモノクローナル抗体のいずれかを含有する注入装置である。特定の態様において、注入装置は注射器である。

別の態様において本明細書で提供されるのは、健康な個人または特定の疾患もしくは障害を有しない個人に比べて、増加したおよび／または多数の活性化Ｔ細胞と関連するかこれに（全体的にまたは部分的に）起因する疾患または障害を、予防および／または処置するための方法である。特定の態様において本明細書で提供されるのは、炎症性障害を処置するための方法であって、これを必要とする対象に対して、前述のモノクローナル抗体のいずれかの治療有効量を投与することを含む、前記方法である。別の特定の態様において、炎症性障害を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、前述の医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与することを含む。特定の態様において、炎症性障害は自己免疫疾患である。別の特定の態様において、炎症性障害は乾癬である。別の特定の態様において、炎症性障害は尋常性乾癬である。別の特定の態様において、尋常性乾癬は、中等度から重度である。別の特定の態様において、炎症性障害は乾癬性紅皮症である。別の特定の態様において、炎症性障害は乾癬性関節炎である。別の特定の態様において、炎症性障害は関節リウマチである。別の特定の態様において、炎症性障害はクローン病である。別の特定の態様において、炎症性障害は強直性脊椎炎である。別の特定の態様において、炎症性障害は糖尿病である。
５．図面の簡単な説明

図１は、ｈ１５Ａ７および１５Ａ７Ｈについての非還元キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を示す。矢印は、半抗体分子のピークを示す。

図２は、１５Ａ７Ｈおよび対照抗体の、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示す。ＥＣ５０値（ｎＭ）は、１部位４パラメータフィットモデルを用いて、抗体濃度に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットすることにより導出した。

図３は、４人のドナーのＰＢＭＣのtrans-vivoＤＴＨにおける、１５Ａ７Ｈ抗体のプールされた用量反応を示す。０．０３、０．１、０．３、１および１０ｍｇ／ｋｇの抗体、またはビヒクルによる処置後の４人のドナーの、プールされた平均±ＳＥＭ。ｐｂｍｃ：ＰＢＭＣのみ、Ｖ：ビヒクル；０．０３、０．１、０．３、１および１０ｍｇ／ｋｇの１５Ａ７Ｈ抗体。０．０３、０．１、０．３、１および１０ｍｇ／ｋｇの１５Ａ７Ｈ抗体処置に応答した、足蹠厚さの阻害％。

図４は、単回腹腔内注射後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、１５Ａ７Ｈ抗体の２４時間の血漿濃度を示す。実験動物における２つの抗体のプールされた血漿レベル（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４）を、trans-vivoＤＴＨアッセイにおける足蹠厚さの阻害％に対してプロットする。

図５は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、時間に対する１５Ａ７Ｈ血漿濃度を示す。４つのサテライトマウスに、０．０３、０．１、０．３、１および１０ｍｇ／ｋｇの１５Ａ７Ｈ抗体を腹腔内投与した。血液サンプルを、１、３、５および２４時間において採取した。

図６は、異なる濃度（５、０．５、０．０５、０．００５および０．０００５μｇ／ｍｌ）で試験した、１５Ａ７Ｈおよび対照抗体のＣＤＣ活性を示す。

図７Ａは、抗体１５Ａ７Ｈの重鎖アミノ酸配列を示す（配列番号２）。可変重鎖領域（配列番号４）は太字で示す。ＣＤＲ（ＣＤＲ１（配列番号８）、ＣＤＲ２（配列番号９）、およびＣＤＲ３（配列番号１０））は四角で囲んで示す。フレームワーク領域（ＦＲ１（配列番号１７）、ＦＲ２（配列番号１８）、ＦＲ３（配列番号１９）およびＦＲ４（配列番号２０））も示す。定常領域も示す。ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号１２）は四角で囲んで示す。ヒンジ領域内のアミノ酸位置２２８における置換されたプロリンは、イタリック体で示す。

図７Ｂは、抗体１５Ａ７Ｈの軽鎖アミノ酸配列を示す（配列番号１）。可変軽鎖領域（配列番号３）は太字で示す。ＣＤＲ（ＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）およびＣＤＲ３（配列番号７））は四角で囲んで示す。フレームワーク領域（ＦＲ１（配列番号１３）、ＦＲ２（配列番号１４）、ＦＲ３（配列番号１５）およびＦＲ４（配列番号１６））も示されている。定常領域も示す。 ６．詳細な説明

本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体である。さらに提供されるのは、かかる抗体をコードする単離された核酸である。さらに提供されるのは、かかる抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む、ベクターおよび宿主細胞である。さらに提供されるのは、かかる抗体、細胞、例えばＣＨＯ細胞を作製する方法、かかる細胞により産生された抗体および産生された抗体の精製である。本明細書でまた提供されるのは、本明細書に記載の障害または疾患（例えば炎症性状態）を処置および／または予防する方法であって、ＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合する、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を投与することを含む、前記方法である。特定の態様において、抗体は、以下の例１〜４に記載されているＩｇＧ４モノクローナル抗体１５Ａ７Ｈである。
６．１ 抗体

本明細書で提供されるのは、ヒトＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体である。特定の態様において本明細書で提供されるのは、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体であって、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変軽（「ＶＬ」）鎖領域；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変重（「ＶＨ」）鎖領域を含む重鎖；および（ｉｉｉ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸２２８においてセリンからプロリンへの置換を含むヒトＩｇＧ４定常領域、を含む、前記モノクローナル抗体である。ヒト定常領域の非限定的な例は当分野で記載されており、例えばKabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと。好ましくは、抗体はＰＳＧＬ−１に結合し、（ＰＳＧＬ−１を発現する他の細胞と比較して）活性化Ｔ細胞のアポトーシスを選択的に誘導する。特定の態様において、抗体のＰＳＧＬ−１への結合は、Ｐ−セレクチンのＰＳＧＬ−１との相互作用を妨害せず、この作用はＰＳＧＬ−１に付随する機能であって、活性化Ｔ細胞および好中球の標的組織への効率的な局在化のための要件である。

特定の態様において、ＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合する抗体は、クラス４の完全長免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ４）であり、好ましくは配列番号２の重鎖配列を含み、さらに好ましくは配列番号２の重鎖配列および配列番号１の軽鎖配列を含む（後者は、モノクローナル抗体１５Ａ７Ｈである）。

本明細書でさらに提供されるのは、抗体の抗原結合断片であって、配列番号３と配列番号４の可変領域配列および、ＥＵインデックスの番号付けによるヒト重鎖のアミノ酸２２８においてセリンからプロリンへの置換を含んだヒトＩｇＧ４ヒンジ領域を含む、ヒト重鎖定常領域の少なくとも一部を含むものである。特定の態様において、本明細書の抗体由来の抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）_２断片である。

本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、好ましくは単離されており、最も好ましくは精製されている。

本明細書において、特に別の指定がない限り、用語「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、および「特異的に認識する」は、抗体および抗体由来抗原結合断片の文脈において類似の用語であり、本明細書において互換的に使用され、当業者によって理解されるように、抗体または抗体由来抗原結合断片の、その抗原結合部位を介したそのエピトープへの結合を意味する。特定の一態様において、抗原に特異的に結合する抗体または抗体由来抗原結合断片はまた、他のペプチドまたはポリペプチドにも結合することができるが、ただし一般的に、例えば免疫測定法、Biacore(登録商標)、KinExA 3000機器（Sapidyne Instruments, Boise, ID）、または当分野に知られている他のアッセイによって決定されるように、より低い親和性においてである。特定の態様において、抗原に免疫特異的に結合する抗体または抗体由来抗原結合断片は、抗体に対して、該抗体または抗体由来抗原結合断片が他の抗原に結合する場合のＫ_ａよりも少なくとも２ｌｏｇｓ、２．５ｌｏｇｓ、３ｌｏｇｓ、４ｌｏｇｓまたはそれ以上のＫ_ａで結合する。別の特定の態様において、抗原に免疫特異的に結合する抗体または抗体由来抗原結合断片は、他のタンパク質との結合によって交差反応を起こさない。特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、ＰＳＧＬ−１の天然のアイソフォームまたは天然の変異体（これは、好ましくはヒトである動物から単離可能な、動物におけるＰＳＧＬ−１の天然のアイソフォームまたは変異体である）に特異的に結合する。特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、ヒトＰＳＧＬ−１またはその断片に免疫特異的に結合する。特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、ヒトＰＳＧＬ−１および／またはカニクイザルＰＳＧＬ−１またはその断片に、特異的に結合する。

配列番号１１のアミノ酸配列は、全長ヒトＰＳＧＬ−１、GenBank(登録商標)受託番号AAA74577.1、GI: 902797を表す。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、例えばＥＬＩＳＡまたはその他の当分野に知られている抗原結合アッセイにより、または本明細書に記載のようにして決定されるように、ＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合する。

特定の側面において、本明細書で提供されるのは、ヒトおよび／またはカニクイザルのＰＳＧＬ−１に特異的に結合する抗体であって、これは、それぞれが重鎖および軽鎖を含む２つの同一のジスルフィド結合二量体の四量体であるクラス４（ＩｇＧ４）の免疫グロブリンＧ（ガンマ−重領域を有する）である。抗体は、好ましくは配列番号２の重鎖を含む。より好ましくは、抗体は、配列番号２の重鎖および配列番号１の軽鎖を含む。軽鎖については、特定の態様において、本明細書に記載の抗体の軽鎖は、カッパ軽鎖である。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むかこれからなる重鎖を含む。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかこれからなる軽鎖を含み、配列番号２のアミノ酸配列を含むかこれからなる重鎖を含む。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかこれからなる軽鎖を含む。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むかこれからなる重鎖を含む。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ４シャフリングとしても知られている、Ｆａｂアーム交換と呼ばれるプロセスを経ることが知られており、ここで、天然のＩｇＧ４ヒンジジスルフィド結合の、還元に対する感受性の増加により、重鎖が分離してランダムに再度結合し、ＩｇＧ４分子とランダム化された重鎖および軽鎖の対の混合集団が生成されることが可能となる（Aalberse et al., 1999. Int Arch Allergy Immunol 118:187-189；Labrijn, et al., 2009, Nat Biotechnol 27:767-771；Schuurman et al., 2001. Mol Immunol 38:1-8；van der Neut Kolfschoten et al., 2007. Science 317:1554-1557）。

ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域における、Kabat番号付を用いた２４１位（Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）、またはＥＵインデックスを用いた２２８位（Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1): 78-85）でのセリンからプロリンへの変異が、鎖内のジスルフィド結合形成の相当な減少をもたらし、これによりＩｇＧ４「半抗体」分子の減少およびＩｇＧ４分子の異質性／シャフリングの減少をもたらすことが実証されている（Bloom et al. 1997, Protein Sci, 6:407-415；Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 30(1): 105-108）。このヒンジの変異は、ＩｇＧ４シャフリングを低減し、in vivoでのＩｇＧ４分子の半減期を増加させ得ることも報告されている（Labrijn, et al., 2009, Nat Biotechnol 27:767-771；Stubenrauch, et al., 2010, Drug Metab Dispos 38:84-91）。Van der Neut Kolfschotenらは、コアヒンジではなくＩｇＧ４のＣ_Ｈ３ドメインが、Ｆａｂアーム交換反応に主に関与していることを報告した（Van der Neut Kolfschoten et al, 2007, Science, 317:1554-1557（“Van der Neut Kolfschoten”）の１５５５ページ、col. 2を参照）。Van der Neut Kolfschotenは、ＩｇＧ１のＣ_Ｈ３ドメインをＩｇＧ４のＣ_Ｈ３ドメインに交換することにより、ＩｇＧ１のＦａｂアーム交換を活性化し、一方でＩｇＧ４のＣ_Ｈ３ドメインの交換が、ＩｇＧ４に対するＦａｂアーム交換を阻害することを報告した（１５５５ページおよび図２Ｄを参照）。

特定の態様において本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合し、ＩｇＧ４ヒンジ領域において１または２以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４抗体またはその抗原結合断片であって、ここで、前記抗体またはその抗原結合断片は、前記ＰＳＧＬ−１に対する特異的結合を保持し、およびここでＩｇＧ４シャフリングは、前記１または２以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含む抗体と比較して低減されている。特定の態様において、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、単一のアミノ酸置換のみを含む。「ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域」の例としては、Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 30(1): 105-108に記載されている、配列番号１２のアミノ酸からなるＣ_Ｈ１およびＣ_Ｈ２ドメインの間のＩｇＧ４抗体の重鎖上の領域である。

特定の態様において、ＩｇＧ４シャフリングの低減の決定は、１または２以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含むＩｇＧ４分子から産生される半抗体分子またはアーム交換の量と比較して、ヒンジ領域における１または２以上のアミノ酸置換を含んでいる本明細書に記載の抗体から産生された半抗体分子またはアーム交換の低い量を検出することにより、行われる。当技術分野でよく知られている任意のアッセイを、半抗体の産生および二重特異性抗体分子を検出するために使用することができる。二重特異性抗体の産生を検出するアッセイの例としては、例えば、Van der Neut Kolfschoten et al, 2007, Science, 317:1554-1557を参照されたい。

特定の態様において本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合するＩｇＧ４モノクローナル抗体であって、ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸位置２２８において、セリンからプロリンへのアミノ酸置換を含む、前記抗体である。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖、およびＥＵインデックスの番号付けによる重鎖の位置２２８においてプロリンを含む重鎖を含む。

特定の態様において、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体は、以下を含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖；および（ｉｉ）ＩｇＧ４ヒンジ領域における１または２以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４定常領域を含む重鎖、ここで前記抗体は、前記ＰＳＧＬ−１に対する特異的結合を保持し、ここでＩｇＧ４シャフリングは、前記１または２以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含む抗体に比べて低減されている。

特定の態様において、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体は、以下を含む：（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖；および（ｉｉ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸位置２２８、またはKabat番号付けによる位置２４１（Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242、およびEdelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1): 78-85）でのセリンからプロリンへのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４定常領域を含む重鎖。

特定の態様において、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体は、以下を含む：（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ鎖領域；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖領域；および（ｉｉｉ）ヒンジ領域における１または２以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ４定常領域、ここで前記抗体は、ＰＳＧＬ−１に対する特異的結合を保持し、ここでＩｇＧ４シャフリングは、前記１または２以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含む抗体に比べて低減されている。

特定の態様において、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体は、以下を含む：（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖領域を含む重鎖；および（ｉｉ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸位置２２８でのセリンからプロリンへのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４重鎖定常領域。

特定の態様において、ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体は、以下を含む：（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ鎖領域；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖領域を含む重鎖；および（ｉｉｉ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸位置２２８でのセリンからプロリンへのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４重鎖定常領域。

一定の態様において、本明細書に記載のＩｇＧ４モノクローナル抗体は、本明細書に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ（例えば表３参照）および本明細書に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ（例えば表２参照）を含み、ここで抗体は、ＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、かつＩｇＧ４シャフリングを低減するヒンジ領域変異（例えば、ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸位置２２８でのセリンからプロリンへのアミノ酸置換）を有する。特定の態様において、ＩｇＧ４モノクローナル抗体はＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、以下を含む重鎖を含む：（ａ）配列番号８、９、および１０を含むＶＨ鎖領域；および（ｂ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸２２８において、セリンからプロリンへのアミノ酸置換を含む、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域。さらに好ましくは、抗体は、配列番号５、６、および７を含むＶＬ鎖領域を含む軽鎖をさらに含む。

以下の表２は、１５Ａ７Ｈのアミノ酸配列のＶＬ ＣＤＲ（特に、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３）を示す。以下の表３は、１５Ａ７Ｈのアミノ酸配列のＶＨ ＣＤＲ（特に、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３）を示す。特定の態様において、ヒトＰＳＧＬ−１（配列番号１１）に免疫特異的に結合する本明細書に記載のモノクローナル抗体は、表２のＶＬ ＣＤＲ配列を含む。特定の態様において、ヒトＰＳＧＬ−１（配列番号１１）に免疫特異的に結合する本明細書に記載のモノクローナル抗体は、表３のものから選択されるＶＨ ＣＤＲ配列を含む。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体はヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、以下を含む：（ｉ）配列番号５、配列番号６、および配列番号７のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む、可変軽（「ＶＬ」）鎖領域；（ｉｉ）配列番号８、配列番号９、および配列番号１０のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む、可変重（「ＶＨ」）鎖領域；および（ｉｉｉ）ヒンジ領域における１または２以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ４重鎖定常領域、ここで前記抗体は、前記ＰＳＧＬ−１に対する特異的結合を保持し、ここでＩｇＧ４シャフリングは、前記１または２以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含む抗体に比べて低減されている。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体はヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、かつ以下を含む：（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ鎖領域；（ｉｉ）配列番号８、配列番号９、および配列番号１０のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨ鎖領域；および（ｉｉｉ）ヒンジ領域における１または２以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ４重鎖定常領域、ここで前記抗体は、前記ＰＳＧＬ−１に対する特異的結合を保持し、ここでＩｇＧ４シャフリングは、前記１または２以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含む抗体に比べて低減されている。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体はヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、かつ以下を含む：（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ鎖領域；（ｉｉ）配列番号８、配列番号９、および配列番号１０のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ鎖領域を含む重鎖；および（ｉｉｉ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸位置２２８において、セリンからプロリンへのアミノ酸置換を含む、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体はヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、かつ以下を含む：（ｉ）配列番号５、配列番号６、および配列番号７のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖領域；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖領域；および（ｉｉｉ）ヒンジ領域における１または２以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧ４ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ４重鎖定常領域、ここで前記抗体は、前記ＰＳＧＬ−１に対する特異的結合を保持し、ここでＩｇＧ４シャフリングは、前記１または２以上のアミノ酸置換を含まないＩｇＧ４ヒンジ領域を含む抗体に比べて低減されている。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体はヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、かつ以下を含む：（ｉ）配列番号５、配列番号６、および配列番号７のアミノ酸配列をそれぞれ有するＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬ鎖領域；（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖領域を含む重鎖；および（ｉｉｉ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸位置２２８において、セリンからプロリンへのアミノ酸置換を含む、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域。

特定の態様において、ＰＳＧＬ−１、例えば配列番号１１のヒトＰＳＧＬ−１ポリペプチドに免疫特異的に結合する本明細書に記載の抗体は、フレームワーク領域（例えばＶＬドメインおよびＶＨドメインのフレームワーク領域）を含む。ヒトフレームワーク領域の非限定的例は、当分野に記載されており、例えばKabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと。
以下の表４は、抗体１５Ａ７ＨのＶＬフレームワーク（ＦＲ）アミノ酸配列（特に、ＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、ＶＬ ＦＲ３、およびＶＬ ＦＲ４配列）を示す。以下の表５は、抗体１５Ａ７ＨのＶＨ ＦＲアミノ酸配列（特に、ＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、およびＶＨ ＦＲ４配列）を示す。

一定の態様において、ＩｇＧ４シャフリングを低減するヒンジ領域における変異を有する上記のＩｇＧ４抗体は、本明細書に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ ＦＲを含む（表４参照）。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、表１および３のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＶＬ鎖領域を含む。

一定の態様において、ＩｇＧ４シャフリングを低減するヒンジ領域における変異を有する上記のＩｇＧ４抗体は、本明細書に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ ＦＲを含む（表５参照）。特定の態様において、抗体は、表２および４のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＶＨ鎖領域を含む。

別の特定の態様において、本明細書に記載のＩｇＧ４モノクローナル抗体は、以下：（ｉ）アミノ酸配列１３、１４、１５、および１６をそれぞれ有するＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、ＶＬ ＦＲ３、およびＶＬ ＦＲ４を含むＶＬ鎖領域；および（ｉｉ）アミノ酸配列１７、１８、１９、および２０をそれぞれ有するＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、およびＶＨ ＦＲ４を含むＶＨ鎖領域、を含み、かつＩｇＧ４シャフリングを低減するヒンジ領域における変異を有する。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、アミノ酸配列１３、１４、１５、および１６をそれぞれ有するＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、ＶＬ ＦＲ３、およびＶＬ ＦＲ４を含むＶＬ鎖領域を含む。別の特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、アミノ酸配列１７、１８、１９、および２０をそれぞれ有するＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、およびＶＨ ＦＲ４を含むＶＨ鎖領域を含む。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体の定常領域のグリコシル化は修飾することができる。例えば、抗体の非グリコシル化（aglycosylated）された定常領域を作ることができ（すなわち、抗体定常領域はグリコシル化を欠いている）、または、１または２以上のグリコシル化部位におけるグリコシル化を取り除くために、１または２以上のグリコシル化部位における変異または置換を含む抗体の定常領域を作ることができる。

グリコシル化は、Ｎ−結合型（またはアスパラギン結合型）グリコシル化またはＯ−結合型グリコシル化を介して行うことができる。Ｎ−結合型グリコシル化は、ポリペプチド中のアスパラギンアミノ酸の側鎖ＮＨ_２基における炭水化物修飾を含む。Ｏ−結合型グリコシル化は、セリン、スレオニン、またはヒドロキシリシンアミノ酸の側鎖のヒドロキシル基における炭水化物修飾を含む。

特定の態様において、非グリコシル化抗体は、必要なグリコシル化機構を欠いた細菌細胞で産生することができる。改変グリコシル化機構を有する細胞は当技術分野において記載されており、本明細書に記載の組換え抗体を発現し、これにより変化したグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として、使用することができる。例えば、Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1；および欧州特許第EP 1,176,195号；ＰＣＴ公開WO 03/035835；WO 99/54342を参照。

一定の態様において、１または２以上の修飾を本明細書に記載の抗体のＦｃ領域に作り、一般に、抗体の１または２以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞障害性などを変化させることができる。これらの修飾は当技術分野において公知であり、例えば、国際特許出願公開WO 2008/153926 A2に記載されている。かかる修飾の例としては、限定することなく以下が挙げられる：１）ヒンジ領域におけるシステイン残基の数を変化させて、軽鎖および重鎖の組み立てを容易にし、または抗体の安定性を増加もしくは減少させること；２）抗体のＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域における１または２以上のアミノ酸を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させること；３）KabatのＥＵインデックスに従ったアミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１または２以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基により置き換えて、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するようにすること；および／または４）KabatのＥＵインデックスに従った次の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の、１または２以上のアミノ酸を修飾して、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させ、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大させること。本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、ＰＳＧＬ−１活性を調節することができる、抗体および抗体由来抗原結合断片である。一定の態様において、本明細書で提供される抗体および抗体由来抗原結合断片は、ＰＳＧＬ−１のＰ−セレクチンへの結合を阻害することなくＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。ＰＳＧＬ−１活性は、当分野で知られているか記載されているＰＳＧＬ−１の任意の活性に関連することができ、例えば、炎症反応の間のＴ細胞の活性化である。ＰＳＧＬ−１活性またはＰＳＧＬ−１機能は、本明細書において互換的に使用される。一定の態様において、ＰＳＧＬ−１活性は、ＰＳＧＬ−１に結合するＰＳＧＬ−１リガンド（例えば、Ｐ−セレクチン）によって誘導される。

一定の態様において、本明細書に記載の抗ＰＳＧＬ−１抗体または抗体由来抗原結合断片は、Ｐ−セレクチンのＰＳＧＬ−１への結合をブロックまたは阻害しない。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、炎症反応の間の白血球動員を低減する。

一定の側面において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、ＰＳＧＬ−１を発現しＰＳＧＬ−１活性シグナル伝達に応答する細胞（例えば、ＰＳＧＬ−１リガンド刺激、ＰＳＧＬ−１シグナル伝達またはセレクチン結合に応答して増殖する細胞）の生存を低減または阻害し、例えば、活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。細胞生存アッセイは当該分野において記載されており、当業者により容易に行うことができる。例えば細胞生存率は、当該技術分野で知られているトリパンブルー染色またはその他の細胞死もしくは生存マーカーを用いて評価することができる（例えば、アネキシン−１、プロピジウムヨウ素（ＰＩ）または７−ＡＡＤ；Gerber A, Bohne M, Rasch J, Struy H, Ansorge S, Gollnick H., 2000. Investigation of annexin V binding to lymphocytes after extracorporeal photoimmunotherapy as an early marker of apoptosis. Dermatology. 2000;201(2):111-7；Coder, D. M. 2001. Assessment of Cell Viability. Current Protocols in Cytometry. 9.2.1-9.2.14およびMuppidi, J., Porter, M. and Siegel, R. M. 2004. Measurement of Apoptosis and Other Forms of Cell Death. Current Protocols in Immunology. 59:3.17.1-3.17.36を参照）。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、ＰＳＧＬ−１に特異的に結合し、本明細書に記載のまたは当業者に知られている方法（例えば、トリパンブルー排除アッセイ、Coder, D. M. 2001. Assessment of Cell Viability. Current Protocols in Cytometry. 9.2.1-9.2.14を参照）により評価されるように、活性化Ｔ細胞の生存を阻害する（例えば、部分的または完全に阻害する）。いくつかの態様において、用語「阻害する」または「阻害」は、活性化Ｔ細胞の生存の低減または防止を意味する。活性化Ｔ細胞の生存率は、対照（例えば、本明細書に記載の抗体の不在における、または非特異的抗体の存在下での、Ｔ細胞の生存）と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％またはそれ以上、低減することができる。

一定の側面において、本明細書に記載の抗ＰＳＧＬ−１抗体は、ＰＳＧＬ−１を発現する活性化Ｔ細胞のアポトーシス（すなわち、プログラムされた細胞死）を誘導することができる。アポトーシスアッセイは当該分野で記載されており、当業者が容易に行うことができる（例えば、Muppidi, J., Porter, M. and Siegel, R. M. 2004. Measurement of Apoptosis and Other Forms of Cell Death. Current Protocols in Immunology. 59:3.17.1-3.17.36を参照）。用語「誘導する」または「誘導すること」は、アポトーシスの開始または対照レベルを上回るアポトーシスの増加を意味する。活性化Ｔ細胞のアポトーシスは、対照（例えば、本明細書に記載の抗体の不在における、または非特異的抗体の存在下での、活性化Ｔ細胞のアポトーシス）と比較して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１２５％、約１５０％またはそれ以上、誘導することができる。

ＰＳＧＬ−１活性と関連する、本明細書に記載のアッセイでの使用に適したＴ細胞およびＴ細胞株は、容易に利用可能であり（例えば、ＡＲＲ、ＤＵ．５２８、Ｊａｒｋａｔ、Ｈ−ＳＢ２、ＲＰＭＩ８４０２、ＣＭＬ−Ｔ１、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７／ＳＫＷ−３、ＳＵＰ−Ｔ１、ＳＵＰ−Ｔ３、ＭＯＬＴ３／４、Ｐ１２−Ｉｃｈｉｋａｗａ、ＰＦ−３８２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｋ−Ｔ１、ＴＡＬＬ−１、 ＭＯＬＴ １６／１７、ＴＡＬＬ−１０４、ＤＮＤ−４１、Ｌｏｕｃｙ、ＭＯＬＴ １３、Ｐｅｅｒ／Ｂｅ１３、ＨＵＴ７８／Ｈ９、ＨＵＴ１０２、ＭＴ−１、ＤＥＬ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９、ＳＵ−ＤＨＬ１、１２Ｈ５、３ＤＯ５４．８、３ＤＯ１１．１０、８ＤＯ５１．１５、または３ＤＯ１８．３）、または、当分野で公知の方法を用いて容易に同定することができる（例えば、Thornton, A. M. 2003. Fractionation of T and B Cells Using Magnetic Beads. Current Protocols in Immunology. 55:3.5A.1-3.5A.11；Hathcock, K. 2001. T Cell Enrichment by Cytotoxic Elimination of B Cells and Accessory Cells. Current Protocols in Immunology. 00:3.3.1-3.3.5；Horgan, K., Shaw, S. and Boirivant, M. 2009. Immunomagnetic Purification of T Cell Subpopulations. Current Protocols in Immunology. 85:7.4.1-7.4.9；Kanof, M. E. 2001. Purification of T Cell Subpopulations. Current Protocols in Immunology. 00:7.3.1-7.3.5参照）。特定の態様において、細胞増殖アッセイにおける使用のための細胞または細胞株は、内因的にまたは組換えによって、ＰＳＧＬ−１を発現することができる。細胞生存アッセイに使用する細胞または細胞株は、内因的にまたは組換えによってＰＳＧＬ−１を発現し、ＰＳＧＬ−１リガンドまたは抗ＰＳＧＬ−１抗体結合に応答して、細胞生存率の変化を示すことができる。アポトーシスアッセイにおける使用のための細胞または細胞株は、内因的にまたは組換えによってＰＳＧＬ−１を発現し、ＰＳＧＬ−１リガンドまたは抗ＰＳＧＬ−１抗体結合に応答して、アポトーシスに変化を及ぼすことができる。好ましくは、細胞または細胞株はヒトのものである（例えば、ＡＲＲ、ＤＵ．５２８、Ｊｕｒｋａｔ、Ｈ−ＳＢ２、ＲＰＭＩ８４０２、ＣＭＬ−Ｔ１、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７／ＳＫＷ−３、ＳＵＰ−Ｔ１、ＳＵＰ−Ｔ３、ＭＯＬＴ３／４、Ｐ１２−Ｉｃｈｉｋａｗａ、ＰＦ−３８２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｋ−Ｔ１、ＴＡＬＬ−１、ＭＯＬＴ１６／１７、ＴＡＬＬ−１０４、ＤＮＤ−４１、Ｌｏｕｃｙ、ＭＯＬＴ１３、Ｐｅｅｒ／Ｂｅ１３、ＨＵＴ７８／Ｈ９、ＨＵＴ１０２、ＭＴ−１、ＤＥＬ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ２９９、またはＳＵ−ＤＨＬ１）。

抗体の、その標的抗原に対する免疫特異的結合を決定するための方法は、容易に利用可能であり、当該分野で記載されている。例えば、抗体の、その標的抗原に対する親和性および結合特性は、当該分野で公知の種々のin vitroのアッセイ方法（生化学または免疫学ベースのアッセイ）により決定することができ、例えば平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動力学（例えば、Biacore(登録商標)分析）、および間接的結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、免疫沈降、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）などのその他の方法である。これらの方法および他の方法は、試験する１または２以上の成分上の標識を利用し、および／または、発色性、蛍光、発光または同位体標識を含むがこれに限定されない種々の検出法を用いることができる。一定の態様においては、標識の使用は必要ではなく、例えばBiacore(登録商標)システムは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の自然現象を利用して、標識を使用することなくリアルタイムでデータを送達する。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体は単離されている。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は精製される。特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、組換えモノクローナル抗体である。

特定の態様において、本明細書で提供されるのは、大規模な製造のための適切な方法で修飾された抗体または抗体由来抗原結合断片である。これには、１または２以上のＣＤＲまたはＦＲなどの、抗ＰＳＧＬ−１抗体の必要なドメインをコードするポリヌクレオチド配列の、これもまた好適な定常領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む好適な発現ベクター中へのクローニングを含むことができ、こうして抗体全体が産生される。発現ベクターによって提供されるポリヌクレオチド配列は、抗体の収率および細胞培養の製造条件および精製プロセスのための安定性を最大にするように最適化することができる、ヌクレオチド配列である。
６．２ ポリヌクレオチド

一定の側面において、本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１抗原に免疫特異的に結合する本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および宿主細胞内（例えば、大腸菌などの微生物、およびマウスハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、および３Ｔ３線維芽細胞などの哺乳動物細胞）での組換え発現のためのかかるポリヌクレオチドを含むベクターである。本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される任意の抗体またはその抗体由来抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに、かかるポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば哺乳動物細胞などの宿主細胞内でのそれらの効率的発現のための発現ベクターである。特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、単離または精製されている。

特定の側面において、本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む、抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。

特定の態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖をコードする。

ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の抗体のＶＨ ＦＲおよびＣＤＲを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み（例えば表２および４を参照）、さらに、ＩｇＧ４シャフリングを低減するヒンジ領域における変異をさらに含むことができる。

本明細書でさらに提供されるのは、配列番号２を含む抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドであって、例えばコドン／ＲＮＡの最適化、異種シグナル配列による置き換え、およびｍＲＮＡの不安定要素の除去によって、最適化されているものである。本明細書でさらに提供されるのは、配列番号１を含む抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、例えばコドン／ＲＮＡの最適化、異種シグナル配列による置き換え、およびｍＲＮＡの不安定要素の除去によって、最適化されているものである。組換え発現のための、抗体または抗体由来抗原結合断片をコードする最適化核酸を生成するための方法であって、コドン変化を導入および／またはｍＲＮＡ中の阻害領域を排除することによる前記方法は、例えば米国特許第5,965,726号；第6,174,666号；第6,291,664号；第6,414,132号；および第6,794,498号に記載の最適化方法を適合させることにより行うことができる。例えば、ＲＮＡ内の潜在的スプライス部位および不安定要素（例えば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕリッチ要素）は、組換え発現のためのＲＮＡの安定性を増加させるために、核酸配列によってコードされるアミノ酸を変更することなく、変異させることができる。改変は、例えば同一のアミノ酸のための代替のコドンを用いて、遺伝コードの縮重などを利用する。いくつかの態様では、１または２以上のコドンを改変して保存的変異をコードすることが、例えば、元のアミノ酸と同様の化学構造および特性および／または機能を有する類似のアミノ酸をコードすることが、望ましい場合もある。かかる方法は、最適化されていないポリヌクレオチドによりコードされる抗ＰＳＧＬ−１抗体の発現と比べて、抗ＰＳＧＬ−１抗体またはその抗原結合断片の発現を増加させることができる。また、ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞における好ましいコドンの使用、例えば、大腸菌コドンの使用またはＣＨＯコドンの使用と適合するように、設計することができる。

本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列に、ハイブリダイズすることができる。特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードする最適化されていないヌクレオチド配列に、高ストリンジェンシー、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は記載されており、例えば米国特許出願公開US 2005/0048549（例えば段落７２〜７３）を参照；これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

当技術分野で公知の任意の方法により、ポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片、およびこれら抗体または抗体由来抗原結合断片の修飾バージョンをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、抗体または抗体由来抗原結合断片をコードする核酸を生成するようなやり方で、作ることができる。抗体をコードするかかるポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドから作ることができ（例えばKutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242に記載のようにして）、これには例えば、抗体または抗体由来の抗原結合断片をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、次いでライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が関与する。オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を生成するための種々の方法は、当技術分野で知られている。

代替的に、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源（例えば、ハイブリドーマ）からの核酸から、当該分野で知られた方法を用いて（例えば、ＰＣＲおよび他の分子クローニング法）、生成することができる。例えば、既知の配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅を、目的の抗体を産生する細胞、たとえばハイブリドーマ細胞から得たゲノムＤＮＡを用いて行うことができる。かかるＰＣＲ増幅法を用いて、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする配列を含む核酸を得ることができる。かかるＰＣＲ増幅法を用いて、抗体の可変軽鎖領域および／または可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を得ることができる。増幅された核酸は、宿主細胞における発現のため、およびさらなるクローニングのためにベクターにクローニングして、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体を生成することができる。定常鎖は、通常は抗体軽鎖のためのカッパまたはラムダであり、抗体重鎖のためには、限定はされないが、任意のＩｇＧアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、または対立遺伝子変異体を含むその他の免疫グロブリンであることができる。

特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手できないが、抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、当分野で知られている任意の方法を用いて、化学的に合成して複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。

本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離して配列決定することができる（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に導入され、次いで、 大腸菌細胞、酵母（Pichia, Saccharomyces）、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞（ＮＳ０）、それ以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない昆虫細胞または植物細胞などの、原核生物または真核生物の宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞における抗体または抗体由来抗原結合断片の合成を得ることができる。
６．３ 宿主細胞および抗体の組み換え発現

一定の側面において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片および関連する発現ベクターを、組換えにより発現する宿主細胞である。本明細書で提供されるのは、原核生物および真核生物宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞における組換え発現のための、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を組換えにより発現するための、かかる発現ベクターを含む宿主細胞である。特定の側面において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を産生するための方法であって、かかる抗体または抗体由来抗原結合断片を宿主細胞から発現することを含む、前記方法である。

ＰＳＧＬ−１抗原に免疫特異的に結合する、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の組み換え発現には、抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が関与する。本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが得られれば、該抗体または抗体由来抗原結合断片の産生のためのベクターを、当分野で周知の技術を用いて、組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。したがって、抗体または抗体由来抗原結合断片を、ヌクレオチド配列（単数または複数）をコードする抗体または抗体由来抗原結合断片を含有するポリヌクレオチドを発現することにより調製する方法が、本明細書に記載される。当業者に周知の方法を用いて、抗体をコードする配列または抗体由来抗原結合断片をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを、構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。さらに提供されるのは、本明細書に記載の抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、または抗体由来の抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターであって、プロモーターに、特に哺乳動物細胞での発現のために提供されたプロモーターに、作動可能に連結されているものである。かかるベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、国際公開WO 86/05807およびWO 89/01036；および米国特許第5,122,464号を参照）、抗体の可変ドメインを、全重鎖、全軽鎖、または全重鎖および軽鎖の両方の発現のために、かかるベクターにクローニングすることができる。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＥＢＶ由来エピソーム、人工染色体などが挙げられる。発現ベクターおよび発現制御配列は、宿主細胞に適合するように選択される。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、非免疫グロブリンタンパク質からの異種ペプチド、または人工ペプチドであってよい。

発現ベクターは、当技術分野で知られている従来の技術によって宿主細胞に移行され（例えば、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリカチオン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム析出、エレクトロポレーション、ウイルスベクターによる移行）、次いでトランスフェクトされた細胞を従来の技術によって培養して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を産生する。したがって、本明細書で提供されるのは、異種プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。二本鎖抗体の発現のための一定の態様において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中で同時発現させることができる。一定の態様において、宿主細胞は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターを含む。特定の態様において、宿主細胞は、２つの異なるベクター、すなわち本明細書に記載の抗体またはその断片（例えばその抗原結合断片）の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および本明細書に記載の抗体またはその断片（例えばその抗原結合断片）の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。別の態様において、第１の宿主細胞は、本明細書に記載の抗体またはその断片の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の宿主細胞は、本明細書に記載の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。

種々の宿主発現ベクター系を用いて、本明細書に記載の抗体分子または抗体由来抗原結合断片を発現することができる（例えば、米国特許第5,807,715号および米国特許第7604800号を参照）。かかる宿主発現系は、これによって関心のあるコード配列が産生され続いて精製されるところのビヒクルを表すのみでなく、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、本明細書に記載の抗体分子または抗体由来抗原結合断片をin situで発現し得る細胞も表すことができる。これらには、限定はされないが以下が挙げられる：抗体コード配列または抗体由来抗原結合断片コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された、細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）などの微生物；抗体コード配列または抗体由来抗原結合断片コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された、酵母（例えばSaccharomyces、Pichia）；抗体コード配列または抗体由来抗原結合断片コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した、昆虫細胞系；抗体コード配列または抗体由来抗原結合断片コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞系（例えばChlamydomonas reinhardtiiなどの緑藻類）；または、哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、アクチンプロモーター）または哺乳動物ウイルス（アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＣＭＶ、サルウイルス４０）に由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む組換え発現コンストラクトを保有する、哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞）。真核細胞における発現のための他の調節要素は、ＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０後期または初期ポリＡなどのポリアデニル化シグナルである。あるいは、免疫グロブリンまたは他の遺伝子のポリアデニル化シグナルを使用することができる。別の特定の態様では、真核細胞は、特に本明細書に記載のＩｇＧ４モノクローナル抗体の発現のために、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片の発現のために使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せて、抗体の有効な発現系である（Foecking et al., 1986, Gene 45:101; and Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2）。一定の態様において、本明細書に記載の抗体は、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞により産生される。一定の態様において、ＰＳＧＬ−１抗原に免疫特異的に結合する本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節される。

細菌系において、多くの発現ベクターを、発現が意図される抗体分子の用途に応じて有利に選択することができる。例えば、大量のかかる抗体または抗体由来抗原結合断片を、抗体分子または抗体由来抗原結合断片の医薬組成物を生成するために産生する場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましい。

さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節し、または、所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾および処理するように、選択することができる。かかる修飾（例えば、グリコシル化）およびタンパク質産物のプロセシングは、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対して、特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主細胞を、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いることができる。かかる哺乳動物宿主細胞としては、限定することなく以下を含む：ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０９（いかなる免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓ細胞。一定の態様において、本明細書に記載の抗体またはその抗体由来抗原結合性断片は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において産生される。

組換え抗体または抗体由来抗原結合断片の長期の高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、安定に抗体分子または抗体由来抗原結合断片を発現する哺乳動物細胞株を、操作することができる。ウイルス起源の複製を含む発現ベクターを用いるよりも、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、非選択培地中で１〜２日間増殖させることができ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が安定的にその染色体にプラスミドを統合することを可能とする。単一細胞クローニング後、細胞を産生細胞株に拡張する。この方法は、有利には、抗体分子または抗体由来抗原結合断片を発現する細胞株を操作するために使用することができる。かかる操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。

多くの選択系を用いることができ、これには限定することなく以下を含む：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11:223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（S Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17）遺伝子を、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、以下の遺伝子の選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を付与する（Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357；O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する（Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-2 15）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Santerre et al., 1984, Gene 30:147）。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られている方法を、所望の組換えクローンを選択するためにルーチンに適用することができ、かかる方法は、例えば以下に記載されている：Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)；およびDracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994) の１２，１３章、；Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1；これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

抗体分子または抗体由来抗原結合断片の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる（概説として、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)を参照）。抗体または抗体由来抗原結合断片を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅された領域は、抗体または抗体由来抗原結合断片遺伝子と関連しているため、抗体または抗体由来抗原結合断片の産生もまた増加する（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。

宿主細胞は、本明細書に記載の１または２以上の発現ベクターにより同時トランスフェクトすることができ、ここで第１のベクターは重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードする。２つのベクターは、同一の選択可能マーカーまたは異なる選択マーカーを含有することができ、これにより、重鎖および軽鎖ポリペプチドの十分な発現を可能にする。宿主細胞は、異なる量の２または３以上の発現ベクターで同時トランスフェクトすることができる。

代替的に、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードして発現することができる、単一のベクターを用いることができる。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。発現ベクターは、モノシストロン性またはマルチシストロン性であることができる。例えば、２シストロン性核酸コンストラクトは、次の順序で、プロモーター、本明細書に記載の抗体の重鎖、および本明細書に記載の抗体の軽鎖を含むことができる。かかる発現ベクターにおいて、両方の鎖の転写はプロモーターによって駆動することができ、一方で、重鎖からのｍＲＮＡの翻訳はキャップ依存性の走査機構によることができるのに対し、軽鎖からのｍＲＮＡの翻訳はキャップ非依存性の機構によって、例えばＩＲＥＳによって行うことができる。

いくつかの態様において、抗体分子または抗体由来抗原結合断片は、宿主細胞内の分子の高発現を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。いくつかの態様において、分子は哺乳動物細胞において、例えば無血清培地中または化学的に明確な培地中のＣＨＯ細胞において、発現される。いくつかの態様において、抗体分子または抗体由来抗原結合性断片は、培養培地から分泌ポリペプチドとして回収されるか、または、例えば分泌シグナルなしで発現させた場合には、宿主細胞溶解物から回収することができる。

本明細書に記載の抗体分子または抗体由来抗原結合断片が、組換え発現により一旦産生されると、それは、当該分野で免疫グロブリン分子の精製のために知られている任意の方法によって精製することができ、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対するアフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、沈殿、濾過、逆相ＨＰＬＣ、または分子の実質的に均質で生物学的に活性な製剤を得るためのタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製することができる。さらに、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、異種ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易にすることができる。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、単離または精製されている。例えば、特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の製剤は、細胞物質、培地成分および／または化学的前駆体を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、抗体または抗体由来抗原結合断片の製剤であって、該抗体または抗体由来抗原結合断片が、これが単離または組み換え的に産生されたところの細胞の細胞成分から分離されている前記製剤を含む。抗体または抗体由来抗原結合断片が組換え的に産生される場合、これは一般的に、培養培地を実質的に含まず、すなわち培養培地は、タンパク質製剤の体積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％または０．１％未満である。抗体または抗体由来抗原結合断片が化学合成により製造される場合、それは一般的に化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、抗体または抗体由来抗原結合断片のかかる製剤は、目的の抗体または目的の抗体由来抗原結合断片以外の化学的前駆体または化合物を、約３０％、２０％、１０％、５％未満（乾燥重量で）で有する。
６．４ 医薬組成物

本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を含む、組成物、医薬組成物である。特定の側面において、本明細書に記載の組成物は、in vitro、in vivo、またはex vivoで使用することができる。特定の態様において本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む、医薬組成物である。

本明細書で提供される抗体または抗体由来抗原結合断片を含む治療用組成物は、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、貯蔵用に調製することができる（Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA；Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD）。許容し得る担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、無水クエン酸ナトリウム、および他の有機酸などの緩衝液；および／またはTWEEN(登録商標)、PLURONICS(登録商標)等の非イオン性界面活性剤またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

本明細書に記載のものなどの組成物はまた、処置される特定の徴候の必要に応じて、１より多くの活性化合物（例えば、分子、例えば本明細書に記載の１つの抗体または複数抗体）を含むことができる。一定の態様において、製剤は、本明細書で提供される抗体または抗体由来抗原結合断片および、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する１または２以上の活性化合物を含む。かかる分子は、意図する目的に有効な量において組み合わせて適切に存在する。例えば、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、１または２以上の他の治療剤と組み合わせることができる。かかる併用療法は、患者に対して、連続的に、または同時にまたは順番に投与することができる。

in vivo投与に使用される組成物は、無菌であることができる。これは、例えば滅菌濾過膜を通す濾過などによって容易に達成される。

特定の側面において、本明細書で提供される医薬組成物は、治療有効量の本明細書で提供される抗体または抗体由来抗原結合断片、および任意に１または２以上の追加の予防剤または治療剤を、薬学的に許容される担体中に含む。かかる医薬組成物は、乾癬などの本明細書に記載の障害または疾患、またはその１もしくは２以上の症状の、予防および／または処置に有用である。「治療有効量」という用語は、安全で、疾患を予防または処置するのに十分な量を指す。本明細書で用いる場合、用語「処置する」、「処置された」または「処置すること」または「処置」は、疾患を有する対象に、有益または所望の臨床結果をもたらすことを意味するために使用される。有益または所望の臨床結果としては、限定はされないが、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定な状態（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延または緩徐、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的を問わず）を含み、検出可能または検出不可能かどうかは問わない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較して、生存期間の延長を意味することができる。

本明細書で提供される抗体または抗体由来抗原結合断片の投与に適した医薬担体は、投与の特定の様式に適することが当業者に知られている、任意のかかる担体を含む。一態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片は、例えば非経口投与用の無菌液剤または懸濁剤などの、適当な医薬製剤に製剤化される。

また、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、組成物中の唯一の薬学的活性成分として製剤化することができ、または他の活性成分（１または２以上の他の予防剤または治療剤など）と組み合わせることができる。

組成物において、本明細書で提供される抗体または抗体由来抗原結合断片は、好適な医薬担体と混合される。組成物中の抗体または抗体由来抗原結合断片の濃度は、例えば、投与されると、本明細書に記載の障害または疾患（例えば炎症性障害）またはその症状を予防および／または処置する量を送達するのに、有効であることができる。

一態様において、組成物は、単回投与用に製剤化される。組成物を製剤化するために、化合物の重量分率は、障害を緩和、処置し、または１もしくは２以上の症状を改善するような有効濃度で、選択された担体中に溶解、懸濁、分散され、または他の方法で混合される。

一定の側面において、本明細書で提供される抗体または抗体由来抗原結合断片は、処置する患者に対して望ましくない副作用がないか、または副作用が最小限もしくは無視できる状態で、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な有効量において、薬学的に許容される担体に含有される。治療有効濃度は、経験的に、ルーチンの方法を用いてin vitroおよびin vivo系において化合物を試験し、次にこれからヒトへの投与量について外挿することによって、決定することができる。

医薬組成物中の抗体または抗体由来抗原結合断片の濃度は、例えば、抗体または抗体由来抗原結合断片の物理化学的特性、投与スケジュール、および投与する量ならびに当業者に公知の他の因子に依存するであろう。

別の態様において医薬組成物は、１日体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇの抗体または抗体由来抗原結合断片の用量を提供する。医薬投与単位形態は、約０．００１ｍｇから約１００ｍｇを、および／または投与単位形態当たり他の任意の必須成分との組み合わせで提供するように調製することができる。特定の態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片は、４０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化される。

抗体または抗体由来抗原結合断片は、１度に投与することができ、または時間間隔をあけて投与される多数のより少ない用量に分割することができる。正確な投与量および処置の期間は、処置される本明細書に記載の疾患または障害の関数であり、既知の試験プロトコルを用いて経験的に、またはin vivoもしくはin vitro試験データからの外挿によって、決定できることが理解される。濃度および投与量の値は、緩和すべき疾患または障害の重症度によっても変化し得ることに留意すべきである。さらに、任意の特定の対象について、具体的な投与レジメンは、個々のニーズと組成物の投与を管理または監督する人の専門的判断に従って、経時的に調整できることを理解すべきである。

医薬組成物は、ヒトおよび動物への投与のために単位剤形で、例えば、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の好適な量を含む無菌非経口液剤または懸濁剤として提供される。一態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片を製剤化し、単位剤形または複数の剤形で投与する。本明細書において単位用量形態は、ヒトおよび動物対象に適しかつ当該技術分野で知られているように個別に包装された、物理的に別個の単位を指す。各単位用量は、所望の治療効果を生じるのに十分な抗体または抗体由来抗原結合断片の所定の量を、必要な医薬担体、ビヒクルまたは希釈剤と共に含有する。単位用量形態の例としては、アンプルおよび注射器が挙げられる。単位用量形態は、その一部または複数を投与することができる。複数用量形態は、分離された単位投与形態で投与される、一つの容器に包装された複数の同一の単位剤形である。複数用量形態の例としては、バイアル、またはパイントもしくはガロンのボトルを含む。したがって、複数用量形態は、包装で分離されていない、複数の単位用量である。

一定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、液体医薬組成物である。液体の薬学的に投与可能な組成物は、本明細書に記載の抗体を、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなどの担体中に、溶解、分散、またはそれ以外で混合することにより調製することができ、それによって液剤または懸濁剤を形成する。所望であれば、投与される医薬組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、およびｐＨ緩衝剤などの非毒性補助物質を少量含有することができる。

かかる剤形を調製する実際の方法は当業者に知られているか、または明らかである；例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA；Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MDを参照。

抗体を、非毒性担体から構成されるバランスにおいて０．００５％〜９９．９％の範囲で含有する、剤形または組成物を調製することができる。これらの組成物の調製のための方法は当業者に知られている。

一態様において、非経口投与は注入を特徴とし、皮下、筋肉内または静脈内のいずれもが本明細書中で意図される。注射剤は、液体の液剤または懸濁剤、液体中の液剤もしくは懸濁剤に適した注射前の固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。注射剤、液剤およびエマルジョンは、１または２以上の賦形剤も含む。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。さらに、必要に応じて、投与される医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤、および他のかかる薬剤などの非毒性補助物質を、少量含有することができる。他の投与経路としては、腸内投与、脳内投与、経鼻投与、動脈内投与、心臓内投与、骨内注入、髄腔内投与、静脈内注入、皮下移植または注射、筋肉内投与、直腸内投与、膣内投与、胃内投与、気管内投与、肺内投与および腹腔内投与を含んでよい。

非経口投与のための製剤は、すぐに注射できる無菌液剤、使用直前に溶媒と組み合わせることができる、例えば凍結乾燥粉末などの無菌乾燥可溶性産物であって、すぐに注射できる無菌懸濁剤、使用直前にビヒクルと組み合わせることができる無菌乾燥不溶性産物、および無菌エマルジョンを含む。液剤は、水性または非水性のいずれかであり得る。

静脈内に投与する場合、好適な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、および、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。

非経口製剤に使用される薬学的に許容し得る担体としては、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、緩衝剤、酸化防止剤、局所麻酔剤、懸濁剤および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート剤および他の薬学的に許容し得る物質が含まれる。医薬担体にはまた、水混和性ビヒクルのためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール；およびｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含まれる。

一例として、抗体を含有する無菌水性液剤の静脈内または動脈内注入は、投与の効果的な様式である。別の態様は、所望の薬理学的効果をもたらすために必要に応じて注射される、活性物質を含む無菌の水性または油性液剤または懸濁剤である。

特定の態様において、医薬製剤は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸、ポリソルベート８０、および水を含む。特定の態様において、医薬製剤は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびクエン酸を含む。特定の態様において、医薬製剤は、９．１ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および０．９ｍＭのクエン酸を含む。特定の態様において、医薬製剤は、本明細書に記載の抗体またはそのコンジュゲートを、０．２６７ｍＭの濃度で含む。特定の態様において、医薬製剤は、２．６７６ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム、８．７６６ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２ｇ／Ｌのポリソルベート８０、および０．１８９ｇ／Ｌのクエン酸を含む。特定の態様において、医薬製剤は、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を、４０ｇ／Ｌの濃度で含む。好ましくは、前述の医薬製剤はｐＨ６．０である。

別の態様において、医薬組成物は、液剤、エマルジョンおよび他の混合物として投与するために再構成することができる、凍結乾燥粉末である。それらはまた、固体またはゲル剤として再構成および製剤化することができる。

凍結乾燥粉末は、適当な溶媒中に、本明細書で提供される抗体を溶解することによって調製される。いくつかの態様において、凍結乾燥粉末は無菌である。溶媒は、粉末または粉末から調製された再構成溶液の安定性やその他の薬理学的な成分を改善する、賦形剤を含むことができる。使用できる賦形剤としては、デキストロース、ソルビタール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適切な薬剤を含むが、これらに限定されるものではない。溶媒はまた、例えばクエン酸、リン酸ナトリウムまたはカリウム、または当業者に公知の他のかかる緩衝液などの緩衝液を、一態様においてはほぼ中性のｐＨにおいて、含むことができる。溶液のその後の滅菌濾過と、当業者に公知の標準条件下での凍結乾燥により、所望の製剤が提供される。一態様において、得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアルに分配される。各バイアルは、化合物の単回投与量または複数回投与量を含む。凍結乾燥粉末は、例えば約４℃から室温などの、適切な条件下で保存することができる。

注射用のこの凍結乾燥粉末の水による再構成は、非経口投与のための製剤を提供する。再構成のために、凍結乾燥粉末を滅菌水または他の適当な担体に添加する。正確な量は、選択された化合物に依存する。かかる量は、経験的に決定することができる。
６．５ 治療法

本明細書に記載の抗体および抗体由来抗原結合断片は、健常な個体または特定の障害または疾患を有しない個体において見出される活性化Ｔ細胞の増殖および／または数と比較して、活性化Ｔ細胞の増殖および／または数の増加に関連付けられているかこれに（全体的または部分的に）起因する障害および疾患を処置するのに有用である。かかる疾患および障害は、当業者に知られているか、または当業者によって確認することができる。特定の態様において、本明細書に記載の抗体および抗体由来抗原結合断片は、炎症性疾患または障害を処置するのに有用である。一態様において、炎症性疾患は自己免疫疾患である。特定の態様において、炎症性疾患または障害は、乾癬、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、クローン病および強直性脊椎炎である。

本明細書に記載の抗体および抗体由来抗原結合断片を用いて処置することができる障害および疾患の非限定的な例としては、以下である：乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、および乾癬性関節炎を含む）、糖尿病、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、シェーグレン症候群、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病リバーサル反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、純粋な赤血球貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、アトピー性アレルギーなどのアレルギー、ＡＩＤＳ、および白血病またはリンパ腫などのＴ細胞腫瘍（T cell neoplasms）。

さらに、抗体および抗体由来抗原結合断片は、健常な個体または特定の障害または疾患を有しない個体において見出される活性化Ｔ細胞の増殖および／または数と比較して、活性化Ｔ細胞の増殖および／または数の増加に関連付けられているかこれに（全体的または部分的に）起因する一定の障害および疾患を、予防および／または処置するのに有用である。本明細書に記載の抗体および抗体由来抗原結合断片を用いて予防および／または処置することができる障害および疾患の非限定的例としては、例えば骨髄移植、肝移植、腎移植、または任意の器官または組織の移植などの、移植片対宿主病および移植拒絶反応の症例（同種または異種組織を用いた移植拒絶反応を含む）が挙げられる。

したがって、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を用いて、本明細書に記載の疾患および障害を予防および処置するための方法である。特定の態様において、かかる方法は、それを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。特定の態様において、本明細書に記載の疾患または障害を処置するために投与される抗体は、１５Ａ７Ｈである。

一態様において、疾患または障害の「処置」、または「処置すること」とは、疾患または障害、またはその少なくとも一つの識別可能な症状の改善を意味する。別の態様において、「処置」または「処置すること」は、必ずしも対象によって認識可能ではない、疾患または障害に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。さらに別の態様において、「処置」または「処置すること」は、疾患または障害の進行を、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、物理的パラメータの安定化）、またはその両方で、阻害することを指す。

特定の態様において、本明細書に記載の処置方法は、本明細書に記載の疾患または障害の進行、重症度、および／または持続期間の低減または改善を提供する。さらなる特定の態様において、本明細書に記載の処置方法は、本明細書に記載の疾患または障害の１または２以上の症状を軽減する。

特定の態様において、本明細書に記載の障害または疾患を処置するための方法は、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量の投与により、以下の効果の少なくとも１、２、３、４またはそれ以上を達成することができる：（ｉ）障害または疾患、および／またはこれに関連する１または２以上の症状の、重症度の軽減または改善；（ｉｉ）障害または疾患に関連する１または２以上の症状の持続時間の低減；（ｉｉｉ）障害または疾患の再発の予防；（ｉｖ）障害または疾患、および／またはこれに関連する１または２以上の症状の退行；（ｖ）対象の入院の減少；（ｖｉ）入院期間の減少；（ｖｉｉ）対象の生存の増加；（ｖｉｉｉ）障害または疾患、および／またはこれに関連する１または２以上の症状の進行の阻害；（ｉｘ）別の治療の治療効果の増強または改善；（ｘ）障害または疾患の減少または排除；（ｘｉ）死亡率の減少；（ｘｉｉ）入院率の減少；（ｘｉｉｉ）障害または疾患に関連する１または２以上の症状の発達または発症の予防。

一態様において、障害または疾患の「予防」または「予防すること」とは、障害または疾患の発症または発達の、完全または部分的な阻害を意味する。

特定の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、乾癬である。一般に、Ｔリンパ球は乾癬の病因において重要な役割を果たすことが認められている。特定の態様において、乾癬を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、乾癬の１または２以上の症状を改善または予防するための方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。乾癬の症状としては、限定することなく、銀白色の鱗屑で覆われた皮膚の紅斑、皮膚の隆起変色部、皮膚の小さな落屑性斑点、乾燥肌、ひび割れた肌が挙げられ、膿疱、かゆみ肌、および肥厚した、へこんだ、または隆起した爪、腫れてこわばった関節なども含む。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、尋常性乾癬である。尋常性乾癬（plaque psoriasis）または尋常性乾癬（psoriasis vulgaris）は乾癬の最も一般的な形態であり、銀白色の鱗屑で覆われた、境界が明確で盛り上がった紅斑性皮膚斑を特徴としている。四肢、腰仙部、および頭皮の伸筋表面が関与する病変の好発が存在する。対応する病理組織学的所見としては、真皮と表皮の顕著な炎症性細胞浸潤、拡張した血管の数の増加、およびケラチノサイトが無秩序に分化した表皮の大幅な肥厚、および過角化症が挙げられる。尋常性乾癬の患者の約３分の１は、中程度または重度の疾患を有すると分類され、結果的に、単なる局所治療を越えた治療の候補である。

特定の態様において、尋常性乾癬を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、尋常性乾癬の１または２以上の症状を改善または予防するための方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。尋常性乾癬の症状としては、限定することなく、銀白色の鱗屑で覆われた皮膚の紅斑、皮膚の隆起した変色部、皮膚の小さな落屑性斑点、乾燥肌、ひび割れた肌が挙げられ、膿疱、かゆみ肌、および肥厚した、へこんだ、または隆起した爪、腫れてこわばった関節なども含む。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される障害は、慢性尋常性乾癬である。特定の態様において、慢性尋常性乾癬を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、慢性尋常性乾癬の１または２以上の症状を改善または予防するための本明細書に記載の方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。慢性尋常性乾癬の症状としては、限定することなく、膝、肘、腰仙領域、頭皮、および爪を含むがこれに限定されない身体の任意の部分の上の、硬貨サイズからそれより大きいサイズの、単一または複数の隆起して赤くなった皮膚の変色部を含む。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される障害は、滴状乾癬である。別の特定の態様において、滴状乾癬を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、滴状乾癬の１または２以上の症状を改善または予防するための方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。滴状乾癬の症状としては、限定することなく、皮膚の上の水滴形状の鱗状プラークのフレア（発赤）と、続く連鎖球菌咽頭感染などの感染である。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、逆位乾癬（inverse psoriasis）である。特定の態様において、逆位乾癬（intertiginous psoriasisおよびflexural psoriasisとも呼ばれる）を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、逆位乾癬の１または２以上の症状を改善または予防するための方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。逆位乾癬の症状としては、限定することなく、尋常性乾癬に関連する落屑とは異なり、以下の身体の部分：脇の下、鼠蹊部、胸の下、および性器や臀部周辺のその他の皮膚のひだの１または２以上における、滑らかで通常は湿った皮膚の領域が赤くなり炎症を起こしているものを含む。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、膿疱性乾癬である。特定の態様において、膿疱性乾癬を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、本明細書に記載の膿疱性乾癬の１または２以上の症状を改善または予防する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。膿疱性乾癬の症状としては、限定することなく、大きさや位置が異なるが多くは手と足の、膿のたまった膿疱を含む。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、乾癬性紅皮症である。特定の態様において、乾癬性紅皮症を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、本明細書に記載の乾癬性紅皮症の１または２以上の症状を改善または予防する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。乾癬性紅皮症の症状としては、限定することなく、皮膚の周期的な広範で燃えるような発赤および、小さな薄片というよりシート状の、鱗屑の脱落が挙げられる。皮膚の発赤および脱落には、多くの場合、激しいかゆみや痛み、心拍数増加、および体温の変動を伴う。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、関節リウマチである。特定の態様において、関節リウマチを処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、本明細書に記載の関節リウマチの１または２以上の症状を改善または予防する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。関節リウマチの症状としては、限定することなく以下が挙げられる：疲労、食欲不振、微熱、腺の腫れ、脱力；手首、肘、肩、腰、膝、足首、つま先、顎、手、足、指、および／または首の関節痛；朝のこわばり、呼吸時の胸痛（胸膜炎）、目の灼熱感、かゆみ、および目脂、皮膚の下の結節、しびれ、うずき、または手や足の灼熱感。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、クローン病である。特定の態様において、クローン病を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、本明細書に記載のクローン病の１または２以上の症状を改善または予防する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。クローン病の症状としては、限定することなく以下が挙げられる：痙攣性腹部（腹部領域）疼痛、発熱、疲労、食欲不振、便通時の疼痛（しぶり）、持続性の水様性下痢、意図的でない体重減少、便秘、眼の炎症、瘻孔（通常、直腸領域の周りで、膿、粘液、または便の排出を引き起こし得る）、関節痛、肝臓の炎症、口内炎、直腸出血および血便、皮膚のしこりまたはただれ（潰瘍）、腫れた歯茎。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、強直性脊椎炎である。特定の態様において、強直性脊椎炎を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、強直性脊椎炎の１または２以上の症状を改善または予防する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。強直性脊椎炎の症状としては、限定することなく以下が挙げられる：腰部および臀部、脊椎、および／または首の頻繁な痛みや凝り；および、肋骨、肩甲骨、腰、大腿やかかとに広がる疼痛および圧痛；眼の炎症（虹彩毛様体炎およびブドウ膜炎）に起因する、赤い眼、眼痛、視力低下、飛蚊症および羞明（まぶしがり症）；疲労；および吐気。

別の態様において、本明細書に記載の方法に従って処置される疾患または障害は、糖尿病である。特定の態様において、糖尿病を処置する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。別の特定の態様において、糖尿病の１または２以上の症状を改善または予防する方法は、これを必要とする対象に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の治療有効量を投与することを含む。糖尿病の症状としては、限定することなく以下が挙げられる：体重減少、多尿（頻尿）、多飲症（渇きの増加）、多食（飢餓の増加）、心血管疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、高浸透圧性非ケトン性状態、および糖尿病性ケトアシドーシス。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、１または２以上の別の治療を以前に受けたか、または現在受けている患者に投与される。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、１または２以上の別の治療を以前に受けたか、または現在受けている患者に投与される。他の特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、抗炎症療法に対して抵抗性または難治性であるか、またはそれが疑われる患者に投与される。

一定の側面において、本明細書で提供されるのは、必要とする個体においてＴ細胞を死滅させるための方法であって、ここで前記方法は、前記個体に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の有効量を投与することを含む。一定の側面において、本明細書で提供されるのは、必要とする個体において活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、ここで前記方法は、前記個体に対して、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の有効量を投与することを含む。

一定の側面において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片またはその医薬組成物は、任意の好適な方法により、必要とする対象に投与することができる。投与法の非限定的例としては、以下を含む：静脈内注入、皮下注射または移植、筋肉内、髄腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、または肺内送達、および／または、本明細書に記載されたかまたは当技術分野で知られている、任意の他の物理的送達。一態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片またはその医薬組成物は、それを必要とする対象に全身的に（例えば、非経口で）投与される。別の態様において、抗体またはその医薬組成物は、それを必要とする対象に局所的に（例えば、腫瘍内に）投与される。各用量は、同一の投与経路によって投与されてもされなくてもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、複数の投与経路を介して同時に、または本明細書に記載の同一もしくは異なる抗体の別の用量に続いて、投与することができる。

疾患またはその症状が処置されている場合、抗体または抗体由来抗原結合断片の投与は、典型的には、疾患またはその症状の発症後に行う。疾患の症状を予防する場合は、抗体または抗体由来抗原結合断片の投与は、典型的には症状の発症前に行う。

本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片またはその医薬組成物の投与量および投与頻度は、副作用を最小限に抑えつつ、予防および／または処置する方法に従って投与される。特定の対象に投与される本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片またはその医薬組成物の正確な投与量は、その処置を必要とする対象に関連する因子に照らして、医師により決定することができる。考慮され得る要因は、疾患状態の重症度、対象の一般的健康状態、対象の年齢および体重、食事、投与の時間および頻度、他の治療剤または薬物との組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答を含む。本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片またはその医薬組成物の投与量および投与頻度は、抗体または抗体由来抗原結合断片の十分なレベルを提供するため、または所望の効果を維持するために、経時的に調整することができる。

製剤に使用する正確な用量はまた、投与経路、および炎症性障害または疾患の重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。

有効用量は、in vitro試験または動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から外挿することができる。

一態様において、本明細書に記載の疾患または障害を予防および／または処置するために患者に投与される、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の投与量は、典型的には患者の体重１ｋｇ当たり、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。別の態様において、本明細書に記載の疾患または障害の予防および／または処置のために治療的に有効な抗体または抗体由来抗原結合断片の適切な投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の「有効量」は、以下の効果の少なくとも１、２、３、４、または５以上を達成するのに十分な、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の量を言う：（ｉ）本明細書に記載の疾患または障害および／またはこれに関連する１または２以上の症状の重症度の低減または改善：（ｉｉ）本明細書に記載の疾患または障害に関連する１または２以上の症状の持続時間の低減；（ｉｉｉ）疾患または障害の再発予防；（ｉｖ）疾患または障害および／またはこれに関連する１または２以上の症状の後退；（ｖ）対象の入院の低減；（ｖｉ）入院期間の低減；（ｖｉｉ）対象の生存の増加；（ｖｉｉｉ）疾患または障害および／またはこれに関連する１または２以上の症状の進行の阻害；（ｉｘ）別の治療の治療効果の増強または改善；（ｘ）疾患または障害の低減または消失；（ｘｉ）死亡率の減少；（ｘｉｉ）入院率の低下；（ｘｉｉｉ）疾患または障害に関連する１または２以上の症状の発達または発症の予防；および（ｘｉｖ）例えばアンケートなどの当該分野で周知の方法により評価された、生活の質の改善。いくつかの態様において、本明細書で使用する「有効量」は、本明細書に記載の抗体の、下記第６節に記載された特定の結果を達成する量を指す。一定の態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片の有効量は、約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇである。

いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の単回用量は、本明細書に記載の障害または疾患を予防および／または処置するために、患者に対して１または２回以上投与される。

特定の態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片またはその医薬組成物は、対象に対して、本明細書に提示される障害または疾患を予防および／または処置するための方法に従って周期的に投与され、ここで該抗体または抗体由来抗原結合断片または医薬組成物は、一定の期間投与され、その後休止の期間が続く（すなわち、抗体または抗体由来抗原結合断片または医薬組成物は、ある期間は投与されない）。

本明細書で提供される抗体または抗体由来抗原結合断片は、本明細書に記載の障害または疾患を予防および／または処置するために、１または２以上の追加の療法（例えば、薬剤）の投与の前に、これと当時に、またはその後に、投与することができる。「組み合わせて」という用語の使用は、抗体または抗体由来抗原結合断片および１または２以上の追加の療法が対象に投与される順序を制限しない。特定の態様において、療法は、連続的にまたは順番に投与することができる。

別の特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片は、別の療法（例えば、抗炎症剤）のある量と組み合わせて用いて、本明細書に記載の障害または疾患を予防および／または処置する。特定の態様において、かかる併用療法は相乗効果を有する。別の態様において、かかる組み合わせは相加効果を有する。

特定の態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片および追加の療法は、対象に対して、抗体または抗体由来抗原結合断片および／または追加の療法のより低い投与量（例えば、最適以下の用量）の使用を可能にし、および／または、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片または追加の療法のより少ない投与頻度を可能にする。一定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片および／または追加の療法のより低い投与量を利用する能力、および／または、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片または前記追加の療法をより少ない頻度で投与する能力は、本明細書に記載の障害または疾患の予防および／または処置において、対象に対する抗体または抗体由来抗原結合断片、または前記追加の療法に関連するそれぞれの毒性を、抗体または追加の療法それぞれの有効性を低減することなく、低下させる。いくつかの態様において、追加の療法と組み合わせた本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の投与は、本明細書に記載の障害または疾患の予防および／または処置における、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片および／または前記追加の療法の有効性の改善をもたらす。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片の投与および／または１または２以上の追加の療法は、任意の単一療法の使用に関連する有害または望ましくない副作用を、回避または低減する。

特定の態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を投与される対象は、動物（例えば、カニクイザルまたはヒト対象）である。好ましい態様において、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を投与される対象は、ヒトである。特定の態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片を投与される対象は、本明細書に記載の疾患または障害の１または２以上の症状を示す。
６．６ 細胞に基づく方法

本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１を発現する細胞においてアポトーシスを誘導または増強するための、細胞を本明細書に記載の抗体の有効量と接触させることを含む、方法である。一態様において、細胞は免疫細胞である。特定の態様において、細胞はＴ細胞である。さらに特定の態様において、細胞は、活性化Ｔ細胞である。アポトーシスを検出するための方法は当技術分野において記載されており、当業者により容易に行うことができる。特定の態様において、ＰＳＧＬ−１を発現する活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導または増強するための方法は、細胞を、本明細書に記載の抗体の有効量と接触させることを含み、ここで有効量は、当業者に知られている方法によって評価された場合に、アポトーシスを誘導または増強するのに十分な量である。

本明細書で提供されるのは、ＰＳＧＬ−１を発現する細胞の生存を低減または阻害するための、細胞を本明細書に記載の抗体の有効量と接触させることを含む、方法である。一態様において、細胞は免疫細胞である。特定の態様において、細胞はＴ細胞である。さらに特定の態様において、細胞は、活性化Ｔ細胞である。細胞生存アッセイは当技術分野において記載されており、当業者により容易に行うことができる。例えば、細胞生存率は、当分野で知られている、トリパンブルー染色または他の細胞死マーカー（例えば、アネキシン−５染色）、または生存マーカー（例えば、プロピジウムヨウ素または７−ＡＡＤ除外）を用いて、評価することができる。特定の態様において、ＰＳＧＬ−１を発現する活性化Ｔ細胞の生存を低減または阻害する方法は、細胞を、本明細書に記載の抗体の有効量と接触させることを含み、ここで有効量は、当業者に知られた方法（例えば、トリパンブルー除外アッセイまたはプロピジウムヨウ素または７−ＡＡＤ除外）によって評価された場合に、アポトーシスを低減または阻害するのに十分な量である。
６．７ キット

本明細書で提供されるのは、例えば本明細書で提供される抗体または抗体由来抗原結合断片などの本明細書に記載の医薬組成物の１または２以上の成分を充填した１または２以上の容器を含む、医薬パックまたはキットである。任意に、かかる１または２以上の容器に付随するのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であることができ、この通知は、ヒトへの投与用の製造、使用または販売についての機関による承認を反映するものである。

特定の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を含む第１の容器を含むキットである。特定の態様において、キットは、抗体または抗体由来抗原結合断片を真空下で凍結乾燥された無菌粉末として含むバイアルである、第１の容器を含み、キットはさらに、薬学的に許容し得る流体を含む第２の容器を含む。

特定の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片を含む注入装置である。特定の態様において、注入装置は、無菌溶液中の抗体を含む。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、注射器である。

本明細書でさらに提供されるのは、上記の方法に使用することができるキットである。一態様において、キットは、本明細書に記載の抗体または抗体由来抗原結合断片、好ましくは精製抗体を、１または２以上の容器内に含む。特定の態様において、本明細書に記載のキットは、実質的に単離されたＰＳＧＬ−１を対照として含む。別の特定の態様において、本明細書に記載のキットはさらに、ＰＳＧＬ−１と反応しない対照抗体を含む。別の特定の態様において、本明細書に記載のキットは、抗体または抗体由来抗原結合断片の、ＰＳＧＬ−１への結合を検出する、１または２以上の要素を含む（例えば、抗体または抗体由来抗原結合断片は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物などの検出可能な基質にコンジュゲートすることができ、または、第１の抗体または抗体由来抗原結合断片を認識する第２抗体が、検出可能な基質にコンジュゲートすることができる）。特定の態様において、キットは、組換え的に産生されたかまたは化学的に合成されたＰＳＧＬ−１を含むことができる。キットで提供されるＰＳＧＬ−１はまた、固体支持体に結合させることができる。さらに特定の態様において、上述のキットの検出手段は、ＰＳＧＬ−１が付着している固体支持体を含む。かかるキットはまた、付着していないレポーター標識抗ヒト抗体を含むことができる。この態様において、抗体または抗体由来抗原結合断片のＰＳＧＬ−１への結合は、前記レポーター標識抗体の結合により検出することができる。
７．例

この節（すなわち、６節）の例は例示のために提供されており、限定するものではない 。
７．１ 例１：抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体を生成する

抗体ｈ１５Ａ７は、２００５年１１月２４日に公開された国際出願公開WO 2005/110475に記載のヒト化１５Ａ７重鎖および軽鎖の可変領域を含んでおり、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ｈ１５Ａ７抗体は、カッパ型軽鎖を有するＩｇＧ４アイソタイプの抗体である。Ｓｅｒ^２２８→Ｐｒｏ^２２８変異は、ｈ１５Ａ７のヒンジ領域に変異原性プライマーを用いるＰＣＲによって導入した。得られたｈ１５Ａ７のヒンジ変異体は、本明細書において１５Ａ７Ｈと呼ばれる。１５Ａ７Ｈの残りのタンパク質配列はｈ１５Ａ７と同一である。１５Ａ７Ｈのアミノ酸配列は、図７Ａ〜Ｂに配列番号１および２として示されている：重鎖および軽鎖についての抗体をコードする遺伝子配列は、ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ１に由来する真核生物発現ベクターに導入した（EP 393 438に記載されている）。

１５Ａ７Ｈは、当技術分野で公知の方法を用いて生成した。簡単に述べると、１５Ａ７Ｈの重鎖および軽鎖をコードすることに加えて、それぞれジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択マーカーをコードする組換え発現ベクターを、ＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞に適合した懸濁液中に同時トランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされた細胞の選択は、ヒポキサンチン／チミジン非含有の選択培地でのトランスフェクションおよび抗生物質Ｇ４１８の添加の２日後に行った。細胞を最初の選択から回収した後、ＤＨＦＲベースの遺伝子増幅を、メトトレキサートの添加によって誘導した。単一細胞堆積により、ＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞を用いてのモノクローナル抗体産生細胞株が、１５Ａ７Ｈのために開発された。 １５Ａ７Ｈ抗体の産生のために、細胞を、生産バイオリアクターの接種用に増殖させた。生産バイオリアクターは、８〜１４日間供給バッチモードで実行した。抗体の産生を支援し、細胞培養物の産生期間を延長するために、栄養補給培地を産生段階中に添加した。細胞培養液を遠心分離およびデッドエンド濾過により回収して、細胞を効率的に除去し、生成物のさらなる精製のために細胞を含まない培養液（ＣＣＦ）を提供した。収穫中に細胞を除去した後、タンパク質を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーおよび陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した。さらに、２つの堅固なウイルス除去工程、低ｐＨウイルス不活化工程およびウイルス除去用のナノ濾過工程が含まれていた。

１５Ａ７Ｈの純度を、キャピラリーゲル電気泳動法により決定した。試料は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて変性させ、ふるい媒体として作用するゲル緩衝液が充填されたキャピラリー中で、サイズに基づいて分離した。還元試料において、ジスルフィド結合は２−メルカプトエタノールで還元され、抗体の重鎖および軽鎖の別個のピークが得られる。非還元試料ではアルキル化剤のヨードアセトアミドを添加して、試料調製により誘導される任意の断片化を回避し、主要なＩｇＧピークが無傷のままであることを保証する。

試料を界面動電的に注入し、動員されたタンパク質を、ＵＶ検出器を用いて２００ｎｍでのＵＶ吸光度により検出した。還元試料については、重鎖および軽鎖の合計（ＬＣ＋ＨＣ％）の時間補正された面積パーセント（ＴＣＡ％）を報告する。非還元試料についての報告可能な値は、ＩｇＧ主要ピークのＴＣＡ％である。

半抗体分子の低い量は、非還元キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）により検出され（図１）、Ｓｅｒ^２２８→Ｐｒｏ^２２８変異が、ヒンジ領域における鎖内ジスルフィド結合の形成を大幅に低下させたことを示す。半抗体分子の量は、 ｈ１５Ａ７についての〜８〜１０％から、１５Ａ７Ｈについての１％未満に低下した。

１５Ａ７Ｈの製剤を表６に示す。
製剤のｐＨは６．０である。
７．２ 例２：１５Ａ７Ｈ抗体の活性化初代ヒトＴ細胞上の結合

１５Ａ７Ｈを、初代活性化ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞における結合について試験した。
７．２．１ 材料および方法

細胞培養およびＴ細胞活性化：末梢血のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、３７℃にてＲＰＭＩ完全培地中１×１０^６で培養し、２０ｕｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｌ（Sigma, Catalog#L2769）を加えて２日間刺激した。細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（R&D systems, Catalog #RD202-IL）でさらに４〜５日間インキュベートして、「活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞」を産生した。

細胞結合アッセイ：活性化ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を計数し、ｖ底の９６ウェル培養プレート（Falcon BD, Catalog # 353263）内のＦＡＣＳ緩衝液中、１×１０^５細胞／１００μｌでプレートし、氷上で３０分間インキュベートした。

抗リゾチームＩｇＧ４アイソタイプ対照、ｈ１５Ａ７、および１５Ａ７Ｈを、丸底希釈プレート内（Falcon, Catalog # 353077）のＦＡＣＳ緩衝液中で９０ｕｇ／ｍｌに希釈した。１１個の、抗体調製物の３倍連続希釈液を、各抗体用にプレート全体にわたって３０ｕｇ／ｍｌの開始濃度で作製した。

デュプリケートの細胞試料をペレット化し、３０μｇ／ｍｌの初期開始濃度で、各抗体希釈１００μｌ中に再懸濁した。細胞を氷上で６０分間インキュベートした。細胞をペレット化し、洗浄緩衝液で洗浄し、続いて１００μｌの希釈した二次ヤギＦ（ａｂ）_２抗ヒトＩｇのＲ−ＰＥコンジュゲート抗体を加えた。二次ヤギＦ（ａｂ’）_２抗ヒトＩｇのＲ−ＰＥコンジュゲート抗体（BD Biosciences, Catalog # 554655；１．０５ｍｇ／ｍｌのストック）を、予めＦＡＣＳ緩衝液で１：８００に希釈した。細胞を氷上で暗所で３０分インキュベートし、その後ペレット化し、洗浄緩衝液で数回洗浄した。細胞を１５０μｌの洗浄緩衝液に再懸濁し、５０μｌの BD Cytofix/Cytoperm固定バッファー（BD Biosciences, Catalog# 554655）を加えて固定した。

試料は、BD FACSアレイ・バイオアナライザで分析した。SSCおよびFSCに応じて設定した「リンパ球」ゲートおよび、各試料について決定された平均蛍光により、BD FACSアレイフローサイトメーターを用いて約５０００のイベントが得られた。

データ分析：抗リゾチームＩｇＧ４、ｈ１５Ａ７、および１５Ａ７Ｈ抗体の、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞への結合親和性を、XLfit（モデル：用量応答１部位、２０５）を用いて、デュプリケートの各試料についての平均蛍光指数（ＭＦＩ）に対する抗体濃度をプロットすることにより決定した。ＥＣ５０値は、各結合曲線について決定した。
７．２．２ 結果：

活性化ヒトＴ細胞への結合：フローサイトメトリーを用いて、１５Ａ７Ｈの活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を決定した。図２は、１５Ａ７Ｈが０．２２ｎＭのＥＣ５０で結合していることを示す。

複数のドナーから総合した結合データは、１５Ａ７Ｈが活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に０．２２±０．０２の平均ＥＣ５０で結合したことを示す。４ドナーからのＥＣ５０値を用いて、平均±ＳＥＭを計算した。抗体ｈ１５Ａ７は同じ条件下で試験し、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に０．２７±０．０５の平均ＥＣ５０で結合した。したがって、１５Ａ７Ｈとｈ１５Ａ７は、活性化Ｔ細胞に対して同等の結合を示した（表７参照）。
７．３ 例３：ヒトにおける１５Ａ７Ｈのin vivo活性
trans vivo遅延型過敏症マウスモデル

１５Ａ７Ｈを、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスのtrans vivo遅延型過敏症（ＤＴＨ）モデルで試験した。用量０．０３、０．１０、０．３、１および１０ｍｇ／ｋｇの１５Ａ７Ｈを、製剤緩衝液中にて腹腔内投与した。ｈ１５Ａ７抗体は、同じ条件下で試験した。
７．３．１ 材料および方法

trans vivoアッセイ：雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、６〜８週齢でHarlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, Indiana)より購入し、到着の４週間以内に使用した。全てのマウスは病原体を含まない環境に収容され、ＮＩＨのガイドラインに従って処理した。全ての動物実験は、施設内動物管理および使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により審査・承認され、ＮＩＨのガイドライン「動物と人間が関与する研究のための基本理念」に準拠して実施した。

血液は、破傷風に良好に応答することが知られている正常なヒトのドナーから、静脈穿刺により収集した。１００ｍｌの全血をCPT Vacutainer管（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）に入れ、１８００ＲＣＦで３０分間回転させた。単核細胞および血小板を含有するバフィー層を分離し、３回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁して計数した。血小板の混入は、ＰＢＳでの複数回の洗浄によって最小化した。１：１を超えない血小板：ＰＢＭＣ比率が許容された。細胞は直ちにマウスの足蹠に注射した。

リン酸アルミニウム吸着破傷風トキソイド（TT- Tetguard）は、注射部位当たり０．２５Ｌｆの濃度で使用した（Ｌｆ単位は凝集値であり、１国際単位の抗毒素と混合した時に最適な凝集混合物を産生するトキソイドの量である）。

総体積５０μｌ中、０．２５ＬＦ単位のＴＴと混合した７〜１０×１０^６のＰＢＭＣを、マウスの後肢足蹠に注射した。足蹠の厚さは、ダイヤル厚みゲージ（Mitutoyo, Aurora, IL）を用いて、注射前および注射の２４時間後に測定した。注射前の厚さは、足の厚さの変化を得るために、２４時間の時点での注射後の厚さから差し引いた。全ての測定はインチで行った。

１５Ａ７Ｈおよびｈ１５Ａ７の試験：１５Ａ７Ｈおよびｈ１５Ａ７（１０ｍｇ／ｍｌのストック）を、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび１１５ｍＭの塩化ナトリウムと０．０４％のTween 80を含有する、ｐＨ５．９７のビヒクルに溶解した。マウスに、０．２ｍｌのビヒクル、または１５Ａ７Ｈもしくはｈ１５Ａ７を０．０３、０．１０、０．３、１および１０ｍｇ／ｋｇで、ＴＴを有するか有しないＰＢＭＣの足蹠への注射の１時間前に腹腔内注射した。１５Ａ７Ｈおよびｈ１５Ａ７抗体の各用量は、４人の異なるドナーからのＰＢＭＣ上で試験され、１ドナーの１処置当たり１匹のマウスを用いた。１５Ａ７Ｈ処置群およびｈ１５Ａ７処置群を、ビヒクル処置群と比較した。

統計：特記のない限り、すべての値は平均±ＳＥＭで報告される。薬物処置群における足蹠の厚さの変化は、ビヒクル処置群と比較した。４人の個別ドナーの実験からのΔ足の厚さをプールし、平均±ＳＥＭを計算した。足の厚さの阻害パーセントを、次のように算出した：１００×（Δ足の厚さ_ｖｅｈ−Δ足の厚さ_ｄｒｕｇ）／（Δ足の厚さ_ｖｅｈ−Δ足の厚さ_ＰＢＭＣ）。阻害効果の有為性は、ランクに対するクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて試験した。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意とみなした。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける１５Ａ７Ｈとｈ１５Ａ７の血漿レベル：雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、０．０３、０．１、０．３、１および１０ｍｇ／ｋｇでの腹腔内注射後２４時間における、１５Ａ７Ｈとｈ１５Ａ７の血漿レベルを決定した。血漿サンプルは、実験の終了時に、trans vivoＤＴＨ実験動物から採取した。生物分析は、全ての試料について行った。

１５Ａ７Ｈのサテライト薬物動態試験：１５Ａ７Ｈの腹腔内投与を受けたサテライト雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（上記と同じ用量レベル）を用い、１５Ａ７Ｈ血漿濃度についてより集中的なデータを収集した。これらのマウスは、ヒトＰＢＭＣまたは破傷風トキソイドで処理しなかった。これらの「ＰＫ」マウスについてのサンプリング時間は、投与後１、３、５、および２４時間であった。ＰＫマウスの各用量群は６匹のマウスから構成された。各用量群内で、３匹のマウスのサブグループを１および５時間でのサンプリングのために使用し、別の３匹のマウスのサブグループを３および２４時間でのサンプリングのために使用した。

１５Ａ７Ｈおよびｈ１５Ａ７の生物分析：サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、マウス血漿中のｈ１５Ａ７または１５Ａ７Ｈの濃度を定量した。簡潔には、ＰＳＧＬ−１で被覆した９６ウェルマイクロタイタープレートを、希釈した血漿試料中のｈ１５Ａ７または１５Ａ７Ｈのいずれかへの結合のために使用した。洗浄後、結合したｈ１５Ａ７または１５Ａ７Ｈを、ビオチン標識モノクローナル抗ヒトＩｇＧ_４抗体および酵素（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンにより検出した。基質反応の間に形成された着色生成物の量を光度的に測定し、これは試料中のｈ１５Ａ７または１５Ａ７Ｈの濃度の増加と共に増加した。測定された吸光度に対応するｈ１５Ａ７または１５Ａ７Ｈの濃度は、非線形の標準曲線のデータ適合により算出した。較正試料の範囲は０．０４〜１．２ｎｇ／ｍＬであった。試料は、少なくとも１：１００に希釈した。したがって、全血漿中のｈ１５Ａ７または１５Ａ７Ｈの定量の下限は４ｎｇ／ｍＬであった。高い希釈係数を用いることにより、定量の上限は、２．４ｍｇ／ｍＬ（１：２００００００ ）まで増加させることができる。

ＥＬＩＳＡにおけるｈ１５Ａ７と１５Ａ７Ｈの基準物質の反応性のわずかな違いにより、２つの較正曲線および２セットの品質対照を使用した。ｈ１５Ａ７で処置した動物からの試料をｈ１５Ａ７較正曲線に対して分析し、１５Ａ７Ｈで処置した動物からの試料を１５Ａ７Ｈ較正曲線に対して分析した。
７．３．２ 結果

trans vivoＤＴＨ：図３は、４人のドナーのＰＢＭＣのtrans vivoＤＴＨにおける１５Ａ７Ｈ抗体のプールした用量反応を、１５Ａ７Ｈで処理した後のＤＴＨの阻害パーセントで示したものである。マウスに、ｈ１５Ａ７と１５Ａ７Ｈを０．０３、０．１、０．３、１および１０ｍｇ／ｋｇで腹腔に投与した場合、ｈ１５Ａ７および１５Ａ７Ｈの両方が用量依存的にtrans vivoＤＴＨを阻害した。表８は、trans vivoＤＴＨにおける、１５Ａ７Ｈおよびｈ１５Ａ７の用量反応および阻害パーセントを示す。０．３ｍｇ／ｋｇ以上の１５Ａ７Ｈまたはｈ１５Ａ７の単回投与は、trans vivoＤＴＨの顕著な阻害を示した。このアッセイにおけるｈ１５Ａ７および１５Ａ７ＨのＥＤ_５０は、ｎ＝４ドナーにてそれぞれ０．０９および０．１ｍｇ／ｋｇであった。

化合物の血漿濃度：サテライトＰＫおよびＤＴＨマウスの両方についての１５Ａ７Ｈの血漿濃度を、図５にまとめる。図４に、２４時間プールした１５Ａ７Ｈの血漿濃度を、ＤＴＨの阻害％に対してプロットしたものを示す。ＰＫおよびＤＴＨマウスに対して与えられた用量レベルにつき、投与後２４時間の平均濃度が非常に類似していたことに注意すべきである。これは、ＰＫおよびＤＴＨマウスは異なって処置されたにも関わらず（ＤＴＨマウスのみがＰＢＭＣおよび破傷風トキソイドを受領した）、２つのケースにおける１５Ａ７Ｈの薬物動態は、非常に類似していたことを示唆している。ｈ１５Ａ７および１５Ａ７Ｈ両方の血漿濃度は、試験の時間経過とともにかなり狭い範囲内でのみ変動した（投与後１〜２４時間の間の濃度測定値）。

ＰＫ−ＰＤ：表９および表１０は、ｈ１５Ａ７および１５Ａ７Ｈ抗体の２４時間の血漿濃度（ＰＫ）および、同一の用量での、trans vivoＤＴＨの対応する阻害％（ＰＤ）を示す。図４は、trans vivoＤＴＨモデルにおける１５Ａ７ＨのＰＫ−ＰＤの関係を比較する。ｈ１５Ａ７および１５Ａ７ＨのＥＤ_５０は、ｎ＝４ドナーにてそれぞれ６８７および７７０ｎｇ／ｋｇであった。
７．３．３ 結論

０．３ｍｇ／ｋｇ以上の１５Ａ７Ｈまたはｈ１５Ａ７の単回投与は、trans vivoＤＴＨの顕著な阻害％を示した。trans vivoＤＴＨアッセイにおけるｈ１５Ａ７および１５Ａ７ＨのＥＤ_５０は、それぞれ０．０９および０．１ｍｇ／ｋｇであった。ｈ１５Ａ７および１５Ａ７Ｈ両方の血漿濃度は、試験の時間経過とともにかなり狭い範囲内でのみ変動した。
７．４ 例４：補体依存性の細胞障害性の評価（ＣＤＣ）

１５Ａ７ＨがＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するため、乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを用いて、種々の濃度でＣＤＣ活性を測定した。
７．４．１ 材料および方法

Ramos細胞（取得したＡＴＣＣ；cat# CRL-1596）を標的細胞として使用し、完全ＤＭＥＭ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA; Catalog number 11995）で０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（(Invitrogen, Carlsbad, CA; Catalog number 10131）と共に培養した。ウサギ補体を補体タンパク質の供給源として使用した（Accurate Chemical &Scientific Corp., Westbury, NY; catalog number: AIC4000-1）。Cedarlane細胞障害性培地をアッセイ培地として用いた（Accurate Chemical &Scientific Corp., Westbury, NY; Catalog Number: CL95100）。

ＣＤＣ活性は、細胞障害性検出キット^PLUS（ＬＤＨ）（Roche Applied Science, Indianapolis, IN; Catalog Number: 04 744 934 001）を使用して、標的細胞のＬＤＨ放出により決定した。１Ｆ５ハイブリドーマ（ATCC), Birmingham, AL; Catalog Number: 6140-01）から精製したマウス抗ヒトＣＤ２０を用いて、補体を、アッセイにおける陽性対照抗体として活性化した。ヒトＩｇＧ４κ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Catalog Number: I4639）を、アイソタイプ対照として使用した。試料および対照は以下のように設定した（すべての試料はデュプリケートで用いる）。
・試料：１００μｌの標準ウサギ補体（アッセイ培地中１：６に希釈）＋５０μｌの標的細胞（アッセイ培地中のRamos細胞）＋５０μｌの抗体希釈
・バックグラウンド対照：２００μｌのアッセイ培地
・最大放出制御：５０μｌの標的細胞＋１００μｌの標準ウサギ補体＋５０μｌのアッセイ培地
・自然放出制御：５０μｌの標的細胞＋１００μｌの標準ウサギ補体＋５０μｌのアッセイ培地

プレートを３７℃で多湿のＣＯ_２インキュベーター内で、３時間インキュベートした。インキュベーション終了の３０分前に（２．５時間のインキュベーションの後）、１０μｌの溶解溶液（細胞障害性検出キットに付属）を最大放出対照試料に添加した。インキュベーションの終わりに、プレートを２００ｇにて室温で１０分間遠心分離し、１００μｌの細胞を含まない上清を、ＬＤＨ検出用の９６ウェル平底プレートの対応するウェルに移した。１００μｌの反応混合物（細胞障害性検出キットに付属）を各ウェルに添加し、プレートを室温で暗所で１５〜３０分間インキュベートした。２回目のインキュベーションの終わりに、この反応を停止溶液５０μｌ（細胞障害性検出キットに付属）を添加することにより停止させた。吸光度をSpectramax Plusプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）上で４９０〜４９２ｎｍの波長で測定した。ＣＤＣ％は、次式により算出した：（［抗体誘導による放出］−［自然放出対照］）／（［最大放出］−［自然放出対照］）×１００％。
７．４．２ 結果

１５Ａ７ＨのＣＤＣ活性は、Ramos細胞を用いて、抗ＣＤ２０のＣＤＣ応答に対して最適化された条件下で試験した。図６および表１１に示すように、異なる濃度の抗体を、１：１２の固定された補体希釈にてＣＤＣ活性について試験した。１５Ａ７Ｈ、ｈ１５Ａ７またはＩｇＧ４陰性対照については、ＣＤＣ活性は検出されなかった。マウス抗ヒトＣＤ２０は、明確な抗体用量反応を示した。

７．４．３ 結論
１５Ａ７Ｈは、Ramos細胞で実施されたアッセイにおいて、１：１２の補体希釈にて５μｇ／ｍｌの抗体濃度まで、ＣＤＣ活性を示さなかった。
７．５ 臨床研究
１５Ａ７Ｈは、ある複数対象に対しては１２５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、および２０００μｇ／ｋｇの単回の増加用量の静脈内投与によって与え、別の複数対象に対しては、５００μｇ／ｋｇおよび１０００μｇ／ｋｇの単回の皮下投与で与えた。投与は適応される。表６に記載の、製剤中に再懸濁させた１５Ａ７Ｈが用いられる。投与後、臨床検査（例えば、血液学、臨床化学および尿検査）を、当該分野で知られている方法を用いて、例えば週単位で実施する。薬物動態学的パラメータも、当該分野で知られている方法を用いて、例えば週単位で決定する。

本出願で引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると指示されるかのようにして、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、理解を明確にすることを目的として、図および実施例によりある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく一定の修正および改変を行えることは、この発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかである。

Claims (15)

1. ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
   （ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む可変軽（「ＶＬ」）鎖領域；
   （ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む可変重（「ＶＨ」）鎖領域を含む重鎖；および
   （ｉｉｉ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸２２８において、セリンからプロリンへの置換を含む、ヒトＩｇＧ４定常領域；
   を含む、前記モノクローナル抗体。
2. ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
   （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖；および
   （ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖；
   を含む、前記モノクローナル抗体。
3. ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
   （ｉ）配列番号２からなる重鎖；および
   （ｉｉ）配列番号１からなる軽鎖；
   を含む、前記モノクローナル抗体。
4. ヒトＰＳＧＬ−１に免疫特異的に結合し、
   （ｉ）配列番号８のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、および配列番号１０のＣＤＲ３を含むＶＨ鎖領域を含む重鎖；
   （ｉｉ）配列番号５のＣＤＲ１、配列番号６のＣＤＲ２、および配列番号７のＣＤＲ３を含むＶＬ鎖領域を含む軽鎖；および
   （ｉｉｉ）ＥＵインデックスの番号付けによる重鎖のアミノ酸２２８において、セリンからプロリンへのアミノ酸置換を含む、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域；
   を含む、モノクローナル抗体。
5. 抗体が精製されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
7. モノクローナル抗体が精製されている、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む第１容器を含む、キット。
9. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む、注入装置。
10. 注入装置が注射器である、請求項９に記載の注入装置。
11. 治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または請求項６もしくは７に記載の医薬組成物を含む、炎症性障害を処置するための医薬組成物。
12. 炎症性障害が自己免疫疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 炎症性障害が、乾癬、尋常性乾癬、慢性尋常性乾癬、滴状乾癬、逆位乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、乾癬性関節炎、関節リウマチ、クローン病、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、またはＩ型糖尿病である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
14. 治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または請求項６もしくは７に記載の医薬組成物を含む、移植片対宿主病および移植拒絶反応を処置するための医薬組成物。
15. 移植が、骨髄移植、肝移植、腎移植、または、任意の器官または組織の移植を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。