NO341236B1 - Fremgangsmåte for produksjon av veksthormon og anvendelse derav - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse ligger innenfor området kultivering av pattedyrceller under serumfrie kulturbetingelser spesielt kultivering av celler som produserer rekombinante proteiner slik som f. eks. humant veksthormon (hGH).

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Cellekultur er i dag ofte anvendt for produksjon av en rekke biologiske aktive produkter, slik som virale vaksiner, monoklonale antistoffer, ikke-antistoff immunregulatorer, polypeptid vekstfaktorer, hormoner, enzymer, tumorspesifikke antigener, etc. disse produkter er fremstilt eller transformerte eller genetisk modifiserte celler.

Ved kultivering av celler blir kulturmediumet tidligere tilsatt serum, som funger som en universal næringskilde for vekst og vedlikehold av alle pattedyrcellelinjer som produserer biologiske aktive produkter. Serum inneholder hormoner, vekstfaktorer, bæreproteiner, feste og spredningsfaktorer, næringsstoffer, sporelementer, etc. Kulturmedium inneholdt normalt opptil omtrent 10% av animalsk serum, slik som føtalt bovint serum (FBS), også kalt føtalt kalveserum (FCS).

Selv om det er bredt anvendt har serum en rekke begrensninger. Det inneholder høye nivåer av en rekke proteiner som interfererer med den begrensede mengden av det ønskede protein som er fremstilt av cellene. Disse proteiner som er avledet fra serumet må bli separert fra produktet i løpet av nedstrømsprosessering slik som rensing av protein av interesse, noe som kompliserer prosessen og øker kostnadene.

Fremkomsten av BSW (bovint spongiform encefalopati), en overførbar neurodegenerativ sykdom fra kveg med en lang latens eller inkubasjonstid har ført til bekymring vedrørende anvendelsen av animalsk avledet serum ved fremstilling av biologisk aktive produkter.

Det er følgelig et stort behov for utvikling av alternative medium som er fri fra animalsk serum og som bidrar til vekst og vedlikehold av celler i løpet av produksjonen av biologisk aktive produkter.

Generelt omfatter cellekulturer av ulike kategorier, slik som aminosyrer, vitaminer, salter, fettsyrer, og ytterlige forbindelser: Aminosyrer: for eksempel US 6,048,726 (Inlow et al.) beskriver at følgende aminosyrer kan bli anvendt i cellekulturmedium; alanin, arginin, aspartat, cystein, glutamat, glutamin, glysin, histidin, isoleucin, laucin, lysin, melonin, fenylalanin, prolin, serin, tryotofan, tyrosin, treonin, og valin. - Vitaminer: US 2003/0096414 /Ciccarone et al.) eller US 5,811,299 (Renner et al.) for eksempel beskriver at følgende vitaminer kan bli anvendt i et cellekulturmedium: biotin, fantotenat, kolin klorid, folinsyre, myo-inositol, niacinamid, pyridoksin, riboflavin,vitmain Bl2, tiamin, putrecin. Salter: for eksempel US 6,399,381 (Blum et al.) beskriver et medium omfattende CaCb, KC1, MgCk, NaCl, monobasisk natrumfosfat, dibasisk natriumfosfat, natrium selenitt, CuSC>4, ZnCb. Andre eksempler på dokumenter som beskriver uorganiske salter som kan bli anvendt i et kulturmedium er US 2003/0153042 (Arnold et al.), som beskriver et medium omfattende CaCb, KC1, MgCb, NaCl, monobasisk natriumfosfat, basisk natriumfosfat, CUCI2.2H2O, ZnCb. - Fettsyrer: Fettsyrer som er kjent og blir anvendt i medium er arakidonsyre, linolsyre, oljesyre, lauronsyre, myristinsyre, så vel som metyl-beta-syklodekstrin, se f.eks. US 5,045,468 (Darfler). Det bør bemerkes at syklodekstrin ikke er et lipid i seg selv, men har evnen til å danne et kompleks med lipider og således er anvendbar for å løse lipider i cellekulturmedium. - Ytterligere komponenter, spesielt anvendt innen rammen av serumfrie cellekulturmedium er forbindelser slik som glukose, glutamin, Natriumpyruvat, insulin eller etanolamin (f. eks. EP 274 445), eller en beskyttende forbindelse slik som Pluronic F68. Pluronic® F68 (også kjent som Poloxamer 188) er en blokk-kopolymer av etylenoksid (EO) og propylenoksid (PO).

Standard "basismedium" er også kjent for fagpersonen. Disse medier inneholder allerede en rekke av mediumkomponentene nevnt ovenfor. Eksempler på slike medier som er bredt anvendt er Dubbecco's endret Eagle's Medium (DMEM), DMEM F12 (1:1), Ham's næringsblanding F-10, Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), MCDB 131, eller William's Medium E. Disse kommersielt tilgjengelige medier er tilgjengelig f.eks. fra Gibco, Invitrogen.

Metaller slik som sink (Zn) og kobber (Cu) er involvert i metabolske reaksjoner (Vallee ogFakxhuk, 1993, eller Lindner, 1991).

Sink er essensiell for struktur og funksjon til en rekke av makromolekyler og for mange enzymatiske reaksjoner. Det spiller en katalytisk, ko-katalytisk eller strukturell rolle ved riktig folding av proteiner. Zn-ATP er nødvendig for syntese av pyridoksal-5-fosfat og flavin adenosin dinukleotid (FAD), to koenzymer som er essensielle for biogen aminsyntese og monoamin oksidasemetabolisme.

Aktiviteten til sink ved beskyttelse av biologiske strukturer fra skade fra radikaler kan skyldes en rekke faktorer: Opprettholdelse av adekvate nivåer av metallproteiner, som også er frie radikalrensere, som en essensiell komponent av superoksid dismutase, som en beskyttende forbindelse for tioler, og med forhindring av interaksjon av kjemiske grupper med jern for dannelse av frie radikaler.

I tillegg til dette hindrer tilstedeværelsen av sinklipid peroksidering. Sink er også en effektor av tubulin polymerisering og virker in vitro på aktin filamentdannelse og stabilisering. Sink er også en komponent av sinkfingermotivet av DNA bindende proteiner, som er et felles motiv i transkripsjonsproteiner.

Sinkioner eksisterer hovedsakelig i form av komplekser med proteiner og nukelinsyrer og deltar i alle aspekt med intermediær metabolisme, overføring og regulering av ekspresjon av genetisk informasjon, lagring, syntese og virkning av peptidhormoner og strukturelt vedlikehold av kromatin og biomembraner.

Kobber er også et sporelement som er viktig for funksjonen til mange cellulære enzymer. Kobberioner kan innta distinkte redokstilstander, oksidert Cu (II), eller redusert Cu (I), noe som setter metallet i stand til å spille en vesentlig rolle i cellulær fysiologi som en katalytisk kofaktor i redokskjemien til enzymene. Det fungerer i en gruppe av kobberoksidaser, som inkluderer cytokrom c oksidase, tyrosinase, dopamin-P-monooksygenase, amino oksidaser og lysyl oksidaser. Kobber er også involvert i mitokondriell respirasjon, jernhomeostase som en komponent av ceruplasmin, fjerning av frie radikaler elastinkryssbinding.

Serumfritt medium omfattende metallioner slik som sink eller kobberioner er kjent innen teknikken, f.eks. fra US 6,048,728 (Inlow et al), US 4,767,704 (Cleveland et al.) eller WO 01/16294 (Lifte Technologies Inc.). Nevnte dokumenter beskriver dog ikke en produktivitetsforbedrende effekt av disse ioner hvis tilsatt ved spesifikke konsentrasjoner til et standard produksjonsmedium.

For utvikling og tilførsel av biologisk aktive produkter, slik som terapeutiske proteiner eller vaksiner, må det fremstilles store mengder. Egnede celler som er bredt anvendt for produksjon av polypeptider er kinesiske hamsterovarie (CHO) celler.

CHO celler ble først kultivert av Puck (J.Exp.Med. 108, 945,1958) fra en biopsi av en ovarie fra en kinesisk hun-hamster. Fra disse opprinnelige cellene er det frembrakt en rekke sublinjer med ulike karakteristika. En av disse CHO cellelinjer, CHO-K1, er avhengig av prolin og er diploid for dehydrofalat reduktase (DHFR) gen. En annen linje avledet fra denne cellelinje er en DHFR mangelfull CHO cellelinje (CHO DUK Bil)

(PNAS 77, 1980, 4216-4220), som erkarakterisert vedtap av DHFR funksjon som en konsekvens av en mutasjon i et DHFR gen og etterfølgende tap av det andre genet.

Ytterligere celler som ofte blir anvendt for produksjon av proteiner ment for administrasjon til mennesker er humane cellelinjer slik som human fibrosarcoma cellelinje HT1080 eller den humane embruonisk nyrecellelinje 293.

Den murine C127 cellelinje er også svært anvendelig for produksjon av rekombinante proteiner (Carter et al., 1989; Okan og Rupp, 1990).

Et terapeutisk protein av interesse er veksthormon. Humant veksthormon (hGH), også kjent som somatropin (INN) eller somatotropiin, er et proteinhormon fremstilt og skilt ut av de somatotropiske celler i den foranliggende hypofyse. Humant veksthormon spiller en nøkkelrolle i somatisk vekst i barndom og i metabolisme i voksen alder gjennom dets effekter på metabolismen av proteiner, karbohydrater og lipider.

Humant veksthormon er en enkelt polypeptidkjede på 191 aminosyrer (Bewly et al., 1972) som har to disulfidbroer, en mellom Cys-53 og Cys-165, som danner en stor loop i molekylet, og den andre mellom Cys-182 og Cys-189, som danner en liten loop nær C-terminalen. DNA sekvensen som bekreftet aminosyresekvensen ble rapportert av Martial et al. (1979). Renset hGH er et hvitt amorft pulver i dets lyofiliserte form. Det er lett løselig (konsentrasjoner >10 mg/l) i vandig buffer med pH i et område på fra 6,5 til 8,5.

I løsning, hGH hovedsakelig som en monomer med en liten andel dimerer og høyere vektoligomerer. Under visse betingelser kan hGH bli indusert til å danne større mengder av dimerer, trimerer og høyere oligomerer.

En rekke derivater av hGH er kjent, inkludert naturlig forekommende derivater, varianter og metabolske produkter, degraderingsprodukter primært fra biosyntetisk hGH og modifiserte derivater av hGH fremstilt ved genetiske metoder. Et eksempel på en naturlig forekommende derivat av hGH er GH-V, en variant av veksthormon som er funnet i morkake. Andre medlemmer av genlocuset er beskrevet i Chen et al (1989). Ethvert derivat av hGH, inkludert derivater designet for å være langtidsvirkende i kroppen, kan bli anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse så lenge det opprettholder biologisk aktivitet av hGH.

Metionyl hGH var den første formen av hGH som ble fremstilt ved rekombinant DNA teknologi. Denne forbindelsen er faktisk et derivat av hGH som har et tilleggs metioninresidue på dets N-terminale ende (Goeddel et al, 1979).

En naturlig forekommende variant av hGH kalt 20-K-hGH har blitt rapportert og forekommer i hypofysen så vel som i blodet (Lewis et al, 1878; Lewis et al, 1980). Denne forbindelsen, som mangler de 15 aminosyreresiduene fra Glu-32 til Gln-46, kommer fra en alternativ spleising av nukleinsyre (DeNoto et al, 1981). Denne forbindelsen gjelder mange, men ikke alle av de biologiske egenskapene til hGH.

20-K-hGH fremstilles i hypofysen og sekreteres inn i blod. Det utgjør omtrent 5% av veksthormonproduksjonen hos voksne, og omtrent 20% av veksthormonproduksjonen i barn. Den har samme vekstfremmende aktivitet som 22 kD veksthormon, og er blitt rapportert å ha lik eller større mengde av lipolytisk aktivitet som 22 kD formen. Det binder til veksthormonreseptorer med samme affinitet som 22 kD veksthormon, og har en tiendedel av den laktogeniske (prolaktin-liknende) bioaktivitet som 22 kD hormonet. I motsetning til 22 kD, har 20-k-hGH svakt anti-insulinaktivitet.

Et antall av derivater av hGH stammer fra proteolytiske modifikasjoner av molekylet. Det primære reaksjonsforløpet for metabolismen av hGH involverer proteolyse. Området av hGH nær residu 130-150 mottakelig for proteolyse, og en rekke derivater av hGH er nicks eller delesjoner i dette området har blitt beskrevet (Theolaclus-Ussing, 1987). Dette området er i den store loopen av hGH, og kløyving av en peptidbinding der resulterer i dannelsen av to kjeder som er bundet sammen med disulfidbindingen ved Cys-53 og Cys-165. Mange av disse tokjedeformene er rapportert å ha forøket biologisk aktivitet (Singh et al, 1974). Mange derivater av humant veksthormon har blitt fremstilt kunstig ved bruk av en enzymer. Ebztnebe trypsin og subtilisin så vel som andre har blitt anvendt for å modifisere hGH ved ulike posisjoner gjennom molekylet (Lewis et al, 1977; Graff et al, 1982). Et slikt derivat, kalt tokjede anabolisk protein (2-CAP), ble dannet ved kontrollert protelyse av hGH ved bruk av trypsin (Becker et al, 1989). 2-CAP ble funnet å ha biologiske egenskaper svært distinkt fra de til intakt hGH molekyl, ved at vekstfremmende aktiviteten til hGH stort sett var beholdt og mesteparten av effektene på karbohydratmetabolismen var fjernet.

Aspargin og glutaminresiduer i proteiner er tilgjengelig for deamideringsreaksjoner under egnede betingelser. Hypofyse hGH har blitt vist og undergå denne type reaksjon noe som resulterer i omdannelsen av Asn-152 til asparginsyre og også til en mindre grad omdannelse av Gln-137 til glutamat (Lewis et al, 1981). Deamidert hGH har blitt vist å ha endret mottagelighet for protolyse med enzymet subtilisin, noe som indikerer at deamidering kan ha fysiologisk betydning ved å dirigere proteolytisk kløyvning av hGH. Biosyntetisk hGH er kjent å degraderes under visse lagringsbetingelser, noe som resulterer i deamidering ved et ulikt aspargin (Asn-149). Dette er hovedsetet for deamidering, men deamidering ved Asn-152 er også observert (Becker et al, 1988), Deamidering ved Gln-137 har ikke blitt rapportert for biosyntetisk hGH.

Metioninresiduer i proteiner er tilgjengelig for oksidasjon, primært til sulfoksidet. Både hypofyseavledet og biosyntetisk hGH undergår sulfoksidering ved Met-14 og Met-125 (Becker et al, 1988). Oksidering ved Met-170 har også blitt rapportert i hypofyse når ikke biosyntetisk hGH. Både desamid hGH og Met-14 sulfoksid hGH har blitt funnet å inneha full biologisk aktivitet (Becker et al, 1988).

Trunkerte former av hGH har blitt fremstilt, enten ved bruk av enzymer eller genetiske metoder. 2-CAP, fremstilt ved kontrollert anvendelse av trypsin, har fjernet de første åtte residuer ved N-terminalen. Andre trunkerte versjoner av hGH har blitt fremstilt ved modifikasjon av genet før ekspresjon i en egnet vert. De første 13 residuer har blitt fjernet for å gi et derivat som har distinkte biologiske egenskaper (Gertler et al, 1986) hvor polypeptidkjeden ikke er kløyvd.

Selv om humant veksthormon opprinnelig ble oppnådd fra hypofysekjertler i kadaver, var disse preparater ikke elektroforetisk homogene, og antistoffer forekom i serum til pasienter behandlet med preparater i størrelsesorden 50% renhet, hvor immunogenisiteten ble tillagt inaktive komponenter. Rekombinant DNA teknologi tillater produksjon av en ubegrenset mengde av hGH i et antall av ulike systemer. Rensing av hGH fra kulturmedium er fasilitert ved tilstedeværelse av kun lave mengder av kontaminerende proteiner. Faktisk har det blitt vist at hGH kan bli fremstilt i laboratortieskala ved et enkelt rensetrinn på revers fase HPLC kolonne (Hsiung et al

(1989).

Rekombinant humant veksthormon, rhGH, er tilveiebrakt av Serono International S.A. som SEROS1TM®, hvor produktet har blitt gitt akselerert FDA godkjenning for behandling av vekttap og tap hos AIDS pasienter. SAIZEN® er rekombinant humant veksthormon indikert for veksthormonmangel hos barn, for Turner syndrom hos jenter, så vel som kronisk nyresvikt hos barn. PROTROPIN® fremstilt av Genentech Inc.

(South San Francisco, CA), skiller seg noe i struktur fra naturlig sekvens hGH ved at den har en tilleggsmetioninresidu ved N-terminale. Rekombinant hGH er generelt markedsført som ampuller inneholdende hGH pluss tilleggseksipienter, f. eks. glysin og mannitol, i en lyofilisert form. En ledesagerdiluent ampull er tilveiebrakt for at pasienten skal kunne rekonstituere produktet til den ønskede konsentrasjon før administrering av dosen. Rekombinant hGH kan også bli markedsført på andre velkjente måter slik som forhåndsfylte sprøyter etc.

Generelt har det ikke blitt observert noen signifikante forskjeller i farmakokinetikk eller biologiske aktiviteter av rekombinant naturlig sekvens hGH, rekombinant N-metionyl-hGH, eller hypofyseavledet materiale i mennesker (Moore et al, 1988; Jorgensson et al, 1988).

I lys av de ulike medisinske indikasjoner hvor veksthormon er anvendt er det et behov for en effektig og trygg måte å fremstille tilstrekkelige mengder av det i cellekulturer spesielt i en serumfri cellekulturprosess.

Serumfritt medium har blitt beskrevet innen teknikken. For eksempel US 6,162,643 beskriver et serumfritt basalmedium gitt navnet HECK-109, inneholdende spormengder av kobbersulfatg og sinkklorid. Dette medium er spesifikt designet for primær og sekundærkulturer av normale humane celler slik som kertaonocytter med det mål å fremstille vev for humane transplantasjoner. Uttrykk av rekombinant humane proteiner i cellelinjer in vitro er ikke beskrevet i dette US patentet.

US 5,324,656 beskriver et serumfritt basalmedium kalt MCDB120 og MCDB131M, omfattende spormengder av kobbersulfat og sinkklorid. Dette medium er spesifikt designet for in vitro kultivering av humane muskelsatelittceller med det mål å hindre differensiering av disse celler. Produksjon av rekombinant humane proteiner er ikke planlagt innen rammen av dette dokument.

GB 2 196 348 beskriver et syntetisk medium for in vitro kultivering av hybridoma og myelomaceller. Mediumet inneholder kobber, sink og jernioner. Kultivering av hybridoma eller myelomaceller i dette medium er eksklusivt for den hensikt å fremstille monoklonale antistoffer.

US 6,103,429 beskriver et serumfritt cellekulturmedium formulering for in vitro kultivering av animalske celler. De animalske celler kan bli anvendt for fremstilling av virus, monoklonale antistoffer, hormoner eller vekstfaktorer. Produksjon av veksthormon er ikke nevnt i dette dokumentet.

US 6,048,728 beskriver et proteinfritt cellekulturmediumomfattende Co-, ZN- og Fe-ioner for kultivering av animalske celler for å fremstille f.eks. naturlig eller rekombinante produkter, slik som antistoffer. Slike produkter som skal fremstilles av de kultiverte celler inkluderer ikke veksthormoner eller vekstfaktorer, som eksklusivt er nevnt som bestanddeler av det serumfrie medium for å øke cellevekst i kultur.

US 5,316,938 beskriver et biokjemisk definert kulturmedium for kinesiske hamsterovarie (CHO) celler omfattende jernsitratm sinksulfat og kobbersulfat, kalt WCM5. Mediumet er spesifikt designet for antistoff og tPA produksjon i CHO celler.

US 5,122,459 beskriver en metode for fremstilling av rekombinante proteiner i et serumfritt kulturmedium inneholdende sink og jernioner, spesielt egnet for kultivering av CHO celler. Produksjon av veksthormon er ikke nevnt i dette dokumentet.

WO 98/08934 beskriver et medium som inneholder 1-11 uM ZnS04 og 4-36nM CuS04.

EP-AO 369 458 beskriver anvendelse av metallothionein promoteren i kombinasjon med ekspresjon av humant veksthormon.

Pavlakis et al., PNAS, Vol 80, januar 1983, side 397-401, XP002031140 ISSN:0027-8424 beskriver at MT-1 promoteren er blitt brukt i kombinasjon med ekspresjon av humant veksthormon.

Følgelig er problemet som ønskes løst ifølge foreliggende oppfinnelse det å tilveiebringe et serumfritt cellekulturmedium for effektiv produksjon av veksthormon, spesielt humant veksthormon (hGH).

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse er basert på utvikling av et cellekulturmedium som er fritt fra komponenter avledet fra animalsk serum og på samme tid er svært effektivt for stimulering av cellevekst og vedlikehold av mammalske celler i kultur, spesielt for produksjon av rekombinante proteiner.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for fremstilling av veksthormon, kjennetegnet ved at den omfatter trinnet med å dyrke celler av en cellelinje som uttrykker veksthormon i et cellekulturmedium fritt for komponenter avledet fra animalt serum hvor nevnte medium omfatter sink i en konsentrasjon i området fra 0,2 uM til 1,75 uM og kobber i en konsentrasjon i området fra 10 nM til 75 nM og jernioner i en konsentrasjon på 5 eller 6 uM.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelsen anvendelse av et medium som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 9 for fremstilling av veksthormon, og også anvendelse av et medium som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 9 for vedlikehold av celler i kultur i produksjonsfasen av veksthormon.

Det beskrives et cellekulturmedium fritt for komponenter avledet fra animalsk serum omfattende sink og/eller kobber, i spormengder. Mediumet kan omfatte jernioner i spormengder. I et aspekt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av et protein omfattende trinnene med å kultivere en celle som uttrykker et protein av interesse i et medium ifølge oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser rhGH produktivitetsprofilen oppnådd i fremstillingsfasen ved kontinuerlig tilsetting av ulike elementer ved 10 uM til DMEM kulturmedium (RB = rulleflaske, Hl-H14 = produksjonsfas edager 1 til 14); Fig. 2 viser gjennomsnittlig rhGH produktivitetsverider, uttrykt som mg rhGH per rulleflaske oppnådd i fremstillingsfasen under kontinuerlig tilsetting av metaller (nikkel, barium, kobolt, krom) ved 10 uM til DMEM kulurmedium; Fig. 3 viser gjennomsnittlige verdier av rhGH produktivitetsøkning sammenliknet med kontroll, oppnådd i fabrikkdesignet eksperiment for testing av kombinasjoner av sink (Zn 0,5 uM), kobber (Cu 0,02 uM), selen (Se 0,050 uM), mangan (Mn 0,001 uM) og jern citrat (4,8 uM); Fig. 4 viser resultatene av et fabrikkdesignet eksperiment for å bestemme resultatene av en blanding av metalliske sporelementer (Zn 0,5 uM, Cu 0,02 uM og jerncitrat 4,8 uM) og aminosyrene glutamin (Gin 4,8 uM), serin (Ser 0,49 uM) og cystin (Cys 0,29 uM); Fig. 5 viser effekten av ulike konsentrasjoner av kobber i kombinasjon med sink og jerncitrat (Zn 0,5 uM, Fe citrat 4,8 uM) på rhGH produktivitet i DMEM; Fig. 6 viser effekten av ulike konsentrasjoner av sink kombinert med kobber og jerncitrat (Cu 0,02 uM, Fe citrat 4,8 uM) på rhGH produktivitet i DMEM;

og

Fig. 7 viser en oppsummering av effekten av rhGH produktivitetøkning oppnådd når tilsatt kobber, sink og jerncitrat (Zn: 1,5 og 0,5 uM, Cu: 0,02 uM og jern citrat: 4,8 uM) som DMEM tilsetningsstoffer fra ulike eksperimenter med rhGH produserende Cl27 celler.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse er basert på utvikling av cellekulturmedium som er fritt for animalt serum.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter cellekulturmediumet fritt for animalsk serum:

Sink (Zn) i en konsentrasjon i området fra 0,2 til 1,75 uM, og

Kobber (Cu) i en konsentrasjon i området fra 10 til 75 nM, og

Jernioner (Fe) i en konsentrasjon i området på 5 eller 6 um.

Som vist i eksemplene nedenfor resulterte tilsetting av Zn og/eller Cu i spormengder til et standardmedium en økning av produktiviteten av celler som uttrykker et sekretprotein av interesse.

Tilsetning av både Zn og Cu i den ovenfornevnte konsentrasjoner førte til en økning i produktiviteten av rekombinant humant veksthormon (GH) i Cl27 celler på over 60% sammenliknet med kontrollen (samme celler kultivert i standard DMEM). Når GH uttrykkende celler ble kultivert i et medium omfattende Zn, Cu og Fe ioner i ovennevnte konsentrasjoner ble produktiviteten økt med omtrent 70% sammenliknet med kontrollen.

Det er beskrevet konsentrasjonsområder av metallioner i mediumet som følger:

- Sink med omtrent 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.5, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1, 1.05, 1.1, 1.15, 1.2, 1.25, 1.3, 1.35, 1.4, 1.45, 1.5, 1.55, 1.6, 1.65, 1.7, 1.75 nM.

Videre er det beskrevet sink benyttet ved omtrent 0,5 uM eller omtrent 1,5 uM. Det er foretrukket i følge oppfinnelsen at sink blir benyttet som sinksulfat. - Det er beskrevet at kobber kan benyttes ved omtrent 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, or 75 nM. Foretrukket i følge oppfinnelsen blir kobber benyttet ved omtrent 25 nM. Det er også foretrukket at kopper blir benyttet som kobbersulfat. - Det er videre beskrevet at jernioner blir benyttet ved omtrent 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 4.8, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 or 10^iM.

Foretrukket i følge oppfinnelsen blir jernioner benyttet ved 5 eller 6 uM. Jernioner kan foretrukket bli benyttet som jerncitrat og/eller jernnitrat, og det er ytterligere foretrukket at jerncitrat står for det meste av jernioner som er omfattet i cellekulturmediumet. Mediumet kan omfatte for eksempel omtrent 6 uM av jerncitrat og omtrent 1 uM av jernnitrat.

I en foretrukket utførelsesform omfatter mediumet ytterligere

basismediumkomponentene. Det er foretrukket at mediumet inneholder Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) som basismedium. Sammensetningen av standard DMEM er vist i eksemplet nedenfor.

Et aspekt av foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av veksthormon omfattende trinnene med å kultivere celler som uttrykker et protein av interesse i mediumet ifølge oppfinnelsen.

Kultiveringstrinnet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan bli utført i ethvert egnet miljø, slik som Petri skåler, T-flasker eller rulleflasker, men kan også bli utført i brønner som har større volumer slik som f. eks. en bireaktor.

Proteinet ifølge oppfinnelsen kan bli uttrykt ved å anvende enhver promoter som er egnet i den spesielle celletypen som blir anvendt. I en svært foretrukket utførelsesform er proteinet uttrykt fra metalltionen (MT) promoter. Hvis murine celler er anvendt for proteinfremstilling, er promoteren foretrukket den murine MT-1 promoteren.

Foretrukket omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnet ved å samle inn medium omfattende veksthormonet.

I en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten ytterligere isolering av veksthormonet.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform omfatter prosessen formulering av det isolerte veksthormonet med en farmasøytisk akseptabel bærer for å oppnå en farmasøytisk sammensetning.

Det er beskrevet anvendelse av mediumet for fremstilling av et polypeptid av interesse.

Det er videre beskrevet anvendelsen av et medium for vedlikehold av celler i kultur i fremstillingsfasen av et polypeptid av interesse.

Cellene som kan anvendes innen rammen av de ulike aspekter av foreliggende oppfinnelse er fortrukket mammalske celler. De kan være av human eller animalsk opprinnelse. Eksempler på mammalske celler som kan bli kultivert i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer, f.eks. murine Cl27 celler, 3T3 celler, COS celler, humane osteosarkomaceller, MRC-5 celler, BHK celler,VERO celler, CHO (kinesiske hamsterovarie) celler, HEK 293 celler, rHEK 293 celler, normale humane fibroblastceller, stromaceller, hepatocyttceller, eller PER.C6 celler. Eksempler på hybridomas som kan bli kultivert i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer f.eks. Da4.4 celler, 123A celler, 127A celler, GAMMA celler og 67-9-B celler.

Det er foretrukket å kultivere murine C127 celler i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Cellene som er kultivert i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan bli dyrket i suspensjon eller, for forankringsavhengige celler, festet til et fast støttemateriale. Mikrobærere og Fibra-Cel® plater er anvendt i mammalske cellekulturer for vekst av forankringsavhengige celler og er blant de etablerte teknologiske plattformer for industriell fremstilling av proteiner (se f.eks. Bohak et al. 1987; Petti et al. 1994).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har foretrukket til hensikt å fremstille et veksthormon av interesse. Mediumet er således anvendt for fremstilling av et veksthormon av interesse, som kan være ethvert veksthormon som er ønsket produsert, enten småskala eller storskala.

Polypeptidet av interesse kan f. eks. være et naturlig sekretert protein, et naturlig cytoplasmisk protein, et normalt transmembran protein, eller et humant eller et humanisert antistoff. Når protein av interesse er et naturlig cytoplasmisk eller et naturlig transmembranprotein, har proteinet blitt modifisert for å være løselig og bli sekretert, f. eks. ved å plassere et signalpeptid i starten av det eller i (løselig eller ekstracellulært) foran et fragment av det.

Polypeptidet av interesse kan være av enhver opprinnelse Polypeptidene av interesse er av human opprinnelse, foretrukket, er proteinene av interesse terapeutiske proteiner.

Foretrukket er proteinet av interesse valgt fra et hormon, et cytokinbindende protein, et interferon, en løselig reseptor, eller et antistoff.

Terapeutiske proteiner som kan bli fremstilt ifølge en fremgangsmåte av foreliggende oppfinnelse inkluderer f. eks. chorionisk gonadotropin, follikelstimulerende hormon, lutropin-choriogonadotropisk hormon, tyroidstimulerende hormon, veksthormon, spesielt humant veksthormon, interferoner (f.eks. interferon beta-la, interferon beta-lb), interferonreseptorer (f. eks. interferon gammareseptor), TNF reseptorer p55 og p75, og løselige varianter derav. TACI reseptor og Fc fusjonsproteiner derav, interleukiner (f.eks. interleukin-2, interleukin-11), interleukinbindende proteiner (f.eks. interleukin-18 bindende protein), anti-CDl la antistoffer, erytropoietin, granulocytt kolonistimulerende faktor, granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor, hypofyse peptidhormoner, menopausal gonadotropin, insulinlikenden vekstfaktorer (f.eks. somatomedin-C), keratinocytt vekstfaktor, glial cellelinje avledet neurotropisk faktor, trombomodulin, basisk fibroblast vektfaktor, insulin, faktor VIII, somatropin, benmorfogenetisk protein.2, plateavledet vekstfaktor, hirudin, epoietin, rekombinant LFA-3/lgGl fusjonprotein, glukocerebrosidase, og muteiner, fragmenter, løselige former, funksjonelle derivater, fusjonsproteiner derav.

Det er beskrevet polypeptid valgt fra gruppen bestående av chorionisk gonadotropin (CG), follikelstimulerende hormon (FSH), lutropin-choriogonadotropisk hormon (LH), tyroidstimulerende hormon (TSH), humant veksthormon (hGH), interferoner (f.eks. interferon beta-la, interferon beta-lb), interferonreseptorer (f.eks. interferon gammareseptor), TNF reseptorer p55 og p75, interlukiner (f.eks. interleukin-2, interleukin-11), interleukinbindende proteiner (f.eks. interleukin-18 bindende protein), anti-CDlla antistoffer, og muteiner, fragmenter, løselige former, funksjonelle derivater, fusjonsproteiner derav.

Ytterligere polypeptider av interesse inkluderer f.eks. erytropoietin, granulocytt kolonistimulerende faktor, granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor, hypofyse peptidhormoner, menopausal goadotropin, insulinliknende vekstfaktorer (f.eks. somatomedin-C), ketatinpcytt vekstfaktor, glial cellelinje avledet neurotropisk faktor, trombomodulin, basisk fibroblast vekstfaktor, insulin, faktor VIII, somatropin, benmorfogenetisk protein-2, plateavledet vekstfaktor, hirudin, epoetin, rekombinant LFA-3/lgGl fusjonsprotein, glukocerebrosidase, og muteiner, fragmenter, løselogige former, funksjonelle derivater, fusjonsproteiner derav.

Hvis veksthormonet, som er fremstilt ifølge fremgangsmåten av oppfinnelsen, skulle bli formulert med farmasøytisk akseptabel bærer, er resultatet av fremgangsmåten en farmasøytisk sammensetning.

Definisjonen av en "farmasøytisk akseptabel" er ment å omfatte enhver bærer som ikke interfererer med effektiviteten av den biologiske aktivitet av de aktive ingrediensene og som ikke er toksisk til verten som blir administrert. For eksempel for parenteral administrering kan det aktive proteinet bli formulert i en enhetsdoseform for injeksjon i bærere slik som salin, dekstroseløsning, serumalbumin og Ringer's løsning.

Den farmasøytiske sammensetningen kan så bli administrert til et individ på en rekke ulike måter. Administrasjonsmåten inkluderer intradermal, transdermal (f.eks. i forsinket frigivelesformuleringer), intramuskulært, intraperitonalt, intravenøst, subkutant, oral. Intrankranial, epidural, topikal, rektal, og intranasale ruter. Hver annen terapeutisk effektiv administrasjonsmåte kan bli anvendt, for eksempel absorpsjon gjennom epitel eller endotelvev eller ved genterapi hvori et DNA molekyl som kode for den aktive forbindelse er administrert til pasienten (f.eks. via en vektor), som fører til at den aktive forbindelse blir uttrykt og sekretert in vivo. I tillegg kan proteinet bli administrert i kombinasjon med andre komponenter av biologiske aktive forbindelser slik som farmasøytisk akseptable surfaktanter, eksipienter, bærere, diluenter og vehikler.

For parenteral (f.eks. intravenøst, subkutant, intramuskulært) administrasjon kan det aktive proteinet bli formulert som en løsning, suspensjon, emulsjon eller lyofilisert pulver i assosiasjon med en farmasøytisk akseptabel parenteral bærer (f.eks. vann, salin, dekstroseløsning) og tilsetningsstoffer som opprettholder isotonisitet (f.eks. mannitol) eller kjemisk stabilitet (f.eks. preservatorer og buffere). Formuleringen er sterilisert ved normalt anvendte teknikker.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse er det svært foretrukket å anvende mediumet som er beskrevet for fremstilling av veksthormon.

GH kan være nativt, f.eks. naturlig forekommende GH. Foretrukket er GH som skal fremstilles av human opprinnelse. Idet GH er et løselig sekretert protein blir det avgitt til cellekultur supernatanten enten ved hjelp av dets naturlige signalpeptid eller ved hjelp av et heterologt signalpeptid, f.eks. et signalpeptid avledet fra andre sekreterte proteiner som kan være mer effektive i det spesifikke eksperisjonssystemet som anvendes.

Termen "veksthormon" er anvendt heri synonymt med GH. Denne termen inkluderer naturlig eller nativt GH, rekombinant fremstilt GH så vel som GH varianter forklart i detalj under overskriften "Oppfinnelsens bakgrunn". Termen "GH" som anvendt heri inkluderer videre muteiner, funksjonelle derivater, aktive fraksjoner, fusjonsproteiner, sirkulærpermulterte proteiner og salter av GH. GH er foretrukket humant, men kan også bli avledet fra andre arter i særdeleshet pattedyr.

Som anvendt heri viser termen "muteiner" til analoger av GH hvor ett eller flere av aminosyreresiduene av naturlig GH er byttet ut med et annet aminosyreresidu, eller er deletert, eller en eller flere aminosyreresiduer er lagt til den naturlige sekvensen av GH uten vesentlig tap av aktiviteten av de resulterende produktene, sammenliknet med villtype GH. Disse muteiner er fremstilt med kjente synteser og/eller seterettet mutageneseteknikker, eller enhver annen kjent teknikk egnet derav.

Muteiner i samsvar med foreliggende oppfinnelse inkluderer proteiner kodet for av en nukleinsyre, slik som DNA eller RNA, som hybridiserer til DNA eller RNA, som koder en GH under stringente betingelser. DA som koder for GH er kjent innen teknikken. Termen "stringente betingelser" viser til hybridisering og etterfølgende vaskebetingelser, som fagpersonene innen teknikken konvensjonelt refererer til som "stringent". Se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, interscience, N.Y., §§ 6.3 og 6.4 (1987, 1992). Uten begrensning inkluderer eksemplet på stringente betingelser vaskebetingelser 12-20°C lavere enn kalkulert Tm for det aktuelle hybrid i f.eks. 2 x SSC og 0,5% SDS i 5 minutter, 2 x SSC og 0,1% SDS i 15 minutter; 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 37°C i 30-60 minutter og så 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 68°C i 30-60 minutter. De som er kjent innen teknikken vil forstå at stringensbetingelser også er avhengig av lengden på DNA sekvensen, oligonukleotide prober (slik som 10-40 baser) eller blandede oligonukleotidprober. Hvis blandede prober er anvendt er det foretrukket å anvende tetrametyl ammoniumklorid (TMAC) istedenfor SSC. Se Ausubel, Supra.

Identitet viser til et forhold mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser bestemt ved å sammenlikne sekvensene. Generelt viser identitet til henholdsvis en eksakt nukleotid til nukleotid eller aminosyre til aminosyrekorrespondanse av de to polynuklotider eller to polypeptidsekvenser over lengden av sekvensene som blir sammenliknet.

For sekvenser hvor det ikke er et eksakt samsvar kan en "% identitet" bli bestemt. Generelt blir de to sekvenser som skal sammenliknes satt opp for å gi maksimal korrelasjon mellom sekvensene. Dette kan inkludere innskudd av "gaps" i enten en av eller begge sekvenser, for å optimalisere graden av oppstilling. En % identitet kan bli bestemt over hele lengden av hver av sekvensene som blir sammenliknet (såkalt global oppstilling), det er spesielt anvendelig for sekvenser av samme eller veldig lik lengde, eller over korte, definerte lengder (såkalt lokal oppstilling), som er mer anvendelig for sekvenser med ulik lengde.

Metoder for å sammenlikne identitet og homologi av to eller flere sekvenser er vel kjent innen teknikken. For eksempel kan programmer tilgjengelig i Wisconsin Sequence Analysis Package versjon 9.1 (Devereux J et al., 1984), for eksempel programmet BESTFIT og GAP bli anvendt for å bestemme % identitet mellom to polynukleotider og % identitet og % homologi mellom to polypeptidsekvenser. BESTFIT anvender "lokal homologi"algoritmen til Smith og Waterman (1981) og finner den beste enkle område av likhet mellom de to sekvensene. Andre programmer for bestemmelse av identitet og/eller likhet mellom sekvenser er også kjent innen teknikken, for eksempel BLAST familien av programmer (Altschul S F et al, 1990, Altschul www. ncbi. nlm. nih. gov) og FASTA (Pearson W.R. 1990).

Ethvert slikt mutein har foretrukket en sekvens av aminosyrer som er tilstrekkelig dublikative til det av et GH slik at det har hovedsakelig tilsvarende aktivitet som GH. En aktivitet av GH er dets evne til å binde GH reseptor. Så lenge muteinet har vesentlig bindingsaktivitet til GH reseptor (GHR), kan det bli ansett å ha vesentlig lik aktivitet som GH. Følgelig kan det bli bestemt om ethvert mutein har vesentlig samme aktivitet som GH ved å anvende rutineeksperimenter omfattende å utsette et slikt mutein, f.eks. for et enkelt sandwich konkurranseassay for å bestemme om det binder eller ikke til en egnet merket GHR eller celler som uttrykker GHR, slik som radioimmunoassay eller ELISA assay.

Et slikt mutein kan ha minst 40% identitet eller homologi med aminosyren eller DNA sekvensen til et GH. Disse sekvenser er kjent innen teknikken, f.eks. fra DeNoto et al, 1981 ellerMartialetal., 1979.

Mer foretrukket har det minst 50%, minst 60%, minst 70%, minst 80% eller mest foretrukket minst 90% eller 95% identitet eller homologi til det.

Foretrukkede endringer for muteiner i samsvar med foreliggende oppfinnelse er de kjent som "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner av GH

polypeptider kan inkludere synonyme aminosyrer innen en gruppe som har tilstrekkelig lik fysiokjemiske egenskaper slik at en substitusjon mellom medlemmer av gruppen vil bevare den biologiske funksjon til molekylet (Grantham, 1974). Det er klart at innskudd og delesjoner av aminosyrer også kan bli utført i de ovenfor definerte sekvenser uten å endre deres funksjon, spesielt hvis innskudd eller delesjoner kun involverer noen få aminosyrer, f.eks. under tredve, og foretrukket under ti, og som ikke fjerner eller omplasserer aminosyrer som er kritisk for funksjonell konfirmasjon, f.eks. cystinresiduer. Proteiner og muteiner fremstilt med slike delesjoner og/eller innskudd ligger innenfor området av foreliggende oppfinnelse.

Termen "fuserte proteiner" viser til et polypeptid omfattende GH eller et mutein eller fragment derav fusert med et annet protein, som f.eks. har en forlenget oppholdstid i kroppsvæske. GH kan derfor bli fusert til andre proteiner, polypeptider eller lignende, f.eks. et immunoglobulin eller fragment derav. Fc deler av IgG er egnede for fremstilling immunoglobulin fusjonsproteiner. Ig fusjonsproteiner er beskrevet for eksempel i EP 314 317 Al (Genentech) eller EP 0 325 224 A2 (Zymogenetics Inc.).

Som "aktive fraksjoner" av et GH, eller muteiner og fuserte proteiner, dekker foreliggende oppfinnelse ethvert fragment eller forløpere av polypeptidkjeden av proteinmolekylet alene eller i kombinasjon med assosierte molekyler eller residuer koblet dertil, f.eks. sukker eller fosfatresiduer, eller aggregater av proteinmolekyl eller sukkerresiduer alene, forutsatt at nevnte fraksjon har vesentlig lik aktivitet som GH.

Hvis GH fremstilt ifølge oppfinnelsen skal bli anvendt som en farmasøytisk sammensetning, kan en slik farmasøytisk sammenslutning bli anvendt for behandling og/eller forebygging av en rekke av lidelser og sykdommer. Slike sykdommer eller lidelser vedrører foretrukket utilstrekkelig endogen GH produksjon. Renset GH kan bli anvendt f.eks. ved behandling og/eller forebygging av GH mangel, AIDS tap, lipodystrofy (også kalt HARS-HTV-assosiert dysmorfi/dysmetabolisk syndrom), eller korttarmsyndrom, spesielt pediatrisk. Ytterligere sykdommer hvor administrering av veksthormon kan bli indikert inkluderer levercirrose, voksen vekstmangel, ateroskerose, Crohns sykdom og ulcerativ volitis, osteoartitt, hjertesvikt, kongestiv hjertefeil, kronisk renal utilstrekkelighet, blodcellerekonstituering eller mobilisering, mannlig infertilitet, hematopoetisk stamcellemobilisering, multippel sklerose, slag, multippel systematrofy eller kreft.

EKSEMPEL: Utvikling av et nytt serumfritt produksjonmedium for hGH uttrykkende Cl27 celler

1. Introduksjon

Denne studien beskriver det eksperimentelle arbeidet som vedrører utvikling av et produksjons kulturmedium (DMEM "Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ved tilsetning av spormetallelementer. Som resultat av denne utvikling er det oppnådd en bemerkelsesverdig økning i r-hGH produktivitet i Cl27 cellekulturer.

Følgende tabell 1 oppsummerer sammensetningen av DMEM og utviklingen som vil bli presentert innen rammen av dette eksempel.

2. Materialer og metoder

REAGENSER OG LØSNINGER

Alle kjemiske reagenser ble oppnådd fra Merck®; Sinksulfat (ZnS04«7H20), kobbersulfat (CuSo4o5H20), Bariumklorid (BaCl2oH20), koboltklorid (CoCl2ogH20), krum kaliumsulfat (K[Cr(S06H4)2(H20)2]o6H20), nikkelnitrat (NI(N03)2o6 H20), natriumselenitt (Na2Se03o5H20). Jerncitrat (FeC6H507Sigma® katalognummer F3388) ble anvendt som en jernkilde.

Vekstmedium sporelementblanding (100.000X) ble tilveiebrakt fra JRH® Biosciences.

Alle sporlementløsninger som ble analysert var fremstilt som konsentrerte løsninger i destillert vann og sterilisert ved filtrering gjennom et 0,2 um filter

Tilsats av de ulike tilsetninger analysert (metalløsninger etc.) i ulike eksperimenter ble utført direkte på friskt kulturmedium.

CELLEKULTUR

Genetisk modifiserte Cl27 murinceller (ATCC CRL 1616) ble anvendt for uttrykk av rekombinant humant veksthormon (rhGH). Vektoren er basert på BPV69T omfattende pBR322 multippel kloningsete og omfatter 1,6 kb av rhGH minigene under kontroll av en mus metallotionin-1 (MT-l) promoter. Kulturer avledet fra en Working Cell Bank oppnådd fra ulike rhGH produksjonsbatcher ble anvendt i eksperimentene.

Cellekulturer ble inkubert ved 36°C ± 0,5°C og 0,4 rpm i 2125 cm<2>rulleflasker inneholdende 375 ml ± 15 ml av kulturmedium eller i 1700 cm cm rulleflasker inneholdende 300 ml av kulturmedium.

KULTURMEDIUM

Kulturmedium anvendt for rhGH produksjonsfasen var DMEM med 4,5 g/l glykose bufiret med natrium bikarbonat (3,7 g/l).

RHGH TITRERING

Måling av rhGH i kulturmediumet ble utført daglig med revers fase HPLC titrering: Materialer

Synchropak RP4, 100 x 4,6 mm i.d., 300 Å katalognr. C4R103-10 (Eichrom). Ressurs RPC 1 ml, 30 mm x 6,4 mm i.d., 15 um, art 17-1181-01, Amersham Biosciences.

Symmetri 300, 50 mm x 4,6 i.d., C45 um, P/N 186000287 (Waters).

Reagenser

Trifluor eddiksyre (TFA) (Plerce, katalognr. 28904 eller ekvivalent).

Acetonitril (ACN) (Merck 1,0030 eller ekvivalent).

Renset vann, PW (f.eks. MilliQ vann, eller ekvivalent).

Helium

Løsninger

Mobil fase A: TF A 0,08% i H20 (v/v).

Mål i en gradert flaske volumet av PW vann og tilsett TFA i henhold til følgende tabell.

Mobil fase B: TFA 0,08% i acetonitril (v/v)

Mål en volumetrisk flaske volum av PW vann og tilsett TFA i henhold til følgende tabell. Rør og merk.

Kromoatografibetingelser er:

Gradienteluering: start med en blandingsfase A/fase B 60/40 slutt med en fase A/fase B 20/80. Gradient ferdigstilles i løpet av 5 minutter (noe variabel avhengig av instrumentet som anvendes

- Injeksjons volum 50 uliter

- Deteksjon: UV absorbanse ved 215 nm

- Kallibreringskurve: r-hGH standard ved 10, 50, 100, 120 og 150 ug/ml

Konsentrasjon av r-hGH i en prøve er bestemt ved sammenlikning med standard r-hGH konsentrasjoner.

GH PRODUKTIVITET

Produktivitet er uttrykt som mg av rhGH per rulleflaske. Rådata er rhGH konsentrasjon ved høsting (målt ved HPLC) og totalt antall av rulleflasker innhøstet. Typisk inneholder en rulleflaske ved innhøsting omtrent IO9 celler.

3. Resultater

I en førte serie av eksperimenter ble effekten av høy koboltkonsentrasjon (20 uM C0G206H2 tilsatt til kulturmediumet målt. Tilsetning ble utført i forbindelse med de to mediumutbyttinger i det innledende trinn (rinse og PM = produksjonsmedium, f.eks. 0 punktet i høstefasen) og ved intermediærtrinnet (høsting 6 og 7) i produksjonsfasen av en batch. Resultatene (ikke vist) indikerte at promoteren er aktiv og kan bli modulert.

Den forbedrede produktivitet ble videre bekreftet for andre metallelementer. Analyser med 10 uM konsentrasjoner av barium (BaCl2o6H20), kobolt (C0O206H2O), krum (K[Cr(S06H4)2(H20)2]o6H20) og nikkel (Ni (N03)2-6 H20), som ble kontinuerlig tilsatt til mediumet ble utført. Resultatene av dette forsøket er vist i fig. 1 og 2.

Fig. 1 viser mengden av hGH sekretert av hGH uttrykkende Cl27 celler når kultivert i medium inneholdende de målte elementer i løpet av eksperimentstidsperioden (14 dager). Fig. 2 viser gjennomsnittlig produktivitetsverdier oppnådd for hvert målte element. Gjennomsnittlig produktivitetsøkning prosenter oppnådd sammenliknet med kontrollverdier, uten sporelementer, var i området mellom 1,1% for barum og 32,4% for kobolt. Det ble også observert at rhGH produktivitet økte fra 9% til 32,5% sammenliknet med kontrollverdier når analysert kontinuerlig versus periodisk induksjon med kobolt. Verken barum eller krum viste produktivitetsøkning med de analyserte konsentrasjoner i DMEM.

Måling av individuelle sporelementer

DMEM ble tilsatt sporelementer av Zn, Cu, Se og Co ved konsentrasjonene vist nedenfor i tabell 2. Disse konsentrasjoner representerer de konsentrasjoner av metallelementene i vekstmediumet. Økning i rhGH produktivitet oppnådd ved å tilsette sporelementene til DMEM er indikert i tabell 2.

Det bør legges merke til at i tilfelle av sink medførte målte konsentrasjon på 1,5 uM et "avskallings" fenomen, f.eks. en løsrivelse av cellemonolaget fra plastikksubstratet i rulleflaskene. I noen tilfeller medførte denne løsrivelsen til tap av kulturene i det siste høstetrinnet (normalt mellom innhøsting 12-14). Løsrivelsesfenomenet kan oppnås ved å anvende adekvate cellekulturbrønner, slik som rulleflaskene tilgjengelige fra Corning® under handelsnavnet Cellbind®.

Måling av intraksjoner mellom metaller.

Basert på effektene av kobber og sink på produktiviteten av hGH produksjon ble fabrikkdesignede eksperimenter utført for å analysere mulige kombinatoriske effekter av metallene.

Statistisk analyse av resultatene er vist i tabell 3. En sterk synergisk effekt på produktiviteten (p < 0,0001) ved bruk av kobber og sink i kombinasjon ble observert.

R-kvadrat = 98.1139 prosent

R-kvadrat (adjusted for d.f.) = 96.8565 prosent

Løsrivelse ble observert i alle kulturer behandlet med sink i konsentrasjoner på 1,5 uM uavhengig om kobber var til stede eller ei.

Etterfølgende fabrikkdesignede eksperimenter ble utført for å studere effekten ved tilsetning av både sink og kobber når sinkkonsentrasjonen var redusert (Zn 0,5 uM) og tilsetning av andre sporelementer til vekstmediumet, slik som mangan, selen eller jerncitrat, som kunne forbedre produktiviteten og festing av kulturene til substratet.

Kontinuerlig vekst ble oppnådd fra et felles produktivitetsstartpunkt, omkring 20 mg

rhGH per flaske, med sluttverdier nær 70 mg av rhGH/RB sammenliknet med 30 mg av rgGH i kontrollkulturen med standard DMEM (ikke vist). Snittverdiene for økning i GH produktivitet (f.eks. produktivitet målt i mg/RB ved dag 14) sammenliknet med kontroll som vist i fig. 3.

I denne rekken av eksperimenter var løsrivningsfenomenet fraværende.

Aminosyretilsetning

En aminosyreanalyse ble utført for å bestemme om økning i hGH produktivitet var begrenset av tilgangen på aminosyrer. Tabell 4 viser prosentandel av aminosyrer ved innhøsting etter to dager i kultur, i medium med og uten tilsetning av sink og kobber.

En blanding av kobber, sink og jerncitrat (Zn 0,5 uM, Cu 0,02 uM og jerncitrat 4,8 uM) ble analysert med kombinasjoner av de aminosyrer med høyest konsumeringsandel: L-glutamin (Gin 4,8 mM), L-serin (Ser 0,49 mM) og L-cystin (Cys 0,29 mM). Resultatene er vist i fig. 4.

Ingen positive effekter på produktivitet ble observert for noen av de testede aminosyrer, verken separat eller kombinert.

Når metallene ble tilsatt i kombinasjon med aminosyrene ble kun minimale effekter på produktivitet observert: en liten positiv effekt av glutamin (fra 78,2% til 81,1%) og en negativ effekt av cystin (fra 78,2% til 69,9%). Slike forskjeller ble ikke vurdert å være signifikante.

Produktiviteten skiller klart mellom kulturer behandlet med en blanding av metaller i DMEM (snittverdi på omtrent 50 mg rhGH/RB per innhøsting) fra de som ikke omfatter metallene (omtrent 30 mg av rhGH/RB per innhøsting). I lys av disse resultater ble det vurdert dit hen at det ikke var nødvendig å modifisere den opprinnelige aminosyresammensetningen i produksjonsmediumet.

Titrering av effekten av kobber og sink.

For å måle optimal konsentrasjon av kobber ble det utført et eksperiment hvor jerncitratkonsentrasjonen (4,8 uM) og sinkkonsentrasjonen (0,5 uM) ble holdt konstant, og kobberkonsentrasjonen ble variert (fig. 5).

Som vist i fig. 5 bekreftet doseresponseksperimentet at den optimale tilsetningskonsentrasjon av kobber i DMEM er 25,6 nM når analysert med det indikerte sink og jerncitratkonsentrasjoner.

I et annet forsøk ble jerncitratkonsentrasjonen (4,8 uM) og kobber (0,025 uM) konsentrasjonene holdt konstant og sinkkonsentrasjonen variert (fig. 6): Et maksimalt produktivitetsnivå (platå) ble observert med sinkkonsentrasjoner over 200 nM, hvor produktiviteten ble stabilisert ved omtrent 60% over snitt kontrollverdi.

Oppsummering av resultater

Fig. 7 oppsummerer resultatene oppnådd med sink og kobberioner i sporkonsentrasjoner, med eller uten jernioner.

Følgende verdier ble oppnådd på basis av data oppnådd for økning i produktivitet ved tilsats av metallsporelementer til DMEM medium;

Sink 1.5 jjM: 10.3% +5.0%, Sink 0.5 jjM: 16.8% ±1.6%.

Kobber 0.02 jjM: 32.1% ±9.4%,

Sink 1.5 jjM + Kobber 0.02 jjM: 66.3% ±16%

Sink 0.5 jjM + Kobber 0.02 jjM: 61.2% (±10%)

Sink 0.5 jjM + Kobber 0.02 \ iM + Jerncitrat 4.8 jjM: 69.4% ±19

I lys av disse data er følgende blanding optimal som en tilsetning til DMEM medium:

Kobber som kobbersulfat (CuS04o5H20) ved 25 nM.

Sink som sinksulfat (ZnS04o7H20), mellom 50 nM og 1500 nM, med

foretrukket konsentrasjoner i området fra 200 til 500 nM.

Jerncitrat ved konsentrasjon på 4,8 uM til en sluttkonsentrasjon på omtrent 6

uM av ionet gitt at jernnitrat allerede er til stede i DMEM

Konklusjon:

Anvendelsen av kobber, sink og jernioner i spormengder som tilsetningsstoffer til DMEM medium økte rhGH produktivitet med mer enn 50% sammenliknet med standard DMEM:

REFERANSER

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 403-410, 1990

2. Arnold et al, US 2003/0153042

3. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience. N. Y. §§6.3 and 6.4 (1987, 1992)

4. Altschu S F et al, Nuclelc Acids Res., 25:389-3402, 1997

5. Becker et al, Biotechnol. Appl. Biochem, 10:326 (1988)

6. Bewly et al, Int. J. Peptide and Protein Res. 4:281:287 (1972)

7. Blum et al. US 6,399,381

8. Bohak et al. 1987 Bohak Z. Kadouri A et al. (1987) "Novel anchorage matrices for suspensionculture of mammalian cells "Biopolymers 26 Suppl: S205-213. 9. Carter MJ, Facklam TJ, Long PC, Scotland RA, Dev. Biol. Stand, 1989; 70:101 - 7.

10. Chen et al, Genomics 4:479-497 (1989)

11. Ciccarone et al. US 2003/0096414

12. Cleveland et al, US 4,767,704

13. DarflerUS 5,045,568

14. DeNoto et al, Nucleic Acids Res. 9:3719 (1981)

15. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984

16. Gertler et al, Endocrinology 118:720 (1986)

17. Goeddel et al Nature, 281:544 (1979)

18. Graff et al, J. Biol. Chem, 257:2365 (1982)

19. Grantham et al, Science, Vol. 185, s 862-864 (1974)

20. Hsiung et al, Biotechnology 7:267 (1989)

21. Inlow et al. US 6,048,728

22. Jorgensson et al, Pharmacol. Toxicol, 63:129 (1988)

23. Lewis et al, Endocrinology 101:1587 (1977)

24. Lewis et al, J. Biol. Chem. 253:2679 (1978)

25. Lewis et al, Endocrinology 104:1256 (1979)

26. Lewis et al, Bichem. Biophys, Res. Comm. 92:511 (1980)

27. Lewis et al. J. Biol. Chem. 256:11645 (1981)

28. Lindner MC 1991, Biochemistry of copper, New York, Plenum press (textbook)

29. Martial et al, Science 205:602-607 (1979)

30. Moore et al, endocrinology 122:2920 (1988)

31. Novivk, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein,

M(1999) Immunity 10, 127-136

32. Oka MS, Rupp RG, Bioprocess Technol. 1990; 10:71-92

33. Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98

34. Petti SA, Kages AC et al. (1994) "Three-dimensional cell growth on nonwoven polyester fabric disks" Biotechnol Prog. 10(5):548-550

35. Puck et al, J. Exp. 108, 945, 1958

36. Renner et al., US 5,811,299

37. Singh et al, Endocrinology 94:883 (1974)

38. Thorlacius-Ussing, Neuroendocrinology 43:233 (1987)

39. Vallee BL and Falchuk KH 1993. The biochemical basis of zinc physiology.

Physiological reviews 73, 79-118

40. EP 274 445 41. EP 314 317 Al 42. EP 0 325 224 A2 43. WO 01/16294

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av veksthormon,karakterisert vedat den omfatter trinnet med å dyrke celler av en cellelinje som uttrykker veksthormon i et cellekulturmedium fritt for komponenter avledet fra animalt serum hvor nevnte medium omfatter sink i en konsentrasjon i området fra 0,2 uM til 1,75 uM og kobber i en konsentrasjon i området fra 10 nM til 75 nM og jernioner i en konsentrasjon på 5 eller 6 uM.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat mediumet omfatter 0,2 uM sink.

3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat mediumet omfatter 0,5 uM sink.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat mediumet omfatter sink i form av sinksulfat.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat mediumet omfatter 25 nM kobber.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat mediumet omfatter kobber i form av kobbersulfat.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat mediumet omfatter jernioner i form av jerncitrat og/ eller j ernnittrat.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de forgående krav,karakterisert vedat mediumet ytterligere omfatter komponentene i et basismedium.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat basismediumet er Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM).

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat veksthormonet er uttrykt under kontroll av en metallotionein (MT) promoter.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat metallotionein promoteren er muse-MT-1 promoteren.

12. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter trinnet med å innsamle veksthormon fra cellekulturen.

13. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter rensing av veksthormonet.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den ytterligere omfatter formulering av det rensede veksthormon med en farmasøytisk akseptabel bærer for oppnåelse av en farmasøytisk sammensetning.

15. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat veksthormonet er humant veksthormon.

16. Anvendelse av et medium som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 9 for fremstilling av veksthormon.

17. Anvendelse av et medium som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 9 for vedlikehold av celler i kultur i produksjonsfasen av veksthormon.

18. Anvendelse ifølge krav 16 eller 17, der veksthormonet er humant veksthormon.

19. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 16 til 18, der cellene er muse Cl27 celler.